Summary
Her presenterer vi en elegant protokoll for i vivo evaluering av vaksine effektivitet og vert immunreaksjoner. Denne protokollen kan tilpasses for vaksine modeller som studerer viral, bakteriell eller parasittiske patogener.
Abstract
Vaksiner er 20th century medisinsk vidunder. De har dramatisk redusert sykelighet og dødelighet forårsaket av infeksjonssykdommer og bidratt til en slående økning i forventet levealder over hele verden. Likevel, å bestemme vaksinen er fortsatt en utfordring. Nye bevis antyder at gjeldende acellular vaksinen (aPV) for Bordetella kikhoste (B. kikhoste) induserer suboptimal immunitet. Derfor er en stor utfordring å designe en neste generasjons vaksine som induserer beskyttende immunitet uten uønskede bivirkninger av en hel celle vaksine (wPV). Her beskriver vi en protokoll som vi pleide å teste effekten av en lovende, romanen adjuvant som forskyver immunreaksjoner til en beskyttende Th1/Th17 fenotypen og fremmer en bedre klaring B. kikhoste utfordring fra murine luftveiene. Denne artikkelen beskriver protokollen for musen immunisering, bakteriell inoculation, vev høsting og analyse av immunreaksjoner. Benytter denne metoden, i vår modell, har vi lykkes belyst avgjørende mekanismer brakt frem av en lovende, neste generasjons acellular kikhoste vaksine. Denne metoden kan brukes til enhver smittsom sykdom modell for å bestemme vaksinen.
Introduction
Vaksiner representerer en av de største folkehelse prestasjonene av 1900-tallet, men vi kan ikke helt forstå mekanismene som vellykket vaksiner stimulere beskyttende immunitet. Identifikasjon av molekylære signaturer (f.eks., cellen aktivisering markører, utvidelse av mobilnettet subtyper og mønstre av genuttrykk) indusert etter vaksinasjon gir en overflod av informasjon for å forutsi og generere en effektiv immunrespons. Kompleksiteten i vert-patogen svar repliseres ikke tilstrekkelig bruker i vitro celle kultur systemer1. I vivo vaksine modeller er utviklet for samtidig vurdere flere immun celletyper i verten. Dette gir en fordel når karakteriserer vaksine antigen prosessering og presentasjon, differensial cytokin sekresjon og utvidelse av immunceller. Protokollen beskrevet her gir en detaljert metode for å bestemme vaksinen gjennom evaluering av immunreaksjoner systemisk og lokale og kvantifisering av patogen byrde vev rundt. Eksempel her tester effekten av en eksperimentelle vaksinen for patogen Bordetella kikhoste (B. kikhoste).
B. kikhoste er en gram-negative bakterie som er paranoid agent luftveissykdom kikhoste (kikhoste)2,3. Nærkontakt med infiserte individer (symptomatisk eller asymptomatisk) fører til overføring, kolonisering og sykdom. Til tross for betydelig global vaksine dekning4, kikhoste anses en resurging sykdom i mange land rundt om i verden og er en viktig årsak til forebygges barndommen dødsfall5,6,7, 8. i 2015, B. kikhoste og kikhoste ble inkludert i National Institute of Allergy og smittsomme sykdommer (NIAID) nye patogen/infeksjonssykdommer liste, understreker behovet for utviklingen av en bedre vaksine som gir varige beskyttende immunitet.
Foreløpig er et aktivt område i etterforskningen til å kontrollere kikhoste gjenopplivet en neste generasjons acellular kikhoste vaksine (aPV) med en optimal kombinasjon av romanen adjuvans og antigener å etterligne immun respons skapte av hele-cellen kikhoste vaksine (wPV)9. Bruker protokollen beskrevet, rapportert vi nylig at endring av en gjeldende FDA-godkjent aPV med tillegg av en roman adjuvant Bordetella kolonisering faktor A (BcfA), resulterte i mer effektiv reduksjon av B. kikhoste bakterielle belastningen fra musen lungene10,11. Dette økt beskyttelse ble ledsaget av forvrenger en Alun-indusert Th1/Th2 immun respons til mer beskyttende Th1/Th17 immune profil10. Denne protokollen er detaljerte og omfattende, aktivere etterforskeren å få maksimal informasjon gjennom samtidige evaluering av vert og immunreaksjoner til en rekke patogener.
Protokollen beskrevet her følger representant vaksinen planen, vist i figur 1, for å sikre optimal vert immunreaksjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter med levende dyr ble utført etter en protokoll godkjent av The Ohio State University IACUC IACUC retningslinjer. C57BL/6 mus ble brukt i alle vaksinasjoner og infeksjoner. Både mannlige og kvinnelige mus brukes i hver gruppe som NIH retningslinjer. Antall dyr per gruppe ble bestemt av makt beregninger basert på spådd forskjellene i utfallet eksperimentelle grupper. For eksempel 8 mus per gruppe vil gi 80% strøm på α = 0,05 (2 sider) for et utvalg med 2 t- test for å oppdage forskjeller i utfallet av interesse 1,33 standardavvik (SDs).
1. immunisering av mus
- Klargjør en master vaksine blandingen i et sterilt fysiologisk buffer som saltvann eller DPS.
Merk: Det totale volumet i miksen bør inneholde 10% mer enn som kreves for immunisering av hele gruppen. Konsentrasjoner av vaksine sammensetningen finner du nedenfor i trinn 1.1.1 og 1.1.2. Transportere varene til vivarium på is.- For B. kikhoste studier, inkluderer følgende vaksine grupper: aPV og aPV + BcfA. I tillegg bruke Alun, vaksine antigener alene (FHA og Prn) og naiv (ikke-vaksineres) mus som kontroll grupper.
Merk: aPV er 1/5th menneskelige dosen av en FDA-godkjent aPV, som består av stivkrampe toxoid, redusert difteritoksoid, kikhoste toxoid (PT), trådformede hemagglutinin (FHA) og pertactin (Prn) adsorbert til aluminium salter. En menneskelig dose av gjeldende kikhoste aPV er 0,5 mL, derfor 1/5th av en dose er 0,1 mL. Volumer for aPV + BcfA er 0,1 mL av aPV (1/5th menneskelige dosen) + 0.046 mL BcfA (30 µg) per musen. Det maksimale volumet som trygt kan leveres til en muskel er 0,1 mL. Fordi det aPV + BcfA vaksine er større enn 0,1 mL, vaksinen må leveres i begge skuldre, delt omtrent like, for å administrere trygt. - For å forberede en eksperimentelle vaksinen, én dose kombinere 1 µg av FHA og 0,5 µg av Prn med 50 µg av aluminium hydroksid gel i sterilt PBS. Tillate den eksperimentelle aPV å blande på en laboratorium roller i 15 min ved romtemperatur (RT). Etterpå spinne røret på 18 000 x g i 5 min på 4 ° C. Fjern nedbryting og resuspend innholdet i 1 mL steril PBS.
