Summary
نيوروسفيريس نمت كثقافات 3D تشكل أداة قوية لدراسة البيولوجيا الدبقي. نقدم هنا بروتوكولا لأداء إيمونوهيستوتشيميستري مع الحفاظ على هيكل ثلاثي الأبعاد نيوروسفيريس الدبقي عن طريق تضمين البارافين. هذا الأسلوب يتيح لتوصيف خصائص نيوروسفيري الدبقي مثل ستيمنيس وتمايز العصبية.
Abstract
تحليل التعبير البروتين في الدبقي ذات الصلة لعدة جوانب في الدراسة في علم الأمراض. قد وصفت بروتينات عديدة كالمؤشرات الحيوية مع تطبيقات في التشخيص والتشخيص والتصنيف، والدولة من تطور الورم وخلية التمييز بين الدولة. تحليل هذه المؤشرات الحيوية مفيدة أيضا لوصف الورم نيوروسفيريس (NS) التي تم إنشاؤها من المرضى الدبقي ونماذج الدبقي. NS الورم تقدم نموذجا قيماً في المختبر لتقييم ميزات مختلفة من الورم التي تستمد ويمكن أكثر دقة من مرآة الدبقي بيولوجيا. هنا يصف لنا طريقة مفصلة لتحليل المؤشرات الحيوية في ورم NS باستخدام إيمونوهيستوتشيميستري (المدينة) على الورم جزءا لا يتجزأ من البارافين NS.
Introduction
Gliomas هي الأورام الصلبة الأولية من الجهاز العصبي المركزي مصنفة حسب خصائصها المظهرية وأوضح وفقا "منظمة الصحة العالمية"1. ويتضمن هذا التصنيف وجود أو عدم وجود برنامج تشغيل الطفرات، التي تمثل مصدرا جذاباً للمؤشرات الحيوية2. المؤشرات الحيوية هي الخصائص البيولوجية التي يمكن قياسها وتقييمها للإشارة إلى العمليات العادية والمرضية، فضلا عن الاستجابات الدوائية إلى تدخل علاجي3. ويمكن الكشف عن المؤشرات الحيوية في ورم الأنسجة والخلايا المشتقة من الدبقي، تمكين توصيفه البيولوجية في جوانب مختلفة. وتشمل بعض الأمثلة للمؤشرات الحيوية الدبقي نازعة إيسوسيتراتي تحور 1 (IDH1)، إنزيم متحولة مميزة من الصف السفلي gliomas المرتبطة بأفضل تنبؤ4. أعربت مرارا عن IDH1 تحور في تركيبة مع TP53 ومتلازمة التخلف العقلي ألفا-الثلاسيميا/العقلية المرتبطة بالعاشر (أتركس)--تعطيل الطفرات، تعريف الدبقي محددة النوع الفرعي4،5. الطفرات أتركس يخمد أيضا تحدث في 44% لطب الأطفال جليوماس عالية الجودة2،6 وارتبطت بالأورام العدوانية وعدم الاستقرار المجيني6،7. وباﻹضافة إلى ذلك، يميز طب الأطفال منتشر الجوهرية البوتانية gliomas (ديبج) في مجموعات فرعية وفقا لوجود أو عدم وجود طفرة K27M في هيستون H3 جين H3F3A، أو في1،جين HIST1H3B/ج6. ولذلك، الأخذ بتوصيف جزيئي يسمح التقسيم، والدراسة، ومعاملة gliomas ككيانات منفصلة، التي سوف تسمح أكثر بتطوير أكثر يستهدف العلاج لكل نوع فرعي. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام تحليل المؤشرات الحيوية لتقييم العمليات البيولوجية المختلفة مثل المبرمج8أوتوفاجي9، تقدم دورة الخلية10، خلية انتشار11وتمايز الخلايا12 .
النماذج الحيوانية المحورة وراثيا التي تأوي الآفات الوراثية موجودة في السرطانات البشرية حاسمة بالنسبة للدراسة من إشارات المسارات التي تتوسط تطور المرض. وقد نفذت مختبرنا استخدام نظام ترانسبوساسي النوم الجمال (SB) لتطوير نماذج الماوس المهندسة وراثيا من الدبقي إيواء طفرات محددة أن الخص الدبقي البشرية الأنواع الفرعية13،14. وتستخدم هذه النماذج الماوس المهندسة وراثيا لتوليد NS المستمدة من الورم، الذي تمكن في المختبر الدراسات في نظام ثلاثي الأبعاد، وتقديم النسخ المتطابق من السمات البارزة في الأورام الموقع في15. أيضا، يمكن أن تولد زرع أورثوتوبيكال NS في الفئران الأورام الثانوية التي تحتفظ بميزات الورم الرئيسي وتقليد الخصائص التشريحية المرضية والجينوم والمظهرية الورم الرئيسي الموافق15.
