Summary
Här presenterar vi ett elegant protokoll för i vivo utvärdering av vaccin effektivitet och värd immunsvar. Detta protokoll kan anpassas för vaccin-modeller som studerar virala, bakteriella, eller parasitic patogener.
Abstract
Vaccin är ett 20th talet medicinsk underverk. De har dramatiskt minskat sjuklighet och dödlighet orsakad av infektionssjukdomar och bidragit till en slående ökning av medellivslängden i världen. Dock fortfarande att fastställa vaccinets effekt en utmaning. Nya bevis tyder på att det nuvarande acellulärt vaccinet (aPV) för Bordetella pertussis (B. pertussis) inducerar suboptimala immunitet. En stor utmaning är därför att utforma nästa generation vaccin som inducerar skyddande immunitet utan de negativa biverkningarna av hela-cell vaccin (wPV). Här beskriver vi ett protokoll som vi använde för att testa effekten av en lovande, Roman adjuvant som förvränger immunsvar mot en skyddande Th1/Th17-fenotyp och främjar en bättre clearance B. pertussis utmaning från murina luftvägarna. Denna artikel beskriver protokollet för mus immunisering, bakteriell Inympning, vävnad skörd och analys av immunsvar. Med denna metod, inom vår modell har vi framgångsrikt klarlagd avgörande mekanismer framkallas av ett lovande, nästa generations acellulärt pertussis-vaccin. Denna metod kan tillämpas på någon smittsam sjukdom modell för att fastställa vaccinets effekt.
Introduction
Vaccin utgör en av de största framgångarna för folkhälsan av 1900-talet, men vi fortfarande helt förstår inte de mekanismer genom vilka framgångsrika vacciner stimulera skyddande immunitet. Identifiering av molekylära signaturer (t.ex., cell aktivering markörer, expansion av cellulära undertyper och mönster av genuttryck) inducerad efter vaccination ger en uppsjö av information för att förutsäga och genererar en effektiv immunsvar. Komplexiteten i värd-patogen Svaren kan inte replikeras på lämpligt sätt använda i vitro cell kultur system1. In vivo vaccin modeller är utformade för att samtidigt utvärdera flera typer av immunceller i värden. Detta ger en fördel vid kännetecknar vaccine antigen bearbetning och presentation, differentiell cytokin sekretion och utbyggnad av immunceller. Protokollet beskrivs här ger en detaljerad metod för att fastställa vaccinets effekt genom utvärdering av systemisk och lokal immunsvaret och kvantifiering av patogen börda i vävnader av intresse. Det exempel som ges här testar effekten av en experimentell vaccin för patogen Bordetella pertussis (B. pertussis).
B. pertussis är en gramnegativ bakterie som är den etiologiska agenten av respiratorisk sjukdom kikhosta (pertussis)2,3. Nära kontakt med infekterade individer (symtomatisk eller asymtomatisk) leder till överföring, colonization och sjukdom. Trots betydande globala vaccin täckning4, kikhosta anses en framvällande sjukdom i många länder runt om i världen och är en viktig orsak till förebyggas barndom dödsfall5,6,7, 8. under 2015 B. pertussis och kikhosta ingick i den nationella institutet för allergi och smittsamma sjukdomar (NIAID) framväxande pathogen/infektionssjukdomar lista, betonar behovet av utveckling av en bättre vaccin som ger långlivat skyddande immunitet.
Ett aktivt område undersökning för att kontrollera kikhosta återkomsten är för närvarande utveckling av nästa generations acellulärt pertussis vaccin (aPV) med en optimal kombination av romanen adjuvans och antigener att efterlikna det immunsvar som framkallas av hela-cellen kikhosta vaccin (wPV)9. Använder protokollet beskrivs rapporterade vi nyligen att ändringen av en nuvarande FDA-godkända aPV genom tillsats av en roman adjuvant, Bordetella colonization faktor A (BcfA), resulterade i mer effektiv minskning av B. pertussis bakteriehalten från mus lungorna10,11. Detta ökade skydd åtföljdes av den skeva av ett alun-inducerad Th1/Th2-immunsvar mot de mer skyddande Th1/Th17 immun profil10. Detta protokoll är detaljerad och heltäckande, gör det möjligt för utredaren att få maximal information genom samtidig utvärdering av värd- och immunsvar mot olika patogener.
Protokollet beskrivs här följer representativa vaccin schemat, visas i figur 1, att säkerställa optimal värd immunsvar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experiment med levande djur genomfördes efter ett protokoll som godkänts av The Ohio State University IACUC enligt IACUC riktlinjer. C57BL/6 möss användes i alla vaccinationer och infektioner. Såväl kvinnliga som manliga möss används i varje grupp enligt NIH riktlinjer. Antalet djur per grupp bestämdes av power beräkningar baserade på förväntade skillnader i resultatet mellan experimentella grupper. Exempelvis 8 möss per grupp kommer att ge 80% effekt vid α = 0,05 (2-sided) för 2-sample t- test för att upptäcka skillnader i resultatet av intresse av 1,33 standardavvikelser (SDs).
1. immunisering av möss
- Förbereda en master vaccin blandning i en steril fysiologisk buffert såsom koksaltlösning eller DPS.
Obs: Den totala volymen i mixen bör innehålla 10% mer än vad som krävs för immunisering av hela gruppen. Koncentrationer av vaccin sammansättningen beskrivs nedan i steg 1.1.1 och 1.1.2. Transportera poster till ett vivarium på is.- För B. pertussis studier, inkluderar följande vaccin grupper: aPV och aPV + BcfA. Dessutom använda alun, vaccinantigen ensam (FHA och Prn) och naiv (icke-immuniserade) möss som kontrollgrupper.
Obs: aPV är 1/5th den humana dosen av ett FDA-godkända aPV, som består av tetanustoxoid, minskad difteritoxoid, kikhosta tetanustoxoid (PT), fintrådiga hemagglutinin (FHA) och pertaktin (Prn) adsorberas till aluminiumsalter. En dos om nuvarande kikhosta aPV är 0,5 mL, alltså 1/5th av en dos är 0,1 mL. Volymer för aPV + BcfA är 0,1 mL för aPV (1/5: e dosen till människa) + 0.046 mL BcfA (30 µg) per mus. Den maximala volym som säkert kan levereras till en muskel är 0,1 mL. Eftersom den aPV + BcfA vaccin volym är större än 0,1 mL, vaccinet måste levereras i båda axlarna, fördelas ungefär lika, för att administreras säkert. - För att förbereda en experimentell vaccin, för en dos kombinera 1 µg av FHA och 0,5 µg Prn med 50 µg aluminiumhydroxid gel i steril fosfatbuffrad Koksaltlösning. Tillåta experimentella aPV att blanda om en laboratorium roller under 15 minuter vid rumstemperatur (RT). Efteråt, snurra röret vid 18.000 x g under 5 minuter vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten och återsuspendera innehållet i 1 mL steril fosfatbuffrad Koksaltlösning.