- For B. kikhoste studier, inkluderer følgende vaksine grupper: aPV og aPV + BcfA. I tillegg bruke Alun, vaksine antigener alene (FHA og Prn) og naiv (ikke-vaksineres) mus som kontroll grupper.
- I vivarium, definere anestesi maskinen (figur 2).
Merk: Kontroller at det er tilstrekkelig nivå av oksygen og isoflurane i deres respektive tanker før bruk. Veie isoflurane åtseldyr beholderen og erstatte når vekten øker med 50 gr. - Grundig ren biologiske sikkerhetskabinett kabinettet (BSC) og plassere det rene induksjon kammeret inni BSC. Koble anestesi og åtseldyr linjene fra anestesi maskinen til induksjon kammeret. Åpne den oksygen tank via regulator å sikre oksygen strømmer og setter nivået til 1.5-2 L/min.
- Plasser mus ønsket alder (6-12 uker) i induksjon kammeret. Slå på isoflurane til 2,5-3% for å lett bedøve musene. Overvåke dyrene før de ikke beveger seg i kammeret og deres puste har avtatt.
- Teste nivået av induksjon ved toe-knipe, observere for enhver refleksiv bevegelse. Hvis det ingen er, så er mus klar til å injisere.
Merk: I dette eksperimentet, hele buret dyr var anesthetized samtidig. Kan du velge å bedøve dyr for injeksjon eller å injisere dyrene uten bedøvelse. En av disse måtene er passende. - I mellomtiden Forbered 1 mL insulin sprøyter (28G 1/2) med 0,1 mL av vaksine hver. Når dyrene er fullt indusert, fjerne en dyr fra kammeret og lå musen ventrally på en håndkle eller benken pad.
- Administrere vaksinen intramuskulært. Sprøyten i 45° vinkel og med skråkanten vender, Legg sprøyten ~ 5 mm i deltoid museklikk og injisere vaksinen.
Merk: Hind kvartal/flanke kan brukes som en injeksjonsstedet i stedet for deltoid. - Etter injeksjon, holde nålen inn i muskelen for ~ 5-10 s. Når volumet er levert, rotere sprøyten ved 180° slik at skråkanten vender bort for å opprette en sel og forhindre lekkasje av vaksinen. Deretter sakte dra pinnen av injeksjonsstedet.
- Tilbake musen til buret. Gjenta dette med alle dyrene i den utpekte gruppen.
- Slå av isoflurane og flush til induksjon kammeret oksygen før anesthetizing neste buret av mus.
- Overvåke dyrene før de er alle varsel og bevegelse i buret. Returnere buret til bolig sted.
- Skjermen dyr hver 12 h etter vaksinasjon, opp til 48 h, for kliniske symptomer på sykelighet som grov/uflidd frakk, langsom gangart og tung pust. Hvis symptomene vedvarer, konferere med institusjonelle veterinær og fjerne mus fra studien om nødvendig.
- Fire uker etter første immunisering, øke mus ved anesthetizing og administrasjon av intramuscular injeksjoner i den høyre deltoid av musen med samme vaksine formulering som tidligere ble gitt.
- Igjen, overvåke dyr for kliniske symptomer. Huset dyr for ytterligere 2 uker og deretter videre med infeksjon.
2. fremveksten av B. kikhoste stammer og forberedelse av infeksjon Inoculum
- Fra frosne aksjer [cryopreserved ved-80 ° C i 15% glyserol, frosset fra planktoniske vekst i fargemaskin-Scholte (SS) media12], strek ut B. kikhoste på Bordet-Gengou (BG) agar13 plater supplert med 10% defibrinated sau blod og 100 µg/mL streptomycin (10% BG + Sm) for utvalg. Inkuber platen på 37 ° C for 4 dager.
- Velg ~ 8-10 personlige kolonier av strain(s) fra platen og vaksinere 3 mL SS media med 22.8 mM L-cystein, 3,6 mM jernvitriol, 3,3 mM niacin, 48.8 mM glutation, 227 mM askorbinsyre, 1 mg/mL heptakis og 100 µg/mL streptomycin. Vokse kulturen på 37 ° C i en berg trommelen 60 RPM for 16-24 h.
- Neste dag, fortynne den primære kultur 1:600, 1:300, 1:120, 1:60, 1:30 og 1:15 i 3 mL supplert SS media. Inkuber kulturen på 37 ° C i roller trommelen 60 RPM for 16-24 h.
- Utføre optisk densitet målinger på 600 nm (OD600) for bakteriell kulturer. Bruker spektrofotometer cuvettes, fortynne kulturer 1:10 ved å legge til 0,1 mL av flytende kulturer 0.9 mL steril PBS.
- Velg en kultur med OD600≈ 0,8-1.2. Beregne volumet nødvendig for å oppnå 1 OD (Figur 3). Nedspinning volumet i en 1,5 mL microcentrifuge tube 6000 x g i 5 min på 25 ° C. Sug opp nedbryting og resuspend bakteriell celle pellet i 1 mL steril PBS å få en tetthet av 1 OD/mL [1-3 x 109 kolonien danner enheter (CFU) /mL].
- Å forberede en inoculum ~ 5 x 105 til 1,5 x 106 CFUs/mus i 40-50 µL, vortex og serielt fortynne bakteriell løsningen (fra trinn 2.5) 100-fold i 1 mL steril PBS å oppnå ~ 1-3 x 107 CFUs/mL (Figur 4A). Transport av inoculum til vivarium på is.
3. murine Intranasal infeksjon modell
- Angi oksygen og anestesi i vivarium, som beskrevet i trinn 1.3 og 1.4. Som beskrevet i trinn 1.5, plassere musene i kammeret til å bedøve. Overvåke dyrene til anestesi trer i kraft.
