Summary
Qui presentiamo un elegante protocollo per la valutazione in vivo di vaccino efficacia e host le risposte immunitarie. Questo protocollo può essere adattato per i modelli di vaccino che studiano virale, batterica o parassitari patogeni.
Abstract
I vaccini sono una meraviglia medica di 20th secolo. Hanno drasticamente ridotto la morbilità e la mortalità causata da malattie infettive e contribuito ad un aumento notevole nella speranza di vita intorno al globo. Tuttavia, determinare l'efficacia del vaccino rimane una sfida. La prova emergente suggerisce che l'attuale vaccino acellulare (aPV) per Bordetella pertussis (pertosse del b.) induce immunità non ottimali. Di conseguenza, una sfida importante è la progettazione di un vaccino di prossima generazione che induce immunità protettiva senza gli effetti collaterali di un vaccino a cellule intere (wPV). Qui descriviamo un protocollo che abbiamo usato per testare l'efficacia di un adiuvante promettente, romanzo che inclina le risposte immunitarie ad un fenotipo Th1/Th17 protettivo e promuove una migliore distanza di una sfida di b. pertussis dal tratto respiratorio murino. Questo articolo viene descritto il protocollo per l'immunizzazione del mouse, inoculazione batterica, tessuto raccolta e analisi delle risposte immunitarie. Utilizzando questo metodo, all'interno del nostro modello, abbiamo con successo Abbiamo delucidato meccanismi cruciali suscitate da un vaccino di pertosse acellulare promettente, generazione. Questo metodo può essere applicato a qualsiasi modello di malattia infettiva al fine di determinare l'efficacia del vaccino.
Introduction
I vaccini rappresentano uno dei più grandi successi di salute pubblica del ventesimo secolo, ma noi ancora non comprendiamo pienamente i meccanismi da cui successo vaccini stimolano l'immunità protettiva. L'identificazione di marcatori molecolari (ad es., gli indicatori di attivazione delle cellule, espansione dei sottotipi cellulari e pattern di espressione genica) indotto dopo vaccinazione offre una pletora di informazioni per la previsione e generando un efficace risposta immunitaria. La complessità delle risposte ospite-patogeno non può essere replicata adeguatamente utilizzando in vitro delle cellule di coltura sistemi1. In vivo vaccino modelli sono progettati per valutare simultaneamente più tipi di cellule immunitarie all'interno dell'host. Questo fornisce un vantaggio quando che caratterizzano vaccino antigene elaborazione e presentazione, secrezione di citochine differenziale ed espansione delle cellule immuni. Il protocollo descritto qui fornisce un metodo dettagliato per determinare l'efficacia del vaccino attraverso la valutazione delle risposte immunitarie sistemiche e locali e la quantificazione del carico dell'agente patogeno nei tessuti di interesse. L'esempio qui fornito prove dell'efficacia di un vaccino sperimentale per l'agente patogeno Bordetella pertussis (pertosse del b.).
B. pertussis è un batterio gram-negativo che è l'agente eziologico della malattia respiratoria pertosse (pertosse)2,3. Stretto contatto con persone infette (sintomatiche o asintomatiche) conduce alla trasmissione, la colonizzazione e la malattia. Nonostante vaccino globale significativa copertura4, pertosse è considerata una malattia resurging in molte nazioni nel mondo ed è delle principali cause di infanzia evitabili morti5,6,7, 8. nel 2015, b. pertussis e pertosse sono stati inclusi nel Istituto nazionale dell'allergia e delle malattie infettive (NIAID) emergenti elenco agente patogeno/malattia infettiva, sottolineando la necessità per lo sviluppo di un vaccino migliore che conferisce immunità protettiva longevo.
Attualmente, un'area attiva di ricerca per controllare la rinascita di pertosse è lo sviluppo di un vaccino di pertosse acellulare di prossima generazione (aPV) con una combinazione ottimale di nuovi adiuvanti e antigeni per simulare la risposta immunitaria provocata dall'intero-cellula pertosse vaccino (wPV)9. Mediante il protocollo descritto, abbiamo recentemente riportato che la modifica di un attuale approvato dalla FDA aPV con l'aggiunta di un romanzo ausiliario, fattore di colonizzazione di Bordetella A (BcfA), ha provocato più efficiente riduzione della carica batterica di b. pertussis da del mouse polmoni10,11. Questa protezione aumentata è stata accompagnata dall'inclinazione di una risposta di immunitaria Th1/Th2 allume-indotta al più protettivo Th1/Th17 profilo immunitario10. Questo protocollo è dettagliata e completa, che consente al ricercatore di ottenere informazioni massimale attraverso la valutazione simultanea dell'host e le risposte immunitarie ai vari agenti patogeni.
Il protocollo descritto qui segue la pianificazione di vaccino rappresentativo, illustrata nella Figura 1, affinché le risposte immunitarie ospite ottimale.
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Protocol
Tutti gli esperimenti con gli animali vivi sono stati condotti seguendo un protocollo approvato da The Ohio State University IACUC conformemente agli orientamenti IACUC. Topi C57BL/6 sono stati utilizzati in tutte le vaccinazioni e infezioni. Topi maschi e femminili sono utilizzati in ogni gruppo secondo le linee guida NIH. Il numero di animali per ogni gruppo è stato determinato dai calcoli di potere basati sulle differenze previste nel risultato fra gruppi sperimentali. Ad esempio, 8 topi per ogni gruppo produrrà 80% della potenza a α = 0.05 (2-sided) per un esempio di 2 t- test per rilevare differenze nel risultato di interesse di 1,33 deviazioni standard (SDs).
1. immunizzazione dei topi
- Preparare un mix master vaccino in un tampone sterile fisiologico come soluzione salina o DPS.
