Summary
여기 선물이 vivo에서 백신의 평가 위한 우아한 프로토콜 효과 호스트 면역 반응. 이 프로토콜은 바이러스 성, 세균성, 백신 모델 또는 기생 병원 균에 대 한 적응 될 수 있다.
Abstract
백신은 20번째 세기 의료 마블. 그들은 극적으로 병 적 상태와 사망률 감소는 전염 성 질환에 의해 발생 하 고 전세계 평균 수명이 눈에 띄는 증가에 기여. 그럼에도 불구 하 고, 백신 효능을 결정 도전 남아 있습니다. 증거를 신흥 Bordetella 백 일 해 (B. 백 일 해)에 대 한 현재 acellular 백신 (aPV) 차선 면역 유도 나왔다. 따라서, 주요 과제는 전체 세포 백신 (wPV)의 불리 한 부작용 없이 보호 면역을 유도 하는 차세대 백신을 디자인 하 고 있다. 여기는 우리가 유망, 소설 보조 보호 Th1/Th17 표현 형에 대 한 면역 응답을 왜곡 하 고 murine 호흡기에서 B. 백 도전 더 나은 정리를 촉진의 효능을 테스트 하는 데 사용 하는 프로토콜에 설명 합니다. 이 문서에서는 마우스 예방접종, 세균 접종, 조직 수확, 및 면역 반응의 분석을 위한 프로토콜을 설명 합니다. 우리의 모델 내에서이 메서드를 사용 하 여 우리 성공적으로 유망한, 다음-세대 acellular 백 일 해 백신으로 elicited 중요 한 메커니즘을 해명 했습니다. 이 메서드는 백신 효능을 결정 하기 위하여 어떤 전염병 모델에 적용할 수 있습니다.
Introduction
백신 대표, 20 세기의 가장 큰 공중 보건 업적 중 아직 우리 여전히 완전히 이해가 안는 성공적인 백신 보호 면역을 자극 하는 메커니즘. 분자 서명 식별 (예., 세포 활성화 마커, 확장, 세포의 유전자 발현의 패턴) 유도 후 예방 접종을 예측 하는 효과 생성에 대 한 정보 제공 면역 응답입니다. 호스트 병원 체 응답의 복잡성은 체 외에서 세포 문화 시스템1을 사용 하 여 적절 하 게 복제 수 없습니다. Vivo에서 백신 모델은 수반 호스트 내의 여러 면역 세포 유형 평가 하도록 설계 되었습니다. 백신 항 원 처리 및 프레 젠 테이 션, 차동 cytokine 분 비 및 면역 세포의 확장을 특성화 할 때 이점을 제공 합니다. 여기에 설명 된 프로토콜 체계 및 면역 반응의 평가 관심의 조직에 병원 체 부담의 정량화를 통해 백신 효능을 결정 하는 자세한 방법을 제공 합니다. 여기에 제공 된 예제에서는 병원 체 Bordetella 백 일 해 (B. 백 일 해)에 대 한 실험 백신의 효능을 테스트 합니다.
B. 백 일 해 는 호흡기 질환 백 (백 일 해)2,3의 etiological 대리인은 그램 음성 박테리아. 전송, 식민지, 및 질병에 감염 된 개인 (증상 또는 무 증상) 리드와 접촉을 닫습니다. 중요 한 글로벌 백신 범위4에 불구 하 고 백 일 해 전 세계의 많은 국가에서 불거진 질병 이라고 여겨진다 고 예방 가능한 유년기 죽음5,6,7, 의 주요 원인입니다. 8. 2015 년에 B. 백 일 해 및 백 일 해에 포함 된 알레르기의 국가 학회 및 감염 증 (NIAID) 신흥 전염병 병원 체 목록, 수 여 하는 더 나은 백신의 개발에 대 한 필요성을 강조 수명이 긴 보호 면역입니다.
현재, 백 일 해의 부활을 제어 하는 조사의 활성 영역 소설 adjuvants 및 항 원 면역 반응 elicited 전체 셀에 의해 모방의 최적의 조합으로 다음-세대 acellular 백 일 해 백신 (aPV)의 개발은 백 일 해 백신 (wPV)9. 설명 된 프로토콜을 사용 하 여, 우리 최근 보고는 현재 FDA 승인 aPV 소설 보조 Bordetella 식민 요소 A의 추가 의해 (BcfA)의 수정 B. 백 일 해 세균 부하에서의 보다 효율적인 감소에 있는 결과 마우스 폐10,11. 이 보호는 더 보호 Th1/Th17 면역 프로필10졸업생 유도 Th1/Th2 면역 응답의 기울이기 동행 했다. 이 프로토콜은 상세 하 고 포괄적인, 호스트와 병원 체의 다양 한 면역 반응의 동시 평가 통해 최대한 정보를 얻을 수 있도록.
여기에 설명 된 프로토콜 최적의 호스트 면역 응답을 보장 하기 위해 그림 1에 나온 대표적인 백신 일정을 따릅니다.
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Protocol
모든 살아있는 동물 실험 프로토콜 IACUC 지침에 따라 오하이오 주립 대학 IACUC에 의해 승인에 따라 실시 했다. C57BL/6 마우스는 모든 예방접종 및 감염에서 사용 되었다. 둘 다 남성과 여성 쥐 NIH 지침에 따라 각 그룹에 사용 됩니다. 그룹 당 동물의 수는 실험 그룹 사이 결과 예측된 차이에 따라 전력 계산에 의해 결정 되었다. 예를 들어 그룹 당 8 마우스 α에서 80% 파워를 얻을 것입니다 (2 면) 2 표본 t-0.05 = 1.33 표준 편차 (SDs)의 관심의 결과에 차이 검출 하는 시험.
1입니다. 마우스의 면역
- 염 분 등 무 균 생리 버퍼에 마스터 백신 믹스 준비 또는 DPS.