- Når mus er anesthetized, fjerne en dyr samtidig fra induksjon kammeret. Plukke opp musen ved dorsal thorax, bak skulderbladene og halsen. Plasser musen oppreist til nesen.
- Bruker en 200 µL pipette tips, langsomt bruke 40-50 µL av bakteriell inoculum å nares på musen (20-25 µL i hver ner). Hold musen til hele inoculum har vært innånding av dyret. Hvis noen av inoculum bobler ut, samle bobler og å innpode i nares. Levere en lik mengde sterilt PBS til en gruppe mus som negativ kontroll.
- Som gjort i fremgangsmåten 1.10-1.12, returnere inokulerte dyrene til deres bur og overvåke dyrene før de er våken og bevegelse. Returnere buret tilbake til sin opprinnelige plass i bolig på stativet. Tømme induksjon kammeret med oksygen å fjerne de gjenværende isoflurane før anesthetizing neste sett med dyr. Overvåke dyr 48 timer etter infeksjon.
- I laboratoriet levert plate føljetong fortynninger av inoculum, i sterilt PBS, kontrollere de faktiske CFUs til mus. Plate 0,1 mL fortynninger på 10% BG + Sm plater (Figur 4A). Plasser platene i 37 ° C inkubator og vokse i 4 dager. Telle og beregne CFUs fra inoculum levert til musen (Figur 4B).
4. høsting av dyr vev etter smitte
- Forberede musen disseksjon og vev innhøsting.
- Sterilisere alle verktøy (grov og fin saks, buede saks, fine tang, pellet støtere og trekant spredere) som trengs for behandling vev i en autoklav. Forsegle verktøyene i sterilisering poser. Pakk glass dounce homogenizers i folie og Legg autoklav tape for å angi sterilitet.
- Forberede agar plater 1 eller 2 dager før vev innhøstingen å sikre at plater er befestet før bruk. For B. kikhoste, kan du bruke 10% BG + Sm. Label plater for nasal septum, trachea og lunge for hver musen med de ønskede fortynninger, bestemt empirisk for hvert eksperiment.
- Fyll- og etikett CFU fortynning rør. Legg til 0.9 mL steril PBS å bakteriefri 1.5 mL microcentrifuge rør basert på antall organer prosessen og fortynninger per orgel.
- Fyll- og etikett rør for vev samling:
- Nasal septum og luftrør: fylle en bakteriefri 1.5 mL microcentrifuge tube med 0,3 mL steril 1% kasein i PBS (Ca2 + og Mg2 +-gratis). Butikken på 4 ° C.
- Lungene: legge 2 mL steril 1% kasein i PBS sterilt 15 mL konisk rør og butikk på 4 ° C. For å høste lungene for histology, legge 2 mL 10% nøytral bufrede formalin (NBF) og lagre på RT.
- Milt: legge 3 mL RPMI + 5% FBS slik konisk 15 mL. Butikken på 4 ° C.
- Blood: etiketten to sett med bakteriefri 1.5 mL microcentrifuge rør, for fullblod og én for serum.
- Frisk 70% etanol bør være forberedt på å fylle begre og spray flasker for disseksjon.
- Transportere alle materialer til vivarium på en vogn på dagen for innhøsting. Rengjør BSC og definere anestesi maskinen i trinn 1.3 og 1.4.
- Plasser mus å være dissekert i induksjon kammeret og, oksygen flyter, slå på isoflurane 5% og vente til dyr er bevisstløs. Fjern mus en om gangen, og cervically dislocate dyret som en sekundær metode å sikre død. Etter cervical forvridning, euthanasia skal bekreftes ved fravær av en respirasjonsfrekvens og/eller fravær av uttak reflex (toe knipe test).
- Plasser musen, ventral siden vendt opp, i disseksjon styret og pin armer og ben åpen. Spray ned kroppen av musen med 70% etanol.
- Ved hjelp av pinsett, hekte huden under magen, i midten av bekken. Bruke skarp saks, lage en loddrett kutt til mandible. Deretter analysere huden fra peritoneal veggen ved å skyve de to lagene fra hverandre, bruker små bevegelser med saksen lukket. Plass huden til sidene av carcass lage en uhindret felt for sterilt orgel innhøsting.
- Forstå intakt peritoneum under ribbeinet buret på eller rundt leveren og kutt den åpen går mot ribbe buret. Utsette nedre fordøyelseskanalen og flytte kolon til venstre avsløre milten. Bruke buede tang, forstå milten og dissekere unna connective vev med saks. Place milt i et 15 mL konisk rør som inneholder 3 mL RPMI + 5% FBS og sted røret på is.
- Bruk tang til å stabilisere ribbe buret xiphoid prosessen og klippes mellomgulvet. Lungene bør tømmes og faller mot ryggraden. Klipp opp ribbe buret på sidene for å fjerne brystet plate.
- Isolere og fjerne den overlegne flik av den høyre lunge14, kutte pulmonary arteriene og venene. Plass flik i et 15 mL konisk rør som inneholder 10% NBF og sted røret på RT for minst 24 timer for å reparere vevet. Isolere gjenværende lobes av høyre lunge og venstre lunge. Plasser fliker i et 15 mL konisk rør med 2 mL 1% kasein i PBS og plassere den på is.
- Etter klipping pulmonary venene og arteriene å dissekere ut lungene, la brysthulen fylles med blod som musen exsanguinates. Bruker en 1 mL pipetman med tips, samle blod og overføre den til forhåndsinnstilte merket 1,5 mL microcentrifuge røret. Sett røret på is.
- Fjern deretter bløtvev (parotid sublinguale og submaxillary kjertler og lymfeknutene) som dekker luftrøret fra nakken. Åpne og Fjern de beskyttende membranene rundt luftrøret. Delikat, med fine tang og saks, skille luftrøret fra spiserøret og alle annet bindevev fra toppen av collarbones nederst på mandible.
- Ved hjelp av pinsett, holde på luftrøret og kuttet luftrøret øverst i krageben. Trekk luftrøret ned maksimere elastisitet og kutt luftrøret nederst på mandible rett over strupehode, isolere som mulig (~ 1 cm). Plasser orgelet i et forhåndsinnstilte merket 1,5 mL microcentrifuge rør med 0,3 mL 1% kasein i PBS og plassere den på is.