في ثقافة خالية من المصل، يمكن إثراء الدماغ ورم الخلايا مع خصائص الخلايا الجذعية، ووجود عوامل نمو البشرة (مماثلة)، وعوامل النمو تنتجها الخلايا الليفية (صندوق الأجيال القادمة)، يمكن زراعتها كمستعمرات المستمدة من خلية واحدة مثل الثقافات NS. في هذا النظام ثقافة انتقائية، معظم خلايا التفريق أو المتباينة سرعة يموت، بينما تقسيم الخلايا الجذعية وتشكيل المجموعات الخلوية. وهذا ما يسمح توليد ثقافة NS تحتفظ الدبقي الورم ميزات16،،من1718. يمكن استخدام NS الدبقي لتقييم جوانب عديدة من الأحياء الورم، بما في ذلك تحليل المؤشرات الحيوية التي لها تطبيقات في التشخيص والتشخيص والتصنيف، والدولة من تطور الورم وخلية التمييز بين الدولة. هنا، نحن بالتفصيل وضع بروتوكول لإنشاء الدبقي NS وتضمين ثقافات 3D في البارافين لاستخدامها لتلطيخ المدينة. هي ميزة واحدة لتثبيت وترسيخ الدبقي NS مورفولوجية NS الإبقاء على أفضل مقارنة بال سيتوسبين التقليدية الأسلوب19، التي الدبقي NS يتعرضون للتلاعب المجهدة لتفكك الخلية وتصبح الأرض. وباﻹضافة إلى ذلك، تضمين يروي أي تعبير فلوروفوري الذاتية من ورم المهندسة وراثيا NS، تمكين تلطيخ عبر أطياف الفلورسنت. والهدف العام لهذا الأسلوب هو للحفاظ على هيكل ثلاثي الأبعاد الدبقي الخلايا عن طريق بارافين تضمين عملية وتمكين توصيف نيوروسفيريس الدبقي باستخدام إيمونوهيستوتشيميستري.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
عليها جميع الأساليب الموصوفة هنا "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من جامعة ميتشيغان.
1-جيل نيوروسفيريس ورم الدماغ مستمدة من طراز الماوس
- قبل إجراء التشريح، تحضير الخلايا الجذعية العصبية الوسائط (وسائط الإعلام في مجلس الأمن القومي: DMEM/F12 مع 1 x B27 الملحق 1 x N2 الملحق، 1 x نورموسين و 1 x المضادات الحيوية/فطري تستكمل مع المؤتلف البشرية مماثلة والأساسية-صندوق الأجيال القادمة بتركيزات من 20 نانوغرام/مليلتر كل). ملء أنبوب 1.5 مل مع 300 ميليلتر لوسائل الإعلام في مجلس الأمن القومي والاحتفاظ بها لوقت لاحق.
- حدد ماوس مع وجود ورم كبير.
ملاحظة: يمكن رصد حجم الورم بالإضاءة الحيوية إذا بلازميد أو الفيروسات حقن بترميز لوسيفرين. عادة، قد ورم كبير الإضاءة الحيوية من > 106 الفوتونات/s/سم2خ. - Euthanize الماوس مع جرعة زائدة من إيسوفلوراني: لبث ورقة الأنسجة مع isoflurane وإدخال الأنسجة في دائرة يوثانيزيشن، تجنب الاتصال المباشر مع الفئران لمنع تهيج. الانتظار حتى لا تظهر الفئران منعكس دواسة (عادة 5-10 دقيقة). قطع رأس الماوس وتشريح الدماغ كما هو موضح في كالينيسكو et al. 13.
- إذا كانت الأورام الفلورسنت، استخدام مجهر تشريح مزودة بمصباح فلوري لتحديد كتلة الورم داخل المخ. مع الملقط غرامة، تشريح الورم (عادة 5-7 ملم في القطر) من أنسجة المخ العادي.
- مكان الورم تشريح في أنبوب 1.5 مل مع وسائل الإعلام في مجلس الأمن القومي (الخطوة 1، 1). مجانسة الورم مع مدقة بلاستيك القابل للصرف التي تناسبها في جدران الأنبوب ميكروسينتريفوجي عن طريق تطبيق ضغط لطيف.
- أن ننأى بكتل الخلية وإضافة 1 مل وسائط خالية من إنزيم الانفصال واحتضان لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
- تصفية تعليق خلية عن طريق مصفاة خلية 70 ميكرومتر وغسل المصفاة مع 20 مل من وسائل الإعلام في مجلس الأمن القومي.
- الطرد المركزي في 300 غرام x لمدة 5 دقائق وصب المادة طافية، وإعادة تعليق بيليه إلى 6 مل أو 15 مل من وسائل الإعلام في مجلس الأمن القومي، تبعاً لحجم بيليه.
- لوحة تعليق خلية الورم إلى قارورة الثقافة T-25 أو T-75 والثقافة في 37 درجة مئوية في حاضنة استنبات الأنسجة مع جو من 95% الهواء و 5% CO2.