- För B. pertussis studier, inkluderar följande vaccin grupper: aPV och aPV + BcfA. Dessutom använda alun, vaccinantigen ensam (FHA och Prn) och naiv (icke-immuniserade) möss som kontrollgrupper.
- I ett vivarium, ställa in maskinens anestesi (figur 2).
Anmärkning: Se till att det finns tillräckliga nivåer av syre och isofluran i deras respektive tankar före användning. Väga isofluran gatsopare behållaren och ersätta när dess vikt ökar med 50 g. - Rengör skåpet biologisk säkerhet (BSC) och placera den rena induktion kammaren inuti BSC noggrant. Anslut raderna anestesi och gatsopare från anestesi maskin till induktion kammaren. Öppna den syre tank via regulatorn att säkerställa syre flödar och att ställa in på 1,5-2 L/min.
- Placera möss önskad ålder (6-12 veckor) i induktion kammaren. Slå på isofluran till 2,5-3% för att lätt söva möss. Övervaka djuren tills de inte rör sig i kammaren och deras andning har avtagit.
- Testa nivån av induktion av tå-klämmande, observerar för reflexiv rörelse. Om det ingen finns, då är mössen redo att injicera.
Obs: I detta experiment, hela buren av djur var sövda på en gång. Man kan välja att söva djur individuellt injektionsvätska eller att injicera djur utan bedövning. Någon av dessa metoder är lämpliga. - Under tiden Förbered 1 mL insulinsprutor (28G 1/2) med 0,1 mL vaccin varje. När djur induceras helt, ta bort ett djur från kammaren och lägga musen ventralt på en handduk eller bänk pad.
- Administrera vaccinet intramuskulärt. Med sprutan i 45° vinkel och med avfasningen uppåt, sätt in sprutan ~ 5 mm i deltoideus musen och injicera vaccinet.
Obs: Hind kvartalet/flanken kan användas som injektionsställe istället för deltoideus. - Håll nålen isatt i muskeln för ~ 5-10 s efter injektionen. När volymen levereras, rotera sprutan vid 180° så att avfasningen ansikten bort för att skapa en tätning och förhindra läckage av vaccinet. Sedan långsamt dra ut nålen från injektionsstället.
- Återgå musen till buren. Upprepa proceduren med alla djur i den valda gruppen.
- Stänga av isofluran och spola induktion kammaren med syre innan anesthetizing nästa buren av möss.
- Övervaka djuren tills de är alla alert och rörliga i buren. Returnera buren till platsen för bostäder.
- Övervaka djur varje 12 h efter vaccinationen, upp till 48 h, för kliniska symtom av morbiditet såsom grov/ovårdade coat, slow gait eller ansträngd andning. Om symptom kvarstår, konferera med den institutionella veterinären och ta bort mössen från studien om det behövs.
- Fyra veckor efter inledande immunisering, öka möss genom anesthetizing och administrerar intramuskulära injektioner i rätt deltoideus av musen med samma vaccin formulering som gavs tidigare.
- Igen, övervaka djur för några kliniska symtom. Hus djur för ytterligare 2 veckor och fortsätt sedan med infektion.
2. tillväxt av B. pertussis stammar och förberedelse av infektion inokulum
- Från fryst lager [fryst tillstånd vid-80 ° C i 15% glycerol, fryst från plankton ökningen Stainer-Scholte (SS) media12], strimma ut B. pertussis på Bordet-Gengou (BG)13 agarplattor kompletteras med 10% defibrinated fårmjölk blod och 100 µg/mL streptomycin (10% BG + Sm) för urval. Inkubera plattan vid 37 ° C i 4 dagar.
- Plocka ~ 8-10 enskilda kolonier nomenklaturkod från plattan och Inokulera 3 mL SS media kompletteras med 22,8 mM L-cystein, 3.6 mM järnsulfat, 3,3 mM niacin, 48,8 mM glutation, 227 mM askorbinsyra, 1 mg/mL heptakis och 100 µg/mL streptomycin. Växer kulturen vid 37 ° C i en rulle trumma vid 60 rpm för 16-24 h.
- Nästa dag, späd den primära kultur 1:600, 1:300, 1:120, 1:60, 1:30 och 1:15 i 3 mL kompletterade SS media. Inkubera kulturen vid 37 ° C i rullen trumma vid 60 rpm för 16-24 h.
- Utföra optisk densitet mätningar på 600 nm (OD600) för bakteriekulturerna. Med spektrofotometer kyvetter, späd kulturer 1:10 genom att tillsätta 0,1 mL av de flytande kulturerna till 0,9 mL steril fosfatbuffrad Koksaltlösning.
- Välj en kultur med OD600≈ 0,8-1,2. Beräkna volymen krävs för att få 1 OD (figur 3). Snurra ner volymen i ett 1,5 mL mikrocentrifug rör vid 6000 x g i 5 min vid 25 ° C. Aspirera supernatanten och återsuspendera bakteriell cellpelleten i 1 mL steril fosfatbuffrad Koksaltlösning att erhålla en densitet av 1 OD/mL [1-3 x 109 kolonibildande enheter (CFU) / ml].
- Att förbereda ett inokulum ~ 5 x 105 till 1,5 x 106 CFUs/mus i 40-50 µL, vortex och seriellt späd bakteriell lösningen (från steg 2.5) 100-fold i 1 mL steril fosfatbuffrad Koksaltlösning att uppnå ~ 1-3 x 107 CFUs/mL (figur 4A). Transportera inokulatet till ett vivarium på is.
3. murina intranasalt infektion modell
- I ett vivarium, ställa syre och anestesi villkor som beskrivs i steg 1.3 och 1.4. Som beskrivs i steg 1,5, placera möss i kammaren att söva. Övervaka djuren tills anestesi träder i kraft.