- Løsne musen og legge det ventrally, med musen mot forskeren klare tilgang til nesen. Spray hodet av musen med 70% etanol, og med hendene forstå musen direkte bak skallen.
- Ved hjelp av saks, kuttet bort myke kjøttet av snute starter fra bunnen av nesen og flytte oppover. I tillegg fjerne pels, hud og værhår rundt nesen. Deretter med tang og buede saks, sett tips av saksen inn nares med kurvene pekte utover, og klippes nasal passasje mot øynene, lage en V-lignende formasjon.
- Bruke fine tang, samle nasal septum og myk vev i opprettet dannelsen. Plasser vevet i et forhåndsinnstilte merket 1,5 mL microcentrifuge rør med 0,3 mL 1% kasein i PBS og plassere den på is.
- Kast carcass i en biohazard bag. Før dissekere neste dyret, skyll verktøy med deionisert vann, og plasser i et beaker fylt med 70% etanol. Fjerne verktøy, rist av overflødig etanol og deretter fortsette med neste dissection
- Dissekere hver musen følger trinnene 4.3-4.14.
- Behandle vev som beskrevet nedenfor.
5. behandling av milten
- Hvis du vil oppheve tilknytningen spleens, Plasser en 70 µm celle sil i 60 mm vev kultur parabol. Hell milten og medfølgende media i filteret, stempelet til en 3 mL sprøyte. Nøye MOS orgelet før det er helt atskilt og filtrert gjennom cellen sil.
- Skyll filteret med 3 mL RPMI + 5% FBS til vev kultur parabolen. Samle celle suspensjon og plassere den i sin opprinnelige 15 mL tube. Sentrifuge rør 450 x g i 5 min på 4 ° C pellets cellene.
- Sug opp eller Dekanter nedbryting og lyse røde blod celler ved resuspending pellet i 2 mL salmiakk kalium (ACK) bufferen (150 mM salmiakk, 10 mM bikarbonat kalium, 0,1 mM natrium EDTA). Inkuber i 3 minutter på RT (25 ° C).
- Fyller rørene opptil 8 mL med RPMI + 5% FBS og sentrifuger rør 450 x g i 5 min på 4° C. Sug opp eller Dekanter nedbryting. Resuspend celle pellets i 5 mL av RPMI + 5% FBS og telle splenocytes bruker hemocytometer og mikroskop.
- Beregne volumet av nødvendig å stimulere 2.5 x 106 celler per brønn. I en 48-vel plate, frø cellene i 0,5 mL av T-celle media (RPMI 1640 + 10% FBS 10 µg/mL gentamicin og 50 µM β-mercaptoethanol) per brønn.
- Basert på beregningen ovenfor, plasser den nødvendige mengden celle suspensjon i en fersk tube og pellets-celler 450 x g i 5 min på 4 ° C.
- Resuspend pellet i et bestemt volum av T-celle media. For en B. kikhoste infeksjon modell, teste antigen-spesifikke cytokin svaret vaksine antigener: pertactin (Prn) og trådformede hemagglutinin vedheft (FHA). Derfor 3 behandlinger er nødvendig: 1) ingen stimulering (NS, som negativ kontroll), 2) Prn og 3) FHA. For analysen er 7.5 x 106 celler i 1,5 mL T-celle medier nødvendig (2,5 x 106 celler per 0,5 mL).
- Aliquot 0,5 mL av cellen suspensjon i en 48-vel plate.
- For å stimulere celler, bland antigener på 2 ganger ønsket konsentrasjonen i T-celle medier. Siste konsentrasjoner av Prn og FHA = 1 µg/mL og 0,5 µg/mL, henholdsvis. Derfor bland 2 µg/mL Prn eller 1 µg/mL FHA i 0,5 mL. Så, aliquot 0,5 mL av stimulering medium i alle Vel, fortynne antigen behandling til 1 x i et siste volum 1 ml i hver brønn.
- Inkuber platene på 37 ° C i 5% CO2. Samle inn supernatants på dag 7 og aliquot 0,5 mL av supernatants til forhåndsinnstilte merket microcentrifuge rør. Lagre prøvene i en 20 ° C til du er klar til å teste antigen-spesifikke cytokiner med ELISA (figur 6).
6. behandling av lungene
- Overføre lungene (i 2 mL 1% kasein i PBS) til en steril, 15 mL dounce homogenizer. Bruk pistil til homogenize vev. Distansere gjenstår ingen store partikler av vev. Plass homogenisert suspensjon tilbake i den opprinnelige 15 mL tuben.
- Fjerne en 0,3 mL aliquot for plating CFUs og sentrifuge homogenate 450 x g i 5 min på 4 ° C. Hente- og aliquot rør nedbryting i 0,5 mL dele inn forhåndsinnstilte merket microcentrifuge. Lagre prøvene i en 20 ° C før analysen av cytokiner med ELISA.
- Forberede valgte fortynninger ved å fortynne serier 0,1 mL homogenisert lunge suspensjon i fortynning rør (0.9 mL steril PBS). Plate 0,1 mL empirisk valgte fortynninger på forhåndsinnstilte merket 10% BG + Sm plater og spre bruker sterilt trekant sprederen.
- Inkuber platene på 37 ° C i rommet luften for 4 dager.
- Telle og beregne CFUs/lungekreft (figur 6). Kort, multiplisere gjenopprettede CFU tall av fortynningsfaktoren av platen, og også av det totale volumet som orgelet ble behandlet. CFU beregningene deretter forvandlet til Logg10 verdier for hvert dyr og grafisk.
- Plater med 30-300 kolonier telles enkelt og nøyaktig. Plater med mindre enn 6 kolonier bør ikke brukes for beregninger siden slike lave kolonien tall introdusere feil15. For å få en nedre grense for påvisning, deles det totale volumet som et organ ble homogenisert volumet brukes å få øye på en plate fra den ufortynnet homogenate (f.eks., 2 mL totalt volum delt på 0,1 mL ufortynnet homogenate er den nedre grensen for 20 CFUs synlig).
7. behandling av Nasal Septum og luftrøret
- Homogenize vevet i den 0,3 mL 1% PBS/kasein med pellet pistil trådløs motor homogenizers. Homogenize vev for 0,5-1 min til vev er hovedsakelig avstand. Bakterier skal bli utøst i suspensjon.
