Summary
Aquí presentamos un elegante protocolo para la evaluación en vivo de la vacuna eficacia y anfitrión inmunorespuestas. Este protocolo puede ser adaptado para modelos de vacuna que estudian viral, bacteriana o parásitos patógenos.
Abstract
Las vacunas son una 20 maravilla médica de sigloXX . Han reducido considerablemente la morbilidad y la mortalidad causada por enfermedades infecciosas y contribuyó a un notable aumento esperanza de vida alrededor del mundo. Sin embargo, determinar la eficacia de la vacuna sigue siendo un desafío. Emergentes de la evidencia sugieren que la actual vacuna acelular (aPV) para Bordetella pertussis (B. pertussis) induce inmunidad subóptima. Por lo tanto, un reto es diseñar una vacuna de nueva generación que induce inmunidad protectora sin los efectos secundarios adversos de una vacuna de células enteras (wPV). Aquí se describe un protocolo que se utilizó para probar la eficacia de un coadyuvante prometedor, la novela que sesga las respuestas inmunes a un fenotipo Th1/Th17 protección y promueve una mejor separación de un desafío B. pertussis en el tracto respiratorio murine. Este artículo describe el protocolo para la inmunización del ratón, inoculación bacteriana, tejidos y análisis de la respuesta inmune. Usando este método, dentro de nuestro modelo, hemos aclarado con éxito mecanismos cruciales provocados por una vacuna de tos ferina acelular prometedor, de última generación. Este método puede ser aplicado a cualquier modelo de enfermedad infecciosa para determinar la eficacia de la vacuna.
Introduction
Las vacunas representan uno de los mayores logros de salud pública del siglo XX, sin embargo, todavía no entendemos los mecanismos por el cual las vacunas exitosas estimulan inmunidad protectora. La identificación de firmas moleculares (ej., marcadores de activación de la célula, expansión de subtipos celulares y los patrones de expresión génica) inducida después de la vacunación proporciona una gran cantidad de información para predecir y generar una eficaz respuesta inmune. La complejidad de las respuestas del huésped-patógeno no puede replicarse adecuadamente usando in vitro de la célula cultura sistemas1. En vivo vacuna modelos están diseñados para evaluar concomitante varios tipos de células inmunitarias en el host. Esto proporciona una ventaja al caracterizar el procesamiento de antígeno de vacuna y presentación, secreción de citocinas diferencial y expansión de células inmunes. El protocolo descrito aquí proporciona un método detallado para determinar la eficacia de la vacuna a través de la evaluación de la respuesta inmune local y sistémica y la cuantificación de la carga del patógeno en los tejidos de interés. El ejemplo proporcionado aquí pruebas de la eficacia de una vacuna experimental para el patógeno Bordetella pertussis (B. pertussis).
B. pertussis es una bacteria gram negativa que es el agente etiológico de la enfermedad respiratoria tos ferina (pertusis)2,3. Contacto cercano con personas infectadas (sintomáticas o asintomáticas) conduce a la transmisión, la colonización y la enfermedad. A pesar de vacuna global significativa cobertura4, la tos ferina es considerada una resurgimiento de la enfermedad en muchas naciones del mundo y es una causa importante de muertes infantiles prevenibles5,6,7, 8. en el año 2015, B. pertussis y la tos ferina se incluyeron en el Instituto Nacional de alergias y enfermedades infecciosas (NIAID) emergentes lista de patógenos/enfermedades infecciosas, haciendo hincapié en la necesidad de desarrollo de una vacuna mejor que confiere inmunidad protectora de larga duración.
Actualmente, un área activa de investigación para controlar la reaparición de la tos ferina es desarrollo de una vacuna de tos ferina acelular de última generación (aPV) con una combinación óptima de nuevos adyuvantes y antígenos para imitar la respuesta inmune provocada por los celulares tos ferina vacuna (wPV)9. Utilizando el protocolo descrito, recientemente informó que la modificación de un actual aprobado por la FDA aPV por la adición de un nuevo adyuvante, factor de colonización de Bordetella A (BcfA), dio lugar a la reducción más eficiente de la carga bacteriana de B. pertussis de los pulmones de ratón de10,11. Esta protección fue acompañada por el sesgo de una respuesta inmunitaria en Th1/Th2 con alum-inducida a la más protectora de perfil inmune Th1/Th1710. Este protocolo es detallada y completa, lo que permite al investigador a obtener la máxima información a través de una evaluación concomitante de acogida y respuesta inmunitaria a una variedad de patógenos.
El protocolo descrito aquí sigue el calendario de vacuna representativas, que se muestra en la figura 1, para asegurar la óptima anfitrión inmunorespuestas.
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Protocol
Todos los experimentos con animales vivos se realizaron siguiendo un protocolo aprobado por el IACUC de Universidad de estado de Ohio con arreglo a directrices IACUC. Ratones C57BL/6 fueron utilizados en todas las vacunas y las infecciones. Ratones masculinos y femeninos son utilizados en cada grupo según las directrices de los NIH. Por cálculos de energía basados en las diferencias previstas en el resultado entre los grupos experimentales se determinó el número de animales por grupo. Por ejemplo, 8 ratones por grupo producirá energía del 80% en α = 0.05 (2 caras) de 2-sample t- test para detectar diferencias en el resultado del interés de 1,33 desviaciones de estándar (SDs).
1. inmunización de ratones
- Preparar una mezcla de la vacuna contra la principal en un tampón fisiológico estéril como solución salina o DPS.