참고: 혼합에 있는 총 볼륨 보다는 전체 그룹의 면역에 필요한 10%를 포함 해야 합니다. 백신 성분의 농도 아래 단계 1.1.1와 1.1.2에에서 자세히 나와 있습니다. 얼음 물고기에 항목을 전송 합니다.- B. 백 일 해 연구에 대 한 다음 백신 그룹 포함: aPV aPV + BcfA와. 또한, 사용 하 여 졸업생, 백신 항 원 혼자 (FHA, 및 Prn), 고 순 진 (예방 접종 비) 마우스 제어 그룹으로.
참고: aPV는 1/5번째 파상풍 사망 toxoid, 사망 toxoid 감소 디프테리아, 백 일 해 사망 toxoid (PT), filamentous 조류 (FHA), 및 pertactin의 구성 하는 FDA 승인 aPV의 인간의 복용량 (Prn) 알루미늄 염을 흡착. 현재 백 aPV의 한 인간의 복용량은 0.5 mL, 그러므로, 복용량의 1/5일 0.1 mL 이다. APV + BcfA 볼륨은 0.1 mL (1/5번째 인간의 복용량) aPV + BcfA의 0.046 mL (30 µ g) 마우스 당. 하나의 근육을 안전 하 게 전달 될 수 있는 최대 볼륨 0.1 mL 이다. 때문에 aPV + BcfA 백신 볼륨 0.1 mL 보다 크면, 백신 안전 하 게 관리 하기 위하여 대략 동등 하 게, 분할 두 어깨에 전달 해야 합니다. - 실험 백신을 준비 하려면 한 복용량에 대 한 결합 FHA의 1 µ g 및 0.5 µ g Prn의 살 균 PBS에 알루미늄 수산화 젤의 50 µ g. 실 온 (RT)에서 15 분 동안 실험실 롤러에 혼합 하는 실험 aPV을 허용 합니다. 이후에, 4 ° c.에서 5 분에 대 한 18000 x g에서 튜브를 회전 상쾌한을 제거 하 고 살 균 PBS의 1 mL에 내용을 resuspend.
- B. 백 일 해 연구에 대 한 다음 백신 그룹 포함: aPV aPV + BcfA와. 또한, 사용 하 여 졸업생, 백신 항 원 혼자 (FHA, 및 Prn), 고 순 진 (예방 접종 비) 마우스 제어 그룹으로.
- 물고기, 마 취 기계 (그림 2)를 설정 합니다.
주: 산소와 isoflurane 사용 하기 전에 그들의 각각 탱크에서의 적절 한 수준이 있다 확인 하십시오. Isoflurane 폐품 용기 무게 고 무게 50 g 증가 하면 대체 합니다. - 철저 하 게 생물 안전 캐비닛 (BSC)를 청소 하 고 BSC 내부 깨끗 한 유도 챔버를 놓습니다. 마 취 기계에서 유도 챔버 마 취 및 폐품 라인을 연결 합니다. 산소 탱크를 통해 산소를 보장 하기 위해 레 귤 레이 터 흐르는 열고 수준을 1.5-2 L/min으로 설정 합니다.
- 유도 챔버로 원하는 시대 (6-12 주)의 마우스를 놓습니다. 가볍게 쥐를 anesthetize 위해 isoflurane 2.5-3%로 설정. 그들은 챔버에 이동 하지 않는 그들의 호흡을 감속 했다 때까지 동물을 모니터링 합니다.
- 발가락-곤란, 어떤 반사 운동에 대 한 관찰에 의해 유도의 수준을 테스트 합니다. None 이면, 생쥐 주입 준비가 되어 있습니다.
참고:이 실험에서 동물의 전체 케이지 했다 마 취 한 번에. 하나 anesthetize 주입에 대 한 개별적으로 동물 또는 동물 마 취 없이 주사를 선택할 수 있습니다. 이러한 방법 중 하나는 적절 합니다. - 한편, 각 백신의 0.1 mL와 인슐린 주사기 (28G 1/2) 1 mL를 준비 합니다. 때 동물 완벽 하 게 유도 하 고, 상공에서 한 동물을 제거 하 고 수건 또는 벤치 패드 마우스 ventrally 누워.
- 피하는 백신을 관리 합니다. 45 ° 각도로 주사기와 경사 직면 하 고, 마우스의 삼각 근에 ~ 5 mm 주사기를 삽입 하 고 백신 주사.
참고: 뒷 다리 분기/측면 사출 사이트는 삼각 근 대신으로 사용할 수 있습니다. - 주입 후 5 ~ 10 s에 대 한 근육에 삽입 된 바늘을 유지. 일단 볼륨을 전달 경사 얼굴 물개를 만들고 백신의 누설 방지를 멀리 있도록 180 °에서 주사기를 회전 합니다. 그런 다음, 천천히 주입 사이트 바늘 당겨.
- 감 금 소에는 마우스를 반환 합니다. 지정 된 그룹에 있는 모든 동물을 가진 절차를 반복 합니다.
- isoflurane 끄고 마우스의 다음 케이지 마비 전에 산소 유도 챔버를 플러시.
- 그들은 감 금 소에 모두 경고 하 고 이동 때까지 동물을 모니터링 합니다. 케이지 주택 위치를 반환 합니다.
- 모니터 동물 마다 12 h 게시 예방 접종, 최대 48 h, 거친/빗질 코트 같은 병의 임상 증상에 대 한 느린 걸음 걸이, 또는 호흡을 일했다. 증상이 계속 되 면, 기관 수 의사 들과 상의 하 고 필요 하다 면 연구에서 쥐를 제거 합니다.
- 초기 접종 후 4 주 마비와 같은 백신 정립 이전 받은 마우스의 오른쪽 삼각 근에 근육 주사를 관리 하 여 마우스 향상.
- 다시 말하지만, 어떤 임상 증상에 대 한 동물을 모니터링 합니다. 추가 2 주에 대 한 동물을 집 고 감염.