- بعد 3 أيام، نقل NS مع وقف التنفيذ السليم وإعادة لوحة لهم في قارورة زراعة الأنسجة T-25 أو T-75. إذا لزم الأمر، إضافة المزيد من الوسائط مجلس الأمن القومي للثقافة.
ملاحظة: يكون هناك عادة عدد سكان مختلطة من خلايا وسوف تكون بعض القتلى وسوف انضمت بعض وبعضها سوف يكون تشكيل NS سوف تطفو في وسائل الإعلام
2-الحفاظ على وباساجينج في NS
ملاحظة: منع فرط والحفاظ على الخلايا في كثافة عالية نسبيا. التقاء يتحدد حجم المجالات (مراكز السوداء من فرط يعني مجالات كبيرة). معدل النمو NS سيتوقف على المسرطنة المستخدمة لتوليد الأورام.
- مجرد ثقافة NS وصلت كونفلوينسي، جمع الثقافة في أنبوب عقيم للطرد مركزي وبيليه NS في ز 300 x لمدة 5 دقائق.
- تجاهل المادة طافية وإضافة 1 مل الحل مفرزة خلية "الماصة؛" بتعليق إعادة بيليه.
- احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، يسددها الأنبوب كل 2 دقيقة للمساعدة على الانفصال من الخلية.
ملاحظة: عندما تصل NS إلى كونفلوينسي، يمكن عادة اعتبار الميكروسكوب مجالات بيضاء صغيرة. يجب أن اختفت على الأقل كل NS مرئية أن أؤكد للانفصال من الخلية،. - إضافة 5 مل حبس 1 x والماصة عدة مرات. خلايا بيليه على 300 غرام x للحد الأدنى 5 تجاهل المادة طافية. إعادة تعليق بيليه في 5 مل من وسائل الإعلام في مجلس الأمن القومي تستكمل مع المؤتلف مماثلة والأساسية-صندوق الأجيال القادمة.
- أضف 1 مل خلايا إلى 15 مل من وسائل الإعلام في مجلس الأمن القومي والثقافة في قارورة T-75 في 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة الأنسجة مع جو من 95% الهواء و 5% CO2.
- إضافة عوامل النمو (لو والأساسية-صندوق الأجيال القادمة) كل 3 أيام. إذا كانت وسائط الإعلام يتحول الضوء البرتقالي والخلايا التي ليست بعد المتلاقية، وتغيير وسائط الإعلام. للقيام بذلك، الطرد المركزي NS في 300 غ س ل 4 دقيقة وإعادة تعليق في وسائل الإعلام في مجلس الأمن القومي وتستكمل مع عوامل النمو.
ملاحظة: تبعاً لحجم بيليه تشكيلها، قد تحتاج الخلايا تقسيمها إلى قوارير أكثر.
3-تجميد NS للتخزين طويل الأجل
- عندما تصبح ثقافة NS المتلاقية، فصل الخلايا كما هو موضح في الخطوات 2.1-2.4. متى تم إعادة معلقة في حبس بيليه، إزالة قاسمة وعد الخلايا.
- الطرد المركزي خلايا في 300 غ س لمدة 4 دقائق وإزالة قدر الإمكان من المادة طافية.
- إعادة تعليق بيليه في تجميد وسائل الإعلام (الحرارة إبطال FBS، 10% [دمس]). ينصح بتجميد بين 1 × 106 و 3 × 106 خلايا للقنينة الواحدة مل.
- تقسيم الخلايا إعادة معلقة في العديد من كريوفيالس المطلوبة ويبرد ببطء قارورة بتحويلها أولاً الجليد، ثم إلى-20 درجة مئوية، ثم إلى-80 درجة مئوية، وأخيراً في اليوم التالي لحاوية تخزين نيتروجين سائل.
4-تثبيت NS الورم
- الثقافة الورم NS في قارورة T-25 لمدة 2-3 أيام حتى يتم الخلايا المتلاقية (~ 3 × 106 خلايا). جمع الورم NS في أنبوب مخروطي 15 مل من أقل واحدة قارورة T-25 المتلاقية. بيليه على 300 غرام x لمدة 5 دقائق.
- إعادة تعليق بيليه في 1 مل فورمالين 10% وتبقى في درجة حرارة الغرفة (RT) لمل إضافة 5 10 كحد أدنى من 1 x HBSS وبيليه الخلايا كما فعلت في الخطوة 3، 2. كرر هذه الخطوة مرة أخرى.
- ضع الأنبوبة المخروطية 15 مل يحتوي على بيليه على الجليد.
5-البارافين التضمين للورم NS
- إعادة تعليق بيليه NS غسلها في 500 ميليلتر من 2% [اغروس] الحارة السائلة وتخلط بلطف بيبيتينج.
- فورا مكان NS جزءا لا يتجزأ من [اغروس] على الجليد حتى بوليميريزيس [اغروس]. إزالة القطعة [اغروس] تأوي في NS. مكان قطعة مبلمرة [اغروس] مع NS في الكاسيت للأنسجة المعالجة (الشكل 2).