- När mössen är sövda, ta bort ett djur i taget från induktion kammaren. Plocka upp musen av kragen av dorsala bröstkorgen, bakom skulderbladen och nacken. Placera musen upprätt för att komma åt näsan.
- Använder en 200 µL pipettspetsen, långsamt gälla 40-50 µL av det bakteriella inokulatet näsborrarna av musen (20-25 µL i varje nare). Håll musen tills det hela inokulatet har inhalerats av djuret. Om några av inokulatet bubblor ut, samla bubblor och åter ingjuta i näsborrarna. Leverera en lika stor mängd steril fosfatbuffrad Koksaltlösning till en grupp av möss som negativ kontroll.
- Som gjort i steg 1.10-1.12, återvända de vaccinerade djuren till deras bur och övervaka djuren tills de är pigga och rörliga. Tillbaka buren till dess ursprungliga bostäder utrymme på sträckbänken. Spola induktion kammaren med syre och ta bort de kvarvarande isofluran innan anesthetizing nästa uppsättning av djur. Övervaka djuren för 48 h efter infektion.
- I laboratoriet, tallrik seriespädningar av inokulatet, i steril fosfatbuffrad Koksaltlösning, att kontrollera de faktiska CFUs som levereras till möss. Tallrik 0,1 mL av spädningar på 10% BG + Sm plattor (figur 4A). Placera plåtarna i 37 ° C inkubatorn och växa i 4 dagar. Räkna och beräkna CFUs från den inokulum som levereras till musen (figur 4B).
4. upptagning av animalisk vävnad efter infektion
- Förbereda för mus dissektion och vävnad skörd.
- Sterilisera alla verktyg (grova och fina sax böjd sax, fin pincett, pellet mortlar och triangel spridare) som behövs för bearbetning av vävnader i en autoklav. Försegla verktygen i sterilisering påsar. Linda glas dounce Homogenisatorer i folie och lägga till autoklavera band för att indikera sterilitet.
- Förbereda agar plattor 1 eller 2 dagar före skörden vävnad så att plattorna är stelnad före användning. För B. pertussis, använda 10% BG + Sm. etikett plattor för nässkiljeväggen, luftstrupen och lungorna för varje mus med önskad spädningarna, bestäms empiriskt för varje experiment.
- Fylla och etiketten CFU utspädning rör. Lägg till 0,9 mL steril PBS sterila 1,5 mL mikrocentrifug rör baserat på antalet organ till processen och spädningar per orgel.
- Fyllnings- och etikett rör för vävnad samling:
- Nässkiljeväggen och luftstrupen: Fyll en steril 1,5 mL mikrocentrifug rör med 0,3 mL steril 1% kasein i PBS (Ca2 + och Mg2 +-gratis). Förvaras vid 4 ° C.
- Lungor: Tillsätt 2 mL steril 1% kasein i PBS till en steril 15 mL koniska rör och förvaras vid 4 ° C. För att skörda lungorna för histologi, tillsätt 2 mL i 10% neutral buffrad formalin (NBF) och lagra på RT.
- Mjälte: tillsätt 3 mL RPMI + 5% FBS till ett 15 mL koniska rör. Förvaras vid 4 ° C.
- Blod: etikett två uppsättningar av sterila 1,5 mL mikrocentrifugrör, en för helblod och en för serum.
- Färsk 70% etanol bör vara beredd att fylla bägarna och spray flaskor för dissektion.
- Transportera alla material till ett vivarium på en vagn på dagen för skörd. Rengöra BSC och ställa in anestesi maskinen som i steg 1.3 och 1.4.
- Placera på möss för att vara dissekeras i induktion kammaren och, med syre flyter, aktivera isofluran till 5% och vänta tills djur är medvetslösa. Ta bort möss en i taget, och cervically dislocate djuret som en sekundär metod för att se döden. Efter cervikal Dislokation, eutanasi bör bekräftas genom avsaknad av en andningsfrekvens eller avsaknad av tillbakadragande reflexen (tå nypa test).
- Placera den mus, ventrala sidan uppåt, i dissekering styrelsen och fästa armar och ben öppen. Spraya ner kroppen av musen med 70% etanol.
- Med pincett, lås huden under buken, i mitten av bäckenet. Med vass sax, göra ett vertikalt snitt upp till underkäken. Sedan dissekera huden från peritoneal väggen genom att trycka de två lagrarna apart, med små rörelser med saxen stängt. Plats huden att sidorna av stommen för att skapa en obehindrad fält för sterila orgel skörd.
- Förstå intakt bukhinnan nedanför revbenen vid eller runt levern och skär den öppen mot bröstkorgen. Utsätta den nedre mag-tarmkanalen och flytta tjocktarmen till vänster avslöjar mjälte. Använda böjda pincetten, förstå mjälte och dissekera bort bindväv med sax. Plats mjälte i en 15 mL koniska rör innehållande 3 mL RPMI + 5% FBS och plats röret på is.
- Använda pincett för att stabilisera bröstkorgen på den xiphoid processen och skar upp membranen. Lungorna bör tömmas och falla mot ryggraden. Skar upp bröstkorgen på sidorna för att ta bort bröstet plattan.
- Isolera och ta bort den överlägsna LOB i den högra lungan14, skära pulmonell artärer och vener. Placera LOB i en 15 mL koniska rör som innehåller 10% NBF och plats röret på RT under minst 24 h för att fixa vävnaden. Isolera de återstående loberna i den högra lungan och den vänstra lungan. Placera lober i en 15 mL koniska rör innehållande 2 mL 1% kasein i PBS och placera det på is.
- Efter styckning pulmonell vener och artärer att dissekera ut lungorna, Tillåt brösthålan att fylla med blod som musen exsanguinates. Använder en 1 mL pipetman med spets, samla in blod och överför det till pre märkta 1,5 mL mikrocentrifug röret. Placera röret på is.
- Ta sedan bort den mjuka vävnaden (parotis, sublinguala och mandibular körtlar och lymfkörtlar) som täcker luftstrupen från halsen. Öppna och ta bort de skyddande membran som omger luftstrupen. Försiktigt, med fin pincett och sax, separat luftstrupen från matstrupen och eventuella andra bindväv från toppen av nyckelben till botten av underkäken.
- Med pincett, håller att luftstrupen och skär luftstrupen överst på nyckelbenet. Dra luftstrupen ner att maximera elasticitet och skär luftstrupen längst ned i underkäken precis ovanför struphuvudet, isolera så mycket som möjligt (~ 1 cm). Placera orgeln i ett pre-märkta 1,5 mL mikrocentrifug rör med 0,3 mL 1% kasein i PBS och placera det på is.