2. B. 백 긴장 및 준비의 감염 Inoculum의 성장
- [Cryopreserved-80 ° c에서 15% 글리세롤, 염색기 Scholte (SS) 미디어12planktonic 성장에서 냉동] 냉동된 주식에서 10 %defibrinated 양 Bordet-Gengou (BG) 한 천13 접시에 B. 백 일 해 에 밖으로 행진 보충 혈액 그리고 선택 위한 100 µ g/mL 스 (10 %BG + Sm). 4 일 동안 37 ° C에서 접시를 품 어.
- 접시에서 strain(s)의 8 ~ 10 개별 식민지를 선택 하 고 SS 미디어와 22.8 m m L-시스테인, 3.6 m m 철 황산 염, 3.3 m m 니코틴산, 48.8 m m 티, 227 mM ascorbic 산, 1 mg/mL heptakis, 100 µ g/mL 스 보충의 3 mL 접종. 16-24 h에 대 한 60 rpm 롤러 드럼에서 37 ° C에서 문화를 성장.
- 다음 날, 희석 주 문화 1:600, 1:300, 1:120, 1:60, 1:30, 및 보충된 SS 미디어의 3 mL에 1시 15분. 16-24 h에 대 한 60 rpm 롤러 드럼에서 37 ° C에서 문화를 품 어.
- 600에서 광학 밀도 측정을 수행 세균성 문화에 대 한 nm (OD600). 분 광 광도 계 큐 벳을 사용 하 여 살 균 PBS의 0.9 ml 0.1 mL 액체 문화를 추가 하 여 문화 1시 10분 희석.
- OD600≈ 0.8-1.2 문화를 선택 합니다. (그림 3) 1 세를 얻는 데 필요한 볼륨을 계산 합니다. 6000 x g 25 ° c.에서 5 분에 1.5 mL microcentrifuge 관에서 볼륨 아래로 회전 상쾌한 발음 하 고 세균성 세포 펠 릿 1 세/mL의 조밀도를 살 균 PBS의 1 mL에 resuspend [1-3 10 배9 콜로 니 형성 단위 (CFU) /mL].
- 5 ~ 10 배의 inoculum을 준비 하5 1.5 x 106 CFUs/마우스 40-50 µ L, 소용돌이 직렬 약 (2.5 단계)에서 세균성 솔루션을 희석 하는 고 ~ 1-3 x 107 CFUs/mL(그림 4)를달성 하기 위해 살 균 PBS의 1 mL에. 얼음 물고기를 inoculum을 전송 합니다.
3. murine Intranasal 감염 모델
- 1.3 및 1.4 단계에서 설명한 대로 물고기에서 산소와 마 취 상태를 설정 합니다. 1.5 단계에 설명 된 대로 anesthetize 챔버에 쥐를 놓습니다. 마 취 적용 됩니다 때까지 동물을 모니터링 합니다.
- 때 생쥐는 마 취 유도 실에서 한 번에 한 동물을 제거 합니다. 등 가슴, 양 어깨와 목 뒤의 아저씨에 의해 마우스를 선택 합니다. 코에 액세스 하려면 마우스 올바른 위치.
- 네어스 마우스 (20-25 µ L에서 각/나 레즈)의 40-50 µ L 세균성 inoculum의 적용 천천히 200 µ L 피 펫 팁을 사용 하 여. 전체 inoculum 동물 흡입 되었습니다 때까지 마우스를 누르십시오. 일부 밖으로 inoculum 거품, 거품을 수집 하 고 다시는 네어스에 한 방울 씩. 부정적인 통제로 쥐 한 그룹에 살 균 PBS의 동일한 금액을 제공 합니다.
- 1.10-1.12 단계에서 완료 그들의 감 금 소에 접종된 동물을 반환 하 고 경고 하 고 이동 때까지 동물을 모니터링. 선반에 그것의 원래 주거 공간에 다시 감 금 소를 반환 합니다. 잔여 isoflurane 동물의 다음 집합을 마비 하기 전에 제거 하는 산소와 유도 챔버를 플러시. 48 h 후 감염에 대 한 동물을 모니터링 합니다.
- 실험실에서 실제 CFUs를 확인 하기 위해 살 균 PBS에서 inoculum의 플레이트 직렬 희석 쥐에 전달. 플레이트 10 %BG + Sm 판(그림 4)에 희석의 0.1 mL. 37 ° C 배양 기에서 접시를 놓고 4 일 동안 성장 합니다. 계산 하 고 계산 inoculum (그림 4B) 마우스에 전달에서 CFUs.
4. 감염 후 동물 조직의 수확
- 마우스 해 부 및 조직 수확에 대 한 준비.
- 압력솥에 조직 처리에 필요한 모든 도구 (조 악 하 고 정밀한가 위, 곡선된가 위, 좋은 집게, 펠 릿 pestles, 및 삼각형 스프레더) 소독. 살 균 파우치에 도구를 봉인. 유리 dounce 균질 호 일에 포장 하 고 불 임의 표시 압력솥 테이프를 추가 합니다.
- 한 천 격판덮개 1 또는 2 일전 접시 사용 하기 응고 전에 되도록 조직 수확을 준비 합니다. B. 백 일 해 에 대 한 비 강 심장, 기관지, 폐 각 실험에 대 한 경험적으로 결정 원하는 dilutions와 각 마우스에 대 한 10 %BG + Sm. 라벨 번호판을 사용 합니다.
- 채우기 및 레이블 CFU 희석 튜브입니다. 살 균 1.5 mL microcentrifuge 튜브를 무 균 PBS의 0.9 mL 기반 프로세스와 희석 기관 당 기관에 수를 추가 합니다.