Nota: El volumen total de la mezcla debe incluir 10% más necesaria para la inmunización de todo el grupo. A continuación se detallan las concentraciones de la composición de la vacuna en los pasos 1.1.1 y 1.1.2. Transporte de los elementos que el vivero en el hielo.- Para los estudios B. pertussis , incluyen los siguientes grupos de vacunas: aPV y aPV + BcfA. Además, usar alumbre, antígenos de la vacuna solo (FHA y Prn) y ratones (no vacunados) ingenuo como grupos de control.
Nota: aPV es 1/5th la dosis humana de una aPV aprobado por la FDA, que se compone de toxoide tetánico, toxoide reducido de difteria, toxoide de tos ferina (PT), hemaglutinina filamentosa (FHA) y pertactin (Prn) adsorbidos en sales de aluminio. Una dosis humana del actual pertussis aPV es 0,5 mL, por lo tanto, 1/5th de una dosis es de 0,1 mL. Volúmenes para aPV + BcfA son 0,1 mL de la aPV (1/5th la dosis humana) + 0,046 mL de BcfA (30 μg) por ratón. El volumen máximo que puede ser entregado con seguridad a un músculo es de 0,1 mL. Porque el aPV + BcfA volumen de vacuna es mayor que 0,1 mL, la vacuna debe ser entregada en ambos hombros, divididas áspero igual, con el fin de ser administrado con seguridad. - Para preparar una vacuna experimental, para una dosis combinar 1 μg de FHA y 0,5 μg de Prn con 50 μg de hidróxido de aluminio gel en PBS estéril. Permita que la aPV experimental mezclar en un rodillo del laboratorio durante 15 min a temperatura ambiente (RT). Luego, girar el tubo a 18.000 x g durante 5 min a 4 ° C. Quite el sobrenadante y resuspender el contenido en 1 mL de PBS estéril.
- Para los estudios B. pertussis , incluyen los siguientes grupos de vacunas: aPV y aPV + BcfA. Además, usar alumbre, antígenos de la vacuna solo (FHA y Prn) y ratones (no vacunados) ingenuo como grupos de control.
- En el vivero, creó la máquina de anestesia (figura 2).
Nota: Asegúrese de que hay niveles adecuados de oxígeno y el isoflurane en sus respectivos tanques antes de su uso. Pesar el frasco de limpiador de isoflurano y sustituir cuando su peso se incrementa en 50 g. - Bien limpiar el gabinete de seguridad biológica (BSC) y coloque la cámara de inducción limpia dentro del BSC. Conecte las líneas de anestesia y limpiador de la máquina de anestesia a la cámara de inducción. Abra el oxígeno tanque vía el regulador para oxígeno está fluyendo y establecer el nivel de hasta 1.5-2 L/min.
- Lugar de ratones de edad deseada (6-12 semanas) en la cámara de inducción. Encienda el isoflurano a 2.5-3% con el fin de anestesiar ligeramente los ratones. Monitorear los animales hasta que no se mueve en la cámara y su respiración se ha ralentizado.
- Probar el nivel de inducción del dedo del pie-pellizcando, observando cualquier movimiento reflexivo. Si no hay ninguno, los ratones están listos para inyectar.
Nota: En este experimento, la jaula entera de los animales fueron anestesiados al mismo tiempo. Uno puede elegir para anestesiar animales individualmente para inyección o para inyectar los animales sin anestesia. Cualquiera de estos métodos es apropiado. - Mientras tanto, prepare 1 mL jeringas de insulina (28 1/2) con 0,1 mL de vacuna cada. Cuando los animales son totalmente inducidos, sacar un animal de la cámara y coloque el ratón ventralmente sobre una almohadilla de toalla o banco.
- Administrar la vacuna por vía intramuscular. Con la jeringa en un ángulo de 45° y con el bisel hacia arriba, inserte la jeringa ~ 5 mm en el deltoides del ratón e inyectar la vacuna.
Nota: La Cierva cuarto/flanco puede ser utilizado como un sitio de la inyección en vez de los deltoides. - Después de la inyección, mantenga la aguja insertada en el músculo de s ~ 5-10. Una vez que se entrega el volumen, gire la jeringa 180 ° para que el bisel quede lejos para crear un sello y evitar la fuga de la vacuna. Luego, lentamente saque la aguja del sitio de la inyección.
- Volver el ratón a la jaula. Repita el procedimiento con todos los animales en el grupo designado.
- Apague el isoflurano y vaciado de la cámara de inducción con oxígeno antes de anestesiar la siguiente jaula de ratones.
- Monitorear los animales hasta que estén todos alerta y movimiento en la jaula. Volver a la jaula a la ubicación de la vivienda.
- Monitor animales cada 12 h post vacunación, hasta a las 48 h, los síntomas clínicos de morbilidad como capa áspera/desarreglado, lento andar o dificultad respiratoria. Si los síntomas persisten, consultar con el veterinario institucional y sacar los ratones del estudio, si es necesario.
- Cuatro semanas después de la inmunización inicial, aumento ratones de anestesiar y la administración de inyecciones intramusculares en el deltoides derecho del ratón con la misma formulación de la vacuna que recibió anteriormente.
- Otra vez, monitor animal síntomas clínicos. Animales de la casa para un adicional de 2 semanas y luego continuar con la infección.
2. crecimiento de las cepas B. pertussis y preparación del inóculo de la infección
- De las acciones congeladas [congeladas a-80 ° C en 15% de glicerol, congelado de crecimiento planctónico en los medios de comunicación de Stainer-Scholte (SS)12], raya a B. pertussis en placas de13 agar Bordet-Gengou (BG) suplementado con 10% desfibrinado ovejas sangre y estreptomicina de 100 μg/mL (10% BG + Sm) para la selección. Incubar la placa a 37 ° C durante 4 días.