- Ta bort musen och lägga den ventralt, med musen inför forskaren för tydlig tillgång till näsan. Spray huvudet av musen med 70% etanol, och med händerna tag musen direkt bakom skallen.
- Med sax, klippa bort mjuka köttet av nosen, start från botten av näsan och flyttar uppåt. Dessutom bort päls, hud, och morrhår runt näsan. Sedan, med böjd sax och pincett, infoga tips av sax i nares med kurvor pekade utåt och uppskuren i nasal passage mot ögonen, skapa en V-liknande formation.
- Med fin pincett, samla nässkiljeväggen och mjuk vävnad inom skapade bildandet. Placera vävnaden i ett pre-märkta 1,5 mL mikrocentrifug rör med 0,3 mL 1% kasein i PBS och placera det på is.
- Förfoga över kadavret i en biohazard väska. Skölj verktyg med avjoniserat vatten innan dissekera nästa djuret, och placera i en bägare fylld med 70% etanol. Ta bort verktyg, skaka av överflödigt etanol och fortsätt sedan med nästa dissektion
- Dissekera varje mus efter steg 4,3-4.14.
- Bearbeta vävnaderna som beskrivs nedan.
5. behandling av mjälte
- För att separera mjälte, placera en 70 µm cell sil i en 60 mm vävnadsodling maträtt. Häll mjälte och medföljande media i filtret, hjälp kolven i en 3 mL spruta. Noggrant mosa orgeln tills det är helt separerade och filtreras genom cell sil.
- Skölj filtret med 3 mL RPMI + 5% FBS i vävnadsodling skålen. Samla cellsuspensionen och placera den i dess ursprungliga 15 mL tub. Centrifugera rören vid 450 x g i 5 minuter vid 4 ° C till pellet cellerna.
- Aspirera eller Dekantera supernatanten och lysera röda blodkroppar genom omblandning pelleten i 2 mL ammoniumklorid kalium (ACK) buffert (150 mM ammoniumklorid, 10 mM kaliumbikarbonat, 0,1 mM natrium EDTA). Inkubera under 3 min vid RT (25 ° C).
- Fyll rören upp till 8 mL med RPMI + 5% FBS och centrifugera rören på 450 x g under 5 minuter vid 4° C. Aspirera eller Dekantera supernatanten. Återsuspendera cell pellets i 5 mL RPMI + 5% FBS och räkna de splenocytes med en hemocytometer och Mikroskop.
- Beräkna volymen av celler som behövs för att stimulera 2,5 x 106 celler per brunn. I en 48-well platta, utsäde cellerna i 0,5 mL av T-cell media (RPMI 1640 + 10% FBS, 10 µg/mL gentamicin och 50 µM β-merkaptoetanol) per brunn.
- Baserat på ovanstående beräkning, placera volymen som krävs av cellsuspensionen i en frisk slang och pellet-celler på 450 x g under 5 minuter vid 4 ° C.
- Återsuspendera pelleten i volymen som krävs av T-cell media. För en B. pertussis infektion modell, testa vaccinantigen antigen-specifika cytokin svar: pertaktin (Prn) och fintrådiga hemagglutinin vidhäftning (FHA). Därför, 3 behandlingar behövs: (1) ingen stimulering (NS, som negativ kontroll), 2) Prn och 3) FHA. För analysen är 7,5 x 106 celler i 1,5 mL T-cell media krävs (2,5 x 106 celler per 0,5 mL).
- Alikvotens 0,5 mL cellsuspension till en 48-bra platta.
- För att stimulera celler, blanda antigener på 2 gånger önskad koncentration i T-cell media. Slutliga koncentrationer av Prn och FHA = 1 µg/mL och 0,5 µg/mL, respektive. Därför blanda 2 µg/mL Prn eller 1 µg/mL FHA i 0,5 mL. Sedan, alikvotens 0,5 mL av stimulering medium i varje särskilt väl, späda antigen behandling till 1 x i en slutlig volym av 1 mL i varje brunn.
- Inkubera plattorna vid 37 ° C i 5% CO2. Samla supernatanterna på dag 7 och alikvotens 0,5 mL supernatanterna i förväg märkt mikrocentrifugrör. Lagra proverna i en-20 ° C tills det att testa antigen-specifika cytokiner av ELISA (figur 6).
6. behandling av lungorna
- Över lungorna (i 2 mL 1% kasein i PBS) till en steril, 15 mL dounce Homogenisatorer. Använd mortel att homogenisera vävnad. Avstånd tills inga stora partiklar av vävnad kvar. Placera den homogeniserade suspensionen tillbaka i den ursprungliga 15 mL tub.
- Ta bort en 0,3 mL alikvotens för plätering CFUs och centrifugera Homogenatet på 450 x g under 5 minuter vid 4 ° C. Samla och alikvot supernatanten i 0,5 mL alikvoter i förväg märkt mikrocentrifug rör. Lagra proverna i en-20 ° C fram till analys av cytokiner av ELISA.
- Förbereda valda utspädningar av seriellt späda 0,1 mL homogeniserad lung suspensionen i utspädning rör (0,9 mL steril fosfatbuffrad Koksaltlösning). Plattan 0,1 mL av empiriskt valt spädningar på förhand märkt 10% BG + Sm plattor och spridning med hjälp av sterila triangel spridare.
- Inkubera plattorna vid 37 ° C i luften i 4 dagar.
- Räkna och beräkna CFUs/lung (figur 6). Kort, multiplicera återvunna CFU tal av utspädningsfaktorn för plattan, sedan också den totala volymen där orgeln bearbetades. CFU beräkningarna är sedan omvandlas till Log10 värden för varje djur och ett diagram.
- Plattor med 30-300 kolonier räknas enkelt och exakt. Plattor med mindre än 6 kolonier bör inte användas för beräkningar eftersom sådana låga kolonin nummer införa fel15. För att få en lägre detektionsgräns, delas den totala volymen som en orgel var homogeniserad av volymen används till plats på en tallrik från outspädd Homogenatet (t.ex., 2 mL totalvolym dividerat med 0,1 mL outspädd Homogenatet är lika med den nedre gränsen för 20 CFUs detekterbara).