- 조직 컬렉션에 대 한 채우기 및 레이블 튜브:
- 비 강 심장 및 기관: PBS에 살 균 1% 카 제인의 0.3 mL에 채워 살 균 1.5 mL microcentrifuge 튜브 (캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 +-무료). 4 ° c.에 게
- 폐: 살 균 15 mL 원뿔 튜브 및 4 ° c.에 게 PBS에서 살 균 1% 카 제인의 2 개 mL를 추가 폐 조직학에 대 한 수확, 10% 중립 버퍼링 된 포 르 말린 (NBF)의 2 개 mL를 추가 하 고 실시간 저장
- 비장: RPMI + 5%의 3 개 mL를 추가 FBS 15 mL 원뿔 튜브에. 4 ° c.에 게
- 혈액: 두 살 균 1.5 mL microcentrifuge 튜브, 전체 혈액 및 혈 청에 대 한 라벨.
- 신선한 70% 에탄올 비 커를 스프레이 해 부에 대 한 병을 준비 한다.
- 수확의 날에 장바구니에 물고기를 모든 자료를 전송 합니다. BSC를 청소 하 고 1.3 및 1.4 단계에서 마 취 기계를 설정 합니다.
- 유도 실에서 해 부 하, 산소 흐르는, 5 %isoflurane 마우스 놓고 동물 의식 될 때까지 기다립니다. 한 번에 마우스 하나를 제거 하 고 cervically 죽음을 보장 하기 위해 보조 방법으로 동물을 탈 구. 자 궁 경부 전위에 따라 안락사 호흡 속도의 부재 및 철수 반사 (발가락 꼬 집 음 시험)의 부재에 의해 확인 되어야 한다.
- 마우스, 복 부 측 해 부 보드에 향하도록 놓고 팔과 다리 오픈 핀. 70% 에탄올과 마우스의 몸 아래로 스프레이.
- 집게를 사용 하 여, 복 부, 골반의 중심 아래 피부를 버클. 날카로운가 위를 사용 하는 mandible까지 세로 컷을 확인 합니다. 다음, 2 개의 층을 떨어져 추진 하 여 복 벽에서 피부를 해 부, 폐쇄는 위로 작은 움직임을 사용 하 여. 피부 살 균 기관 수확에 대 한 탁 트인된 필드를 만드는 시체의 양쪽에 배치 합니다.
- 또는 간 주위에 흉 곽 아래 그대로 복을 잡고 자르면 그것은 흉 곽 쪽으로 이동. 더 낮은 소화 관 하 고 비장을 드러내는 왼쪽 결 장 이동. 곡선된 겸 자 사용 하 여, 비장을 파악 하 고가 위 결합 조직을 멀리 해 부. 장소 RPMI + 5 %FBS 및 장소 얼음 튜브 3 mL를 포함 하는 15 mL 원뿔 튜브에 비장.
- 집게를 사용 하 여 안정화 하 칼 과정에서 빗 고 자르면 횡 경 막. 폐는 폐 하 고 척추 쪽으로을 해야 합니다. 잘라 오픈 흉 곽 유 방 격판덮개를 제거 하는 측면에서.
- 분리 하 고 오른쪽 폐14, 폐 동맥과 정 맥을 절단의 우수한 엽을 제거. 15 mL 원뿔 튜브 조직을 해결 하기 위해 10 %NBF 및 장소 적어도 24 h에 대 한 실시간에 튜브를 포함 하는 엽을 놓습니다. 오른쪽 폐는 왼쪽된 폐의 나머지 돌출부를 격리 합니다. 2 mL PBS 카 제인 1%의를 포함 하는 15 mL 원뿔 튜브에 돌출부를 놓고 얼음에 배치 합니다.
- 폐 정 맥 및 동맥 폐 밖으로 해 부 절단 후 마우스 exsanguinates 피 채우기 위해 흉을 수 있습니다. 팁 1 mL pipetman를 사용 하 여, 혈액을 수집 하 고 사전 레이블이 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 전송. 얼음에 튜브를 놓습니다.
- 그런 다음 목에서 기도 커버 부드러운 조직 (선, 설 하, 및 submaxillary 동맥 및 림프절)를 제거 합니다. 열고 기도 둘러싼 보호 막을 제거 합니다. 섬세 하 게, 식도 및 어떤 다른 결합 조직은 collarbones의 위에서 아래로 mandible의 기도 구분 잘 집게와가 위를 사용 하 여 합니다.
- 집게를 사용 하 여 기도 유지와 쇄 골의 위쪽에 기도 잘라. 탄력을 극대화 하 고 잘라 바로 후 두, 가능한 한 많이 격리 (~ 1 cm) 위에 mandible의 하단에 기도에 기도 아래로 당겨. 0.3 mL PBS 카 제인 1%의 사전 분류 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 장기를 놓고 얼음에 배치 합니다.
- 마우스를 제거 하 고 마우스에 대 한 명확한 접근 코 연구원 직면 ventrally, 누워. 70% 에탄올과 마우스의 머리를 스프레이 하 고, 두개골의 뒤에 직접 마우스를 잡고 손을 사용 하 여.
- 가 위를 사용 하 여, 멀리 주 둥이, 코의 바닥에서 시작 하 고 위쪽으로 이동의 부드러운 살 잘라. 또한, 모피, 피부, 그리고 코 주위 수염을 제거 합니다. 다음, 집게, 곡선된가 위 삽입가 위 팁 네어스 밖으로, 그리고 V 모양의 대형을 만드는 눈을 향해 비 강 통로 자르면 곡선.
- 미세 집게를 사용 하 여 만든된 형성 내 부드러운 조직과 비 강 심장 수집 합니다. 0.3 mL PBS 카 제인 1%의 사전 분류 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 조직을 놓고 얼음에 배치 합니다.
- 생물 학적 가방에서 시체의 처분. 다음 동물 해 부, 전에 이온된 수와 도구를 헹 구 고 70% 에탄올으로 채워진 비 커에 장소. 도구 제거 하 고, 초과 에탄올을 떨쳐 하 고 다음 해 부와 함께 진행
- 다음 단계 4.3-4.14 각 마우스 해 부.
- 아래 설명 된 대로 조직 처리 합니다.