Nota: Il volume totale nel mix dovrebbe includere il 10% più rispetto che richiesto per l'immunizzazione di tutto il gruppo. Concentrazioni della composizione del vaccino sono specificate di seguito ai punti 1.1.1 e 1.1.2. Trasportare a Vivario su ghiaccio.- Per gli studi di b. pertussis , includere i seguenti gruppi di vaccino: aPV e aPV + BcfA. Inoltre, utilizzare allume, antigeni vaccinali da solo (FHA e Prn) e ingenuo (non immunizzati) topi come gruppi di controllo.
Nota: aPV è 1/5th la dose umana di un aPV approvato dalla FDA, che si compone di tossoide tetanico, ridotta tossoide difterico, tossoide tetanico pertosse (PT), Emoagglutinina filamentosa (FHA) e pertactina (Prn) adsorbito da sali di alluminio. Una dose umana di corrente pertosse aPV è 0,5 mL, quindi, 1/5th di una dose è di 0,1 mL. Volumi per aPV + BcfA sono 0,1 mL di aPV (1/5th la dose umana) + mL 0,046 di BcfA (30 µ g) del mouse. Il volume massimo che può essere consegnato in modo sicuro a un muscolo è di 0,1 mL. Perché l'aPV + BcfA vaccino volume è maggiore di 0,1 mL, il vaccino deve essere consegnato in entrambe le spalle, divise approssimativamente ugualmente, al fine di essere somministrato in modo sicuro. - Per preparare un vaccino sperimentale, per una dose di combinare 1 µ g di FHA e 0,5 µ g di Prn con 50 µ g di gel di idrossido di alluminio in PBS sterile. Consentire l'aPV sperimentale di mescolare su un rullo di laboratorio per 15 min a temperatura ambiente (TA). In seguito, lo spin del tubo a 18.000 x g per 5 min a 4 ° C. Rimuovere il supernatante e risospendere il contenuto in 1 mL di PBS sterile.
- Per gli studi di b. pertussis , includere i seguenti gruppi di vaccino: aPV e aPV + BcfA. Inoltre, utilizzare allume, antigeni vaccinali da solo (FHA e Prn) e ingenuo (non immunizzati) topi come gruppi di controllo.
- Nel vivarium, impostato la macchina di anestesia (Figura 2).
Nota: Assicurarsi che ci siano adeguati livelli di ossigeno e isoflurane nei loro rispettivi serbatoi prima dell'uso. Pesare il sebatoio di scavenger di isoflurano e sostituire quando il suo peso aumenta di 50 g. - Pulire il gabinetto di sicurezza biologico (BSC) e posizionare la camera di induzione pulito dentro il BSC. Collegare le linee di anestesia e scavenger dalla macchina di anestesia alla camera di induzione. Aprire l'ossigeno serbatoio tramite il regolatore per garantire ossigeno sta fluendo e impostare il livello di 1,5-2 L/min.
- Posto topi di età desiderata (6-12 settimane) nella camera di induzione. Accendere l'isoflurano a 2,5-3% per anestetizzare leggermente i topi. Monitorare gli animali fino a quando non si stanno muovendo in aula e ha rallentato la loro respirazione.
- Verificare il livello dell'induzione di punta-pizzicotti, osservando per qualsiasi movimento riflessivo. Se non c'è nessuno, i topi sono pronti a iniettare.
Nota: In questo esperimento, l'intera gabbia degli animali sono stati anestetizzati in una sola volta. Si può scegliere per anestetizzare animali individualmente per iniezione o per iniettare gli animali senza anestesia. Uno di questi metodi è appropriato. - Nel frattempo, preparare 1 mL siringhe da insulina (28 1/2) con 0,1 mL di vaccino ogni. Quando gli animali sono completamente indotte, togliere un animale dalla camera e appoggiare il mouse ventralmente su un asciugamano o panca pad.
- Somministrare il vaccino per via intramuscolare. Con la siringa ad un angolo di 45° e con lo smusso rivolto verso l'alto, inserire la siringa ~ 5 mm il deltoide del mouse e iniettare il vaccino.
Nota: La cerva trimestre/fianco può essere usato come un sito di iniezione invece il deltoide. - Dopo l'iniezione, tenere l'ago inserito nel muscolo per ~ 5-10 s. Una volta che il volume è consegnato, ruotare la siringa a 180° in modo che lo smusso rivolto verso via per creare un sigillo ed evitare le dispersioni del vaccino. Poi, lentamente estrarre l'ago dal sito di iniezione.
- Restituire il mouse alla gabbia. Ripetere la procedura con tutti gli animali del gruppo designato.
- Spegnere l'isoflurano e lavare la camera di induzione con ossigeno prima anestetizzando la gabbia successiva dei topi.
- Monitorare gli animali fino a quando sono tutti allerta e commovente nella gabbia. Restituire la gabbia per la posizione di alloggiamento.
- Monitor animali ogni 12 h dopo la vaccinazione, fino a 48 ore, per i sintomi clinici della morbosità come cappotto grezzo/spettinati, gait lento o lavorarono respirazione. Se i sintomi persistono, conferire con il veterinario istituzionale e rimuovere i topi dallo studio, se necessario.
- Quattro settimane dopo l'immunizzazione iniziale, Spinta topi da anestetizzante e somministrare iniezioni intramuscolari nel deltoide destro del mouse con la stessa formulazione di vaccino che è stato dato in precedenza.
- Ancora una volta, animale di monitor per qualsiasi sintomi clinici. Casa animali per altre 2 settimane e poi procedere con l'infezione.