7. behandling av nässkiljeväggen och luftstrupen
- Homogenisera vävnaden i 1% 0,3 mL PBS/kasein med pellet mortelstöt sladdlös motor Homogenisatorer. Homogenisera vävnaden för 0,5-1 min tills vävnaden är till stor del skiljas. Bakterier bör spridas i suspensionen.
- Förbereda valt 10 x utspädningar av seriell utspädning av 0,1 mL homogeniserad suspensionen i spädningar rör som innehåller 0,9 mL steril PBS. Dot 0.1 mL av varje på förhand märkt 10% BG + Sm plattor och sprida suspensionen med hjälp av en triangel-spridare som har steriliserats genom en 70-procentig etanol wash och lågan.
- Inkubera plattorna vid 37 ° C i luften i 4 dagar.
- Räkna och beräkna CFUs/orgel som i steg 6,5 (figur 6). För att få en lägre detektionsgräns, delas den totala volymen som en orgel var homogeniserad av volymen används till prick på en tallrik från outspädd Homogenatet (t.ex., 0,3 mL total volym dividerat med 0,1 mL outspädd lika med den nedre gränsen för 3 CFUs detecta ble).
8. bearbetning av blod
- Centrifugera rören som innehåller isolerade helblod vid 18.000 x g i 30 minuter vid 4 ° C till pellet röda blodkroppar.
- Tag försiktigt av serum supernatanten och Pipettera till en pre märkt serum mikrocentrifug rör. Förvara rören i-20 ° C tills den för vidare nedströms analys (dvs., total och specifik Ig ELISA).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Modellen beskrivs visar en metod för att utvärdera vaccin effektivitet och immunsvar under host-patogen interaktioner. Figur 1 illustrerar den representativa vaccin schema används för att vaccinera och infekterar möss och skörda vävnader för analys. Figur 2 visar inställningen av anestesi systemet sysselsatt att inducera möss, aktivera utredarna att leverera vaccinationer och bakteriell inoculums. Figur 3 visar exempel OD600 mätningar och beräkningar för att uppnå en 1 OD bakteriesuspension för att förbereda 100-faldig utspädning bakteriell inokulum ska levereras till möss. Figur 4 illustrerar inokulum preparatet används för infektionen, plätering systematiken i de seriella utspädningarna och exempel beräkningar används för att räkna upp CFUs levereras till möss utifrån plätering seriespädningar. Figur 5 visar antigen-specifika recall svar framkallas när sju dagar av stimulering med vaccin antigenet FHA. Vaccinera mjältceller från gruppen kombination vaccin alun/FHA/BcfA, producerade IFNγ och IL-17, medan betydligt downregulating IL-5. Denna effekt främjar en Th1/Th17 polarisering av immunsvaret under B. pertussis infektion. Bakgrundsnivåer av cytokiner producerades av inkubering av immuniserade mjältceller med media ensam, vilket indikerar att de cytokiner som upptäckts recall Svaren till immunisering (inga data anges). Figur 6 visar ett exempel CFU uppräkning av bakterier som återhämtat sig från luftvägarna vävnader i en immuniserade musen, använda seriespädningar av B. pertussis vävnad homogenates pläterade på 10% BG + Sm plattor. Råa räknas multiplicerades med utspädning faktor och totala volymen av vävnad lysate data var loggen omvandlas. CFUs från immuniserade djur jämförs sedan med icke-immuniserade (naiva) djur att avgöra den skyddande effekten av vaccinet.
Figur 1 : Representativa vaccin schema. Möss är immuniserats på dag 0 och sedan förstärkt ~ 4 veckor senare (d28) med lämpliga aPV. Infektion i möss med B. pertussis uppstår ~ 2 veckor (d42) efter öka möss. Efter infektion dödas djuren på olika dagar (d43-56) efter inympningen. Vävnad och blod samlas för efterföljande analys (t.ex., CFU uppräkning, cytokin och antikropp ELISAs). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: anestesi maskinställ. Visas är ett bedövningsmedel spridare med bifogade induktion kammare och gatsopare system (inuti biologisk säkerhet skåp). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Beredning av 1 OD600 bakteriesuspensionen. OD600 värden erhölls från utspädda primära B. pertussis kulturer. En kultur i loggen fas användes för att beräkna volymen som krävs för att erhålla en kultur på 1 OD600 kultur för infektion. Kort, en OD600 1 delades av den beräkna OD600 av önskad kultur till en total volym om 1 OD användas för infektion. Kort, var en OD600 1 dividerat med de beräknade OD600 av önskad kultur till en total volym om 1 OD användas för infektion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Beräkning av levererade intranasalt inokulatet. (A) Schematisk bild av seriell utspädning av infektion inokulatet som späds till 10-4, 10-5och 10-6. Dessa utspädningar pläterade på 10% BG + Sm, inkuberas i 4 dagar vid 37 ° C och sedan räknas. (B) räknas från 10-4, 10-5och 10-6 utspädningar används sedan för att beräkna intranasalt levererade CFUs. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 : Cytokin produktion av mjältceller immuniserats med FHA, alun/FHA, BcfA/FHA och alun/BcfA/FHA. Dissocierade celler odlades med FHA i 7 dagar. Supernatanterna testades av sandwich-ELISA för a IFN-γ, (B) IL-17 och (C) IL-5. Fel barer uttrycks som standardavvikelsen för medelvärdet för varje grupp, n = 5 per grupp. p < 0,001. Siffran är anpassade från en tidigare publikation10. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 : B. pertussis CFUs och beräkningar från skördade vävnad från möss. (A) B. pertussis CFUs från homogeniserade mus vävnad. 0,1 mL seriespädningar inkuberas vid 37 ° C i 4 dagar. (B) beräkningar på grundval av CFUs som erhållits från homogeniserade luftstrupen. CFUs var multiplicerat med respektive utspädning och sedan multipliceras med 10 för att uppnå CFUs per mL. För att erhålla CFU per orgel, var CFUs per mL multiplicerat med den totala volymen där orgeln var homogeniserad (0,3 mL). CFUs per orgel var då log omvandlas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den omfattande protokoll som beskrivs här för att studera vaccin-inducerad immunitet mot B. pertussis infektion kommer också att tillåta utvärdering av värd Svaren till en mängd andra patogener. Protokollet beskrivs metoder att leverera vaccinationer, avgöra vaccin effekt följande patogener utmaning, och parallella dissekering av immunförsvaret. Anpassa protokollet för att studera andra patogener, skulle flera parametrar behöva ändras. Dessa inkluderar, men är inte begränsade till, funktionsläget av animaliskt anestesi, vaccin sammansättning, DOS och administreringssätt. Dessutom är den dosen och administrationssätt för intresse, valda vävnad för skörd utmanade patogen och efterföljande utvärdering av immunsvar faktorer som kan ändras för patogen/sjukdomen av intresse.