5입니다. 비장 처리
- Spleens, 해리 60 m m 조직 문화 접시에 70 µ m 셀 스 트레이너를 배치 합니다. 3 mL 주사기의 플런저를 사용 하 여 필터에 비장와 함께 미디어를 붓는 다. 때까지 그것은 완전히 해리 셀 스 트레이너를 통해 필터링 기관에 매 시 신중 하 게.
- 3 mL RPMI + 5%의와 함께 필터를 씻어 FBS 조직 문화 접시에. 세포 현 탁 액을 수집 하 고 그것의 원래 15 mL 튜브에. 작은 셀을 4 ° C에서 5 분 동안 450 x g에서 튜브 원심
- 발음 나는 상쾌한 가만히 따르다 고 염화 염화 칼륨 (ACK) 버퍼 (염화 암모늄 150 mM, 10 mM 칼륨 중 탄산염, 나트륨 EDTA 0.1 m m)의 2 개 mL에 펠 릿을 resuspending 하 여 붉은 혈액 세포를 lyse. RT (25 ° C)에서 3 분 동안 품 어.
- 튜브를 채우기 최대 8 mL RPMI + 4 ° c.에서 5 분 x 450g에 5 %FBS 및 원심 분리기 튜브 발음 나는 상쾌한 가만히 따르다. Hemocytometer를 현미경을 사용 하 여 splenocytes RPMI + 5 %FBS 카운트의 5 mL에 셀 펠 릿을 resuspend.
- 2.5 x 잘 당 106 세포를 자극 하는 데 필요한 셀의 볼륨을 계산 합니다. 48-잘 접시에 잘 당 T-셀 미디어 (RPMI 1640 + 10 %FBS, 10 µ g/mL gentamicin, 및 50 µ M β-mercaptoethanol) 0.5 mL에 셀 씨.
- 신선한 튜브와 4 ° c.에서 5 분 동안 450 x g에서 펠 릿 세포에 세포 현 탁 액의 필요한 볼륨을 넣습니다 위의 계산에 따라 달라 집니다,
- T-세포 미디어의 필요한 볼륨에 펠 릿을 resuspend. B. 백 일 해 감염 모델에 대 한 백신 항 원에 항 원 특정 cytokine 응답 테스트: pertactin (Prn)와 filamentous 조류 접착 (FHA). 따라서, 3 치료 필요: 1) 자극 (NS, 부정적인 컨트롤), 2) Prn, 및 3) FHA. 분석 결과, 7.5 x 106 세포 T 세포 미디어의 1.5 ml에서 필요 (0.5 mL 당 106 셀 x 2.5)입니다.
- 48-잘 접시에 세포 현 탁 액의 aliquot 0.5 mL.
- 세포를 자극, 2 번 T-셀 미디어에서 원하는 농도에서 항을 혼합 한다. Prn와 FHA의 최종 농도 = 1 µ g/mL, 0.5 µ g/mL, 각각. 따라서, 2 µ g/mL Prn 또는 0.5 mL에 1 µ g/mL FHA 믹스. 잘, 지정 각 각 잘에서 1 mL의 최종 볼륨에서 1 x 항 치료를 diluting 자극 매체의 0.5 mL, aliquot
- 5% CO2에서 37 ° C에서 번호판을 품 어. 사전 분류 microcentrifuge 튜브 supernatants 날 7과는 supernatants의 aliquot 0.5 mL를 수집 합니다. ELISA (그림 6)에 의해 항 원 특정 cytokines 테스트 준비까지-20 ° C에 샘플을 저장 합니다.
6입니다. 폐의 처리
- 살 균, 15 mL dounce 균질 화기로 (2 mL PBS 카 제인 1%)에서 폐를 전송 합니다. 조직 균질을 사용 유 봉. 해리 조직의 더 큰 입자 남아 때까지. 원래 15 mL 튜브에 다시 무 균된의 현 탁 액을 넣습니다.
- 0.3 mL CFUs 도금에 대 한 aliquot를 제거 하 고 원심에서 4 ° c.에서 5 분 동안 450 x g homogenate 수집 및 약 수 미리 레이블된 microcentrifuge에 0.5 mL aliquots에 상쾌한 튜브합니다. ELISA 여 cytokines의 분석까지-20 ° C에 샘플을 저장 합니다.
- 순차적으로 희석 튜브 (0.9 mL의 멸 균 PBS)에서 무 균된 폐 현 탁 액의 0.1 mL를 diluting 하 여 선택한 희석을 준비 합니다. 플레이트 미리 레이블이 10 %BG 경험적으로 선택한 희석의 0.1 mL + Sm 접시와 살 균 삼각형 분산기를 사용 하 여 확산
- 4 일 방 공기에서 37 ° C에서 번호판을 품 어.
- 계산 하 고 계산 CFUs/폐 (그림 6). 간단히, 접시의 희석 요인에 의해 그 후에 또한 장기 처리 된 총 볼륨에 의해 복구 된 CFU 숫자를 곱하면 됩니다. CFU 계산 다음 각 동물에 대 한 로그10 값으로 변환 하 고 그래프.
- 30-300 식민지와 번호판을 쉽고 정확 하 게 계산 됩니다. 미만 6 식민지 접시 같은 낮은 식민지 숫자 오류15소개 이후 계산에 사용할 수 없습니다. 탐지의 저 한계를, 기관 무 균 총 볼륨 undiluted homogenate에서 접시에 자리 하는 데 사용 하는 볼륨으로 분할 된다 (예., 2 mL 전체 볼륨 undiluted homogenate의 0.1 mL로 나눈 같습니다의 하한값 20 CFUs 감지)입니다.
7. 비 강 심장 및 기관지의 처리
- 조직 균질 펠 릿으로 PBS/카 제인 유 봉 무선 모터 균질 1%의 0.3 ml에서. 0.5-1 조직 균질 분 조직을 크게 해리 될 때까지. 박테리아는 서 스 펜 션에는 창 고 한다.