- متابعة تجهيز الأنسجة (باستخدام معالج بارافين تلقائي) والبارافين التضمين (باستخدام محطة تضمين).
6-تقطيع من NS جزءا لا يتجزأ من البارافين
- تعيين حمام الماء إلى 42 درجة مئوية وإدراج الشفرة على مبضع بعناية باستخدام اثنين من فرش الطلاء للتأكد من أنه يتم تسويته. استخدام شفرة هذا فقط للتشذيب.
- وضع كتلة البارافين في مبضع. مع الجهة غير المهيمنة، اضغط لأسفل على رافعة الموجود على الجانب الأيسر الذي يتحكم بسمك كل قسم. اضغط للمحطة الثانية التي تشير إلى سماكة 30 ميكرون.
- يبدأ التشذيب الكتلة (أي.، إزالة الزائدة البارافين) بتحويل عجلة اليد الخشنة باليد اليمنى حتى يتم التوصل إلى سطح العينة. عند هذه النقطة، الإفراج عن رافعة الذي يتحكم بسمك القطع على 10 ميكرومتر أو 5 ميكرومترات. إيقاف التشذيب عند الوصول إلى سطح العينة.
- تعبئة على مربع جليد بالجليد وإضافة ما يكفي من الماء بحيث عندما يتم وضع كتلة البارافين على الجليد، الماء بمثابة فيلم حول الكتلة البارافين، تحميه من ملامسة مباشرة للجليد. احتضان كتلة البارافين على الجليد لمدة 20 دقيقة.
- تجاهل بليد القديمة وإدخال كلمة مرور جديدة لتمزيقها. كتلة جافة باستخدام شاش، ثم ضعه على مبضع.
- مع الجهة غير المهيمنة، الحصول على زوج من الملقط المنحنية التي سيتم استخدامها لسحب الشريط البارافين. الاحتفاظ بفرشاة طلاء رطب قرب يده اليمنى، التي سوف تستخدم لنقل الشريط البارافين إلى حمام الماء. يبدأ المقطع بتحويل عجلة اليد الخشنة باليد اليمنى على نحو سريع الخطي. استخدام الملقط في اليد اليسرى لعقد الشريط البارافين.
- استخدم فرشاة الطلاء رطبة لنقل الشريط البارافين إلى حمام الماء.
- استخدم منحنى الملقط للتفكك المقاطع بشكل سطحي وضع الملقط في الفترات الفاصلة بين قسمين البارافين، ثم دفع قسمين بعيداً برفق.
ملاحظة: ينبغي أن يكون هذا الاقتراح تماما على سطح المقطع البارافين. لا اضغط على أسفل المقطع. - استخدم فرشاة الطلاء رطب لدفع الفروع البارافين المنفصلين عن ذويهم على شرائح المجهر التصاق مشحونة بشكل إيجابي.
- السماح بأن بين عشية وضحاها الجافة داخل غطاء كيميائية قبل تخزينها في مربعات الشرائح الشرائح. تخزين الشرائح يعتمد على نوع وصمة المنجز.
7-إيمونوهيستوتشيميستري (المدينة) من NS جزءا لا يتجزأ من البارافين
- تذوب البارافين بوضع الشرائح في رف معدني وتفرخ لهم عند 60 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
- ديبارافينيزي الشرائح بالحضانة في قطار الإماهة في RT: 3 × زيلين نفط لمدة 5 دقائق، الإيثانول 2 x 100% 2 دقيقة, الإيثانول 95% 2 x دقيقة 2, 70% 1 x الإيثانول لدقيقة 2، و 1 × المياه للحد الأدنى 2 هيرون، تبقى الشرائح في ماء الصنبور حتى استرجاع مستضد ، كالجفاف سوف يتسبب ربط جسم غير محدد.
- احتضان الشرائح الموجودة في المخزن المؤقت حمض الليمون (حمض الستريك 10 ملم، والمنظفات غير الأيونية 0.05%، الرقم الهيدروجيني 6) في 125 درجة مئوية لمدة 30 ثانية وعند 90 درجة مئوية لمدة 10 ق. يبرد، ثم شطف الشرائح 5 مرات بماء مقطر.
- احتضان الشرائح في RT في 0.3% H2O2 لمدة 30 دقيقة.
- يغسل الشرائح 3 مرات في غسل العازلة (0.025% المنظفات في تبس) لمدة 5 دقائق مع الانفعالات لطيف.
- احتضان الشرائح في RT بعرقلة الحل (مصل الحصان 10%، 0.1% جيش صرب البوسنة في تبس) لمدة 30 دقيقة.
- احتضان الشرائح بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في دائرة هوميديفيد بجسم الأولية استعدادا لتمييع الحل (0.1% جيش صرب البوسنة في تبس). يغسل الشرائح 3 مرات في الغسل المخزن المؤقت لمدة 5 دقائق مع الانفعالات لطيف.