Musmodell av B. pertussis infektion används flitigt och är en utmärkt modell för patogenes och vaccinologi studier16,17,18,19,20. Murina modeller uppvisar många likheter med mänskliga infektion, inklusive: (i) bakterier är begränsade till luftvägarna och föröka sig snabbt, ii) unga djur Visa jämförelsevis svåra infektioner, iii) bra korrespondens mellan vacciner som skyddar barn mot kikhosta och dem som skyddar möss mot infektion, och iv) B. pertussis-specifika T-celler och antikroppar medla naturliga och vaccin-inducerad skyddande immunitet21,22, 23 , 24. därför murina modellen tillåter studier av immunisering effekter på bakteriell clearance25. En annan fördel med att använda möss till modell B. pertussis infektioner är tillgången på genetiskt modifierade knockout och transgena djur att studera kritiska spelare i vaccin-inducerad immunsvar19,26.
Majoriteten av vaccinationer administreras parenteralt, särskilt via intramuskulär (i.m.) vägen. Denna väg är att föredra eftersom det framkallar systemiska immunitet med minimal lokala reaktogeniciteten27,28,29. Alternativ till intramuskulära injektioner inkluderar subkutana (s.c.) eller intraperitoneal (IP) leverans, som också få systemiska Svaren. Subkutan rutter är också lockande, eftersom det finns en stor population av bosatta antigenpresenterande celler (APC) inom dermis med tillgång till kärl och lymfatiska system30. Intradermala leverans har dock inte undersökts för kikhosta vaccinet. Intraperitoneal leverans av experimentella aPV genererar liknande immunitet till intramuskulär immunisering31 och är en pålitlig injektion rutt för murina studier, om än det är opraktiskt för klinisk användning.
Detta protokoll använder tredjeparts i.m. immunisering rutten, som ger skydd i lungorna, men inte i nasofarynx32. Nyligen genomförda studier har visat att ett vaccin intranasalt (i.n.) främjar en lokal, mucosal immunsvar som skyddar övre och nedre luftvägarna, särskilt näsan, som fungerar som en reservoar för bakterierna som därefter kan överföras till andra värd33. I.n. immunisering har dessutom visat att generera vävnad resident minne som inte genereras av systemisk immunisering33,34. Därför beror valet av vaccin administrationssätt mycket på vilken typ av vaccin och immunsvar som krävs för att skydda mot sjukdom.
Den intranasala bakteriell leverans som beskrivs i detta protokoll är en allmänt använd metod för luftvägspatogener som säkert och konsekvent levererar en bakteriell inokulum direkt in i luftvägarna hos sövda möss. Våra protokollet använder en dos med hög volym (40 – 50 µL) som inhaleras i nasofarynx och resor in i de nedre luftvägarna. En låg volym inokulatet (10-20 µL) skulle kolonisera nasofarynx, men koloniseringen av lungorna blir minimal35. Dock inandning av B. pertussis-innehållande luft droppar anses det naturliga läget av infektion av individer och överföring. Detta administreringssätt har använts i olika djurmodeller36,37. För att uppnå jämförbara nivåer av infektion direkt i.n. Inympning, är betydligt högre koncentrationer av den bakteriella inokulatet (109-1011 CFUs/mL) och leveranstiden krävs38.
För att fastställa koloniseringen av mus luftvägarna, använder detta protokoll färska bakterier, odlas i flytande kultur så att bakterier används för inympning är i fasen virulent och replikerar i loggen scenen. Praktiker kan också använda ett inokulum från förtitrerad, fryst lager. Detta möjliggör en kunskap om de CFUs som administreras till musen. Bakterierna i dessa inoculums kan dock i den icke-virulent fasen, som kan minska effektiviteten i luftvägarna colonization39. Efter infektionen, är inokulatet klädd för att fastställa den bakteriella CFUs levereras till musen. Utredarna kan också välja att platta inokulatet före i vivo infektionen att säkerställa bärkraften av bakterier och bekräfta dos av inokulatet.
Efter infektion räknas bakteriell CFUs av homogenisering isolerade vävnad från offrade möss vid en förutbestämd tidpunkt. En nackdel med denna metod är dess oförmåga att kinetiskt spåra patogen CFUs för en angiven uppsättning möss. Forskare måste använda flera grupper av djur som offras vid olika tidpunkter för att granska vaccin-inducerad bakteriell begränsning. Antalet möss i varje experiment varierar beroende på antalet tidpunkter att undersöka och önskad effekt storlek. Detta kan medföra ökad biologisk variation. Integrering av en självlysande eller fluorescerande reporter gen i patogen intresse kommer att tillåta icke-invasiv övervakning av tillväxt och spridning i vivo i hela loppet av infektion35. Denna metod minskar biologisk variation och minimerar antalet krävs för försöksdjur, eftersom longitudinella data hämtas från samma grupp av djur.
Den vävnad dissociation och homogenisering protokoll som anställd här för luftvägarna vävnader är även tillämplig för kolonin uppräkning av andra fasta vävnader såsom lever, njure, tarmen eller blåsan att förhöra platser av infektion och spridning av patogener av intresse.
Tillsammans med CFU uppräkning gör detta protokoll karakterisering av immunsvar som framkallas av immunisering och naturlig infektion. Specifikt, kvantifiering av cytokiner produceras systemiskt och möjliggöra lokalt bestämning av effektiv immun profiler som följd av immunisering. Cytokiner är Immunmodulerande medel att främja cellulära tillströmning till drabbade vävnader och aktivering av cellulär immunitet, samt ger hjälp för generering av humorala svar10,40,41. Användning av detta protokoll, upptäcks cytokiner produceras i olika vävnad fack, såsom lunga och mjälte. Även om inte visas här, gäller även protokollet stimulering för utvärderingen av svaren i dränerande lymfkörtlarna.
