Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Forberedelse og gen modifikation af ikkemenneske primat hæmatopoietisk stamceller og stamceller

Published: February 15, 2019 doi: 10.3791/58933
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,2,3, 1,2
1Stem Cell and Gene Therapy Program, Fred Hutchinson Cancer Research Center, 2Department of Medicine, University of Washington, 3Department of Pathology, University of Washington

Summary

Målet med denne protokol er at isolere rettighedsbegrebet primat CD34+ celler fra PRIMES knoglemarv, gen-redigere disse celler med lentiviral vektorer og forberede et produkt til infusion til den autologe vært. Den samlede protokol længde er ca. 48 h.

Abstract

Hæmatopoietisk stilk og stamfader celle (HSPC) transplantation har været en hjørnesten terapi for leukæmi og andre kræftformer i næsten et halvt århundrede, ligger til grund for den eneste kendte kur af human immundefekt virus (HIV-1) infektion og viser enorme løfte i behandling af genetiske sygdomme som beta thalassemia. Vores gruppe har udviklet en protokol til model HSPC genterapi i humane primater (primaterne), gør det muligt videnskabsfolk til at optimere mange af de samme reagenser og teknikker, der anvendes i klinikken. Her, vi beskriver metoder til rensning af CD34+ HSPCs og langsigtede vedvarende hæmatopoietisk stamcelle (HSC) delmængder fra PRIMES knoglemarv (BM). Samme teknikker kan anvendes til rensning af andre HSPC kilder (f.eks. mobiliserede perifert blodstamceller [PBSCs]). Skitseret er en 2-dages protokol, hvor celler er renset, kulturperler, modificeret med lentivirus (LV) og forberedt til infusion tilbage ind i autolog værten. Centrale udlæsninger af succes omfatter renheden af CD34+ HSPC befolknings, renset HSPCs evne til at danne morfologisk adskilte kolonier i halvfaste medier og vigtigst gen ændring effektivitet. Den vigtigste fordel ved HSPC genterapi er evnen til at give en kilde af langlivede celler, der giver anledning til alle hæmatopoietisk celletyper. Som sådan, har disse metoder været anvendt til model behandlingsformer for kræft, genetiske sygdomme og infektionssygdomme. I hvert tilfælde konstateres terapeutiske virkning ved at øge funktionen distinct HSPC afkom, herunder røde blodlegemer, T-celler, B-celler eller myeloide delmængder. Metoder til at isolere, redigere og forberede HSPC produkter er direkte gældende og oversættes til flere sygdomme i menneskelige patienter.

Introduction

Stem cell genterapi er et effektivt middel til at løse en bred vifte af menneskelige patologier. HSPC genterapi er et særligt attraktivt tilgang, på grund af i) den relative lethed indsamle disse celler fra patienter, ii) rigdommen af viden, der er tilgængelig om celle overflade fænotyper og ex vivo kultur parametre, og udvider sig som feltet, fordi iii) det præsenterer forskere med en stigende værktøjskasse af genet ændring strategier skræddersyet til forskellige sygdomme af interesse. Vi undersøger aktivt HSPC gen terapi metoder fra flere vinkler, herunder de grundlæggende videnskab HSPC biologi, engraftment af gen-modificerede HSPCs i prækliniske undersøgelser in vivo modeller og ansøgning til relevante patientgrupper. Vi og andre har præget den celle overflade Fænotypen af funktionelt adskilte HSPC delmængder1,2,3, mobilisering og conditioning regimer, at Maksimer HSPC udbytte og engraftment samtidig minimere toksicitet4,5, og genet ændring og gen-redigering strategier, der er skræddersyet til en bred vifte af ondartede, genetiske og infektionssygdomme6,7,8, 9,10. Funktion og engraftment af gen-modificerede HSPCs kan evalueres i et antal små - og store-dyr modeller, herunder mus, hunde og primaterne. Især er PHN modeller fordelagtig, fordi mange reagenser, for eksempel antistoffer specifikke for HSPC celle overflade proteiner som CD34 og CD90, kan blive brugt i flæng i menneskelige og NHP celler. Desuden, i modsætning til mus, store dyr som primaterne tillade et tættere indbyrdes tilnærmelse af omfanget af gen ændring nødvendig for klinisk effekt. Endelig primaterne er guld standard for modellering af menneskers sygdomme såsom HIV-1 infektion11 og er en spirende modelsystem for kandidat anticancer og anti-HIV immunoterapi12,13.

Formålet med denne protokol er at skitsere metoder til rensning, genetisk ændring, og tilbereder NHP HSPC infusion produkter. Selv om uden for anvendelsesområdet for denne protokol, har vi tidligere vist at disse produkter indpode autolog PHN hosts, give anledning til alle hæmatopoietisk lineages og give terapeutisk virkning i en bred vifte af sygdom modeller1. Vi har også præget clonality af engrafting HSPCs og bygget en platform for at spore kinetik, menneskehandel og fænotype af individuelle HSPCs og deres afkom, følgende autolog transplantation1,14. De metoder, der præsenteres her er blevet udviklet med følgende mål: i) at isolere meget rene HSPCs og langsigtede engrafting HSC delmængder, ii) at opretholde primitive HSCs under ex vivo kultur, og iii) til effektivt gen-ændre enten bulk HSPCs eller langsigtede engrafting HSC undersæt. Vi ansætter magnetisk-assisteret celle sortering (MLA), samt fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS), for at isolere fænotype/funktionelt adskilte HSPC befolkninger, i overensstemmelse med metoderne, der af mange grupper2,15, 16. Vedligeholdelse af primitive HSCs i kultur (dvs., minimere differentieringen af disse celler i engageret progenitorceller, som giver anledning til fuldt differentierede lymfoide og myeloide delmængder) er en vigtig facet af den protokol, der er beskrevet her. Selv om vi har tidligere karakteriseret tilgange for at udvide HSPCs samtidig bevare en primitiv fænotype17,18, her, beskriver vi en protokol, der fokuserer på at fastholde HSCs via en minimal (48 h) og defineret ex vivo kultur.