- Seleccionar colonias individuales ~ 8-10 de las cepas de positivo de la placa y sembrar 3 mL de SS medio suplementado con 22,8 mM de L-cisteína, 3,6 mM sulfato de ferroso, niacina de 3,3 mM, 48,8 mM glutatión, ácido ascórbico de 227 mM, heptakis 1 mg/mL y estreptomicina μg/mL 100. Crece el cultivo a 37 ° C en un tambor de rodillo a 60 rpm durante 16-24 h.
- Al día siguiente, diluir el cultivo primario 1: 600, 1:300, 1:120, 1: 60, 1:30 y 1:15 en 3 mL de medio suplementado de la SS. Incubar el cultivo a 37 ° C en el tambor de rodillo a 60 rpm durante 16-24 h.
- Realizar mediciones de densidad óptica a 600 nm (OD600) para las culturas bacterianas. Usar cubetas del espectrofotómetro, diluir las culturas 1:10 mediante la adición de 0,1 mL de los cultivos líquidos a 0,9 mL de PBS estéril.
- Seleccione una cultura con OD600≈ 0.8-1.2. Calcular el volumen necesario para obtener 1 OD (figura 3). Girar por el volumen en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL a 6000 x g durante 5 min a 25 ° C. Aspirar el sobrenadante y resuspender el precipitado de células bacterianas en 1 mL de PBS estéril para obtener una densidad de 1 OD/mL [1-3 x 109 colonias formando unidades (UFC) / ml].
- A preparar un inóculo de ~ 5 x 105 1.5 x 106 UFC/ratón en 40-50 μL, vortex y en serie, diluir la solución bacteriana (del paso 2.5) 100-fold en 1 mL de PBS estéril para lograr ~ 1-3 x 107 UFC/mL (figura 4A). Transporte el inóculo para el vivero en el hielo.
3. modelo de infección Intranasal murino
- En el vivero, establecer las condiciones de oxígeno y anestesia como se describe en los pasos 1.3 y 1.4. Como se describe en el paso 1.5, colocar el ratón en la cámara para anestesiar. Monitorear los animales hasta que la anestesia surte efecto.
- Cuando los ratones son anestesiados, sacar un animal a la vez de la cámara de inducción. Tome el ratón por el pescuezo del tórax dorsal, detrás de los hombros y el cuello. Coloque el pie del ratón para acceder a la nariz.
- Utilizando una pipeta de 200 μL, poco a poco aplicar 40-50 μl del inóculo bacteriano a las narinas del ratón (20-25 μL en cada nare). Mantenga pulsado el ratón hasta que el inóculo todo ha sido inhalado por el animal. Si algunas de las burbujas de inóculo hacia fuera, recoja las burbujas y volver a infundir en las narinas. Entregar una cantidad igual de PBS estéril a un grupo de ratones como control negativo.
- Como en pasos 1.10 1.12, regresar los animales inoculados a su jaula y vigilar los animales hasta que estén alerta y en movimiento. Nuevamente la jaula su espacio de vivienda original en la bandeja. Limpie la cámara de inducción con el oxígeno para eliminar el isoflurano residual antes de anestesiar el siguiente conjunto de animales. Seguimiento de los animales para la infección después de 48 h.
- En el laboratorio, placa de diluciones seriadas del inóculo, en PBS estéril, para verificar la real UFC a los ratones. Placa de 0,1 mL de diluciones 10% BG + placas de Sm (figura 4A). Coloque las placas en la incubadora de 37 ° C y crecen durante 4 días. Contar y calcular las UFC de inóculo entregada al mouse (figura 4B).
4. recolección de tejido Animal después de la infección
- Preparar para la disección de ratón y cosecha de tejido.
- Esterilizar todas las herramientas (gruesos y finos tijeras, tijeras curvas, pinzas finas, pellet majas y Esparcidores de triángulo) necesarias para el procesamiento de los tejidos en un autoclave. Sello de las herramientas en bolsas de esterilización. Envuelva los homogeneizadores dounce de vidrio en aluminio y añadir cinta de autoclave para indicar esterilidad.
- Preparar agar placas 1 o 2 diasd la cosecha de tejido para que las placas sean solidificado antes de usar. Para B. pertussis, use 10% BG + placas etiqueta de SM para tabique nasal, tráquea y pulmón para cada ratón con las diluciones deseadas, determinado empíricamente para cada experimento.
- Llenar y etiquetar tubos de dilución UFC. Añadir 0,9 mL de PBS estéril en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL estéril basado en número de órganos al proceso y diluciones por órgano.
- Llenar y tubos para la recogida de tejido de la etiqueta:
- Tabique nasal y tráquea: llenar un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL estériles con 0,3 mL de estéril 1% caseína en PBS (Ca2 + y Mg2 +-libre). Almacenar a 4 ° C.
- Pulmones: Añadir 2 mL de caseína 1% estéril en PBS de un tubo cónico de 15 mL estéril y almacenar a 4 ° C. Para cosechar los pulmones para histología, añadir 2 mL de 10% formalina tamponada neutra (NBF) y almacenar a TA.
- Bazo: Añadir 3 mL de RPMI + 5% FBS a un tubo cónico de 15 mL. Almacenar a 4 ° C.