- 선택한 10 준비 0.1 mL의 직렬 희석 하 여 살 균 PBS의 0.9 mL를 포함 하는 희석 튜브에 무 균된 현 탁 액의 희석 배. 도트에 각 희석의 0.1 mL 중 10 %BG 표시 + Sm 플레이트 및 서 스 펜 션 70% 에탄올 세척 및 화 염에 의해 소독 된 삼각형 분산기를 사용 하 여 확산.
- 4 일 방 공기에서 37 ° C에서 번호판을 품 어.
- 고 단계 6.5 (그림 6) 에서처럼 CFUs/장기를 계산. 탐지의 저 한계를, 기관 무 균 총 볼륨 볼륨 사용에 의해 나누어져 undiluted homogenate에서 접시에 도트를 (예., 0.3 mL 전체 볼륨 나눈 undiluted equals의 0.1 mL 3 CFUs detecta의 하한값 경)입니다.
8입니다. 혈액의 처리
- 18000 x g 작은 붉은 혈액 세포에 4 ° C에서 30 분 동안에 고립 된 전 혈을 포함 하는 튜브 원심
- 조심 스럽게 표면에 뜨는 혈 청 및 사전 분류 혈 청 microcentrifuge 튜브에 피펫으로 이륙. 추가 다운스트림 분석에 대 한 준비까지 튜브-20 ° C에 저장 (즉., 총 및 특정 Ig ELISA).
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Representative Results
설명 모델 호스트 병원 체 상호 작용 동안 백신 효율과 면역 응답을 평가 하는 방법을 보여 줍니다. 그림 1 에 면역 및 감염 쥐 조직 분석을 위한 수확 하는 데 사용 하는 대표적인 백신 일정을 순서 다. 그림 2 예방접종 및 세균성 inoculums 수사를 사용 마우스를 유도 하는 마 취 시스템의 설정을 보여 줍니다. 그림 3 예 세600 측정 및 쥐에 게 배달 100 희석된 세균성 inoculum을 준비 하는 1 OD 세균성 정지를 달성 하기 위해 계산을 보여준다. 그림 4 묘사 inoculum 준비 감염에 대 한 사용, 마우스 직렬 희석 도금 기반 직렬 희석 및 CFUs를 열거 하는 데 사용 하는 예제 계산의 도금 계획 전달. 그림 5 에서는 항 원 특정 리콜 응답 백신 항 원 FHA와 자극의 7 일 후 elicited. 비장 세포를 조합 백신 그룹에서 졸업생/FHA/BcfA, IFNγ 생산 및 IL-17, 크게 downregulating IL-5 동안 면역 하십시오. 이 효과 B. 백 일 해 감염 시 면역 반응의 Th1/Th17 양극 화를 촉진합니다. Cytokines의 배경 수준 미디어 혼자, 감지 하는 cytokines 면역 (데이터 표시 되지 않음)에 대 한 리콜 응답 했다 나타내는 면역된 비장 세포의 배양에 의해 생산 되었다. 그림 6 예제는 면역된 한 마우스의 호흡기 조직에서 발견 한 박테리아의 CFU 열거형 묘사, B. 백 일 해 의 직렬 희석을 사용 하 여 조직 homogenates 도금 10 %BG + Sm에 접시. 안됨 조직 lysate의 희석 비율과 총 볼륨 곱한 했다 하 고 데이터 로그 변환 했다. CFUs 면역된 동물에서 예방 접종 비 (순) 동물 백신의 보호 효과 확인 다음 비교 됩니다.
그림 1 : 대표 백신 일정. 쥐 날 0에 예방 접종 되며 다음 적절 한 aPV와 ~ 4 주 후 (d28)를 증폭. B. 백 일 해 와 쥐의 감염 쥐 증폭 후 ~ 2 주 (d42)를 발생 합니다. 감염 후 다양 한 일 (d43-56) 후 접종에 동물을 살해. 조직 및 혈액 다운스트림 분석을 위해 수집 됩니다 (예., CFU 열거형, cytokine 및 ELISAs는 항 체). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 마 취 기계 설치. 표시 하는 것은 연결 된 유도 챔버와 폐품 시스템 (생물 안전 캐비닛) 안에 마 취 기화 기입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 1 OD600 세균 현 탁 액의 준비. OD600 값 희석된 주 B. 백 일 해 에서 가져온 문화. 로그 단계에서 하나의 문화 감염 1 세600 문화에서 문화를 얻는 데 필요한 볼륨을 계산 하기 위해 사용 되었다. 간단히, OD600 1 인 1 명이 감염에 사용할 볼륨을 얻기 위해 원하는 문화의 계산된 세600 으로 분할 되었다. 간단히, 1의 OD600 감염에 사용할 1 세 인 볼륨을 얻기 위해 원하는 문화의 계산 된 OD600에 의해 분할 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 배달된 intranasal inoculum의 계산. (A) 10-4, 10-5, 및 10-6희석 감염 inoculum의 직렬 희석의 회로도 이 희석은 10 %BG + Sm에 도금 37 ° C에서 4 일 동안 알을 품을 다음 계산. (B) 10-4, 10-5, 및 10-6 희석 수 다음 intranasally 배달된 CFUs를 계산 하는 데 사용 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : 졸업생/BcfA/FHA, BcfA/FHA, 졸업생/FHA, FHA 접종 하는 비장 세포 Cytokine 생산. 천연된 셀 FHA와 7 일 동안 배양 했다. Supernatants는 IFN-γ (A), (B) IL-17, 및 (C) IL-5 샌드위치 ELISA에 의해 테스트 되었습니다. 오류 바의 n 각 그룹의 평균 표준 편차로 표현 된다 그룹 당 5 =. p < 0.001입니다. 그림10이전 간행물 적응입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6 : B. 백 CFUs 및 쥐에서 수확된 조직에서 계산. 무 균된 마우스 조직에서 (A) B. 백 CFUs. 0.1 mL 직렬 희석 37 ° C에서 4 일 동안 알을 품. (B) 계산 CFUs 무 균된 기관에서 얻은 기반으로 합니다. CFUs 각각 희석에 의해 곱한 고 mL 당 CFUs를 달성 하기 위해 10을 곱한 다음. 기관 당 CFU를 얻으려면 mL 당 CFUs 기관 무 균된 (0.3 mL)를은 총 볼륨을 곱한 했다. 기관 당 CFUs 다음 로그 변환 했다입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
B. 백 일 해 감염을 백신 유도 면역 연구를 설명 하는 포괄적인 프로토콜 또한 다양 한 다른 병원 균에 대 한 호스트 응답의 평가 수 있도록 합니다. 프로토콜 제공 예방 접종, 백신 효능 다음 결정 하는 방법에 설명 합니다 병원 체, 그리고 면역 기능의 병렬 해 부. 다른 병원 체를 연구 하기 위해 프로토콜을 적응, 여러 매개 변수 수정 되어야 할 것 이다. 이 포함 되지만 국한 되지 않습니다, 동물 마 취, 백신, 복용량, 구성과 관리의 경로 모드. 또한, 투여 및 관심, 수확, 선택한 조직 장애인된 병원 체 및 면역 반응의 다운스트림 평가 관리의 경로 요소가 관심의 병원 체/질병에 대 한 수정할 수 있습니다.