Den effektive ændring af HSPCs og HSC delmængder er et centralt mål i denne protokol. Blandt flere metoder vi har rapporteret, to er langt de mest undersøgte i kliniske forsøg: LV-medieret gen ændring og nukleasen-medieret gen redigering1,6,19. Gen-redigering strategier bruger en af en række nukleasen platforme specifikt ændre en målrettet gen af interesse, for eksempel, C-C chemokine receptor type 5 (CCR5) til behandling af HIV infektion7,19 eller Bcl11A til behandling af hemoglobinopathies6. Her fokuserer vi på LV-medieret gen ændring, hvor transgene ladninger integrere semirandomly i genom1,8,20. En vigtig fordel af LV tilgange er evnen til at levere store mængder af genetisk materiale (op til 8 eller 9 kilobases). Selv om redigering af genet strategier udvikles for at målrette en transgen af interesse at integrere kun på en bestemt locus af homologe donor rekombination (HDR), kræver disse metoder yderligere udvikling af in vitro og i små dyremodeller. Derimod har LV vektorer været brugt i udstrakt grad i primaterne og patienter21,22. Vigtigere, kan protokollen beskrevet her, som benytter primet BM som udgangspunkt HSPC kilde, nemt og generelt tilpasses, for eksempel, for at isolere PBSCs. Som beskrevet ovenfor, drage vi fordel af den høje grad af genetisk lighed mellem primaterne og mennesker at bruge reagenser, der anvendes til begge arter. Endelig, denne tilgang er blevet tilpasset for at ændre andre hæmatopoietisk delmængder, nemlig T celler12,23,24; fremkomsten af virkningsfuldt T-celle immunterapi tilgange har påberåbt sig stærkt samme LV platformen udnyttes i denne protokol. Disse metoder er hensigtsmæssige for enhver interesseret i enten HSPC biologi eller LV-medieret gen ændring forsker. For eksempel, HSPC rensning protokollen præsenteres her kunne bruges til at karakterisere romanen HSC-beriget delmængder, som tidligere beskrevet1,15,25. Ligeledes, LV transduktion metoder præsenteres her kunne ligeledes anvendes og yderligere udviklet til talrige andre celletyper og eksperimenterende spørgsmål, både i in vitro- og in vivo modeller.

I sammendrag præsenterer vi metoder for at isolere og genetisk ændre PHN HSPCs. Disse metoder kan være let tilpasses til andre arter og andre kilder til HSPCs. Denne grundigt undersøgt protokollen viser meget lovende i modellering af effektive behandlinger for mange menneskelige sygdomme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Autolog PHN transplantationer, priming (mobilisering), samlingen af celler og gen-modifikation er udført i overensstemmelse med tidligere publicerede protokoller26. Alle eksperimentelle procedurer gennemgås og godkendes af institutionelle Animal Care og brug Udvalget af Fred Hutchinson Cancer Research Center og University of Washington (protokol #3235 - 01). Alle undersøgelser er udført i nøje overensstemmelse med anbefalinger i vejledningen for pleje og anvendelse af forsøgsdyr af National Institutes of Health ("The Guide"); dyrene blev randomiseret til undersøgelserne.

1. berigelse af CD34+ HSPCs og natten kultur (dag -1)

