Summary

Processus de moulage humide-filage à base de gélatine pour la régénération des tissus

Published: March 07, 2019
doi:

Summary

Nous avons développé et décrire un protocole basé sur le concept de filage humide, pour la construction des biomatériaux axée sur la gélatine utilisée pour l’application de l’ingénierie tissulaire.

Abstract

Cet article présente une méthode peu coûteuse pour fabriquer la gélatine, comme un polymère naturel, en fibres monofilament ou toute autre forme appropriée. Par le biais de l’humide méthode de filature, fibres de gélatine sont produits par extrusion lisse dans un milieu approprié de coagulation. Pour augmenter la surface fonctionnelle de ces fibres de gélatine et de leur capacité à imiter les caractéristiques des tissus, la gélatine peut être moulé en forme de tube en se référant à ce concept. Examinés par des essais in vitro et in vivo, les tubes de gélatine démontrent un grand potentiel d’application en génie tissulaire. Agissant comme un matériau de remplissage approprié gap, gélatine tubes peuvent être utilisés pour remplacer les tissus dans la zone endommagée (par exemple, dans le système nerveux ou cardiovasculaire), ainsi que pour favoriser la régénération en fournissant un remplacement direct des cellules souches et des circuits neuronaux. Ce protocole prévoit une procédure détaillée pour la création d’un biomatériau basé sur un polymère naturel, et sa mise en œuvre devrait grandement favoriser le développement de polymères naturels corrélatives, permettant de réaliser des stratégies de régénération des tissus.

Introduction

Le dernier développement dans la régénération des tissus implique l’application de l’ingénierie tissulaire, ce qui représente un défi pour l’amélioration de nouvelles stratégies thérapeutiques dans les traitements médicaux. Par exemple, le potentiel limité de régénération du système nerveux, suivant les blessures ou les maladies, pose un problème de santé important dans le monde entier. En raison de la complexité des processus physiopathologiques associés au système nerveux, l’utilisation d’autogreffe traditionnelle ou la mise en œuvre de la chirurgie de stabilisation a été démontré d’offrir des avantages dans les résultats fonctionnels, mais il n’y a aucune preuve solide pour les effets de fixation vertébrale chirurgie1,2. Le tissu à la zone endommagée est perdu et remplacé par des astrocytes induit hypertrophically3, formant éventuellement une cicatrice gliale dense4,5. Cette matrice agit comme une barrière que bloque la récupération du nerf fonctionne6,7 et est, ainsi, grandement entrave la régénération. Donc, un matériau d’écart de remplissage approprié devrait empêcher la perte de tissus et de réduire la formation du tissu conjonctif, associée à cicatrice en maintenant l’intégrité de la zone endommagée, ainsi qu’en fournissant le remplacement direct des cellules neuronales et circuits pour promouvoir la régénération axonale.

Biomatériaux polymériques ont été préféré comme échafaudages pour la thérapie de régénération des tissus, basée sur la régulation des cellules ou axone comportement et tissu la progression grâce à l’appui naturel de la matrice extracellulaire (mec). Le format de la fibre est communément considéré comme un bloc de construction pour différents matériaux, en raison de sa structure de dimension8. Les fibres peuvent généralement être obtenus par extrusion de fonte ou humide filature méthode ; Cependant, la grande taille et le coût de l’équipement et de la difficulté à effectuer ces méthodes sont difficiles. En outre, la majorité des travaux lié aux fibres de polymère a été axée sur les matériaux synthétiques ou composites. Polymères naturels comme source de biomatériau offrent de meilleures propriétés de biocompatibilité pour le corps humain. Néanmoins, pour obtenir un alignement des fibres polymères naturels est relativement plus difficile que de polymère synthétique sources9. Par conséquent, la conversion d’un polymère naturel comme une source riche de protéines, en fibres de biomatériau est une stratégie importante — non seulement les fibres du biomatériau peuvent être directement isolées de la matière première, évitant ainsi une transformation inutile aux monomères, mais la fibres de protéine ont également un bon aspect et les caractéristiques favorables10.

À cet égard, les auteurs décrivent une méthode de traitement peu coûteux pour la fabrication des fibres de polymère naturel à travers le concept de base du filage humide, pouvant être mises en œuvre sur l’échelle de laboratoire pour l’ingénierie tissulaire. Filage humide est réalisée par l’extrusion et la coagulation d’une solution de polymère dans une nonsolvent de polymère adapté. Une solution appropriée, visqueuse dopée dans le milieu de coagulation entraîne les molécules de polymère dissoudre. Par le biais de la phase de transition, les filaments puis perdent leur solubilité et sont précipités sous la forme d’un polymère solide étape11. Se référant à ce concept, nous avons élargi puis le développement de la gélatine dans la forme du tube par un procédé de moulage, qui est considérée comme approprié pour application de régénération tissulaire. En outre, intrinsèquement, nous pouvons également développer toutes les formes de matière de fibres de gélatine (par exemple, conduit de gélatine enroulé plusieurs fibres de gélatine), pour d’autres voulu des applications.