2. crescita di ceppi di b. pertussis e preparazione dell'inoculo di infezione
- Dalle scorte congelate [congelate a-80 ° C in 15% glicerolo, congelato da crescita planctonico di Stainer-Scholte (SS) media12], striscia fuori b. pertussis sui piatti di Bordet-Gengou (BG) agar13 completati con 10% defibrinato pecora sangue e 100 µ g/mL di streptomicina (10% BG + Sm) per la selezione. Incubare la piastra a 37 ° C per 4 giorni.
- Pick ~ 8-10 diverse colonie di ceppo dalla piastra e inoculare 3 mL di SS media completati con 22,8 mM L-cisteina, solfato ferroso 3,6 mM, niacina 3,3 mM, 48,8 mM glutatione, acido ascorbico 227 mM, heptakis 1 mg/mL e 100 µ g/mL di streptomicina. Far crescere la cultura a 37 ° C in un rullo di tamburo a 60 giri/min per 16-24 h.
- Il giorno successivo, diluire la coltura primaria 1:600, 1: 300, 1: 120, 1: 60, 01:30 e 01:15 in 3 mL di completati SS media. Incubare la coltura a 37 ° C in rullo di tamburo a 60 giri/min per 16-24 h.
- Eseguire misurazioni di densità ottica a 600 nm (OD600) per le colture batteriche. Utilizzando cuvette spettrofotometro, diluire le culture 01:10 aggiungendo 0,1 mL di colture liquide a 0,9 mL di PBS sterile.
- Selezionare una cultura con OD600≈ 0.8-1.2. Calcolare il volume necessario per ottenere 1 OD (Figura 3). Rotazione verso il basso il volume in una microcentrifuga da 1,5 mL a 6000 x g per 5 min a 25 ° C. Aspirare il supernatante e risospendere le cellule batteriche in 1 mL di PBS sterile per ottenere una densità di 1 OD/mL [1-3 x 109 Colonia formando unità (CFU) /mL].
- Preparare un inoculo di ~ 5 x 105 a 1,5 x 106 CFU/mouse in 40-50 µ l, vortice e in serie diluire la soluzione batterica (dal punto 2.5) 100 volte in 1 mL di PBS sterile per raggiungere ~ 1-3 x 107 CFU/mL (Figura 4A). Trasporto l'inoculo per la terraristica sul ghiaccio.
3. murino infezione intranasale modello
- Nel vivarium, impostare condizioni di ossigeno ed anestesia come descritto ai punti 1.3 e 1.4. Come descritto al punto 1.5, è possibile posizionare i topi in aula per anestetizzare. Monitorare gli animali fino a quando l'anestesia ha avuto effetto.
- Quando i topi sono anestetizzati, togliere un animale alla volta dalla camera di induzione. Sollevare il mouse per la collottola del torace dorsale, dietro le scapole e il collo. Posizionare il montante del mouse per accedere al naso.
- Utilizzando una punta di pipetta 200 µ l, applicare lentamente 40-50 µ l dell'inoculo batterico per le narici del mouse (20-25 µ l in ogni nare). Tenere premuto il mouse fino a quando l'inoculo intero è stato inalato dall'animale. Se alcune delle bolle dell'inoculo, raccogliere le bolle e ri-instillare nelle narici. Consegnare una quantità uguale di PBS sterile per un gruppo di topi come controllo negativo.
- Come fatto nei passaggi 1.10-1.12, restituire gli animali inoculati alla loro gabbia e monitorare gli animali fino a quando essi sono attenti e commovente. Restituire la gabbia al suo originale spazio di alloggiamento sulla cremagliera. Lavare la camera di induzione con l'ossigeno per rimuovere il residuo isoflurano prima anestetizzando il successivo set di animali. Monitorare gli animali per post-infezione 48 h.
- In laboratorio, piastra diluizioni seriali dell'inoculo, in PBS sterile, per verificare l'effettivo CFUs consegnato ai topi. Piastra di 0,1 mL di diluizioni su 10% BG + piastre Sm (Figura 4A). Posizionare le piastre nell'incubatore 37 ° C e crescere per 4 giorni. Contare e calcolare il CFUs dall'inoculo consegnato al mouse (Figura 4B).
4. raccolta di tessuto animale dopo l'infezione
- Preparare per la dissezione del mouse e tessuto raccolto.
- Sterilizzare tutti gli strumenti (forbici grossolane e fine, forbici curve, una pinzetta, pellet Pestelli e spargitori di triangolo) necessari per la lavorazione di tessuti in autoclave. Sigillare gli strumenti in buste per sterilizzazione. Avvolgere i vetro lisata omogeneizzatori in un foglio e aggiungere nastro autoclave per indicare la sterilità.
- Preparare agar piastre 1 o 2 giorni prima della raccolta del tessuto per garantire che le piastre siano solidificata prima dell'uso. Per b. pertussis, utilizzare 10% BG + mq. Targhette per setto nasale, trachea e polmone per ogni mouse con le diluizioni desiderate, determinato empiricamente per ogni esperimento.
- Riempimento e l'etichetta provette CFU. Aggiungere 0,9 mL di PBS sterile per microcentrifuga da 1,5 mL sterile basato su numero di organi al processo e diluizioni per organo.
- Riempire ed etichettare provette per la raccolta di tessuto:
- Setto nasale e della trachea: riempire un tubo del microcentrifuge sterili da 1,5 mL con 0,3 mL di sterile 1% caseina in PBS (Ca2 + e Mg2 +-gratuito). Conservare a 4 ° C.
- Polmoni: aggiungere 2 mL di sterile 1% caseina in PBS a una provetta conica sterile da 15 mL e conservare a 4 ° C. Per raccogliere i polmoni per l'istologia, aggiungere 2 mL di formalina 10% neutra tamponata (NBF) e memorizzare a TA.
- Milza: aggiungere 3 mL di RPMI + 5% FBS di una provetta conica da 15 mL. Conservare a 4 ° C.