  1. Høste BM og betingelse det.
    1. Mobilisere primaterne med granulocyt koloni-stimulerende faktor (GCSF) i 4 dage som tidligere beskrevet26.
    2. Adstadige dyr med 100 mg/kg af ketamin og 0,03 mL/kg dexmedetomidine (0,5 mg/mL bestand). Administrere analgetika (fx buprenorphin SR) på tidspunktet for lodtrækningen.
    3. Bruger neglesaks, barbere dyrets hår fra den proksimale ende af humerus og/eller lårben knoglerne(med) og skrub huden med jod-baserede scrub eller en lignende antiseptisk opklaring, suppleant med alkohol, og Gentag 3 x. Som en ekstra narkose, indgyde periosteum med bupivacaine (2 mg pr. websted, 5 mg/mL bestand).
    4. Placer knoglemarv aspiration nål (16 G) over webstedet periosteal post (medullær hulrum) og gennembore huden, gennemtrængende medullær hulrummet ved hjælp af en roterende bevægelse. Fjerne stylet af aspiration nålen og reservere det i et sterilt felt til yderligere brug.
      Bemærk: Vælg webstedet periosteal post til den medullære kavitet i et område af knoglen, ikke er omfattet af muskler og hvor figur/landskab af knoglen er enten synlige eller kan kunne nemt mærkes gennem huden (almindeligt mod den proksimale eller distale ende af knoglen).
    5. BM nålen, tillægger en forudfyldte sprøjte indeholdende en blanding af antikoagulerende dextrose citratopløsning (ACD-A) og heparin (20 USP/mL, 1 mL pr 9 mL af marv indsamles).
    6. Trække stemplet tilbage mens blidt rokkende lemmer og dreje det, for at agitere i sprøjten for at blande aspirat og antikoagulans. Rotere nålen og flytte det hele til aspiration og tilbagetrækning at få adgang til en større procentdel af celler i marv plads.
    7. Når prøven er indsamlet, fjerne nålen og lægge pres på webstedet aspiration indtil blødningen standser.
      Bemærk: Afhængigt af mængden nødvendig, kan knoglemarv fra én til fire lemmer (to humeri, to lårben) drages under en enkelt samling. Ikke mere end 20 mL bør indsamles fra hver legemsdel, og den samlede mængde indsamlet bør udgøre højst 10% af dyrets vægt (10 mL/kg).
    8. Hvis modtager aspirates fra flere lemmer, kombinere og optage volumen.
    9. Lad PHN genoprette postanesthesia.
      1. Modvirke effekten af dexmedetomidine med 0,03 mL/kg Atipamezol (5 mg/mL lager) efter indgrebet. Give analgetika (fx buprenorphin SR) som foreskrevet af klinisk veterinær personale i mindst 48 timer efter indgrebet eller længere, efter skøn af den kliniske dyrlæge, baseret på kliniske tegn.
      2. Returnere dyret til sit hjem bur efter indgrebet og overvåge det hvert 15-20 min, indtil dyret kan sidder op sin egen. Overvåge dyret dagligt af dyrlægen personale, indtil det er fastslået, at aspiration kvadratnetsreference er helet. Desuden overvåge for tegn på betændelse, infektion eller smerter.
    10. Parallelt til celle forarbejdning, forudsat den samme PHN med myeloablative samlet organ bestråling (TBI): 1.020 cGy med en sats på 7 cGy/min. administrere bestråling i fraktionerede doser over 2 dage før celle infusion.
  2. Hemolyze af BM.
    1. Opdele BM i 50 mL konisk rør (10-12 mL pr tube) og tilføje hæmolytisk buffer for at bringe lydstyrken til 50 mL (tabel 1). Inkuber cellerne ved stuetemperatur (RT), indtil de er mængden men ikke længere end til 7 min. centrifugeres ved 800 x g i 5 min og Opsug supernatanten fra pellet(s), forlader 2-5 mL volumen/tube. Resuspenderes i residualvolumen.
      Bemærk: Med held mængden prøver ændre farve, fra en mørk rød til en gennemsigtig lys rød.
    2. Tilføje 10-15 mL hæmolytisk buffer/pellet. Fjerne enhver blodpropper, ved hjælp af 70 µm celle sier. Tilføje hæmolytisk buffer op til 50 mL, inkuberes i 5 min på RT og spin på 800 x g i 5 min.
    3. Opsug supernatanten og resuspend celler i 10 mL af MACS buffer (tabel 1). Filtrere igen gennem en 70 µm celle si. Skyl rør og filter det med 40 mL MACS buffer op til 50 mL.
  3. Berige CD34+ celler fra de hemolyzed hvide blodlegemer (WBCs) bruger standardprotokoller.
    1. Spin celler ved 800 x g i 15 min. Check rør for at sikre ingen celle hvirvler er tydelig i top/midten. Hvis celler er til stede over pellet, spin igen ved en højere hastighed (op til 1.000 x g maksimale) og for op til 10 min.
    2. Opsug supernatanten og resuspend det i 10 mL eller derunder af MACS buffer, at bemærke det nøjagtige volumen. Tælle celler ved 1: 100 eller 1:1,000 ved hjælp af en hemocytometer eller en automatiseret celle counter.
      Bemærk: Denne total leukocyttal er optællingen pre berigelse.
    3. Tilføje MACS buffer for at bringe den celle koncentration til 1 x 108 celler/mL. Hvis det er nødvendigt, først Gentag trin 1.3.1 - 1.3.2 (f.eks. på grund af en lav pre berigelse count). Reserve 5 x 106 celler i MACS buffer til HSC delmængde farvning (pre berigelse prøve).
    4. Tilføje ukonjugeret anti-CD34 antistof (klon 12,8, Tabel af materialer)27 til de resterende pre berigelse celler til en endelig koncentration på 40 µg/mL (1 x 108 celler/mL). Inkuber cellesuspension ved 4 ° C på en tube rotator (Se Tabel af materialer) for 25-30 min.
    5. Brug MACS buffer til at bringe lydstyrken til 50 mL og spin celler ved 800 x g i 5 min. Aspirér supernatanten, resuspend celler i 50 mL MACS buffer og spin igen ved 800 x g i 5 min.
    6. Degas 100 mL MACS buffer med to filter rør, indpakning luftindtaget med bagepapir, for 25-30 min eller indtil klar til brug.
    7. Beregne den nødvendige mængde af magnetiske perler: 1 mL af perler/109 celler. Opsug supernatanten og resuspend celler 108 celler/ml, når perlerne er tilføjet. For eksempel: 3 x 109 celler + 3 mL af perler + 27 mL MACS buffer til 30 mL af det samlede volumen.
    8. Inkuber cellesuspension ved 4 ° C på en tube rotator til 25-30 min.
    9. Erhverve magneter for kolonnerne; Planlæg at bruge 0,6 x 109 celler pr. kolonne. Anbring kolonnerne på magnet og placere en 50 mL konisk slange under hver kolonne til at indsamle flow gennem. Forberede en 15 mL konisk slange og stemplet for hver kolonne for eluering (trin
    10. Når inkubering i trin 1.3.8 er komplet, tilføje MACS buffer til 50 mL og spin på 800 x g i 5 min. aspirat supernatanten og resuspend celler i afgassede MACS buffer (2 mL pr. kolonne). Tilsæt forsigtigt for at undgå at indføre bobler.
    11. Uden at tillade kolonnen for at løbe tør, tilsættes 1 mL af afgassede MACS buffer til hver kolonne, efterfulgt af 2 mL cellesuspension. Skyl det filter og den oprindelige tube med afgassede MACS buffer og opdele løsning ligeligt mellem kolonner (6 mL/kolonne); derefter tilsættes 7 mL afgassede MACS buffer for den sidste vask.
    12. Forsigtigt trække kolonnen fra magnet (skubbe den øverste bagsiden) og indsamle de sidste drop ind i flow-gennem røret. Der tilsættes 5 mL af afgassede MACS buffer til hver kolonne og anvende stemplet for at eluere celler ind i sterile koniske rør fra trin 1.3.9. Indsamle ikke nogen form for væske, efter bobler vises.
  4. Tælle celler i både den beriget og gennemstrømning (FT) indsamling rør på et fortyndingsforhold på 1:10. Hold celler på is. Alikvot 1 x 106 celler fra CD34-beriget fraktion og 5 x 106 celler fra FT fraktioner analyseres ved flowcytometri. Butik FT brøkdel ved 4 ° C indtil kvalitetskontrol (trin 2) er afsluttet.
    Bemærk: Antallet af CD34+ celler, der kræves for succesfuld multilineage engraftment i PHN er afhængig af frekvensen af HSC-beriget CD34+CD90+CD45RA- undersæt. Baseret på en gennemsnitlig frekvens på 3-5% og minimumskravet på 122.000 CD34+CD90+CD45RA- celler pr. kilogram af kroppens vægt1, det er anbefalet at gå videre med en total på mindst 2,5 x 106 og op til 10 x 10 6 CD34+ celler pr. kg kropsvægt.
  5. Tilføje MAC'ER af CD34-buffer+ beriget brøk til en 50 mL i alt, spin på 800 x g i 5 min, Aspirér supernatanten og resuspend celler 106 celler/ml i HSPC medier (tabel 1).
    1. Plade celler med en tæthed på 106 celler/mL i udluftet, vævskultur (TC)-behandlet T-75 kolber, 10-20 mL pr. flaske, og Inkuber dem natten over i et 37 ° C, 5% CO2 inkubator. Hvile kolber på langs (ikke stående).
      Bemærk: Hvis det ønskes, yderligere CD34+ celler eller CD34- FT kan være befrugtede i 90% varme-inaktiverede føtal bovint serum (FBS) + 10% dimethylsulfoxid (DMSO) ved en koncentration på 1 x 106 til 5 x 106 celler/mL, derefter langsom-afkølet på - 80 ° C (fx ved hjælp af indefrysning containere). Det gennemsnitlige inddrivelse udbyttet af kryopræserverede celler er afhængig af CD34+ renhed og almindeligt varierer fra 50% til 80% med en levedygtighed af > 80%.