- احتضان الشرائح في RT ح 1 مع جسم الثانوية بيوتينيلاتيد أعدت في تمييع الحل. يغسل الشرائح 3 مرات في الغسل المخزن المؤقت لمدة 5 دقائق مع الانفعالات لطيف.
- احتضان الشرائح في RT في الظلام لمدة 30 دقيقة مع عبدين-بيوتينيلاتيد الفجل البيروكسيديز المعقدة. يغسل الشرائح 3 مرات في الغسل المخزن المؤقت لمدة 5 دقائق مع الانفعالات لطيف.
- احتضان الشرائح مع الدأب-ح2س2 الركيزة الماركات هنا لمدة 2-5 دقيقة في الرايت
- شطف 3 مرات بماء الصنبور. تراجع (1-2 s) الشرائح في الحل توضع كونتيرستين، وشطف لهم جيدا في ماء الصنبور حتى تطهير.
- يذوي الشرائح على النحو التالي: احتضانها في الماء المقطر لمدة 2 دقيقة، وتراجع 3 مرات في الإيثانول 80%، احتضانها في الإيثانول 95% 2 مرات لكل 2 دقيقة، واحتضان في الإيثانول 100% 2 مرات لكل منهما، 2 دقيقة، وأخيراً في زيلين نفط 3 مرات لكل 3 دقائق.
- ساترة الشرائح مع وسيلة متزايدة على أساس زيلين نفط والسماح لهم الجافة على سطح مستو في الرايت حتى تكون جاهزة للتصوير. ملاحظة: إذا كان أداء 3، 3 '--ديامينوبينزيديني (DAB) تلطيخ، يمكن تخزين الشرائح في الرايت ومع ذلك، إذا كان يتم إجراء تلطيخ الفلورة، يجب تخزين الشرائح في الظلام في-20 درجة مئوية للحد من تبييض الصورة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
رصد التنمية الورم وتقييم إذا كان الورم قد وصلت إلى الحجم اللازم لتوليد NS، قمنا بتحليل التﻷلؤ المنبعثة من الأورام باستخدام الإضاءة الحيوية. وهذا ما يسمح دراسة كفاءة توصيل في الجراء وتطور الورم بإشارة التﻷلؤ لوسيفراس (الشكل 1ألف و 1 باء). عندما يصل حجم الورم إشارة 1 × 107 الفوتونات/s/سم 2/ريال (الشكل 1ب)، يمكن معالجة الدماغ لتوليد NS. وهناك ميزة أخرى لهذا النظام أن الترميز تسلسل البروتينات الفلورية المختلفة يمكن أن تضاف إلى والبلازميدات المستخدمة لتوليد الجينات التسليم والورم. ثم نؤكد على التعبير عن التعديلات الوراثية المدرج، استخدام مجهر تشريح مزودة بمصباح فلوري (الشكل 1ج). يتم تعريف NS المتولدة من وزن-IDH1 (الشكل 1د)، والأورام (الشكل 1ﻫ) mIDH1 بواسطة مورفولوجية كروية مميزة، والتعبير عن فلوروفوريس المرتبطة بالآفة الوراثية المحددة ( أي. والتجارة والنقل المرتبطة شاطر و shp53 وكاتوشكا المرتبطة mIDH1؛ الشكل 1 د و 1E). للمضي قدما في المدينة في NS، الخلايا الثابتة، ثم جزءا لا يتجزأ من [اغروس] والبارافين (الشكل 2). التضمين في NS في كتل البارافين له العديد من المزايا، بما في ذلك الحفاظ على هياكل ثلاثية الأبعاد NS والسماح للتخزين على المدى الطويل. يمكن الملون NS المضمنة للمؤشرات الحيوية الدبقي محددة. باستخدام هذا الأسلوب، قمنا بتحليل التعبير عن أتركس و Ki67 و OLIG2 (علامة التمايز أوليجوديندروسيتي) (الشكل 3A-3_C). أكدنا التعبير انخفاض مستويات البروتين أتركس في ثقافاتنا NS (الشكل 3أ)، الذي سمة من سمات الدبقي لج النوع الفرعي حاليا درس4. أيضا، وكي-67، وصف جيد العلامات البيولوجية لتكاثر الخلايا، كان إيجابيا في NS mIDH1 (الشكل 3ب)، مما يدل على انتشار النشط، الذي سمة رئيسية للخلايا السرطانية. من المثير للاهتمام، وكانت الزنزانات المترجمة في وسط مجموعات NS الدبقي أكبر السلبية لكي-67 (الشكل 3ب)، التي تشير إلى أن أنها كانت لا تنتشر، خلافا للخلايا إيجابية كي-67 مترجمة إلى الهامش. قد تكون هذه الظاهرة يرجع ذلك إلى حقيقة أن الخلايا الطرفية لا يستطيعون الوصول إلى المواد المغذية من وسائط النمو. عندما تصل إلى هذا الحجم أكبر، وينبغي فصل الدبقي NS وباساجيد. وأخيراً، NS wt IDH1 كانت إيجابية بالنسبة Olig2، عامل نسخ المشاركة في تمايز oligodendrocyte (الشكل 3ج).