- Sangue: etichettare due serie di provette per microcentrifuga da 1,5 mL sterili, uno per sangue intero e uno per il siero.
- Etanolo al 70% dovrebbe essere pronti a riempire bicchieri e bottiglie spray per dissezione.
- Tutti i materiali per il vivarium su un carrello di trasporto il giorno della raccolta. Pulire il BSC e impostare la macchina di anestesia come nei passaggi 1.3 e 1.4.
- Posizionare i topi per essere sezionata in camera di induzione e, con l'ossigeno che scorre, accendere l'isoflurano al 5% e attendere fino a quando gli animali sono inconsci. Rimuovere i topi uno alla volta e cervicale dislocare l'animale come un metodo secondario per assicurare la morte. A seguito di dislocazione cervicale, l'eutanasia dovrebbe essere confermata l'assenza di una frequenza respiratoria e/o assenza del riflesso del ritiro (prova di pizzico di punta).
- Posizionare il mouse, il lato ventrale rivolto verso l'alto, sulla scheda di dissezione e pin di braccia e gambe aperte. Spruzzare lungo il corpo del mouse con etanolo al 70%.
- Usando il forcipe, stringo la pelle sotto l'addome, al centro del bacino. Utilizzando delle forbici affilate, fare un taglio verticale fino a mandibola. Quindi, sezionare la pelle lontano dalla parete peritoneale premendo i due strati apart, utilizzando piccoli movimenti con le forbici chiuse. Posto la pelle ai lati della carcassa per creare un campo senza ostacoli per il raccolto di organo sterile.
- Afferrare il peritoneo intatto sotto la gabbia toracica presso o intorno al fegato e tagliarlo aperta verso la gabbia toracica. Esporre il tratto digestivo inferiore e spostare i due punti a sinistra rivelando la milza. Usando il forcipe curvo, afferrare la milza e sezionare via il tessuto connettivo con le forbici. Posto della milza in una provetta conica da 15 mL contenente 3 mL di RPMI + 5% di FBS e posto il tubo sul ghiaccio.
- Utilizzare pinze per stabilizzare la gabbia toracica al processo xifoideo e tagliare aperto il diaframma. Polmoni dovrebbero sgonfiare e cadere verso la spina dorsale. Aprite la gabbia toracica ai lati per rimuovere la piastra del seno.
- Isolare e rimuovere il lobo superiore del polmone di destra14, taglio delle arterie polmonari e vene. Posizionare il lobo in una provetta conica da 15 mL contenente 10% NBF e posto il tubo a temperatura ambiente per almeno 24 h per fissare il tessuto. Isolare i rimanenti lobi del polmone di destra e il polmone di sinistra. Posizionare i lobi in una provetta conica da 15 mL contenente 2 mL di caseina 1% in PBS e posizionarlo sul ghiaccio.
- Dopo aver tagliato le vene polmonari e le arterie di sezionare i polmoni, consentire la cavità toracica a riempirsi di sangue come il mouse puri. Utilizzando una pipetman 1 mL con punta, raccogliere il sangue e trasferirlo al tubo del microcentrifuge pre-etichettata 1,5 mL. Posizionare il tubo sul ghiaccio.
- Quindi, dal collo, è possibile rimuovere il tessuto molle (ghiandole parotidee, sublinguale e sottomascellari e linfonodi) che copre la trachea. Aprire e rimuovere le membrane protettive che circondano la trachea. Delicatamente, con delle forbici, una pinzetta, separare la trachea dall'esofago e qualsiasi altro tessuto connettivo da cima le clavicole verso il basso della mandibola.
- Usando il forcipe, tenere la trachea e tagliare la trachea nella parte superiore della clavicola. Abbassare la trachea per massimizzare elasticità e tagliare la trachea nella parte inferiore della mandibola proprio sopra la laringe, isolando il più possibile (~ 1 cm). Posizionare l'organo in una microcentrifuga da 1,5 mL pre-etichettata con 0,3 mL di caseina 1% in PBS e posizionarlo sul ghiaccio.
- Sbloccare il mouse e laici ventralmente, con il mouse il ricercatore per liberare l'accesso al naso di fronte. La testa del mouse di spruzzo con etanolo al 70% e, usando le mani, afferrare il mouse direttamente dietro il cranio.
- Utilizzando le forbici, tagliare carne morbida del muso, iniziando dalla parte inferiore del naso e lo spostamento verso l'alto. Inoltre, rimuovere la pelliccia, pelle e baffi intorno al naso. Quindi, con pinze e forbici curve, inserire le punte delle forbici in narici con le curve puntato verso l'esterno e taglio aperto il passaggio nasale, verso gli occhi, creando una formazione V.
- Utilizzando una pinzetta, raccogliere il setto nasale ed il tessuto molle all'interno della formazione creato. Posizionare il tessuto in una microcentrifuga da 1,5 mL pre-etichettata con 0,3 mL di caseina 1% in PBS e posizionarlo sul ghiaccio.
- Smaltire la carcassa in un sacchetto di biohazard. Prima il prossimo animale di dissezione, risciacquare gli strumenti con acqua deionizzata e poi posto in un becher pieno di etanolo al 70%. Rimuovere gli strumenti, scrollarsi di dosso in eccesso dell'etanolo e quindi procedere con la successiva dissezione
- Sezionare ogni mouse seguendo passaggi 4.3-4.14.
- Elaborare i tessuti come descritto di seguito.
5. elaborazione della milza
- Per dissociare le milze, posizionare un colino di cella di 70 µm in un piatto di coltura del tessuto di 60 mm. Versare la milza e accompagnamento media nel filtro, utilizzando lo stantuffo della siringa da 3 mL. Poltiglia con attenzione l'organo finché è completamente dissociato e filtrata attraverso un filtro di cella.