- Forberede valgte 10 x fortynninger av føljetong fortynning av 0,1 mL av homogenisert suspensjon i fortynninger rør som inneholder 0.9 mL steril PBS. Dot 0,1 mL av hver fortynning på pre merket 10% BG + Sm plater og spre suspensjon med en trekant sprederen som har blitt sterilisert med 70% etanol vask og flamme.
- Inkuber platene på 37 ° C i rommet luften for 4 dager.
- Telle og beregne CFUs/orgel som i trinn 6.5 (figur 6). For å få en nedre grense for påvisning, deles det totale volumet som et organ ble homogenisert volumet som ble brukt til prikk på en plate fra den ufortynnet homogenate (f.eks., 0,3 mL totalt volum delt på 0,1 mL ufortynnet lik den nedre grensen for 3 CFUs detecta ble).
8. prosesseringen av blod
- Sentrifuge rør som inneholder isolert fullblod 18.000 x g i 30 min på 4 ° C pellets røde blodlegemer.
- Forsiktig ta av serum supernatant og Pipetter i en forhåndsinnstilte merket serum microcentrifuge tube. Lagre rør på 20 ° C til du er klar for ytterligere nedstrøms analyse (dvs., totalt og spesifikke Ig ELISA).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Modellen beskrevet viser en metode for å vurdere vaksine effektivitet og immunreaksjoner under vert-patogen interaksjoner. Figur 1 viser representant vaksine tidsplanen immunize infisere mus og høste vev for analyse. Figur 2 viser oppsettet for anestesi systemet å indusere mus, aktivere etterforskere vaksinasjoner og bakteriell inoculums. Figur 3 viser eksempel OD600 mål og beregninger for å oppnå en 1 OD bakteriell suspensjon å forberede 100-fold utvannet bakteriell inoculum leveres til mus. Figur 4 viser inoculum utarbeidelse brukes for infeksjon, plating ordningen føljetong fortynninger og eksempel beregningene brukes til å nummerere CFUs levert til mus basert på plating føljetong fortynninger. Figur 5 viser antigen-spesifikke tilbakekalling svar elicited etter syv dager med stimulering vaksine antigen FHA. Immunize milt celler fra gruppen kombinasjon vaksine Alum/FHA/BcfA, IFNγ og IL-17, mens betydelig downregulating IL-5. Denne effekten fremmer en Th1/Th17 polarisering av immunrespons under B. kikhoste infeksjon. Bakgrunn nivåer av cytokiner ble produsert av inkubasjon vaksineres milt celler med media alene, som indikerer at cytokiner oppdaget var tilbakekalling Svar å immunisering (data ikke vist). Figur 6 viser et eksempel CFU opplisting av bakterier fra luftveier vev av en vaksineres mus, bruker serielle fortynninger av B. kikhoste vev homogenates belagt på 10% BG + Sm plater. Rå teller ble multiplisert fortynning faktor og totalt volumet av vev lysate og dataene var Logg forvandlet. CFUs fra vaksineres dyr er deretter sammenlignet med ikke-vaksineres (naiv) dyr å bestemme beskyttende effekten av vaksinen.
Figur 1 : Representant vaccine tidsramme. Mus er vaksinert dag 0 og deretter økte ~ 4 uker senere (d28) med de riktige aPV. Infeksjon av mus med B. kikhoste oppstår ~ 2 uker (d42) etter øke mus. Etter infeksjon er dyrene drept på ulike dager (d43-56) etter vaksinering. Vev og blod samles for nedstrøms (f.eks., CFU opplisting, cytokin og antistoff ELISAs). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: anestesi MASKINOPPSETT. Vist er et bedøvende fordamper med vedlagte induksjon kammer og åtseldyr (innenfor biologiske sikkerhetskabinett kabinett). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Forberedelse 1 OD600 bakteriell hjuloppheng. OD600 verdier Hentet fra utvannet primære B. kikhoste kulturer. En kultur i loggen fasen ble brukt til å beregne volumet nødvendig for å oppnå en kultur på 1 OD600 kultur for infeksjon. Kort, et OD600 1 ble delt av den beregnede OD600 av ønsket kulturen å få et volum tilsvarer 1 OD brukes for infeksjon. Kort, en OD600 på 1 ble delt av den beregnede OD600 av ønsket kulturen å få et volum tilsvarer 1 OD brukes for infeksjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Beregning av levert intranasal inoculum. (A) skjematisk av føljetong fortynning av infeksjon inoculum som er fortynnet 10-4, 10-5og 10-6. Disse fortynninger er belagt på 10% BG + Sm, ruges i 4 dager på 37 ° C og deretter regnet. (B) teller fra 10-4og 10-510-6 fortynninger brukes deretter til å beregne gjennom leverte CFUs. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Cytokiner produksjonen av milten cellene vaksinert med FHA, Alun/FHA, BcfA/FHA og Alum/BcfA/FHA. Dissosiert celler ble kultivert med FHA i 7 dager. Supernatants ble testet av sandwich ELISA for (A) IFN-γ, (B) IL-17 og (C) IL-5. Feil barer uttrykkes som standardavvik for gjennomsnittet av hver gruppe, n = 5 per gruppe. p < 0,001. Figuren er tilpasset fra en tidligere publikasjon10. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6 : B. kikhoste CFUs og beregninger fra høstet vev fra mus. (A) B. kikhoste CFUs fra homogenisert musen vev. 0,1 mL føljetong fortynninger ruget på 37 ° C for 4 dager. (B) beregninger basert på CFUs fra homogenisert luftrøret. CFUs var multiplisert med de respektive fortynning og deretter multipliseres med 10 for å oppnå CFUs per mL. For å få CFU per orgel, ble CFUs per mL multiplisert med det totale volumet der orgelet ble homogenisert (0,3 mL). CFUs per orgel var da Logg forvandlet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den omfattende protokollen beskrevet her for å studere vaksine-indusert immunitet til B. kikhoste infeksjon vil også tillate evaluering av verten svar til en rekke andre patogener. Protokollen drøfter metoder for å levere vaksinasjoner, bestemme vaksinen effekt følgende patogen utfordring, og parallelle Disseksjon av immunforsvar. Tilpasse protokollen for å studere andre patogener, må flere parametere endres. Disse inkluderer, men er ikke begrenset til, dyr anestesi, vaksine komposisjon, dose og bruksmåten. I tillegg er dose og bruksmåten for utfordret patogen rundt, valgte vev for innhøsting, og nedstrøms evaluering av immunreaksjoner faktorer som kan endres for patogen/sykdom av interesse.