2. kvalitetskontrol af CD34-beriget celler (dag -1)

  1. Forberede prøverne til flowcytometri.
    1. Resuspend prøver reserveres fra hver isolation fase nævnt ovenfor (før tilsætning, FT og CD34-beriget brøker) i FACS buffer i en koncentration på 10 x 106 celler/mL og overføre 100 µL af hver cellesuspension (tabel 1) til en FACS tube.
      Bemærk: Kontrolprøver bør omfatte unstained celler fra hvert isolation trin (f.eks. 5 x 105 celler) ved justeringen af forward scatter (FSC), side scatter (SSC) og autofluorescence i hver kanal, fluorescens. Derudover skal single-farvede kompensation perler for hver fluorokrom-konjugeret antistof til at justere for kompensation mellem tilstødende kanaler (tabel 2 og tabel 3).
    2. Tilføje ønskede antistoffer (fx anti-CD45, anti-CD34, anti-CD45RA og anti-CD90), ifølge fabrikantens anvisninger, for en test (1 x 106 celler i 100 µL) (tabel 3). Inkuber i 20 min. ved 4 ° C. Tilføj 3 mL af FACS buffer og spin på 800 x g i 5 min, Aspirér supernatanten, resuspend i 100 µL af FACS buffer og analysere på et passende flow forskellige (trin 2.2).
  2. Forberede flow forskellige/celle sorteringsanlæg til analyse.
    Bemærk:     anbefales det at udføre analysen på den samme maskine, der vil blive brugt til celle sortering i trin 2.3.
    1. Generere en protokol, herunder FSC/SSC, CD45/CD34 og CD45RA/CD90 (tre flow parceller). Højreklik på en flow plot og tilføje befolkning hierarki -layoutet.
    2. Venstreklik på FSC/SSC plot, Vælg funktionen polygon gate, og tegne en gate for at udelukke snavs og døde hudceller. Fremhæve den nye gate og omdøbe den til Scatter i vinduet inspektør.
      Bemærk: Dette kaldes automatisk som P1.
    3. Højreklik i midten af handlingen CD45/CD34 flow, Naviger til at vise befolkningerog gate plot på scatter. Tegne en rektangulær gate omkring CD45intCD34+ celler til at udelukke ikke-CD34 celler og nonhematopoietic celler, som godt som resterende blodplader og erythrocytter (CD45-). Omdøbe porten til CD34+.
    4. Gate CD45RA/CD90 flow plottet på en CD34+ befolkning. Tegne tre uafhængige subgates omkring CD90+CD45RA- celler (beriget til HSCs), CD90-CD45RA- celler (beriget til Multipotente og erythro-myeloide stamceller [MPPs/EMPs]) og CD90-CD45RA + celler (beriget til lymfocytter-myeloide stamceller [LMPs]). Omdøb porte til HSC, MPP-EMPog LMP, henholdsvis.
    5. Når du er færdig, sikre, at befolkningen hierarkiet indeholder seks hierarkisk organiseret poster i følgende rækkefølge: 1) alle begivenheder; 2) scatter; 3) CD34+; 4) HSC; 5) MPP-EMP; 6) LMP. Sikre, at flow plots og formen på porten ser som illustreret i figur 4.
    6. Køre unstained pre berigelse WBCs for at justere spændingen til FSC, SSC og alle fluorescens kanaler (tabel 2, prøve 5). Kør single-farvede kompensation perler for at justere kompensation mellem tilstødende kanaler (tabel 2, prøver 1-4). Kør alle de resterende unstained og farves prøver med den justerede og kompenseret protokollen, for at dokumentere CD34 berigelse effektivitet (tabel 2, prøver 6-9).
      Bemærk: Hold den sidste prøve (tabel 2, prøve 10) for den samtidige flow analyse og celle sortering i trin 2.4.
  3. Konfigurere celle sorteringsanlæg til sortering-rensning af CD34 delmængder i kolonidannende celle (CFC) assays.
    Bemærk:     hvis en anden maskine er blevet brugt til analyse (trin 2.2), opsætning af protokollen om cellen sorter som tidligere beskrevet i trin 2.2.1 - 2.2.5.
    1. Justere vinkel/spænding for venstre og højre side vandløb i celle sorteringsanlæg software at indbetale celler til 15 mL rør indeholdende CFC medium. Konfigurere vinklen på side stream at forhindre forskydning. Trinvis, finjustere vinklen på afrettet side stream, indtil de sorterede celler ramte CFC medium og ikke siden af røret, fordi meget få celler er sorteret.
    2. I browseren, åbne mappen globale regneark og oprette en ny form-layout ved hjælp af knappen i menuen øverst i browservinduet. Ændre posten i rullemenuen samling enhed til 2 rør, posten i rullemenuen præcision til 4-vejs renhed eller enkelt celle og angive mål begivenheder til 800-1.200 celler. Venstreklik på feltet sorter-placering (venstre eller højre), Vælg den post tilføje i menuen, og vælg befolkningen til at sortere fra menuen.
  4. Sortere cellerne for CFC assays.
    Bemærk:     sortering for CFC-assays er kun udføres med celler fra CD34-beriget produktet (tabel 2, prøve 10).
    1. Indlæse prøve 10, optage 2.000-3.000 begivenheder og fin-justere form portene passer til signal styrke og målrette populationer.
    2. Når installationsprogrammet er fuldført, erhverve celler (tabel 2, prøve 10). Erhverve data som beskrevet i trin 2.2.3, justere flow til 500-1.000 celler/s og sortere 800-1.200 celler fra i) Scatter gate, ii) CD34+ gate, iii) HSC porten, iv) MPP-EMP-porten, og v) LMP gate i separate rør indeholdende 3,6 mL af CFC medier.
      Bemærk: Sortering for CFC assays er kun udføres med celler fra produktets CD34-beriget (tabel 3, prøve 10). Celler fra Scatter og CD34+ gates skal sorteres individuelt, hvorimod HSCs, MPP-EMPs og LMPs kan sorteres samtidigt i den venstre og højre tube holder holdning.
    3. Vortex og dispensere 1 mL cellesuspension til hver af de 3 x 3.5 cm sterile, nontissue, kultur-behandlede petriskåle. Inkuber celler ved 37 ° C i 10-14 dage i en sekundær container (f.eks.en 15 cm petriskål).
    4. Dage 10-11 postplating, tælle enkelte kolonier fra alle tre plader pr. betingelse, baseret på koloni morfologi.