- Risciacquare il filtro con 3 mL di RPMI + 5% FBS nella piastra di coltura del tessuto. Raccogliere la sospensione cellulare e inserirlo nella sua originale tubo da 15 mL. Centrifugare le provette a 450 x g per 5 min a 4 ° C per agglomerare le cellule.
- Aspirare o decantare il supernatante e lisare cellule rosse del sangue di risospendere il pellet in 2 mL di tampone di potassio (ACK) di cloruro di ammonio (150 mM di cloruro di ammonio, bicarbonato di potassio 10 mM, 0,1 mM sodio EDTA). Incubare per 3 min a RT (25 ° C).
- Riempire le provette fino a 8 mL con RPMI + 5% FBS e centrifuga tubi a 450 x g per 5 min a 4° C. Aspirare o decantare il supernatante. Risospendere il pellet cellulare in 5 mL di RPMI + 5% di FBS e conteggio splenocytes con un emocitometro e microscopio.
- Calcolare il volume di cellule necessarie per stimolare 2,5 x 106 cellule per pozzetto. In una piastra a 48 pozzetti, seme le cellule in 0,5 mL di T-cell supporti (RPMI 1640 + 10% FBS, 10 µ g/mL Gentamicina e 50 µM β-mercaptoetanolo) per pozzetto.
- Secondo il calcolo di cui sopra, inserire il volume richiesto della sospensione delle cellule in una nuova provetta e pellet-cellule a 450 x g per 5 min a 4 ° C.
- Risospendere il pellet nel volume richiesto di media delle T-cellule. Per un modello di infezione di b. pertussis , testare la risposta antigene-specifica citochina agli antigeni del vaccino: pertactina (Prn) e l'adesione di emoagglutinina filamentosa (FHA). Pertanto, sono necessari 3 trattamenti: 1) nessuna stimolazione (NS, come controllo negativo), 2) Prn e 3) FHA. Per il dosaggio, 7.5 x 106 cellule in 1,5 mL di T-cell supporti è richiesto (2,5 x 106 cellule per 0,5 mL).
- Aliquotare 0,5 mL della sospensione delle cellule in una piastra a 48 pozzetti.
- Per stimolare le cellule, mescolare gli antigeni a 2 volte la concentrazione media di T-cellula. Le concentrazioni finali di Prn e FHA = 1 µ g/mL e 0,5 µ g/mL, rispettivamente. Pertanto, miscelare 2 µ g/mL, 1 µ g/mL FHA in 0,5 mL o Prn. Quindi, aliquotare 0,5 mL di terreno stimolazione in ciascuno indicato bene, diluendo il trattamento antigene a 1 x in un volume finale di 1 mL in ciascun pozzetto.
- Incubare le piastre a 37 ° C in 5% CO2. Raccogliere i surnatanti il giorno 7 e aliquota 0,5 mL di surnatanti in pre-etichettata per microcentrifuga. Conservare i campioni in un da-20 ° C fino al momento di testare antigene-specifiche citochine da ELISA (Figura 6).
6. trattamento dei polmoni
- Trasferire i polmoni (in 2 mL di caseina 1% in PBS) in un sterile, omogeneizzatore lisata 15 mL. Pestello di uso per omogeneizzare il tessuto. Dissociare finché non rimangono senza grandi particelle di tessuto. Rimettere la sospensione omogeneizzata nell'originale tubo da 15 mL.
- Rimuovere un aliquota per placcatura CFUs di 0,3 mL e centrifugare l'omogeneizzato a 450 x g per 5 min a 4 ° C. Raccogliere e aliquota del surnatante in aliquote di 0,5 mL in pre-etichettata microcentrifuga tubi. Conservare i campioni in un da-20 ° C fino all'analisi delle citochine da ELISA.
- Preparare diluizioni selezionate diluendo in serie 0,1 mL della sospensione del polmone omogeneizzato nelle provette di diluizione (0,9 mL di PBS sterile). Piastra di 0,1 mL di diluizioni empiricamente selezionate sul pre-etichettata 10% BG + piastre Sm e diffusione mediante spatola sterile triangolo.
- Incubare le piastre a 37 ° C in aria della stanza per 4 giorni.
- Contare e calcolare CFUs/polmone (Figura 6). Brevemente, moltiplicare numeri di CFU recuperati dal fattore di diluizione della piastra, quindi anche con il volume totale in cui l'organo è stato elaborato. I calcoli di CFU sono poi trasformati in valori di Log10 per ogni animale e rappresentati graficamente.
- Piastre con 30-300 colonie sono contati con facilità e precisione. Piastre con meno di 6 colonie non devono essere utilizzate per i calcoli dal momento che un numero così basso di Colonia introdurre errore15. Per ottenere un limite inferiore di rilevamento, il volume totale in cui un organo è stato omogeneizzato è diviso per il volume utilizzato per spot su un piatto dall'omogeneizzato non diluito (ad es., volume totale 2 mL diviso da 0,1 mL di omogenato non diluito è uguale al limite inferiore di 20 CFUs rilevabile).
7. elaborazione del setto nasale e Trachea
- Omogeneizzare il tessuto nel 0,3 mL di 1% PBS/caseina con pellet pestello cordless motore omogeneizzatori. Omogeneizzare il tessuto per 0,5-1 min fino a quando il tessuto è in gran parte dissociato. I batteri dovrebbero essere versati nella sospensione.
- Preparare 10 selezionate x diluizioni di diluizione seriale di 0,1 mL della sospensione omogeneizzata in provette diluizioni contenenti 0,9 mL di PBS sterile. Puntino 0,1 mL di ciascuna diluizione sul pre-etichettata BG 10% + Sm piastre e diffondere la sospensione utilizzando un diffusore di triangolo che è stato sterilizzato da un lavaggio di etanolo al 70% e la fiamma.