Musemodell av B. kikhoste infeksjon er utbredt og er en utmerket modell for patogenese og vaccinology studier16,17,18,19,20. Murine modellene viser mange likheter til menneske infeksjon, inkludert: i) bakterier er begrenset til luftveiene og formere seg raskt, ii) ung dyrene vise relativt alvorlige infeksjoner, iii) god korrespondanse mellom vaksiner som beskytter barn mot pertussis og de som beskytte mus mot infeksjon, og iv) B. pertussis-spesifikke T-celler og antistoffer megle naturlig og vaksine-indusert beskyttende immunitet21,22, 23 , 24. derfor murine modellen tillater studiet av immunisering effekter på bakteriell klaring25. En annen fordel med å bruke mus til modell B. kikhoste infeksjoner er tilgjengeligheten av genmodifiserte knockout og transgene dyr å studere viktige spillere i vaksine-indusert immunreaksjoner19,26.
Fleste immunizations administreres parenterally, spesielt via intramuscular (IM) rute. Denne ruten er foretrukket fordi det utløser systemisk immunitet med minimal lokale reactogenicity27,28,29. Alternativer til intramuskulær injeksjoner inkluderer subcutaneous (SC) eller intraperitoneal (IP) levering, som også føre til systemisk svar. Subkutan ruter er også attraktive, som det er en stor bestand av bosatt antigen presentere celler (APC) i dermis tilgang til vaskulær og lymfatiske30. Intradermal levering er imidlertid ikke utforsket for pertussis vaksine. Intraperitoneal levering av eksperimentell aPV genererer lignende immunitet intramuskulær immunisering31 og er en pålitelig injeksjon rute for murine studier, men upraktisk for klinisk bruk.
Denne protokollen bruker im immunisering ruten, som gir beskyttelse i lungene, men ikke nasopharynx32. Nyere studier har vist at en intranasal (i.n.) vaksine fremmer en lokal, mucosal immunrespons som beskytter øvre og nedre luftveier, spesielt nesen, som fungerer som et reservoar av bakterier som kan overføres senere til andre vert33. I tillegg har i.n. immunisering vist å generere vev bosatt minne som ikke er generert av systemisk immunisering33,34. Derfor, valg av vaksine administrasjon rute avhenger sterkt på vaksine og immunrespons nødvendig for å beskytte mot sykdom.
Intranasal ruten av bakteriell levering beskrevet i denne protokollen er brukte metode for åndedretts patogener som trygt og konsekvent leverer en bakteriell inoculum direkte i luftveiene bedøvet mus. Våre protokollen bruker en høy-volum dose (40-50 µL) som er inhalert i nasopharynx og reiser i de nedre luftveier. Et lavt volum inoculum (10-20 µL) ville kolonisere nasopharynx, men kolonisering av lungene blir minimal35. Imidlertid innånding av B. pertussis-som inneholder luft dråper anses den naturlige måte å smitte av enkeltpersoner og overføring. Denne bruksmåten er brukt i ulike dyremodeller36,37. For å oppnå sammenlignbare nivåer av smitte til direkte i.n. vaksinasjon, er betydelig høyere konsentrasjoner av bakteriell inoculum (109-1011 CFUs/mL) og leveringstid nødvendig38.
For å etablere kolonisering av musen luftveier, bruker denne protokollen ferske bakterier, dyrket i flytende kultur slik at bakterier brukes til vaksinasjon er i virulente fase og kopierer Logg stadium. Forskere kan også bruke en inoculum fra pre titrerte, frosne aksjer. Dette gjør en kunnskap om CFUs som administreres til musen. Bakterier i disse inoculums kan imidlertid være i ikke-ondartet fase, som kan redusere effektiviteten av luftveiene kolonisering39. Etter infeksjon, er inoculum belagt å bestemme bakteriell CFUs levert til musen. Etterforskerne kan også velge å plate inoculum før i vivo infeksjonen å sikre levedyktighet av bakterier og bekrefte dose av inoculum.
Etter infeksjon, er bakteriell CFUs nummerert av homogenisere isolert vev fra ofret mus på en forhåndsdefinert timepoint. En ulempe med denne metoden er dens manglende evne til å spore kinetically patogen CFUs for et angitt sett med mus. Forskere må bruke flere grupper av dyr ofret på forskjellige timepoints undersøke vaksine-indusert bakteriell begrensning. Antall mus i hvert eksperiment vil variere avhengig av antall timepoints undersøke og ønsket effekt størrelsen. Dette kan gi økt biologisk variasjon. Integrasjon med et bioluminescent eller fluorescerende reporter i patogen rundt tillater ikke-invasiv overvåking av vekst og spredning i vivo i løpet av infeksjon35. Denne metoden reduserer biologisk variasjon og minimerer antall forsøksdyr, siden Longitudinelle data hentes fra den samme gruppen av dyr.
Vev dissosiasjon og homogenisering protokollen ansatt her for luftveier vev gjelder også for kolonien opplisting av andre solid vev som lever, nyre, tarm eller blære avhøre områder av infeksjon og formidling av patogener rundt.
Sammen med CFU opplisting kan denne protokollen karakteristikk av immunreaksjoner elicited immunisering og infeksjon naturlig. Spesielt kvantifisering av cytokiner produsert systemisk og tillate lokalt fastsettelse av effektiv immun profiler som følge av immunisering. Cytokiner er immunomodulators som fremmer mobilnettet tilstrømningen til berørte vev og aktivering av cellulære immunitet, samt gi hjelp for generering av humoral svar10,40,41. Bruker denne protokollen, oppdages cytokiner produsert i ulike vev avdelinger, som lunge og milt. Selv om ikke vises her, er stimulering protokollen også tilgjengelig for evaluering av svar i drenering lymfeknuter.
ELISA analyse tillater påvisning og kvantifisering av cytokiner i media supernatants eller blandet suspensjoner (dvs., homogenates eller serum) gir informasjon på befolkningsnivå og karakterisere antigen-spesifikke cytokin svar fra en mikset-cellekultur på utpekte timepoints. I kontrast metoder som ELISPOT eller flowcytometri tillate evaluering av antall celler som produserer en analytt og hvilket uttrykk per celle42,43. Selv om ikke er beskrevet her, er disse metodene også gjelder for påvisning av antigen-spesifikke B-celler. Kombinasjonen av CFU opplisting og immunologiske analyser gi fullstendig bilde av svaret til immunisering.