- Sangre: etiqueta dos conjuntos de tubos de microcentrífuga de 1,5 mL estériles, uno para la sangre entera y uno para suero.
- Etanol al 70% fresco debe estar preparado para llenar vasos y botellas para la disección del aerosol.
- Todos los materiales para el vivero en un carro de transporte en el día de la cosecha. Limpie el BSC y configurar la máquina de anestesia como en los pasos 1.3 y 1.4.
- Coloque los ratones para ser disecados en la sala de inducción y, con flujo de oxígeno, encender el isoflurano al 5% y espere hasta que los animales son inconscientes. Eliminar ratones uno a la vez y cervically dislocarse el animal como un método secundario para asegurar la muerte. Después de la dislocación cervical, eutanasia se debe confirmar por la ausencia de un ritmo respiratorio o ausencia del reflejo de retirada (prueba del pellizco del dedo del pie).
- Coloque el mouse, el lado ventral hacia arriba, en el tablero de disección y pin los brazos y piernas abiertas. Aerosol hacia abajo el cuerpo del ratón con etanol al 70%.
- Con unas pinzas, cierre la piel por debajo del abdomen, en el centro de la pelvis. Usando unas tijeras afiladas, haga un corte vertical hasta la mandíbula. Entonces, disecar la piel de la pared peritoneal empujando las dos capas separadas, utilizando pequeños movimientos con las tijeras cerradas. Lugar la piel a los lados de la canal para crear un campo despejado para la cosecha de órgano estéril.
- Sujete el peritoneo intacto por debajo de la caja torácica en o alrededor del hígado y corte abierto hacia la caja torácica. Exponer el tracto digestivo inferior y el colon hacia la izquierda revela el bazo. Con unas pinzas curvas, agarre el bazo y a disecar el tejido conectivo con tijeras. Lugar del bazo en un tubo cónico de 15 mL que contiene 3 mL de RPMI + 5% FBS y lugar el tubo en hielo.
- Utilice pinzas para estabilizar la caja torácica en el proceso del xiphoid y corte abierto el diafragma. Los pulmones deben desinflar y caer hacia la columna. Corte las costillas en los lados para retirar la placa de pecho.
- Aislar y retirar el lóbulo superior del pulmón derecho14, cortando las arterias y venas pulmonares. Coloque el lóbulo en un tubo cónico de 15 mL que contiene 10% NBF y coloque el tubo a temperatura ambiente durante al menos 24 h para fijar el tejido. Aislar los restantes lóbulos del pulmón derecho y pulmón izquierdo. Colocar los lóbulos en un tubo cónico de 15 mL que contiene 2 mL de caseína 1% en PBS y coloque en hielo.
- Después de cortar las arterias para disecar a los pulmones y las venas pulmonares, permiten la cavidad torácica se llenen de sangre como el ratón exsanguinates. Utilizando un pipetman 1 mL con punta, recoger la sangre y traslado al tubo de microcentrífuga de 1,5 mL previamente rotulado. Coloque el tubo en hielo.
- Entonces, desde el cuello, retire el tejido blando (glándulas parótidas, sublinguales y submaxilares y ganglios linfáticos) que cubre la tráquea. Abrir y quitar las membranas protectoras que rodean la tráquea. Con delicadeza, usando tijeras y pinzas finas, separar la tráquea el esófago y cualquier otro tejido conectivo desde la parte superior de la clavícula hacia abajo de la mandíbula.
- Con unas pinzas, aferrarse a la tráquea y cortar la tráquea en la parte superior de la clavícula. Tire la tráquea hacia abajo para maximizar la elasticidad y cortar la tráquea en la parte inferior de la mandíbula por encima de la laringe, aislar lo más posible (~ 1 cm). Colocar el órgano en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL previamente rotulado con 0,3 mL de caseína 1% en PBS y coloque en hielo.
- Liberar el ratón y pone ventralmente, con el ratón hacia el investigador para tener acceso a la nariz. Rociar la cabeza del ratón con etanol al 70% y, utilizando las manos, agarre el mouse directamente detrás del cráneo.
- Con unas tijeras, corte la carne suave del hocico, partiendo desde la parte inferior de la nariz y moviéndose hacia arriba. Además, quitar la piel, la piel y el bigotes alrededor de la nariz. Luego, con pinzas y tijeras curvas, inserte las puntas de tijeras nares con las curvas puntas hacia fuera y corte las fosas nasales hacia los ojos, creando una formación V.
- Con unas pinzas finas, recoger el tabique nasal y el tejido blando dentro de la formación creada. Colocar el tejido en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL previamente rotulado con 0,3 mL de caseína 1% en PBS y coloque en hielo.
- Deseche el cadáver en una bolsa de biohazard. Antes de disecar el animal siguiente, enjuague los instrumentos con agua desionizada y luego colocar en un vaso de precipitado con etanol al 70%. Quitar las herramientas, sacuda el exceso etanol y luego proceder con la disección siguiente
- Diseccionar cada ratón siguiendo pasos 4.3-4.14.
- Proceso de los tejidos como se describe a continuación.
5. proceso de bazo
- Para disociar los bazos, colocar un colador celular de 70 μm en un plato de cultivo de tejidos de 60 mm. Vierta el bazo y el acompañamiento de los medios de comunicación en el filtro, con el émbolo de una jeringa de 3 mL. Triturar cuidadosamente el órgano hasta que esté totalmente disociado y filtrada a través de tamiz de la célula.
- Enjuague el filtro con 3 mL de RPMI + 5% FBS en el plato de cultivo de tejidos. Recoge la suspensión de células y colocar en el tubo original de 15 mL. Centrifugar los tubos a 450 x g durante 5 min a 4 ° C para que sedimenten las células.