3. gen ændring af CD34+ HSPCs og natten Recovery (dag 0)

  1. Fortynd 2,5 mL af 1 µg/µL CH-296 løsning til 50 µg/mL i 50 mL af Hanks afbalanceret saltopløsning (HBSS, se Tabel af materialer).
  2. Forberede LV transduktion kolber.
    1. Bestemme det omtrentlige antal nontissue-kultur (ikke-TC)-behandlet kolber behov (normalt fra celletal bestemmes i trin 1.4). Planlægger at plade 1 x 107 celler i 10 mL af medier pr. T-75 kolbe (1 x 108 samlede celler ville kræve 10 kolber) og omfatter et ikke-TC-behandlede 12-godt plade (mock transduktion betingelse). Tilføje sterile HBSS og 50 µg/mL CH-296 bestand fra trin 3.1 til hver kolbe/plade, i en koncentration på 2 µg/cm2. Til T-75 kolber, brug 3 mL 50 µg/mL CH-296 + 7 ml af HBSS; for den 12-godt plade, skal du bruge 160 µL af 50 µg/mL CH-296 + 340 µL af HBSS pr. brønd.
    2. Tillad retter at sidde uforstyrret på RT på en ren bænk eller i hood for 2 h. aspirat CH-296 og erstatte det med et tilsvarende volumen af sterile HBSS + 2% bovint serumalbumin (BSA). Der inkuberes ved RT i 30 min, Aspirér HBSS/BSA og vaske op med et tilsvarende volumen af sterile HBSS som indeholder 2,5% 1 M HEPES, pH 7,0. Opsug umiddelbart før plating celler (trin 3,4).
      Bemærk: Følgende trin 3.2.2, tillader ikke plader/kolber til at tørre ud. Plader der indeholder sterilt HBSS + 2,5% 1 M HEPES opbevares ved 4 ° C natten over (dvs., forberede dag -1).
  3. Høst og transduce af CD34+ celler fra dag -1.
    1. Ved hjælp af 10 mL pipette, skyl løst vedhængende celler af de gentagne, blid afskylning af hver kultur kolbe med steril HBSS. Sørg for at alle celler vil frigøre (hvis det er nødvendigt, tryk/slag kolben for at løsne cellerne).
    2. Centrifugeres celler ved 800 x g i 5 min og Opsug supernatanten resuspend celler i transduktion medier til en koncentration på 1 x 106 celler/mL. Når alle celler er blevet indsamlet, afgøre celletal, ved hjælp af en hemocytometer eller automatiseret celle counter.
    3. Tilsæt 1 mL cellesuspension (1 x 106 celler) til en brønd af CH-296-belagt 12-godt plade (for mock-transduced kontrolprøve). Kløft resten af celler blandt T-75 kolber (trin 3.2.2), tilføje ca 10 mL (1 x 107 celler) pr. flaske. Tillad celler til at overholde CH-296 belægning ved inkubering ved 37 ° C, 5% CO2 i 30 min, med hætter udluftet.
    4. Tø virus-aircondition medier (VCM, Tabel af materialer) og afgøre titer i smitsomme enheder per milliliter (IU/mL)28,29,30,31,32 . Tilføje den passende mængde af VCM til hver T-75 kolben fra trin 3.3.3 og inkuberes celler ved 37 ° C, 5% CO2.
      Bemærk: Hvis udførelsen af en enkelt transduktion, inkuberes natten; Hvis udførelsen af en dobbelt transduktion, Gentag dette stepapproximately 6 - 8 timer efter den første transduktion uden en vask/nyttiggørelse fase og, derefter, inkuberes natten over. For eksempel for én kolbe (1 x 107 celler) med en ønskede mangfoldighed af infektion (MOI) 10, tilsættes 1 mL af virus titered på 1 x 108 IU/mL.