Andre analyser som kan utføres ved hjelp av denne infeksjon protokollen inkludere epigenetic eller transcriptomic analyse når DNA og RNA hentes fra vev rundt44. Dermed med vurdering av nødvendige vaksine komposisjon, immunisering og patogen levering ruten er denne protokollen allsidig i gjennomføringen og lett egnet for ulike modeller av infeksjon. Disse teknikkene gjelder også for ikke-smittsomme sykdommer (dvs. kreft, multippel sklerose, astma, autoimmune sykdommer) der vaksiner blir brukt som et terapeutisk modalitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av 1R01AI125560-01 og oppstart midler fra Ohio State University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2L induction chamber | Vet Equip | 941444 | |
| Fluriso | Vet One | V1 501017 | any brand is appropriate |
| Bordet Gengou Agar Base | BD bioscience | 248200 | |
| Casein | Sigma | C-7078 | |
| Casamino acids | VWR | J851-500G | Strainer Scholte (SS) media components |
| L-Glutamic acid | Research Products Int | G36020-500 | |
| L-Proline | Research Products Int | P50200-500 | |
| Sodium Chloride | Fisher | BP358-10 | |
| Potassium Phosphate monobasic | Fisher | BP362-1 | |
| Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | |
| Magnesium Chloride hexahydrate | Fisher | M2670-500G | |
| Calcium Chloride | Fisher | C75-500 | |
| Tris base | Fisher | BP153-1 | |
| L-cysteine HCl | Fisher | BP376-100 | SS media suplements |
| Ferrous Sulfate heptahydrate | Sigma | F-7002 | |
| Niacin | Research Products Int | N20080-100 | |
| Glutathione | Research Products Int | G22010-25 | |
| Ascorbic acid | Research Products Int | A50040-500 | |
| RPMI 1640 | ThermoFisher Scientific | 11875093 | |
| FBS | Sigma | F2442-500mL | any US source, non-heat inactivated |
| gentamicin | ThermoFisher Scientific | 15710064 | |
| B-mercaptoethanol | Fisher | BP176-100 | |
| 15mL dounce tissue grinder | Wheaton | 357544 | any similar brand is appropriate |
| Cordless Hand Homogenizer | Kontes/Sigma | Z359971-1EA | any similar brand is appropriate |
| Instruments - scissors, curve scissors, forceps, fine forceps, triangle spreaders | any brand is appropriate | ||
| 3mL syringes | BD bioscience | 309657 | |
| 15mL conical tubes | Fisher | 339651 | |
| 1.5mL microfuge tubes | Denville | C2170 | |
| 70um cell strainers | Fisher | 22363548 | |
| 60mm plates | ThermoFisher Scientific | 130181 | |
| 48-well tissue culture plates | ThermoFisher Scientific | 08-772-1C | |
| 1mL insulin syringe 28G1/2 | Fisher Scientific/Excel Int. | 14-841-31 | |
| Mouse IFN-gamma ELISA Ready-SET-Go! Kit | Invitrogen / eBioscience | 50-173-21 | |
| Mouse IL-17 ELISA Ready-SET-Go! Kit | Invitrogen / eBioscience | 50-173-77 | |
| Mouse IL-5 ELISA Ready-SET-Go! Kit | Invitrogen / eBioscience | 50-172-09 |
References
- Tacken, P. J., Figdor, C. G. Targeted antigen delivery and activation of dendritic cells in vivo: steps towards cost effective vaccines. Seminars in Immunology. 23 (1), 12-20 (2011).
- Kilgore, P. E., Salim, A. M., Zervos, M. J., Schmitt, H. J. Pertussis: Microbiology, Disease, Treatment, and Prevention. Clinical Microbiology Reviews. 29 (3), 449-486 (2016).
- Dorji, D., et al. Bordetella Pertussis virulence factors in the continuing evolution of whooping cough vaccines for improved performance. Medical Microbiology and Immunology. 207 (1), 3-26 (2018).
- Feldstein, L. R., et al. Global Routine Vaccination Coverage, 2016. Morbidity and Mortality Weekly Report. 66 (45), 1252-1255 (2017).
- Cherry, J. D. Epidemic pertussis in 2012--the resurgence of a vaccine-preventable disease. New England Journal of Medicine. 367 (9), 785-787 (2012).
- Celentano, L. P., et al. Resurgence of pertussis in Europe. The Pediatric Infectious Disease Journal. 24 (9), 761-765 (2005).
- McNabb, S. J., et al. Summary of notifiable diseases. Morbidity and Mortality Weekly Report p. 54 (53), 1-92 (2007).
- Sealey, K. L., Belcher, T., Preston, A. Bordetella pertussis epidemiology and evolution in the light of pertussis resurgence. Infection, Genetics, and Evolution. 40, 136-143 (2016).
- Warfel, J. M., Merkel, T. J. The baboon model of pertussis: effective use and lessons for pertussis vaccines. Expert Reviews of Vaccines. 13 (10), 1241-1252 (2014).
- Jennings-Gee, J., et al. The adjuvant Bordetella Colonization Factor A attenuates alum-induced Th2 responses and enhances Bordetella pertussis clearance from mouse lungs. Infection and Immunity. , (2018).
- Sukumar, N., Mishra, M., Sloan, G. P., Ogi, T., Deora, R. Differential Bvg phase-dependent regulation and combinatorial role in pathogenesis of two Bordetella paralogs, BipA and BcfA. Journal of Bacteriology. 189 (10), 3695-3704 (2007).
- Stainer, D. W., Scholte, M. J. A simple chemically defined medium for the production of phase I Bordetella pertussis. Journal of General Microbiology. 63 (2), 211-220 (1970).
- Bordet, J. Le microbe de le coqueluche. Annales de l'Institut Pasteur. 20, 731-741 (1906).
- Cook, M. J. The Anatomy of the Laboratory Mouse. , Academic Press. (1965).
- Sutton, S. Accuracy of Plate Counts. Journal of Validation Techniques. 17 (3), 42-46 (2011).
- Conover, M. S., Sloan, G. P., Love, C. F., Sukumar, N., Deora, R. The Bps polysaccharide of Bordetella pertussis promotes colonization and biofilm formation in the nose by functioning as an adhesin. Molecular Microbiology. 77 (6), 1439-1455 (2010).