- Incubare le piastre a 37 ° C in aria della stanza per 4 giorni.
- Contare e calcolare CFUs/organo come descritto al punto 6.5 (Figura 6). Per ottenere un limite inferiore di rilevamento, il volume totale in cui un organo è stato omogeneizzato è diviso per il volume utilizzato per puntino su un piatto dall'omogeneizzato non diluito (ad es., 0,3 mL di volume totale diviso da 0,1 mL di equals non diluito il limite inferiore di 3 CFUs detecta BLE).
8. lavorazione del sangue
- Centrifugare le provette contenenti sangue intero isolato a 18.000 x g per 30 min a 4 ° C a pellet di globuli rossi.
- Togliere con attenzione il siero surnatante e pipettare in una provetta da microcentrifuga siero pre-etichettata. Conservare i capillari a-20 ° C fino al momento per ulteriori analisi a valle (cioè., ELISA Ig totale e specifico).
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Representative Results
Il modello descritto illustra un metodo per valutare l'efficienza del vaccino e le risposte immunitarie durante le interazioni ospite-patogeno. Figura 1 illustra la pianificazione rappresentante vaccino usata per immunizzare e infettare i topi e tessuti per l'analisi della raccolta. Figura 2 viene illustrato il programma di installazione del sistema di anestesia impiegato per indurre i topi, consentendo gli investigatori a consegnare inoculanti batterici e vaccinazioni. La figura 3 Mostra esempio OD600 misurazioni e calcoli per ottenere una 1 sospensione batterica OD per preparare l'inoculo batterico diluito 100 volte da consegnare ai topi. Figura 4 descrive la preparazione dell'inoculo utilizzata per l'infezione, il regime di placcatura di diluizioni seriali e i calcoli di esempio utilizzati per enumerare CFUs consegnato ai topi basati su diluizioni seriali di placcatura. La figura 5 Mostra risposte antigene-specifiche richiamo dopo sette giorni di stimolazione con l'antigene di vaccino FHA. Immunizzare cellule della milza da gruppo vaccino di combinazione, allume/FHA/BcfA, prodotto IFNγ e IL-17, mentre significativamente downregulating IL-5. Questo effetto favorisce una polarizzazione Th1/Th17 della risposta immunitaria durante l'infezione di b. pertussis . Livelli di fondo delle citochine sono state prodotte da incubazione delle cellule della milza immunizzati con media da solo, indicando che le citochine rilevate erano le risposte di richiamo per l'immunizzazione (dati non mostrati). Figura 6 illustra un esempio di enumerazione di CFU di batteri recuperati dai tessuti delle vie respiratorie di un mouse immunizzato, utilizzando diluizioni seriali di b. pertussis omogenati placcato su 10% BG + Sm lastre. Conteggi sono stati moltiplicati per il volume di diluizione fattore e totale del tessuto lisato e i dati erano registro trasformato. CFUs da animali immunizzati vengono quindi confrontati agli animali non vaccinati (ingenuo) per determinare l'effetto protettivo del vaccino.
Figura 1 : Pianificazione rappresentante vaccino. I topi sono immunizzati il giorno 0 e quindi potenziati ~ 4 settimane più tardi (d28) con l'aPV appropriato. Infezione dei topi con b. pertussis si verifica ~ 2 settimane (d42) dopo amplificazione topi. Dopo l'infezione, gli animali sono uccisi su vari post-inoculazione di giorni (d43-56). Tessuto e sangue è raccolto per l'analisi a valle (ad es., CFU enumerazione, citochina e l'anticorpo ELISAs). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: setup macchina anestesia. Viene mostrato un vaporizzatore anestetico con sistema di alloggiamento e scavenger di induzione allegata (all'interno di armadio di sicurezza biologica). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Preparazione della sospensione batterica OD600 1. OD600 valori sono stati ottenuti da primario diluito b. pertussis culture. Una cultura in fase di log è stata utilizzata per calcolare il volume necessario per ottenere una cultura a 1 OD600 cultura per l'infezione. Brevemente, un OD600 di 1 era diviso per la OD calcolato600 della cultura desiderata per ottenere un volume pari a 1 OD a essere usati per l'infezione. Brevemente, un OD600 di 1 è stato diviso per il OD600 calcolato della cultura desiderata per ottenere un volume pari a 1 OD a essere usati per l'infezione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Calcolo dell'inoculo intranasale consegnato. (A) schema di diluizione seriale di inoculo di infezione che viene diluito al 10-4, 10-5e 10-6. Queste diluizioni sono placcate su 10% BG + Sm, incubate per 4 giorni a 37 ° C e quindi contati. (B) conta da 10-4, 10-5e 10-6 diluizioni vengono quindi utilizzati per calcolare CFUs consegnati per via nasale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 : Produzione di citochine dalle cellule della milza immunizzati con FHA, allume/FHA, BcfA/FHA e allume/BcfA/FHA. Cellule dissociate sono state coltivate con FHA per 7 giorni. I surnatanti sono stati testati da ELISA sandwich per (A) IFN-γ, IL-17 (B) e (C) IL-5. Bar di errori sono espressi come deviazione standard della media di ogni gruppo, n = 5 per gruppo. p < 0,001. La figura è adattata da una precedente pubblicazione10. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6 : B. pertussis calcoli dal tessuto raccolto dai topi e CFUs. (A) b. pertussis CFUs dal tessuto omogeneizzato del mouse. diluizioni seriali di 0,1 mL incubate a 37 ° C per 4 giorni. (B) calcoli basati sui CFUs ottenuti dalla trachea omogeneizzato. CFUs sono stati moltiplicati per i rispettiva diluizione e quindi moltiplicato per 10 per ottenere CFU / mL. Al fine di ottenere CFU per organo, il CFU / mL sono stati moltiplicati per il volume totale in cui l'organo è stato omogeneizzato (0,3 mL). Il CFUs per organo sono stati quindi registro trasformato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il protocollo completo descritto qui per studiare l'immunità indotta dal vaccino all'infezione di b. pertussis permetterà anche la valutazione della risposta ospite ad una varietà di altri agenti patogeni. Il protocollo viene descritto metodi per consegnare le immunizzazioni, determinare vaccino efficacia segue agente patogeno sfida e dissezione parallela della funzione immune. Adattare il protocollo al fine di studiare altri agenti patogeni, diversi parametri avrebbero bisogno di essere modificati. Questi includono, ma non sono limitati a, la modalità di anestesia degli animali, la composizione del vaccino, dose e via di somministrazione. Inoltre, la dose e la via di somministrazione del contestato patogeno di interesse, dei tessuti selezionati per la raccolta e la valutazione a valle delle risposte immunitarie sono fattori che possono essere modificate per l'agente patogeno/malattia di interesse.