4. celle høst og forberedelse til Infusion (dag 1)

  1. Høste cellerne.
    1. Indsamle transduced og mock celler, som beskrevet i trin 3.3.1 - 3.3.2. Udføre sekventielle vasker med 10 mL af HBSS, overfører vasker til den koniske rør med celler. Sikre, at alle celler er blevet fjernet fra kolber, aflytning/slapping kolberne, hvis nødvendigt.
    2. Centrifugeres celle suspensioner ved 800 x g i 5 min og Opsug supernatanten resuspenderes i 1 mL af HBSS. Kombinere de rør, der indeholder celler fra samme tilstand. Skyl med 10 mL af HBSS og tilføje, at cellesuspension. Bestemme de celle tæller ved hjælp af en hemocytometer. Bringe den samlede cellevolumen til 50 mL i HBSS og centrifugeres ved 800 x g i 5 min.
  2. Puls prostaglandin E2 (PGE2) og forberede infusion produkt reagenser.
    1. Opsug supernatanten og resuspend de transduced celler (ikke falsk) til 5 x 106/mL i HSPC medier uden cytokiner. Tilføje 10 mM PGE2 til en slutkoncentration på 10 µM. Inkuber celler på is til 2 h, forsigtigt hvirvlende dem al mulig 30 min.
    2. Under trin 4.2.1, varme-inaktivere autolog serum (Table of Materials), indpakning containeren i bagepapir og inkubere det ved 56 ° C i 30 min. forberede 2% autolog serum i HBSS (500 µL af varme-inaktiverede serum + 24,5 mL af HBSS), bland dem godt, og gemme blandingen på køl indtil brug. Også, under trin 4.2.1, høste mock-transduced celler i en 12-godt plade af pipettering cellerne op og ned kraftigt. Tilføje cellesuspension til en 15 mL konisk slange, vaske dem 3 x med 1 mL af HBSS, og Tilføj vasker til den samme 15 mL konisk slange.
    3. Efter 2 h af PGE2 inkubation, vaske celler 2 x ved centrifugering dem ved 800 x g i 5 min og kassere supernatanten. Efter den anden vask, resuspend celler i et passende volumen af HBSS for at tælle, ved hjælp af en hemocytometer eller en automatiseret celle counter.
      Bemærk: Celler ofte klumper sig efter en PGE2 puls, som kan gøre for mindre pålidelige celletal. Hvis det er tilfældet, skal du bruge celletal fra trin 4.1.2 istedet for sig fra trin 4.2.3.
  3. Reserve mock og transduced celler for kvalitetskontrol (trin 5) af varens infusion: 5 x 105 til 1 x 106 celler flow flowcytometri/celle sortering (trin 5.1 og 5.3) og ca 1 x 106 celler til flydende kultur (trin 5.2) og koloni polymerase kædereaktion (PCR) (trin 5.4).
  4. Forberede infusion produkt.
    1. Med resten af de transduced celler, udføre en tredje vask i 50 mL af HBSS, Aspirér supernatanten og resuspend celler i 10 mL af HBSS + 2% autolog serum (udarbejdet i trin 4.2.2). Trække 10 mL opløsning i en 20 mL sprøjten udstyret med en 16,5 G kanyle. Vaske tube med 10 mL af HBSS + 2% auto serum og trække vask i den samme sprøjte til at bringe den samlede mængde til 20 mL. Cap sprøjten med nål cap, etiket sprøjten, og placere den på is for transport/infusion.
    2. Indgyde produktets transduced celle i autolog værten, som ligger inden for en akkrediteret dyreforskning facilitet, via en central venøs kateter33,34. Overvåge den transplanterede dyr komplet blodlegemer tæller (CBCs) og blod kemi og udføre undersøgelsesspecifikke gen-mærkning assays skræddersyet til projekt1,6,19.

5. kvalitetskontrol

Bemærk: Flow flowcytometri og celle sortering udføres efter at cellerne er infunderet i dyrene som led i opfølgningen af beskrevet taktfast 4.4.2. Flow cytometric data bruges umiddelbart efter transplantation til at bestemme sammensætningen af fænotype definerede stilk og stamfader celle subsets i infusion produkt (trin 5.1 og 5.3), der henviser til, at analysen af CFC-undersøgelser, som udføres 12-14 dage postinfusion til at bestemme gen-modifikation effektiviteten af kolonien PCR (trin 5.4).