ELISA analys tillåter identifiering och kvantifiering av cytokiner i media supernatanterna eller blandade suspensioner (dvs., homogenates eller serum), ger information på populationsnivå och karaktärisera antigen-specifika cytokin svar från en blandad cellkultur vid bestämda tidpunkter. Däremot metoder som ELISPOT eller flödescytometri medger utvärdering av antalet celler som producerar en analyt och nivån på uttryck per cell42,43. Även om inte beskrivs här, gäller även dessa metoder för påvisande av antigen-specifika B-celler. Kombinationen av CFU uppräkning och immunologiska analyser ger fullständig bild av svar till immunisering.
Andra analyser som kan utföras med denna infektion protokollet omfatta epigenetiska eller transcriptomic analys när DNA och RNA erhållits från vävnader av intresse44. Således, med övervägande av den lämpliga vaccin sammansättning, immunisering och patogen leveransväg, detta protokoll är mångsidig i dess genomförande och enkelt lämpad för olika modeller av infektion. Dessa tekniker är också tillämpliga på icke-smittsamma sjukdomar (dvs. cancer, multipel skleros, astma, autoimmuna sjukdomar) där vacciner används som en terapeutisk modalitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av 1R01AI125560-01 och nystartade fonder från The Ohio State University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2L induction chamber | Vet Equip | 941444 | |
| Fluriso | Vet One | V1 501017 | any brand is appropriate |
| Bordet Gengou Agar Base | BD bioscience | 248200 | |
| Casein | Sigma | C-7078 | |
| Casamino acids | VWR | J851-500G | Strainer Scholte (SS) media components |
| L-Glutamic acid | Research Products Int | G36020-500 | |
| L-Proline | Research Products Int | P50200-500 | |
| Sodium Chloride | Fisher | BP358-10 | |
| Potassium Phosphate monobasic | Fisher | BP362-1 | |
| Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | |
| Magnesium Chloride hexahydrate | Fisher | M2670-500G | |
| Calcium Chloride | Fisher | C75-500 | |
| Tris base | Fisher | BP153-1 | |
| L-cysteine HCl | Fisher | BP376-100 | SS media suplements |
| Ferrous Sulfate heptahydrate | Sigma | F-7002 | |
| Niacin | Research Products Int | N20080-100 | |
| Glutathione | Research Products Int | G22010-25 | |
| Ascorbic acid | Research Products Int | A50040-500 | |
| RPMI 1640 | ThermoFisher Scientific | 11875093 | |
| FBS | Sigma | F2442-500mL | any US source, non-heat inactivated |
| gentamicin | ThermoFisher Scientific | 15710064 | |
| B-mercaptoethanol | Fisher | BP176-100 | |
| 15mL dounce tissue grinder | Wheaton | 357544 | any similar brand is appropriate |
| Cordless Hand Homogenizer | Kontes/Sigma | Z359971-1EA | any similar brand is appropriate |
| Instruments - scissors, curve scissors, forceps, fine forceps, triangle spreaders | any brand is appropriate | ||
| 3mL syringes | BD bioscience | 309657 | |
| 15mL conical tubes | Fisher | 339651 | |
| 1.5mL microfuge tubes | Denville | C2170 | |
| 70um cell strainers | Fisher | 22363548 | |
| 60mm plates | ThermoFisher Scientific | 130181 | |
| 48-well tissue culture plates | ThermoFisher Scientific | 08-772-1C | |
| 1mL insulin syringe 28G1/2 | Fisher Scientific/Excel Int. | 14-841-31 | |
| Mouse IFN-gamma ELISA Ready-SET-Go! Kit | Invitrogen / eBioscience | 50-173-21 | |
| Mouse IL-17 ELISA Ready-SET-Go! Kit | Invitrogen / eBioscience | 50-173-77 | |
| Mouse IL-5 ELISA Ready-SET-Go! Kit | Invitrogen / eBioscience | 50-172-09 |
References
- Tacken, P. J., Figdor, C. G. Targeted antigen delivery and activation of dendritic cells in vivo: steps towards cost effective vaccines. Seminars in Immunology. 23 (1), 12-20 (2011).
- Kilgore, P. E., Salim, A. M., Zervos, M. J., Schmitt, H. J. Pertussis: Microbiology, Disease, Treatment, and Prevention. Clinical Microbiology Reviews. 29 (3), 449-486 (2016).
- Dorji, D., et al. Bordetella Pertussis virulence factors in the continuing evolution of whooping cough vaccines for improved performance. Medical Microbiology and Immunology. 207 (1), 3-26 (2018).
- Feldstein, L. R., et al. Global Routine Vaccination Coverage, 2016. Morbidity and Mortality Weekly Report. 66 (45), 1252-1255 (2017).
- Cherry, J. D. Epidemic pertussis in 2012--the resurgence of a vaccine-preventable disease. New England Journal of Medicine. 367 (9), 785-787 (2012).
- Celentano, L. P., et al. Resurgence of pertussis in Europe. The Pediatric Infectious Disease Journal. 24 (9), 761-765 (2005).
- McNabb, S. J., et al. Summary of notifiable diseases. Morbidity and Mortality Weekly Report p. 54 (53), 1-92 (2007).
- Sealey, K. L., Belcher, T., Preston, A. Bordetella pertussis epidemiology and evolution in the light of pertussis resurgence. Infection, Genetics, and Evolution. 40, 136-143 (2016).
- Warfel, J. M., Merkel, T. J. The baboon model of pertussis: effective use and lessons for pertussis vaccines. Expert Reviews of Vaccines. 13 (10), 1241-1252 (2014).
- Jennings-Gee, J., et al. The adjuvant Bordetella Colonization Factor A attenuates alum-induced Th2 responses and enhances Bordetella pertussis clearance from mouse lungs. Infection and Immunity. , (2018).
- Sukumar, N., Mishra, M., Sloan, G. P., Ogi, T., Deora, R. Differential Bvg phase-dependent regulation and combinatorial role in pathogenesis of two Bordetella paralogs, BipA and BcfA. Journal of Bacteriology. 189 (10), 3695-3704 (2007).
- Stainer, D. W., Scholte, M. J. A simple chemically defined medium for the production of phase I Bordetella pertussis. Journal of General Microbiology. 63 (2), 211-220 (1970).
- Bordet, J. Le microbe de le coqueluche. Annales de l'Institut Pasteur. 20, 731-741 (1906).
- Cook, M. J. The Anatomy of the Laboratory Mouse. , Academic Press. (1965).
- Sutton, S. Accuracy of Plate Counts. Journal of Validation Techniques. 17 (3), 42-46 (2011).