Il modello del mouse dell'infezione di pertosse del b. è ampiamente usato ed è un eccellente modello per patogenesi e vaccinologia studi16,17,18,19,20. Modelli murini esibiscono molte somiglianze all'infezione umana, tra cui: i) batteri sono limitati alle vie respiratorie e si moltiplicano rapidamente, ii) i giovani animali display relativamente gravi infezioni, iii) buona corrispondenza tra i vaccini che proteggono bambini contro pertosse e quelli che proteggere i topi dall'infezione e iv) b. pertussis-specifico T-cellule e anticorpi mediano l'immunità protettiva naturale e indotta da vaccino21,22, 23 , 24. Pertanto, il modello murino permette lo studio degli effetti di immunizzazione sullo spazio batterico25. Un altro vantaggio dell'utilizzo di topi per le infezioni di b. pertussis modello è la disponibilità di knockout geneticamente e animali transgenici per lo studio critici giocatori nella risposta immunitaria indotta da vaccino19,26.
La maggior parte delle vaccinazioni vengono somministrata per via parenterale, in particolare tramite l'itinerario intramuscolare (i.m.). Questo percorso è comodo perché suscita l'immunità sistemica con minimo reattogenicità locale27,28,29. Alternative alle iniezioni intramuscolari includono sottocutanea (s.c.) o consegna intraperitoneale (i.p.), che inoltre inducono risposte sistemiche. Itinerari sottocutanei sono anche interessanti, come c'è una grande popolazione di residenti dell'antigene che presenta le cellule (APC) all'interno del derma con accesso alla vascolare e linfatico30. Tuttavia, intradermica consegna non è stata esplorata per il vaccino di pertosse. Consegna intraperitoneale di aPV sperimentale genera immunità simili a immunizzazione intramuscolare31 ed è un percorso di iniezione affidabile per studi murini, seppur poco pratico per l'uso clinico.
Questo protocollo utilizza il percorso di immunizzazione i.m., che fornisce una protezione nei polmoni, ma non il nasofaringe32. Recenti studi hanno mostrato che un vaccino intranasale (i.n.) favorisce una risposta immunitaria locale, mucosa che protegge la parte superiore e più basso tratto respiratorio, in particolare il naso, che funge da serbatoio di batteri che possono essere successivamente trasmessi agli altri padroni di casa33. Inoltre, i.n. immunizzazione ha dimostrato di generare memoria residente del tessuto che non viene generato da immunizzazione sistematica33,34. Pertanto, la scelta della via di somministrazione del vaccino dipende molto dal tipo di vaccino e risposta immunitaria necessaria per proteggere contro la malattia.
L'itinerario intranasale della consegna batterica descritto in questo protocollo è un metodo ampiamente usato per patogeni respiratori che in modo sicuro e coerente trasporta un inoculo batterico direttamente nel tratto respiratorio dei topi anestetizzati. Il nostro protocollo utilizza una dose elevata (40-50 µ l) che viene inalata in nasopharynx e corse nel tratto respiratorio inferiore. Un inoculo di basso volume (10-20 µ l) sarebbe colonizzare nasopharynx, ma la colonizzazione dei polmoni sarà minimo35. Tuttavia, l'inalazione di b. pertussis-contenenti goccioline d'aria è considerato il modo naturale di infezione degli individui e trasmissione. Questa via di somministrazione è stata utilizzata in vari modelli animali36,37. Per raggiungere livelli comparabili di infezione di i.n. inoculazione diretta, considerevolmente più alte concentrazioni dell'inoculo batterico (109-1011 CFU/mL) e tempi di consegna sono necessari38.
Per stabilire la colonizzazione delle vie respiratorie del mouse, questo protocollo utilizza batteri freschi, coltivati in coltura liquida per garantire che i batteri utilizzati per inoculazione sono in fase di virulenta e vengono replicate in fase di log. Sperimentatori possono anche utilizzare un inoculo dalle scorte pretitolate, congelati. In questo modo una conoscenza di CFUs amministrato al mouse. Tuttavia, i batteri in questi Inoculanti possono essere in fase non virulento, che può ridurre l'efficienza delle vie respiratorie colonizzazione39. Dopo l'infezione, l'inoculo è placcato al fine di determinare il batterico CFUs consegnato al mouse. Gli investigatori possono anche scegliere di piastra l'inoculo prima l'infezione in vivo per assicurare la vitalità dei batteri e confermare la dose di inoculo.