  1. Udføre flowcytometri og CFC sortering af varens infusion.
    1. Analysere cellerne ved flowcytometri og form-rense CD34 delmængder for CFC assays, som beskrevet i afsnit 2. Frø CFC-undersøgelser fra mock og transduced CD34 celler (infusion produkt efter PGE2 puls).
    2. Sortere maksimalt 800 celler pr. betingelse og vortex, plade, kultur, og tælle CFC assays som beskrevet i trin 2.4. Efter tælle, vælge kolonier fra CFC-assays til at udføre koloni PCR som beskrevet i trin 5.4.
  2. Flydende kultur
    1. Plade celler for flydende kultur i HSPC medier på 1 x 106/mL i ikke-TC-behandlede plader. På dag 2, 5 og 12 posttransduction, høst og tælle cellerne til flowcytometri. Der kræves ikke celle sortering for CFC assays.
    2. På dag 2 og 5, replate 33% af cellerne i frisk HSPC medier på 1 x 106/mL. Fryse 33% af cellerne i DNA ekstraktionsbuffer for kvantitative real-time PCR. Bruge 33% af celler til flowcytometri, som beskrevet i trin 2.1 og 2.2.
    3. Bruge disse data fra trin 5.2.2 til at analysere fænotypiske sammensætningen af hæmatopoietisk afkom. Bestemme hyppigheden af CD34 + celler og fænotype definerede delmængder, som beskrevet i trin 2.2.2 inden for hver enkelt prøve. Sammenligne sammensætningen af CD34+ celler mellem betingelser at fastlægge effekten af gen ændring.
      Bemærk: CD34+ celler bør bevare deres udtryk i hele den hele kultur og indeholder alle fænotypiske undersæt. Et tab af CD90+CD45RA- celler eller en overrepræsentation af phenotypical delmængder kan angive direkte eller indirekte virkninger af genet ændring.
  3. Kvantificere transgen udtryk (fx., grøn fluorescerende protein [normal god landbrugspraksis]) ved flowcytometri (valgfri og afhængigt af opsætningen af eksperimenterende), om tilpasning af protokollen fra trin 2.2.
    1. Tilføj tre flow parceller viser SSC/transgen (f.eks. VSK/normal god landbrugspraksis). Gate første plottet på HSCs, andet på MPPs-EMPs, og tredje på LMPs. Plot hver versus transgen (fx normal god landbrugspraksis) og oprette gates opkaldt HSC-NGL+, MPP-EMP-NGL+og LMP-NGL+, henholdsvis.
    2. Når du er færdig, befolkningen hierarki har indeholder ni hierarkisk organiseret poster i følgende rækkefølge: 1) alle begivenheder; 2) scatter; 3) CD34+; 4) HSC; 5) HSC-NGL+; 6) MPP-EMP; 7) MPP-EMP-NGL+; 8) LMP; 9) LMP-NGL+.
      Bemærk: Enhver transgen udtryk senere i flydende kultur (f.eks. dage 5 og 12) bedre afspejler gen ændring effektivitet afhænger af kolonien PCR taktfast 5.4. Tidligere tidspunkt punkter i flydende kultur kan overvurdere transgen udtryk, på grund af skadevirkning LVs. Tilsvarende vil flow-sortering normal god landbrugspraksis+ celler for CFC assays på dag 1 resultere i mange falske positive kolonier.
  4. Udføre koloni PCR.
    1. Efter optællingen i trin 2.4.4 og 5.1.1, vælge enkelt kolonier i 50 µL DNA ekstraktionsbuffer, ved hjælp af en 10 µL eller 20 µL afpipetteres og pipetteres op og ned for at overføre kolonierne til et rør af en 8-tube PCR strip cap. Vælge otte kolonier fra mock tilstand og 88 kolonier fra den transduced tilstand til at generere en fuld 96-brønd plade. Tilsæt 50 µL DNA ekstraktionsbuffer til hver brønd.
    2. Uddrag DNA fra kolonier, ved hjælp af en thermocycler og følgende program: 65 ° C/20 min, 99 ° C/10 min og et 4 ° C hold. Planlæg at flytte DNA-20 ° c så hurtigt som muligt for optimal kvalitet.
    3. Udføre koloni PCR at kvantificere LV-transduced celler, sammenligne antallet af LV+ kolonier, ved hjælp af Lenti F/R primere, til samlede kolonier, ved hjælp af Actin F/R og kontrol primere (Tabel af materialer).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den protokol, der er beskrevet ovenfor er designet til at isolere og gen-ændre PHN CD34+ HSPCs, som efterfølgende kan være infunderes tilbage ind i autolog værten (figur 1 og figur 2). Efter denne protokol, vi indhente normalt op til 8 x 109 samlede WBCs fra PRIMES BM fra grisehale makakaber og, undertiden, fordoble dette beløb fra rhesus makakaber. I begge arter, antallet af CD34+ HSPCs, som vi berige er proportional med input til den samlede leukocyttal (figur 3). Tidligere resultater viser, at den samlede CD34+ HSPC produkt indeholder celler, ikke der rigtigt, langsigtede engrafting HSCs. derfor, vi har udviklet flow-flowcytometri-baserede teknikker (figur 4) og bruge CFC assays (tal 5-6) til at identificere langsigtede HSCs og engageret stamfader delmængder i kulturer. I modsætning til ægte HSCs, vil engagerede stamfaderen vare ved en relativ kort tidsperiode in vivo. Endelig, LV-medieret gen ændring strategi resultater i robust gen mærkning i kulturperler CD34+ HSPCs. Disse celler er overvåget i op til 2 uger i kultur, dels for at reducere antallet af "falsk positiv" celler, der udtrykker normal god landbrugspraksis fra nonintegrated LV vektorer. Da disse celler ikke fører et stabilt integreret kopi af LV vektor i det cellulære genom, bliver de fortyndet ud over 12-dages flydende kultur assay (figur 7).

Figure 1
Figur 1: produktion af en autolog, gen-modificerede NHP HSPC produkt. Protokollen isolerer CD34+ HSPCs (dag -1), gen-ændrer disse celler (dag 0), og forbereder en infusion produkt (dag 1) over en 48 h tidsforløb. Koloni dannelse, flydende kultur, og relaterede ex vivo assays fortsætte i yderligere 2 uger, for at karakterisere disse produkter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: tidslinje for begivenheder. Den gennemsnitlige tid til at udføre hver enkelte trin i protokollen over ca 2 dage. Timingen af enkelte trin varierer afhængigt af stamceller kilde (trin 1 i protokollen) og/eller type af genet modifikation (trin 3 i protokollen). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: hvide blodlegemer og CD34 udbytte fra PRIMES grisehale og rhesus makak knoglemarv. Beriget CD34+ HSPC tæller (trin 1.4 i protokollen) som en funktion af samlede hvide blodlegemer (trin 1.3.3 i protokollen) fra 10 grisehale makakaber (firkanter) og seks rhesus makakaber (trekanter). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: strategi for kvalitetskontrol af CD34-beriget og gen-modificerede produkter-Gating. Samlede hvide blodlegemer ("før berigelse") og efterfølgende CD34-beriget HSPCs farves med antistoffer specifikke for CD34, CD45, CD90 og CD45RA, for at kvantificere antallet af HSC - MPP-, EMP- og LMP-beriget CD34 undersæt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: morfologi af CD34+ celler før og efter gen ændring. Top paneler: tre repræsentative brightfield billeder fra HSPC koloni assays. Bund paneler: normal god landbrugspraksis fluorescens svarende til hvert brightfield billedet ovenfor. Skalalinjen = 1 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: kolonidannende celle (CFC) potentiale af CD34+ celler og form-renset delmængder. Efter sortering rensning for CFC-undersøgelser fra HSPC delmængder dag -1 (afsnit 1 og 2 i protokollen) og dag 1 (punkt 5 i protokollen), enkelt kolonier er scorede baseret på morfologiske karakteristika. CFU-MIX = blanding af myeloide (hvid) og erythroid (rød) celler; BFU-E = kun erythroid celler; CFU-G = granulocytter; CFU-GM = granulocytter og makrofager/monocytter; CFU-M = makrofager/monocytter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: repræsentative flow cytometric data fra gen-modificerede celler i flydende kultur. Procentdel af CD34+ HSPCs efter transduktion med en normal god landbrugspraksis-udtrykker LV vektor. Celler er kulturperler i op til 2 uger efter transduktion. Et fald i normal god landbrugspraksis+ begivenheder over tid afspejler et tab af normal god landbrugspraksis signal fra celler transporterer nonintegrated LV vektorer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Navn Indhold
Hæmolytisk Buffer 150 mM ammoniumklorid, 12 mM natriumbikarbonat, 0.1 mM EDTA i dobbeltdestilleret vand (ddH2O)
Kommerciel Buffer Fosfatbufferet saltopløsning (1 X) pH 7,2, 0,5% BSA, 2 mM EDTA
FACS buffer Fosfatbufferet saltopløsning (1 X) pH 7,2, 2% føtal bovint Serum
HBSS + 2% BSA Hanks afbalanceret saltopløsning, 2% bovint serumalbumin
HSPC medier StemSpan SFEM II, 1% Penicillin/Streptomycin, 100 ng/mL hver rekombinant humant TPO, SCF, FLT-3
Transduktion medier StemSpan SFEM II, 1% Penicillin/Streptomycin, 100 ng/mL hver rekombinant humant TPO, SCF, FLT-3, 1 µg/mL cyclosporin, 4 ug/mL Protamine sulfat