Gélatine, un polymère naturel biodégradable, est formée de collagène dénaturé et hydrolysée, y compris n’importe quel état hélicoïdale semi-cristallin, amorphe ou triple de collagène12. Il est bien connu que le collagène est la protéine structurale essentielle dans tous les tissus conjonctifs de vertébrés et invertébrés13,14, qui est similaire à la structure de la protéine de l’ECM principal qui induit la croissance nerveuse et, simultanément, remplace une grande quantité de glycosaminoglycanes sécrétée au cours de la moelle épinière. Par conséquent, l’utilisation de la gélatine en tant que source serait un excellent choix pour n’importe quel véhicule médicalisé. En plus d’être une source peu coûteuse, gélatine est aussi biodégradable et cytocompatible et cliniquement prouvé pour être temporaire défaut remplissage15. Est devenue une forme de tube, des essais in vitro et in vivo décrits ici démontrent que la gélatine a une excellente biocompatibilité et l’aptitude au tissu futur applications d’ingénierie. Cultivés avec des cellules souches humaines adipeuses, tubes de gélatine améliorent la différenciation cellulaire dans les cellules progénitrices neurales à l’aide de nestin coloration positive comme un marqueur de cellules neurales. En outre, gélatine comme garnissage d’écart, sont produits par la méthode établie dans la présente étude, devrait être facile à gérer en toute sécurité et profiter grandement ingénieurs de tissus qui sont en train de développer des polymères naturels corrélatives pour le renforcement du tissu stratégies de régénération.

Protocol

Les tissus adipeux ont été obtenues de chirurgies orthopédiques, attestée par l’institutionnel Conseil examen de hôpital général pour le Tri-Service, Taipei, Taiwan, R.O.C. procédures portant sur des sujets animaux ont été approuvés par le Comité de protection des animaux au National Centre médical de la défense, Taiwan (équipe R.O.C). 1. Imprégnez processus de filature Préparation de la solution Dissoudre 5 g de poudre de gélatine dans…

Representative Results

Dans cette étude, nous avons développé avec succès la gélatine en fibres (Figure 2A) et les tubes (Figure 2B, C) à travers le concept convivial filage humide. Ces matériaux à base de gélatine peut être utilisées comme n’importe quel outil médical, selon leurs formes. Considérant que la surface fonctionnelle et la trame de ces matériaux sont plus adaptés pour la régénération de…

Discussion

Nous avons présenté le développement des biomatériaux à base de gélatine en utilisant un simple humide filage technique qui peut être appliquée dans l’étude des polymères naturels pour la régénération des tissus. Ce travail a démontré la possibilité de fabrication de la gélatine comme source de protéines grande sans l’ajout d’autres sources, dans le but d’optimiser les propriétés de la gélatine lui-même. Le développement des biomatériaux axée sur la gélatine a été entièrement réalis?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Cette étude a été financée par le ministère de la défense nationale (MAB-105-070 ; MAB-106-077 ; MAB-107-032 ; MAB-107-065), le ministère de la Science et la technologie (la plupart 107-2320-B016-016), Tri-Service General Hospital, le National Defense Medical Center, Taiwan (TSGH-C106-046 ; TSGH-C106-115 ; TSGH-C107-041) et Cheng-Hsin General Hospital et la coopération (CH-CMDN-107-8) de la National Defense Medical Center.