- Aspirar o decantar el sobrenadante y lisar los glóbulos rojos por Resuspender el sedimento en 2 mL de tampón de potasio (ACK) de cloruro de amonio (cloruro de amonio 150 mM, 10 mM bicarbonato de potasio, 0.1 mM EDTA de sodio). Incubar 3 min a temperatura ambiente (25 ° C).
- Llenar los tubos de hasta 8 mL de RPMI + 5% FBS y centrifugar los tubos a 450 x g durante 5 min a 4° C. Aspirar o decantar el sobrenadante. Resuspender el pellet celular en 5 mL de RPMI + 5% FBS y cuenta los esplenocitos usando un hemocitómetro y microscopio.
- Calcular el volumen de células necesarias para estimular 2.5 x 106 células por pocillo. En una placa de 48 pozos, sembrar las células en 0,5 mL de medio de T-cell (RPMI 1640 + 10% FBS, 10 μg/mL gentamicina y 50 μm β-mercaptoetanol) por pozo.
- Basado en el cálculo anterior, coloque el volumen requerido de la suspensión de células en un tubo nuevo y pellets-células a 450 x g durante 5 min a 4 ° C.
- Resuspender el precipitado en el volumen requerido de los medios T-cell. Para un modelo de infección por B. pertussis , la prueba la respuesta del cytokine antígeno-específica a antígenos de la vacuna: pertactin (Prn) y la adherencia de la hemaglutinina filamentosa (FHA). Por lo tanto, son necesarios 3 tratamientos: 1) sin estimulación (NS, como control negativo), 2) Prn y 3) FHA. Para el análisis, 7.5 x 106 células en 1,5 mL de medio de células T es necesario (2.5 x 106 células / mL 0,5).
- Alícuota 0,5 mL de la suspensión de células en una placa de 48 pozos.
- Para estimular las células, mezcla de antígenos en 2 veces la concentración deseada en los medios T-cell. Concentraciones finales de Prn y FHA = 1 μg/mL y 0,5 μg/mL, respectivamente. Por lo tanto, se mezclan 2 μg/mL Prn o 1 FHA μg/mL en 0.5 mL. Entonces, alícuota 0,5 mL del medio de estimulación en cada uno señalado, diluyendo el tratamiento el antígeno a 1 x en un volumen final de 1 mL en cada pocillo.
- Incubar las placas a 37 ° C en 5% CO2. Recoger sobrenadante en el día 7 y alícuota 0,5 mL de los sobrenadantes en tubos de microcentrífuga previamente etiquetados. Almacenar las muestras en a-20 ° C hasta que esté listo para probar citocinas específicas de antígeno por ELISA (figura 6).
6. proceso de pulmones
- Transferencia de los pulmones (en 2 mL de caseína 1% en PBS) en un homogeneizador de dounce estéril, de 15 mL. Mortero de uso para homogeneizar el tejido. Disociar hasta que no queden las partículas grandes de tejido. Coloque la suspensión homogeneizada en el tubo original de 15 mL.
- Quitar un 0,3 mL de alícuota de UFC de la galjanoplastia y centrifugar el homogeneizado a 450 x g durante 5 min a 4 ° C. Recoger y alícuota tubos el sobrenadante en alícuotas de 0.5 mL en microcentrífuga previamente etiquetado. Almacenar las muestras en a-20 ° C hasta el análisis de citoquinas mediante ELISA.
- Preparar diluciones solicitadas por dilución en serie de 0,1 mL de la suspensión de pulmón homogeneizado en tubos de dilución (0,9 mL de PBS estéril). Placa de 0,1 mL de diluciones solicitadas empíricamente sobre previamente rotulado 10% BG + Sm placas y propagación utilizando triángulo estéril esparcidor.
- Incubar las placas a 37 ° C en aire de la habitación para 4 días.
- Contar y calcular las UFC/pulmón (figura 6). Brevemente, multiplicar a números de UFC recuperados por el factor de dilución de la placa, luego también por el volumen total en el que fue procesado el órgano. Los cálculos de UFC son luego transformados en valores de10 Log para cada animal y graficar.
- Placas con 30-300 colonias se cuentan fácilmente y con precisión. No utilizar placas con menos de 6 colonias para cálculos, ya que tales números bajos Colonia introducen error15. Para obtener un límite inferior de detección, el volumen total en el que un órgano se homogeneizó es dividido por el volumen utilizado a punto en un plato de homogeneizado sin diluir (por ej., 2 mL de volumen total dividido por 0,1 mL del homogeneizado sin diluir es igual al límite inferior de 20 UFC detectable).
7. proceso de Tabique Nasal y la tráquea
- Homogeneizar el tejido en 0.3 mL de 1% PBS/caseína con bolita de mano inalámbricos homogeneizadores motor. Homogeneizar el tejido de 0.5-1 min hasta que el tejido es en gran medida disociado. Las bacterias se deben arrojar en la suspensión.
- Preparar 10 solicitadas x diluciones por dilución seriada de 0,1 mL de la suspensión homogeneizada en los tubos de diluciones que contiene 0,9 mL de PBS estéril. Punto 0.1 mL de cada dilución en el etiquetado BG 10% + Sm placas y extender la suspensión usando un esparcidor de triángulo que ha sido esterilizado por un lavado de etanol al 70% y la llama.
- Incubar las placas a 37 ° C en aire de la habitación para 4 días.