الشكل 1 : نيوروسفيريس الدبقي المتولدة من التجارة والنقل وكاتوشكا-مصابات بالنوم ورم الدماغ الجمال (SB). (أ) الإنارة إشارة الماوس الوليد حقن مع بلازميد SB-ترانسبوساسي في تركيبة مع والبلازميدات إيواء الآفات الوراثية لحمل الدبقي (تخطيطية/shP53/شاطر/IDH1-R132H). (ب) التﻷلؤ تشير إلى تطوير ورم في 132 يوما بعد انتهاء الحقن (نقطة في البوصة). (ج) مشرق-حقل والصورة الفلورية الدماغ حصادها من ماوس الذي وصل إلى مرحلة نقطة النهاية. منطقة الورم مرسومة بخط منقط وإيجابية بالنسبة للصحفيين الفلورسنت، التجارة والنقل وكاتوشكا. (دال وهاء) ورم نيوروسفيريس المتولدة من أورام الدماغ SB معربا عن التجارة والنقل المرتبطة shP53 وشاطر؛ وكاتوشكا المرتبطة إلى IDH1-R132H. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : تمثيل لسير العمل الدبقي جزءا لا يتجزأ من البارافين NS. جمعت من قارورة T-25 في أنبوب مخروطي 15 مل NS وإصلاحها في الفورمالين 10%. ثم يتم غسلها مع حبس NS وجزءاً لا يتجزأ من 2% [اغروس]. مبلمرة [اغروس] يتضمن الدبقي NS توضع في كاسيت لتجهيز الأنسجة وتضمينها البارافين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : الممثل نتائج إيمونوهيستوتشيميستري مع الكشف عن برنامج الصحة الإنجابية-الدأب المؤشرات الحيوية. (أ-ج) المدينة يقوم على mIDH1 جزءا لا يتجزأ من البارافين الدبقي NS الملون أتركس (A) و Ki67 (B)، ووزن IDH1 الدبقي NS الملون ل OLIG2 (C). وتبين الأسهم الحمراء الخلايا إيجابية لتلطيخ العلامات البيولوجية. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذه المقالة، نحن بالتفصيل طريقة تنوعاً واستنساخه لأداء immunohistochemistry على الدبقي جزءا لا يتجزأ من البارافين NS، التي تحافظ على هيكل ثلاثي الأبعاد المميزة للخلايا السرطانية في النمو في الدماغ في الموقع. يملك هذا الأسلوب الميزات التالية عبر استخدام خلايا مطلي على الزجاج أو الأسطح البلاستيكية: أنا) الحفاظ على هيكل ثلاثي الأبعاد NS؛ ثانيا) تجنب الإجهاد من تفكك الخلية قبل تحليل التعبير البروتين؛ ثالثا) تبريد من أي تعبير فلوروفوري الذاتية من ورم المهندسة وراثيا NS، تمكين تلطيخ عبر أطياف الفلورية؛ ورابعاً) التخزين على المدى الطويل.
خطوة حاسمة لهذا الأسلوب ضمان أن الخلايا إعادة تعليق جيدا في [اغروس] لضمان أنها وزعت المتجانس ولا تجمعت معا. واحد الحد من هذا الأسلوب هو مضيعة للوقت الخطوات المتعلقة باستزراع خلية و NS تجهيز قبل المدينة تلطيخ الداخلي. القيد ثاني هو العدد الكبير من الخلايا المطلوبة لتنفيذ هذا الأسلوب. وإذا كان العدد الخلايا أقل من 1 × 106 خلايا، سيكون هناك عدد قليل جداً من الخلايا مجموعات مجال الرؤية NS في كل قسم. ولذلك، يمكن أن يكون من الصعب التوصل إلى العدد المثالي من الخلايا إذا كانت ثقافة الخلية الدبقي بطيئة النمو. كنا قارورة T-25 المتلاقية تتضمن على الأقل 3.0 x 106 خلايا. يمكن تعديل عدد الخلايا المستخدمة كالمطلوب؛ ومع ذلك، من الضروري الحصول بيليه NS من الحجم المناسب لعملية الدمج. بعد هذا، NS المضمنة ويمكن التلاعب بها ككتلة جزءا لا يتجزأ من البارافين عادية، ومن ثم المتابعة إلى تمزيقها وتلطيخ لتحليل التعبير البروتين خلال الفلورة المدينة أو المدينة باستخدام البث الإذاعي الرقمي تلطيخ.