- Conover, M. S., Sloan, G. P., Love, C. F., Sukumar, N., Deora, R. The Bps polysaccharide of Bordetella pertussis promotes colonization and biofilm formation in the nose by functioning as an adhesin. Molecular Microbiology. 77 (6), 1439-1455 (2010).
- Cattelan, N., Jennings-Gee, J., Dubey, P., Yantorno, O. M., Deora, R. Hyperbiofilm Formation by Bordetella pertussis Strains Correlates with Enhanced Virulence Traits. Infection and Immunity. 85 (12), (2017).
- Andreasen, C., Carbonetti, N. H. Pertussis toxin inhibits early chemokine production to delay neutrophil recruitment in response to Bordetella pertussis respiratory tract infection in mice. Infection and Immunity. 76 (11), 5139-5148 (2008).
- Mills, K. H., Gerdts, V. Mouse and pig models for studies of natural and vaccine-induced immunity to Bordetella pertussis. Journal of Infectious Diseases. 209, Suppl 1 16-19 (2014).
- Dunne, A., et al. A novel TLR2 agonist from Bordetella pertussis is a potent adjuvant that promotes protective immunity with an acellular pertussis vaccine. Mucosal Immunology. 8 (3), 607-617 (2015).
- Denoel, P., Godfroid, F., Guiso, N., Hallander, H., Poolman, J. Comparison of acellular pertussis vaccines-induced immunity against infection due to Bordetella pertussis variant isolates in a mouse model. Vaccine. 23 (46-47), 5333-5341 (2005).
- Marr, N., et al. Protective activity of the Bordetella pertussis BrkA autotransporter in the murine lung colonization model. Vaccine. 26 (34), 4306-4311 (2008).
- Feunou, P. F., Bertout, J., Locht, C. T- and B-cell-mediated protection induced by novel, live attenuated pertussis vaccine in mice. Cross protection against parapertussis. PLoS One. 5 (4), 10178 (2010).
- Mills, K. H., Ryan, M., Ryan, E., Mahon, B. P. A murine model in which protection correlates with pertussis vaccine efficacy in children reveals complementary roles for humoral and cell-mediated immunity in protection against Bordetella pertussis. Infection and Immunity. 66 (2), 594-602 (1998).
- Higgs, R., Higgins, S. C., Ross, P. J., Mills, K. H. Immunity to the respiratory pathogen Bordetella pertussis. Mucosal Immunology. 5 (5), 485-500 (2012).
- Alving, C. R. Design and selection of vaccine adjuvants: animal models and human trials. Vaccine. 20, Suppl 3 56-64 (2002).
- Ipp, M. M., et al. Adverse reactions to diphtheria, tetanus, pertussis-polio vaccination at 18 months of age: effect of injection site and needle length. Pediatrics. 83 (5), 679-682 (1989).
- Fessard, C., Riche, O., Cohen, J. H. Intramuscular versus subcutaneous injection for hepatitis B vaccine. Vaccine. 6 (6), 469 (1988).
- Bergeson, P. S., Singer, S. A., Kaplan, A. M. Intramuscular injections in children. Pediatrics. 70 (6), 944-948 (1982).
- Zhang, L., Wang, W., Wang, S. Effect of vaccine administration modality on immunogenicity and efficacy. Expert Review of Vaccines. 14 (11), 1509-1523 (2015).
- Ross, P. J., et al. Relative Contribution of Th1 and Th17 Cells in Adaptive Immunity to Bordetella pertussis: Towards the Rational Design of an Improved Acellular Pertussis Vaccine. PLoS Pathogens. 9 (4), 1003264 (2013).
- Warfel, J. M., Zimmerman, L. I., Merkel, T. J. Acellular pertussis vaccines protect against disease but fail to prevent infection and transmission in a nonhuman primate model. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 111 (2), 787-792 (2014).
- Allen, A. C., et al. Sustained protective immunity against Bordetella pertussis nasal colonization by intranasal immunization with a vaccine-adjuvant combination that induces IL-17-secreting TRM cells. Mucosal Immunology. , (2018).
- Solans, L., et al. IL-17-dependent SIgA-mediated protection against nasal Bordetella pertussis infection by live attenuated BPZE1 vaccine. Mucosal Immunology. , (2018).
- Miller, M. A., et al. Visualization of murine intranasal dosing efficiency using luminescent Francisella tularensis: effect of instillation volume and form of anesthesia. PLoS One. 7 (2), 31359 (2012).
- Sato, Y., Izumiya, K., Sato, H., Cowell, J. L., Manclark, C. R. Aerosol infection of mice with Bordetella pertussis. Infection and Immunity. 29 (1), 261-266 (1980).
- Warfel, J. M., Beren, J., Merkel, T. J. Airborne transmission of Bordetella pertussis. Journal of Infectious Diseases. 206 (6), 902-906 (2012).
- Scanlon, K. M., Snyder, Y. G., Skerry, C., Carbonetti, N. H. Fatal Pertussis in the Neonatal Mouse Model Is Associated with Pertussis Toxin-Mediated Pathology beyond the Airways. Infection and Immunity. 85 (11), (2017).
- Martinez de Tejada, G., et al. Neither the Bvg- phase nor the vrg6 locus of Bordetella pertussis is required for respiratory infection in mice. Infection and Immunity. 66 (6), 2762-2768 (1998).
- Higgins, S. C., Jarnicki, A. G., Lavelle, E. C., Mills, K. H. TLR4 mediates vaccine-induced protective cellular immunity to Bordetella pertussis: role of IL-17-producing T-cells. Journal of Immunology. 177 (11), 7980-7989 (2006).
- Mahon, B. P., Brady, M. T., Mills, K. H. Protection against Bordetella pertussis in mice in the absence of detectable circulating antibody: implications for long-term immunity in children. Journal of Infectious Diseases. 181 (6), 2087-2091 (2000).
- Karlsson, A. C., et al. Comparison of the ELISPOT and cytokine flow cytometry assays for the enumeration of antigen-specific T-cells. Journal of Immunological Methods. 283 (1-2), 141-153 (2003).
- Hagen, J., et al. Comparative Multi-Donor Study of IFNgamma Secretion and Expression by Human PBMCs Using ELISPOT Side-by-Side with ELISA and Flow Cytometry Assays. Cells. 4 (1), 84-95 (2015).
- Raeven, R. H. M., et al. Molecular and cellular signatures underlying superior immunity against Bordetella pertussis upon pulmonary vaccination. Mucosal Immunology. 11 (3), 1009 (2018).