- Contar y calcular las UFC/órgano como en el paso 6.5 (figura 6). Para obtener un límite inferior de detección, el volumen total en el que un órgano se homogeneizó es dividido por el volumen utilizado a punto en una placa de homogeneizado sin diluir (e.g., 0,3 mL de volumen total dividido por 0,1 mL de igual a igual sin diluir el límite inferior de 3 UFC detecta ble).
8. procesamiento de sangre
- Centrifugar los tubos que contienen sangre aislada a 18.000 x g durante 30 min a 4 ° C para que sedimenten los glóbulos rojos.
- Con cuidado sacar el suero sobrenadante y pipeta en un tubo de microcentrífuga de suero previamente etiquetados. Guarde los tubos en-20 ° C hasta que esté listo para su posterior análisis aguas abajo (es decir., ELISA Ig total y específico).
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Representative Results
El modelo descrito muestra un método para evaluar la eficacia de la vacuna y las respuestas inmunitarias durante interacciones huésped-patógeno. La figura 1 muestra el calendario de vacuna representante para inmunizar e infectar ratones y tejidos para el análisis de la cosecha. Figura 2 se muestra la configuración del sistema de anestesia empleado para inducir a ratones, permitiendo a los investigadores ofrecer vacunas y el inoculo bacteriano. La figura 3 muestra el ejemplo OD600 mediciones y cálculos para lograr una suspensión bacteriana de 1 OD para preparar el inóculo bacteriano diluido 100-fold a ratones. Figura 4 muestra la preparación del inóculo utilizada para la infección, el esquema de la galjanoplastia de diluciones seriadas y los cálculos del ejemplo utilizados para enumerar UFC entregado a ratones basadas en diluciones seriadas de la galjanoplastia. La figura 5 muestra las respuestas de memoria específica de antígeno provocadas tras siete días de estimulación con el antígeno de la vacuna contra la FHA. Inmunizar el bazo las células del grupo de vacunas de combinación, alumbre/FHA/BcfA, producido IFNγ y la IL-17, mientras que perceptiblemente disminuyendo IL-5. Este efecto promueve una polarización Th1/Th17 de la respuesta inmune durante la infección por B. pertussis . Niveles de citoquinas de fondo fueron producidos por la incubación de células de bazo inmunizados con medios de comunicación solo, indicando que las citocinas detectadas fueron las respuestas de memoria a la inmunización (datos no mostrados). Figura 6 muestra un ejemplo de recuento de CFU de bacterias de los tejidos de las vías respiratorias de un ratón inmunizado, usando diluciones seriadas de B. pertussis homogenados de tejido plateado 10% BG + Sm placas. Cuentas crudas se multiplicaron por el volumen de dilución factor y total del tejido del lisado y los datos fueron el registro transformado. Unidades formadoras de colonias de animales inmunizados entonces se comparan a los animales no inmunizados (ingenua) para determinar el efecto protector de la vacuna.
Figura 1 : Calendario de vacuna representante. Ratones inmunizados en el día 0 y luego potenciados ~ 4 semanas más tarde (d28) con la aPV apropiada. La infección de los ratones con B. pertussis ocurre ~ 2 semanas (d42) después impulsar ratones. Después de la infección los animales se matan en inoculación después de varios días (d43-56). Tejido y la sangre se recoge para el análisis de aguas abajo (e.g., UFC (enumeración), citoquinas y anticuerpos ELISA). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: configuración de la máquina de anestesia. Es un vaporizador de anestesia con sistema de cámara y carroñero de inducción conectado (dentro de la cabina de seguridad biológica). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Preparación de la suspensión bacteriana de 1 OD600 . Se obtuvieron valores de600 OD de primario diluido B. pertussis culturas. Un cultivo en fase logarítmica se utilizó para calcular el volumen necesario para obtener una cultura 1 cultura de OD600 para la infección. Brevemente, un OD600 de 1 fue dividido por el calculado OD600 de la cultura deseada para obtener un volumen de 1 OD a utilizarse para la infección del mismo. Brevemente, una OD600 de 1 fue dividido por la OD600 calculado de la cultura deseada para obtener un volumen de 1 OD a utilizarse para la infección del mismo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Cálculo del inóculo intranasal entregado. (A) esquema de dilución seriada de inóculo de infección que es diluido a 10-410-5y 10-6. Estas diluciones son plateadas 10% BG + Sm, se incuba durante 4 días a 37 ° C y entonces contadas. (B) cuenta de 10-410-5y 10-6 diluciones se utiliza entonces para calcular UFC intranasal entregado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 : Producción de citoquinas por las células de bazo inmunizados con FHA, alumbre/FHA, BcfA/FHA y BcfA/Alum/FHA. Disociada de las células fueron cultivadas con FHA durante 7 días. Sobrenadantes fueron probados por sandwich ELISA para (A) IFN-γ, (B) IL-17 y (C) IL-5. Barras de errores se expresaron como desviación estándar de la media de cada grupo, n = 5 por grupo. p < 0.001. La figura es una adaptación de una anterior publicación10. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6 : B. pertussis UFC y cálculos de tejido recolectado de los ratones. (A) UFC B. pertussis de tejido de ratón homogeneizada. diluciones seriadas de 0,1 mL se incuban a 37 ° C durante 4 días. (B) cálculos basados en unidades formadoras de colonias de tráquea homogeneizada. Unidades formadoras de colonias fueron multiplicadas por la dilución respectiva y luego multiplicado por 10 para lograr unidades formadoras de colonias por mL. Para obtener las UFC por órgano, la UFC por mL se multiplica por el volumen total en el que el órgano fue homogeneizada (0,3 mL). La UFC por órgano era entonces registro transformado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El protocolo completo que se describe aquí para estudiar la inmunidad inducida por la vacuna a la infección por B. pertussis también permitirá la evaluación de las respuestas del anfitrión a una variedad de otros patógenos. El protocolo describe métodos para entregar vacunas, determinar el siguiente de eficacia de vacuna desafío patógeno y disección paralela de la función inmune. En la adaptación del protocolo para el estudio de otros patógenos, varios parámetros tendría que modificarse. Éstos incluyen, pero no se limitan a, el modo de anestesia animal, la composición de la vacuna, dosis y vía de administración. Además, la dosis y vía de administración de impugnada patógeno de interés, tejido seleccionado para la cosecha y posterior evaluación de las respuestas inmunes son factores que pueden modificarse para el patógeno, la enfermedad de interés.