Dopo l'infezione, batterica CFUs vengono enumerate tramite omogeneizzazione del tessuto isolato dai topi sacrificati ad un determinato timepoint predeterminato. Uno svantaggio di questo metodo è l'incapacità di traccia cineticamente CFUs patogeno per un set specificato di topi. I ricercatori devono utilizzare più gruppi di animali sacrificati a diversi punti temporali per esaminare indotta da vaccino batterico restrizione. Il numero dei topi in ogni esperimento variano a seconda del numero di punti temporali per esaminare e la dimensione dell'effetto desiderato. Questo può introdurre una maggiore variazione biologica. Integrazione di un gene reporter bioluminescenti o fluorescente nell'agente patogeno di interesse consentirà il monitoraggio non invasivo della crescita e la diffusione in vivo durante tutto il corso dell'infezione35. Questo metodo riduce la variazione biologica e riduce al minimo il numero di animali da esperimento, poiché dati longitudinali sono ottenuti dallo stesso gruppo di animali.
Il protocollo di dissociazione e l'omogeneizzazione del tessuto impiegato qui per i tessuti delle vie respiratorie è anche applicabile per l'enumerazione di Colonia di altri tessuti solidi quali fegato, rene, intestino o vescica per interrogare i luoghi dell'infezione e diffusione di agenti patogeni di interesse.
Insieme enumerazione CFU, questo protocollo consente la caratterizzazione della risposta immunitaria suscitata da immunizzazione e infezione naturale. In particolare, quantificazione delle citochine prodotte sistematicamente e consentire localmente per la determinazione di profili immunitaria efficace derivanti dall'immunizzazione. Le citochine sono immunomodulatori che favorire afflusso cellulare ai tessuti colpiti e l'attivazione di immunità cellulare, nonché di forniscono aiuto per la generazione di risposte umorali10,40,41. Usando questo protocollo, citochine prodotte in vari compartimenti, come il polmone e la milza, vengono rilevate. Anche se non mostrato qui, il protocollo di stimolazione è anche applicabile per la valutazione delle risposte nei linfonodi drenanti.
Analisi di ELISA permette la rilevazione e quantificazione dei cytokines in supernatants media o sospensioni misti (cioè., omogeneati o siero), rendendo le informazioni a livello di popolazione e che caratterizzano le risposte antigene-specifiche citochine da un coltura cellulare mista timepoints designato. Al contrario, i metodi come ELISPOT o citometria a flusso permettono di valutare il numero di cellule che producono un analita e il livello di espressione per cellule42,43. Anche se non descritto qui, questi metodi sono anche applicabili al rilevamento delle cellule di B di antigene-specifiche. La combinazione di enumerazione CFU e analisi immunologiche forniscono un quadro completo della risposta all'immunizzazione.
Altre analisi che possono essere eseguite usando questo protocollo di infezione includono epigenetici o analisi trascrittomica quando DNA e RNA viene ottenuto da tessuti di interesse44. Così, tenendo in considerazione la composizione appropriato vaccino, immunizzazione e itinerario di consegna del patogeno, questo protocollo è versatile nella sua attuazione e facilmente adatto per vari modelli di infezione. Queste tecniche sono anche applicabili alle malattie non infettive (cioè, cancro, sclerosi multipla, l'asma, malattie autoimmuni) dove i vaccini vengono usati come modalità terapeutica.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da fondi 1R01AI125560-01 e Start-up da The Ohio State University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2L induction chamber | Vet Equip | 941444 | |
| Fluriso | Vet One | V1 501017 | any brand is appropriate |
| Bordet Gengou Agar Base | BD bioscience | 248200 | |
| Casein | Sigma | C-7078 | |
| Casamino acids | VWR | J851-500G | Strainer Scholte (SS) media components |
| L-Glutamic acid | Research Products Int | G36020-500 | |
| L-Proline | Research Products Int | P50200-500 | |
| Sodium Chloride | Fisher | BP358-10 | |
| Potassium Phosphate monobasic | Fisher | BP362-1 | |
| Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | |
| Magnesium Chloride hexahydrate | Fisher | M2670-500G | |
| Calcium Chloride | Fisher | C75-500 | |
| Tris base | Fisher | BP153-1 | |
| L-cysteine HCl | Fisher | BP376-100 | SS media suplements |
| Ferrous Sulfate heptahydrate | Sigma | F-7002 | |
| Niacin | Research Products Int | N20080-100 | |
| Glutathione | Research Products Int | G22010-25 | |
| Ascorbic acid | Research Products Int | A50040-500 | |
| RPMI 1640 | ThermoFisher Scientific | 11875093 | |
| FBS | Sigma | F2442-500mL | any US source, non-heat inactivated |
| gentamicin | ThermoFisher Scientific | 15710064 | |
| B-mercaptoethanol | Fisher | BP176-100 | |
| 15mL dounce tissue grinder | Wheaton | 357544 | any similar brand is appropriate |
| Cordless Hand Homogenizer | Kontes/Sigma | Z359971-1EA | any similar brand is appropriate |
| Instruments - scissors, curve scissors, forceps, fine forceps, triangle spreaders | any brand is appropriate | ||
| 3mL syringes | BD bioscience | 309657 | |
| 15mL conical tubes | Fisher | 339651 | |
| 1.5mL microfuge tubes | Denville | C2170 | |
| 70um cell strainers | Fisher | 22363548 | |
| 60mm plates | ThermoFisher Scientific | 130181 | |
| 48-well tissue culture plates | ThermoFisher Scientific | 08-772-1C | |
| 1mL insulin syringe 28G1/2 | Fisher Scientific/Excel Int. | 14-841-31 | |
| Mouse IFN-gamma ELISA Ready-SET-Go! Kit | Invitrogen / eBioscience | 50-173-21 | |
| Mouse IL-17 ELISA Ready-SET-Go! Kit | Invitrogen / eBioscience | 50-173-77 | |
| Mouse IL-5 ELISA Ready-SET-Go! Kit | Invitrogen / eBioscience | 50-172-09 |
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