بعد تقطيع القطع واتباع البروتوكول للمدينة، وينبغي أن كونتيرستاينيد الأقسام مع الهيماتوكسيلين (أزرق). إذا الأنسجة وتعرب عن البروتين المستهدف، ينبغي أن تكون إشارة بني مرئية (الشكل 3). إذا كانت الأبواب براون أيضا بعد المدينة (خلفية عالية)، هذا يمكن أن يكون سبب المتعهدة 1) غير محددة من جسم الثانوية، 2) تبريد غير مكتملة من البيروكسيديز الذاتية، أو عرقلة 3) غير كافية. هذه المسائل يمكن حلها بواسطة 1) استخدام شريحة مراقبة سلبية (المحتضنة فقط مع جسم ثانوي) للتحقق من الربط غير محددة من جسم الثانوية، 2) زيادة البيروكسيديز تبريد مرة أو 3) زيادة فترة الحضانة حظر. من ناحية أخرى، إذا تم الكشف عن لا إشارة، فمن الممكن لا يزال ملثمين [ابيتوبس]، التي قد تكون ذات صلة بالنوع من المخزن المؤقت المستخدم لاسترداد مستضد. في تجربتنا، كان لدينا مرضية تلطيخ استخدام سترات المخزن المؤقت، ولكن هذا يمكن الأنسجة وتعتمد الأجسام المضادة، ويمكن استخدام صيغ مختلفة للمخازن المؤقتة لاسترجاع مستضد مثل 0.1 M تريس-HCl (pH 8.0) المخزن المؤقت21. هذه بعض المشاكل الشائعة المتعلقة تلطيخ المدينة، ولكن إذا كانت تنشأ صعوبة أخرى، استكشاف الأخطاء وإصلاحها يجب أن تنفذ كما هو الحال مع أي المدينة الأخرى (أي.، تحاول تخفيف مختلف الأجسام الأولية والثانوية، حجب مختلفة الكواشف، أوقات حظر مختلفة، إلخ).
ووصف طريقة بديلة لتقييم تعبير البروتين باستخدام خلايا جزءا لا يتجزأ من البارافين سابقا هاسيلباتش et al. 20. هذا الأسلوب لا تتضمن الخطوات [اغروس]، التي تمكن التوزيع الخاص الملائم لمجموعات خلايا ثلاثية الأبعاد في هذا البروتوكول. ونحن أيضا تصف طريقة دقيقة ل NS استزراع وباساجينج، وتجميد للتخزين على المدى الطويل. هذا الأسلوب يوضح أيضا كيفية جمع وإصلاحها، وتضمين NS دون تغيير هيكل ثلاثي الأبعاد (الشكل 2).
يمكن أن تتولد في NS من الدبقي الأنسجة التي تم الحصول عليها من المرضى ونماذج حيوانية الدبقي، هذا الأسلوب يشكل أداة قوية يمكن استخدامها لتحليل التعبير العلامات البيولوجية في سوبتيبيس الدبقي مختلفة والتحقق من صحة النماذج الأصلية. هنا يصف لنا هذه التقنية مع NS نشأت من الفئران المهندسة وراثيا باستخدام نظام ترانسبوساسي SB (الشكل 1). ومع ذلك، هذا الأسلوب أيضا استخدامها لتحليل البروتين في الخلايا جزءا لا يتجزأ من البارافين الدبقي البشرية التي تنمو كثقافات 3D دون تعديلات على البروتوكول، عدا شروط ثقافة الخلية. لذا، قد أيضا تطبيق هذا الأسلوب للثقافات ثلاثية الأبعاد التي تم الحصول عليها من نماذج حيوانية الأولى والبشرية PDX النماذج والنماذج الأخرى المهندسة وراثيا. وأخيراً، يمكن استخدام هذا الأسلوب مع أنواع أخرى من السرطان، نماذج الماوس والسرطانات البشرية، بالإضافة إلى جليوماس.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
أيد هذا العمل الوطنية معاهد للصحة الوطنية المعهد من الاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية (المعاهد الوطنية للصحة/NINDS) منح R37-NS094804، R01-NS074387، R21-NS091555 إلى M.G.C.؛ تمنح المعاهد الوطنية للصحة/NINDS R01-NS076991 و R01 NS082311 R01-NS096756 P.R.L.؛ R01 المعاهد الوطنية للصحة/نيندس-EB022563؛ 1UO1CA224160؛ قسم جراحة الأعصاب؛ قلوب في ليا سعيدة ب M.G.C. و P.R.L.؛ و "الجيش الملكي النيبالي" الطب الحيوي منحة F046166 إلى M.G.C. F.M.M. معتمد من قبل F31 المعاهد الوطنية للصحة/نيندس-F31NS103500. جيه بي أيده وزارة الرياضة الأرجنتينية فولبرايت وزمالة التعليم.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coated microtome blade HP35 | Thermo Scientific | 3150734 | |
| Microtome RM 2135 | Leica | MR2135 | |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-aldrich | HT501128-4L | |
| Rabbit polyclonal anti-ATRX, | Santa Cruz Biotechnology | sc-15408 | IHC, 1:250 dilution |
| Rabbit polyclonal anti-Ki-67 | Abcam | Ab15580 | IHC, 1:1000 dilution |
| Rabbit polyclonal anti-OLIG2 | Millipore | AB9610 | IHC, 1:500 dilution |
| Goat polyclonal anti-rabbit biotin-conjugated | Dako | E0432 | IHC, 1:1000 dilution |
| Vectastain Elite ABC HRP kit | Vector Laboratories Inc | PK-6100 | |
| BETAZOID DAB CHROMOGEN KIT | Biocare medical | BDB2004 L/price till 12/18 | |
| N-2 Supplement | ThermoFisher | 17502048 | |
| N-27 Supplement | ThermoFisher | A3582801 | |
| Accutase® Cell Detachment Solution | Biolegend | 423201 | |
| AGAROSE LE | GoldBio | A-201-1000 | |
| Genesee Sc. Corporation | Olympus 15 ml | 21-103 | |
| Genesee Sc. Corporation | TC-75 treated Flask | 25-209 | |
| Genesee Sc. Corporation | TC-25 treated Flask | 25-207 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330-057 | NS media |
| HBSS | GibcoTM | 14175-103 | balanced salt solution |
| C57BL/6 | Taconic | B6-f | C57BL/6 mouse |
References
- Louis, D. N., et al. The 2016 World Health Organization Classification of Tumors of the Central Nervous System: a summary. Acta Neuropatholica. 131 (6), 803-820 (2016).