Materials

Solution preparation:
Gelatin type B (porcine) Ferak Art. -Nr. 10733 500 g vial
Wet spinning process:
Peristaltic pump Gilson Model M312 Minipuls*3
Plastic tube connector World Precision Instruments 14011 1 box
Syringe Sterican 5A06258541 26Gx1/2"(0.45 x 12mm)
Acetone Ferak Art. -Nr. 00010 2.5 L vial
Polycaprolactone CAPA 6500 Perstorp 24980-41-4
Dichloromethane  Scharlau CL03421000 1 L vial
Glass Pasteur pipette Fisher Scientific 13-678-20A
Hemostat Shinetec instruments ST-B021
Peripheral venous catheter (Introcan Certo) B. Braun 1B03258241 24Gx3/4"(0.7 x 19mm)
Morphology of the gelatin tube:
Ion sputter coater machine  Hitachi e1010
Scanning electron microscopy Hitachi S-3000N
Cultivation of cells on the gelatin tube:
Trypsin-EDTA Gibco 488625 100 mL vial
Fetal bovine serum Gibco 923119 500 mL vial
Dulbecco's modified Eagle's medium  Gibco 31600-034 Powder
Keratinocyte-SFM medium Gibco 10744-019 500 mL vial
T25 culture flask TPP 90025 VENT type
6-well plate Falcon 1209938
Immunocytochemistry:
Phospate-buffered saline Gibco 654471 500 mL vial
Acetic acid glacial Ferak Art. -Nr. 00697 500 mL vial
NP-40 surfactant (Tergitol solution) Sigma 056K0151 500 mL vial
Normal goat serum Vector Laboratories S-1000-20 20 mL vial, concentrate
Nestin (primary antibody) Santa Cruz Biotechnology SC-23927
Donkey anti-mouse-fluorescein isothiocyanate (secondary antibody) Santa Cruz Biotechnology SC-2099
Hoechst 33342 Anaspec AS-83218 5 mL vial
In vivo biocompatibility test:
Tiletamine+zolazepam  Virbac BC91 5 mL vial
Xylazine Bayer korea KR03227 10 mL vial
Ketoprofen Astar 1406232 2 mL vial
Povidone-iodine solution Everstar HA161202 4 L barrel
Cefazolin China Chemical & Pharmaceutical 18P909 1 g vial
Scalpel blade Shinetec instruments ST-B021
Surgical scissor Shinetec instruments ST-B021

References

  1. Bagnall, A. M., Jones, L., Duffy, S., Riemsima, R. P. Spinal fixation surgery for acute traumatic spinal cord injury. Cochrane Database of Systematic Reviews. 1, 004725 (2008).
  2. Fehlings, M. G., Perrin, R. G. The role and timing of early decompression for cervical spinal cord injury: update with a review of recent clinical evidence. Injury. 36, 13-26 (2005).
  3. Yang, L., Jones, N. R., Stoodley, M. A., Blumbergs, P. C., Brown, C. J. Excitotoxic model of post-traumatic syringomyelia in the rat. Spine. 26, 1842-1849 (2001).
  4. Rolls, A., et al. Two faces of chondroitin sulfate proteoglycan in spinal cord repair: a role in microglia/macrophage activation. PLoS Medicine. 5, 1262-1277 (2008).
  5. Properzi, F., Asher, R. A., Fawcett, J. W. Chondroitin sulphate proteoglycans in the central nervous system: changes and synthesis after injury. Biochemical Society Transactions. 31, 335-336 (2003).
  6. Fawcett, J. W., Asher, R. A. The glial scar and central nervous system repair. Brain Research Bulletin. 49, 377-391 (1999).
  7. Yang, Z., Mo, L., Duan, H., Li, X. Effects of chitosan/collagen substrates on the behavior of rat neural stem cells. Science China Life Sciences. 53, 215-222 (2010).
  8. Chawla, K. K. . Fibrous Materials. , (1998).
  9. Pickering, K. L., Aruan Efendy, M. G. A review of recent developments in natural fibre composites and their mechanical performance. Composites Part A-Applied Science and Manufacturing. 83, 98-112 (2016).
  10. Lundgren, H. P. Synthetic fibers made from proteins. Advances in Protein Chemistry. 5, 305-351 (1954).
  11. Radishevskii, M. B., Serkov, A. T. Coagulation mechanism in wet spinning of fibres. Fibre Chemistry. 37, 266-271 (2005).
  12. Yannas, I. V. Collagen and gelatin in the solid state. Journal of Macromolecular Science Part C Polymer Reviews. 7, 49-106 (1972).
  13. Baer, E., Cassidy, J. J., Hiltner, A. Hierarchical structure of collagen composite Systems: lessons from biology. Pure and Applied Chemistry. 6, 961-973 (2009).
  14. Harrington, W. F., Von Hippel, P. H. The structure of collagen and gelatin. Advances in Protein Chemistry. 16, 1-138 (1961).
  15. Veis, A. . The Macromolecular Chemistry of Gelatin. , (1994).
  16. Freyman, T. M., Yannas, I. V., Gibson, L. J. Cellular materials as porous scaffolds for tissue engineering. Progress in Materials Science. 46, 273-282 (2001).
  17. Michalczyk, K., Ziman, M. Nestin structure and predicted function in cellular cytoskeletal organization. Histology and Histopathology. 20, 665-671 (2005).

Play Video

Cite This Article
Wang, C., Sartika, D., Wang, D., Hong, P., Cherng, J., Chang, S., Liu, C., Wang, Y., Wu, S. Wet-spinning-based Molding Process of Gelatin for Tissue Regeneration. J. Vis. Exp. (145), e58932, doi:10.3791/58932 (2019).

View Video