- Cattelan, N., Jennings-Gee, J., Dubey, P., Yantorno, O. M., Deora, R. Hyperbiofilm Formation by Bordetella pertussis Strains Correlates with Enhanced Virulence Traits. Infection and Immunity. 85 (12), (2017).
- Andreasen, C., Carbonetti, N. H. Pertussis toxin inhibits early chemokine production to delay neutrophil recruitment in response to Bordetella pertussis respiratory tract infection in mice. Infection and Immunity. 76 (11), 5139-5148 (2008).
- Mills, K. H., Gerdts, V. Mouse and pig models for studies of natural and vaccine-induced immunity to Bordetella pertussis. Journal of Infectious Diseases. 209, Suppl 1 16-19 (2014).
- Dunne, A., et al. A novel TLR2 agonist from Bordetella pertussis is a potent adjuvant that promotes protective immunity with an acellular pertussis vaccine. Mucosal Immunology. 8 (3), 607-617 (2015).
- Denoel, P., Godfroid, F., Guiso, N., Hallander, H., Poolman, J. Comparison of acellular pertussis vaccines-induced immunity against infection due to Bordetella pertussis variant isolates in a mouse model. Vaccine. 23 (46-47), 5333-5341 (2005).
- Marr, N., et al. Protective activity of the Bordetella pertussis BrkA autotransporter in the murine lung colonization model. Vaccine. 26 (34), 4306-4311 (2008).
- Feunou, P. F., Bertout, J., Locht, C. T- and B-cell-mediated protection induced by novel, live attenuated pertussis vaccine in mice. Cross protection against parapertussis. PLoS One. 5 (4), 10178 (2010).
- Mills, K. H., Ryan, M., Ryan, E., Mahon, B. P. A murine model in which protection correlates with pertussis vaccine efficacy in children reveals complementary roles for humoral and cell-mediated immunity in protection against Bordetella pertussis. Infection and Immunity. 66 (2), 594-602 (1998).
- Higgs, R., Higgins, S. C., Ross, P. J., Mills, K. H. Immunity to the respiratory pathogen Bordetella pertussis. Mucosal Immunology. 5 (5), 485-500 (2012).
- Alving, C. R. Design and selection of vaccine adjuvants: animal models and human trials. Vaccine. 20, Suppl 3 56-64 (2002).
- Ipp, M. M., et al. Adverse reactions to diphtheria, tetanus, pertussis-polio vaccination at 18 months of age: effect of injection site and needle length. Pediatrics. 83 (5), 679-682 (1989).
- Fessard, C., Riche, O., Cohen, J. H. Intramuscular versus subcutaneous injection for hepatitis B vaccine. Vaccine. 6 (6), 469 (1988).
- Bergeson, P. S., Singer, S. A., Kaplan, A. M. Intramuscular injections in children. Pediatrics. 70 (6), 944-948 (1982).
- Zhang, L., Wang, W., Wang, S. Effect of vaccine administration modality on immunogenicity and efficacy. Expert Review of Vaccines. 14 (11), 1509-1523 (2015).
- Ross, P. J., et al. Relative Contribution of Th1 and Th17 Cells in Adaptive Immunity to Bordetella pertussis: Towards the Rational Design of an Improved Acellular Pertussis Vaccine. PLoS Pathogens. 9 (4), 1003264 (2013).
- Warfel, J. M., Zimmerman, L. I., Merkel, T. J. Acellular pertussis vaccines protect against disease but fail to prevent infection and transmission in a nonhuman primate model. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 111 (2), 787-792 (2014).
- Allen, A. C., et al. Sustained protective immunity against Bordetella pertussis nasal colonization by intranasal immunization with a vaccine-adjuvant combination that induces IL-17-secreting TRM cells. Mucosal Immunology. , (2018).
- Solans, L., et al. IL-17-dependent SIgA-mediated protection against nasal Bordetella pertussis infection by live attenuated BPZE1 vaccine. Mucosal Immunology. , (2018).
- Miller, M. A., et al. Visualization of murine intranasal dosing efficiency using luminescent Francisella tularensis: effect of instillation volume and form of anesthesia. PLoS One. 7 (2), 31359 (2012).
- Sato, Y., Izumiya, K., Sato, H., Cowell, J. L., Manclark, C. R. Aerosol infection of mice with Bordetella pertussis. Infection and Immunity. 29 (1), 261-266 (1980).
- Warfel, J. M., Beren, J., Merkel, T. J. Airborne transmission of Bordetella pertussis. Journal of Infectious Diseases. 206 (6), 902-906 (2012).
- Scanlon, K. M., Snyder, Y. G., Skerry, C., Carbonetti, N. H. Fatal Pertussis in the Neonatal Mouse Model Is Associated with Pertussis Toxin-Mediated Pathology beyond the Airways. Infection and Immunity. 85 (11), (2017).
- Martinez de Tejada, G., et al. Neither the Bvg- phase nor the vrg6 locus of Bordetella pertussis is required for respiratory infection in mice. Infection and Immunity. 66 (6), 2762-2768 (1998).
- Higgins, S. C., Jarnicki, A. G., Lavelle, E. C., Mills, K. H. TLR4 mediates vaccine-induced protective cellular immunity to Bordetella pertussis: role of IL-17-producing T-cells. Journal of Immunology. 177 (11), 7980-7989 (2006).
- Mahon, B. P., Brady, M. T., Mills, K. H. Protection against Bordetella pertussis in mice in the absence of detectable circulating antibody: implications for long-term immunity in children. Journal of Infectious Diseases. 181 (6), 2087-2091 (2000).
- Karlsson, A. C., et al. Comparison of the ELISPOT and cytokine flow cytometry assays for the enumeration of antigen-specific T-cells. Journal of Immunological Methods. 283 (1-2), 141-153 (2003).
- Hagen, J., et al. Comparative Multi-Donor Study of IFNgamma Secretion and Expression by Human PBMCs Using ELISPOT Side-by-Side with ELISA and Flow Cytometry Assays. Cells. 4 (1), 84-95 (2015).
- Raeven, R. H. M., et al. Molecular and cellular signatures underlying superior immunity against Bordetella pertussis upon pulmonary vaccination. Mucosal Immunology. 11 (3), 1009 (2018).