- Hochberg, F. H., et al. Glioma diagnostics and biomarkers: an ongoing challenge in the field of medicine and science. Expert Review of Molecular Diagnosis. 14 (4), 439-452 (2014).
- Ziegler, A., Koch, A., Krockenberger, K., Grosshennig, A. Personalized medicine using DNA biomarkers: a review. Human Genetics. 131 (10), 1627-1638 (2012).
- Ceccarelli, M., et al. Molecular Profiling Reveals Biologically Discrete Subsets and Pathways of Progression in Diffuse Glioma. Cell. 164 (3), 550-563 (2016).
- Cancer Genome Atlas Research, N., et al. Comprehensive, Integrative Genomic Analysis of Diffuse Lower-Grade Gliomas. The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2481-2498 (2015).
- Mackay, A., et al. Integrated Molecular Meta-Analysis of 1,000 Pediatric High-Grade and Diffuse Intrinsic Pontine Glioma. Cancer Cell. 32 (4), 520-537 (2017).
- Koschmann, C., et al. ATRX loss promotes tumor growth and impairs nonhomologous end joining DNA repair in glioma. Science Translational Medicine. 8 (328), (2016).
- Ward, T. H., et al. Biomarkers of apoptosis. British Journal of Cancer. 99 (6), 841-846 (2008).
- Gil, J., Pesz, K. A., Sasiadek, M. M. May autophagy be a novel biomarker and antitumor target in colorectal cancer. Biomarkers in Medicine. 10 (10), 1081-1094 (2016).
- Williams, G. H., Stoeber, K. The cell cycle and cancer. Journal of Pathology. 226 (2), 352-364 (2012).
- Preusser, M., et al. Ki67 index in intracranial ependymoma: a promising histopathological candidate biomarker. Histopathology. 53 (1), 39-47 (2008).
- Trepant, A. L., et al. Identification of OLIG2 as the most specific glioblastoma stem cell marker starting from comparative analysis of data from similar DNA chip microarray platforms. Tumour Biology. 36 (3), 1943-1953 (2015).
- Calinescu, A. A., et al. Transposon mediated integration of plasmid DNA into the subventricular zone of neonatal mice to generate novel models of glioblastoma. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
- Wiesner, S. M., et al. De novo induction of genetically engineered brain tumors in mice using plasmid DNA. Cancer Research. 69 (2), 431-439 (2009).
- Xie, Y., et al. The Human Glioblastoma Cell Culture Resource: Validated Cell Models Representing All Molecular Subtypes. EBioMedicine. 2 (10), 1351-1363 (2015).
- Vescovi, A. L., Galli, R., Reynolds, B. A. Brain tumour stem cells. Nature Reviews Cancer. 6, 425 (2006).
- Dirks, P. B. Brain tumor stem cells: bringing order to the chaos of brain cancer. Journal of Clinical Oncology. 26 (17), 2916-2924 (2008).
- Lenting, K., Verhaak, R., Ter Laan, M., Wesseling, P., Leenders, W. Glioma: experimental models and reality. Acta Neuropathologica. 133 (2), 263-282 (2017).
- Koh, C. M. Preparation of cells for microscopy using cytospin. Methods in Enzymology. 533, 235-240 (2013).
- Hasselbach, L. A., et al. Optimization of high grade glioma cell culture from surgical specimens for use in clinically relevant animal models and 3D immunochemistry. Journal of Visualized Experiments. (83), e51088 (2014).
- Pileri, S. A., et al. Antigen retrieval techniques in immunohistochemistry: comparison of different methods. The Journal of Pathology. 183 (1), 116-123 (1997).