El modelo murino de infección por B. pertussis es ampliamente utilizado y es un excelente modelo para la patogenesia y la vacunología estudios16,17,18,19,20. Modelos murinos muestran muchas similitudes con la infección humana, incluyendo: i) las bacterias se limitan al tracto respiratorio y se multiplican rápidamente, animales ii) jóvenes Mostrar comparativamente graves infecciones, iii) la buena correspondencia entre las vacunas que protegen los niños contra la tos ferina y los que protegen a ratones contra la infección y iv) B. pertussis-anticuerpos y células T específicas median la inmunidad natural e inducida por la vacuna protectora21,22, 23 , 24. por lo tanto, el modelo murino permite el estudio de los efectos de inmunización sobre la remoción bacteriana25. Otra ventaja de usar ratones a las infecciones de B. pertussis de modelo es la disponibilidad de knockout genéticamente modificado y animales transgénicos para estudiar jugadores importantes en la respuesta inmune inducida por la vacuna19,26.
La mayoría de las vacunas se administra por vía parenteral, especialmente a través de la vía intramuscular (i.m.). Esta ruta es preferida porque produce inmunidad sistémica con mínima reactogenicidad local27,28,29. Alternativas a las inyecciones intramusculares son subcutánea (s.c.) o intraperitoneal (i.p.) entrega, que también inducen respuestas sistémicas. Vías subcutáneas también están atractivas, ya que hay una gran población de residente antígeno que presenta las células (APC) dentro de la dermis con acceso a los sistemas linfático y vascular30. Sin embargo, entrega intradérmica no se ha explorado para la vacuna contra la tos ferina. Intraperitoneal de aPV experimental genera inmunidad similar a vacunación intramuscular31 y es una ruta de inyección confiable para estudios murinas, aunque impráctico para el uso clínico.
Este protocolo utiliza la ruta de inmunización i.m., que proporciona protección en los pulmones, pero no la nasofaringe32. Estudios recientes han demostrado que una vacuna intranasal (i.n.) promueve una respuesta inmune local y mucosa que protege la parte superior y baja de vías respiratorias, particularmente la nariz, que sirve como un reservorio de bacterias que pueden transmitirse posteriormente a otro cuenta con33. Además, i.n. inmunización ha demostrado generar memoria residente de tejido que no es generada por la inmunización sistémica33,34. Por lo tanto, la elección de la vía de administración de la vacuna depende del tipo de vacuna y la respuesta inmunitaria para proteger contra la enfermedad.
La ruta intranasal de entrega bacteriana que se describe en este protocolo es un método ampliamente usado para patógenos respiratorios que con seguridad y constantemente ofrece un inóculo bacteriano directamente en las vías respiratorias de los ratones anestesiados. Nuestro protocolo utiliza una dosis de gran volumen (40-50 μL) que se inhala en la nasofaringe y recorridos en las vías respiratorias inferiores. Un inóculo de bajo volumen (10-20 μl) coloniza la nasofaringe, pero la colonización de los pulmones será mínimo35. Sin embargo, la inhalación de B. pertussis-que contiene gotitas de aire constituye el modo natural de la infección de los individuos y la transmisión. Esta vía de administración se ha utilizado en varios modelos animales36,37. Para alcanzar niveles comparables de infección a la directa inoculación de i.n., considerablemente altas concentraciones de inóculo bacteriano (109-1011 unidades formadoras de colonias/mL) y tiempo de entrega son necesarios38.
Para establecer la colonización del tracto respiratorio del ratón, este protocolo utiliza bacterias frescas, cultivadas en cultivo líquido para asegurarse de que utiliza para la inoculación de bacterias en la fase virulenta y se replican en la etapa de registro. Los experimentadores también pueden utilizar un inóculo de existencias previamente valoradas, congeladas. Esto permite un conocimiento de la UFC se administra al ratón. Sin embargo, las bacterias en los inóculos pueden ser en la fase no virulenta, que puede reducir la eficiencia de las vías respiratorias colonización39. Después de la infección, el inóculo se platea para determinar bacterias UFC entregada al mouse. Los investigadores también pueden optar por placa el inóculo antes de la infección en vivo para asegurar la viabilidad de las bacterias y confirmar la dosis del inóculo.