B. 백 일 해 감염 마우스 모델은 널리 이용 되 고 pathogenesis 및 백신 연구16,17,18,,1920에 대 한 우수한 모델입니다. Murine 모델 전시 많은 유사성 인간 감염을 포함 한: i) 박테리아는 호흡기와 급속 하 게 증식, ii) 젊은 동물 표시 비교적 심한 감염, 보호 하는 백신 iii) 좋은 대응 어린이 백 일 해 감염, 및 iv에 대 한 쥐를 보호 하는 그에 대 한) B. 백 일 해-특정 T 세포와 항 체 중재 자연 및 백신 유도 보호 면역21,22, 23 , 24. murine 모델 세균 정리25에 면역 효과의 연구를 허용 하는 따라서. 모델 b. 백 일 해 감염을 마우스를 사용 하 여의 또 다른 장점은 유전자 변형된 녹아웃 및 백신 유도 면역 응답19,26에서 중요 한 선수를 공부 하는 유전자 변형 동물의 가용성 이다.
예방 접종의 대부분 parenterally, 관리는 특별히 루트를 통해 근육 (인스턴트 메신저). 이 경로 선호 최소한의 로컬 reactogenicity27,,2829와 조직의 면역 elicits 때문입니다. 근육 주사에 대 한 대안 포함 피하 (사우스 캐롤라이나) 또는 복 (i.p.)는 또한 조직의 응답을 유도 합니다. 피하 노선 주민 항 혈관과 임 파 액 시스템30에 대 한 액세스와 함께 진 피 내의 세포 (APC)를 제시의 큰 인구로 매력적인, 있습니다. 그러나, 피부 배달 하지 백 일 해 백신에 대 한 탐험 되었습니다. 실험적인 aPV의 복 배달 근육 접종31 비슷한 면역 생성 이며 murine 연구에 대 한 신뢰할 수 있는 주입 경로 이기는 하지만 임상 사용에 대 한 허무.
이 프로토콜 활용 인스턴트 메신저 예방 접종 경로, 폐, 하지만 하지 nasopharynx32에 보호를 제공 합니다. 최근 연구는 intranasal (i.n.) 백신은 위를 보호 하는 지역, 점 막 면역 반응을 촉진 낮은 호흡기 책자, 특히 이후에 다른 사람에 게 전송 될 수 있는 박테리아의 저수지로 코 호스트33. 또한, i.n. 면역 조직의 면역33,34에 의해 생성 되지 않습니다 조직 상주 메모리 생성을 보여왔다. 따라서, 백신 관리 경로 선택 크게 백신 및 질병 으로부터 보호 하는 데 필요한 면역 응답의 종류에 따라 다릅니다.
이 프로토콜에서 설명 하는 세균성 배달 intranasal 경로 안전 하 고 지속적으로 마 취 쥐의 호흡기에 직접 세균 inoculum을 제공 호흡기 병원 균에 대 한 널리 사용된 방법입니다. 우리의 프로토콜 nasopharynx 및 더 낮은 호흡 기관에 여행으로 흡입 대량 복용량 (40-50 µ L)를 사용 합니다. 낮은 볼륨 inoculum (10-20 µ L) nasopharynx, 식민지 이라고 하지만 폐의 식민 최소35됩니다. 그러나, B. 백 일 해의 흡입-공기 방울을 포함 하는 개인 및 전송의 감염의 자연 모드 간주 됩니다. 관리의이 경로 다양 한 동물 모델36,37에 사용 되었습니다. 직접 i.n. 접종 감염의 유사한 수준을 달성, 세균성 inoculum (109-1011 CFUs/mL)의 상당히 높은 농도 및 배달 시간 필요한38있습니다.
마우스 호흡기의 식민을 설정 하기 위해이 프로토콜 되도록 접종에 사용 되는 박테리아 악성 단계에 로그 단계에서 복제 하는 액체 문화에서 자란 신선한 박테리아를 사용 합니다. 경험 중 적정 한, 냉동 주식에서 inoculum을 사용할 수도 있습니다. 마우스에 게 투여 되 고 CFUs의 지식을 수 있습니다. 그러나,이 inoculums에 있는 박테리아는 호흡기 식민39의 효율성을 줄일 수 있는 비-치명적인 단계에 있을 수 있습니다. 감염 후는 inoculum CFUs 마우스에 전달 하는 박테리아를 확인 하기 위해 도금입니다. 수 사관 또한 박테리아의 생존을 보장 하 고 복용량은 inoculum의 확인을 vivo에서 감염 전에 inoculum 플레이트를 선택할 수 있습니다.
감염 후 미리 정해진된 timepoint에 희생된 쥐에서 고립 된 조직 조직에 의해 세균성 CFUs 열거 됩니다. 이 방법에 단점은 네 쥐의 지정된 된 집합에 대 한 병원 체 CFUs를 추적 하는 그것의 무 능력 이다. 연구원은 백신 유발 세균 제한 검사를 다른 timepoints에서 희생 동물의 여러 그룹을 사용 해야 합니다. 각 실험에서 쥐의 수는 timepoints을 검사 하 고 원하는 효과 크기의 수에 따라 달라 집니다. 이 증가 된 생물 학적 변화를 발생할 수 있습니다. 관심의 병원 체에는 발광 또는 형광 성 취재 원 유전자의 통합의 성장과 보급에서 vivo에서 감염35의 과정을 통해 비-침략 적 모니터링 허용 됩니다. 이 방법은 생물학 변이 감소 시킨다 고 경도 데이터 동물의 동일한 그룹에서 얻을 수 있습니다 이후 실험 동물의 필요한 수를 최소화 합니다.
여기 호흡기 조직에 대 한 고용 조직 분리 및 균질 프로토콜은 또한 다른 단단한 조직 간, 신장, 소장, 방광 감염의 사이트가 등의 식민지 열거형에 대 한 적용 및 병원 체의 보급
CFU 열거형과 함께이 프로토콜 elicited 예방 접종 및 자연 감염에 의해 면역 반응의 특성을 수 있습니다. 특히, cytokines의 정량화 체계적으로 생산 하 고 로컬로 예방 접종에서 유래한 효능 면역 프로필의 허용 합니다. Cytokines는 세포 유입 영향을 받는 조직 및 세포 면역의 활성화를 촉진 뿐만 아니라 체액 응답10,,4041의 세대에 대 한 도움말을 제공 하는 immunomodulators. 이 프로토콜을 사용 하는 폐와 비장, 등 다양 한 조직 구획에서 생산 하는 cytokines 검색 됩니다. 여기에 표시 되지, 비록 자극 프로토콜은 또한 배출 림프절에 응답의 평가 대 한 적용입니다.
ELISA 분석 수 검색과 미디어 supernatants 또는 혼합된 정지에서 cytokines의 정량화 (즉,., homogenates 또는 혈 청), 인구 수준에 정보를 응답 하지 및에서 항 원 특정 cytokine 응답 한 지정 된 timepoints에서 혼합된 셀 문화입니다. 반면, 같은 ELISPOT 방법 또는 cytometry 허용의 평가 분석을 생성 하는 셀의 개수 및 셀42,43당 식의 수준. 여기서 설명 하지, 하지만 이러한 방법은 항 원 특정 B 세포의 탐지에 적용할 수 있습니다. CFU 열거형 및 면역학 분석 실험의 조합 예방 접종에 대 한 응답의 완전 한 그림을 제공 합니다.
다른 분석이 감염 프로토콜을 사용 하 여 수행할 수 있는 epigenetic 포함 또는 transcriptomic 분석 때 DNA와 RNA 관심44의 조직에서 얻은 것입니다. 따라서, 적절 한 백신 구성, 예방 접종, 그리고 병원 체 배달 경로의 배려,이 프로토콜은 구현에서 다양 하 고 쉽게 감염의 다양 한 모델에 적합. 이 기술은 또한 백신 치료 양식 적임으로 사용 됩니다 (즉, 암, 다 발성 경화 증, 천식, 자가 면역 질환) 비 전염 성 질병에 적용 됩니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품에 오하이오 주립 대학에서 1R01AI125560-01 시작 자금에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2L induction chamber | Vet Equip | 941444 | |
| Fluriso | Vet One | V1 501017 | any brand is appropriate |
| Bordet Gengou Agar Base | BD bioscience | 248200 | |
| Casein | Sigma | C-7078 | |
| Casamino acids | VWR | J851-500G | Strainer Scholte (SS) media components |
| L-Glutamic acid | Research Products Int | G36020-500 | |
| L-Proline | Research Products Int | P50200-500 | |
| Sodium Chloride | Fisher | BP358-10 | |
| Potassium Phosphate monobasic | Fisher | BP362-1 | |
| Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | |
| Magnesium Chloride hexahydrate | Fisher | M2670-500G | |
| Calcium Chloride | Fisher | C75-500 | |
| Tris base | Fisher | BP153-1 | |
| L-cysteine HCl | Fisher | BP376-100 | SS media suplements |
| Ferrous Sulfate heptahydrate | Sigma | F-7002 | |
| Niacin | Research Products Int | N20080-100 | |
| Glutathione | Research Products Int | G22010-25 | |
| Ascorbic acid | Research Products Int | A50040-500 | |
| RPMI 1640 | ThermoFisher Scientific | 11875093 | |
| FBS | Sigma | F2442-500mL | any US source, non-heat inactivated |
| gentamicin | ThermoFisher Scientific | 15710064 | |
| B-mercaptoethanol | Fisher | BP176-100 | |
| 15mL dounce tissue grinder | Wheaton | 357544 | any similar brand is appropriate |
| Cordless Hand Homogenizer | Kontes/Sigma | Z359971-1EA | any similar brand is appropriate |
| Instruments - scissors, curve scissors, forceps, fine forceps, triangle spreaders | any brand is appropriate | ||
| 3mL syringes | BD bioscience | 309657 | |
| 15mL conical tubes | Fisher | 339651 | |
| 1.5mL microfuge tubes | Denville | C2170 | |
| 70um cell strainers | Fisher | 22363548 | |
| 60mm plates | ThermoFisher Scientific | 130181 | |
| 48-well tissue culture plates | ThermoFisher Scientific | 08-772-1C | |
| 1mL insulin syringe 28G1/2 | Fisher Scientific/Excel Int. | 14-841-31 | |
| Mouse IFN-gamma ELISA Ready-SET-Go! Kit | Invitrogen / eBioscience | 50-173-21 | |
| Mouse IL-17 ELISA Ready-SET-Go! Kit | Invitrogen / eBioscience | 50-173-77 | |
| Mouse IL-5 ELISA Ready-SET-Go! Kit | Invitrogen / eBioscience | 50-172-09 |
References
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