Después de la infección, se enumeran los unidades formadoras de colonias bacterianas de tejido aislado de ratones sacrificados en un punto predeterminado de homogeneización. Una desventaja a este método es su incapacidad para seguir cinéticamente patógeno UFC para un conjunto específico de ratones. Los investigadores deben utilizar varios grupos de animales sacrificados en diferentes puntos de tiempo para examinar restricción bacteriana inducida por la vacuna. El número de ratones de cada experimento variará dependiendo del número de puntos de tiempo para examinar y el tamaño del efecto deseado. Esto puede introducir mayor variación biológica. Integración de un gen reportero bioluminiscente o fluorescente en el patógeno de interés permitirá la monitorización no invasiva de crecimiento y difusión en vivo a través del curso de infección35. Este método reduce la variación biológica y reduce al mínimo el número necesario de animales de experimentación, ya que se obtienen datos longitudinales del mismo grupo de animales.
El protocolo de disociación y la homogeneización de tejido empleado aquí para los tejidos de las vías respiratorias también es aplicable para la enumeración de colonias de otros tejidos sólidos como el hígado, riñón, intestino o vejiga para interrogar a sitios de infección y diseminación de patógenos de interés.
Junto con la enumeración de la UFC, este protocolo permite la caracterización de la respuesta inmune inducida por la vacunación y la infección natural. Específicamente, cuantificación de citocinas producido sistémica y localmente permite la determinación de perfiles inmunes eficaces resultante de la inmunización. Las citoquinas son inmunomoduladores que promoción la afluencia celular a los tejidos afectados y la activación de la inmunidad celular, así como proporcionan ayuda para la generación de las respuestas humorales10,40,41. Mediante este protocolo, citoquinas producidas en diversos compartimientos de tejido, como el pulmón y el bazo, se detectan. Aunque no se muestra aquí, el protocolo de estimulación también es aplicable para la evaluación de las respuestas en los nódulos linfáticos drenantes.
Análisis de ELISA permite la detección y cuantificación de citoquinas en el sobrenadante de los medios de comunicación o suspensiones mixtas (es decir., homogenados o suero), obtención de información a nivel poblacional y caracterización de las respuestas del cytokine del antígeno específico de un mezclado de la célula cultura en horarios designados. En contraste, los métodos como ELISPOT o citometría de flujo permite la evaluación del número de células que producen un analito y el nivel de expresión por celular42,43. Aunque no se describe aquí, estos métodos también son aplicables a la detección de las células B antígeno específicas. La combinación de análisis inmunológicos y enumeración de UFC proporcionan un cuadro completo de la respuesta a la inmunización.
Otros análisis que pueden ser realizadas mediante este protocolo de infección incluyen epigenéticos o análisis transcriptómico al ADN y el ARN se obtiene de los tejidos de interés44. Así, con la consideración de la composición de la vacuna adecuada inmunización y ruta de entrega de patógeno, este protocolo es versátil en su aplicación y fácilmente adaptado para varios modelos de infección. Estas técnicas también son aplicables a las enfermedades no infecciosas (por ejemplo, cáncer, esclerosis múltiple, asma, enfermedades autoinmunes) donde se utilizan las vacunas como una modalidad terapéutica.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por los fondos de 1R01AI125560-01 y puesta en marcha de la Universidad Estatal de Ohio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2L induction chamber | Vet Equip | 941444 | |
| Fluriso | Vet One | V1 501017 | any brand is appropriate |
| Bordet Gengou Agar Base | BD bioscience | 248200 | |
| Casein | Sigma | C-7078 | |
| Casamino acids | VWR | J851-500G | Strainer Scholte (SS) media components |
| L-Glutamic acid | Research Products Int | G36020-500 | |
| L-Proline | Research Products Int | P50200-500 | |
| Sodium Chloride | Fisher | BP358-10 | |
| Potassium Phosphate monobasic | Fisher | BP362-1 | |
| Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | |
| Magnesium Chloride hexahydrate | Fisher | M2670-500G | |
| Calcium Chloride | Fisher | C75-500 | |
| Tris base | Fisher | BP153-1 | |
| L-cysteine HCl | Fisher | BP376-100 | SS media suplements |
| Ferrous Sulfate heptahydrate | Sigma | F-7002 | |
| Niacin | Research Products Int | N20080-100 | |
| Glutathione | Research Products Int | G22010-25 | |
| Ascorbic acid | Research Products Int | A50040-500 | |
| RPMI 1640 | ThermoFisher Scientific | 11875093 | |
| FBS | Sigma | F2442-500mL | any US source, non-heat inactivated |
| gentamicin | ThermoFisher Scientific | 15710064 | |
| B-mercaptoethanol | Fisher | BP176-100 | |
| 15mL dounce tissue grinder | Wheaton | 357544 | any similar brand is appropriate |
| Cordless Hand Homogenizer | Kontes/Sigma | Z359971-1EA | any similar brand is appropriate |
| Instruments - scissors, curve scissors, forceps, fine forceps, triangle spreaders | any brand is appropriate | ||
| 3mL syringes | BD bioscience | 309657 | |
| 15mL conical tubes | Fisher | 339651 | |
| 1.5mL microfuge tubes | Denville | C2170 | |
| 70um cell strainers | Fisher | 22363548 | |
| 60mm plates | ThermoFisher Scientific | 130181 | |
| 48-well tissue culture plates | ThermoFisher Scientific | 08-772-1C | |
| 1mL insulin syringe 28G1/2 | Fisher Scientific/Excel Int. | 14-841-31 | |
| Mouse IFN-gamma ELISA Ready-SET-Go! Kit | Invitrogen / eBioscience | 50-173-21 | |
| Mouse IL-17 ELISA Ready-SET-Go! Kit | Invitrogen / eBioscience | 50-173-77 | |
| Mouse IL-5 ELISA Ready-SET-Go! Kit | Invitrogen / eBioscience | 50-172-09 |
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