Tabel 1: Buffer og medier formuleringer.

ID PE PECF594 APC-Cy7 V450 Beskrivelse
1 CD90 Kompensation perler
2 CD34 Kompensation perler
3 CD45RA Kompensation perler
4 CD45 Kompensation perler
5 Unstained WBCs før CD34-berigelse
6 CD90 CD34 CD45RA CD45 Farvede WBCs før CD34-berigelse
7 Unstained WBCs i gennemstrømnings (FT)
8 CD90 CD34 CD45RA CD45 Farvede WBCs i gennemstrømnings (FT)
9 Unstained WBCs af CD34-beriget produkt
10 CD90 CD34 CD45RA CD45 Farves WBCs af CD34-beriget produkt

Tabel 2: Repræsentative flow panel for kvalitetskontrol af CD34-beriget og gen-modificerede celle produkter.

Antigen Klon Fluorokrom Laser Filter
CD45 D058-1284 V450 395 nm 450/40 nm
CD90 5.00E + 10 PE 488 nm eller 532 nm 585/42 nm
CD34 563 PE-CF594 488 nm eller 532 nm 610/20 nm
CD45RA 5H 9 APC-Cy7 633 nm 780/60 nm
V450: violet 450 nm; PE: Phycoerythrin; PE -CF594: varemærke navn fra Biotium; APC: Allophycocyanin-cyanine 7

Tabel 3: Antistoffarvning panel for kvalitetskontrol ved flowcytometri og celle sortering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

LV vektor engineering er de bedst karakteriserede metode til at gen-ændre celletyper såsom CD34+ HSPCs, til efterfølgende transplantation in vivo. Protokollen beskrevet her er designet til at maksimere antallet af gen-modificerede HSPCs, der eksisterer langsigtede i vivo, og kliniske udrede patienter med forskellige maligne, smitsomme og genetiske sygdomme. Selv om redigering af genet strategier er dukket op i det sidste årti, LV-modificerede celler er bedst undersøgt in vitro, i dyremodeller og i patienter1,8,20,21,22.

Baseret på vores omfattende erfaring med denne protokol, berigelse af ren CD34+ HSPCs (dvs. > 80% af CD34+ celler i produktets sorteret celle) er et kritisk aspekt af succes. Da disse celler er afledt fra en blandet population af samlede BM WBCs, kan lav-renhed kulturer omfatte celler, der ikke bliver indpode langsigtede, til gengæld sænke dosis af sande stamceller, der er tilført ind i autolog værten. Derudover sikrer høj kvalitet LV VCM gen ændring højeste effektivitet.

Adresse mangler i renheden af beriget CD34+ HSPC produkter, det er ofte nyttigt at efterprøve kvaliteten af de reagenser, der anvendes til at isolere disse celler, nemlig den anti-CD34-antistof (som vores gruppe renser in-house fra en hybridom cellelinje), og magnetiske perler, som binder antistof-mærket celler. Vi anbefaler et MOI 10, med mulighed for at gentage denne transduktion (MOI 10 x 2). Vigtigere, bør MOI bestemmes empirisk, efter en kvalitetsvurdering af VCM, herunder titrering af hver vektor på et standardiseret titering cellelinje såsom HT108029. Vigtigere, kan forskellige fremstilling af VCM laboratorier bruge særskilte titering cellelinjer, herunder HOS30, HeLA31og 293T32, som kan begrænse muligheden for at sammenligne titers mellem faciliteter. Vi foretrækker at retiter en vektor med analysen, for at beregne den mest præcise af VCM til effektivt gen-ændre CD34+ HSPC målrette celler. Endnu en lang-seriøs CD34+ HSPCs og VCM har opnået, transduktion effektivitet og engraftment er yderligere forbedret i tre forskellige trin. Først, tilsætning af ciclosporin transduktion media aids i de tidlige trin af vektor transduktion og integration i target celler35,36, mens protamine sulfat falder frastødende kræfter mellem den lentiviral vektor partikler og celle overflade33,37. Andet, behandling af plader med en rekombinant fibronektin fragment (f.eks. RetroNectin, CH-296) øger transduktion effektivitet og også forbedrer in vivo engraftment potentiale af gen-modificerede HSPCs 33,38, 39. Navnlig tyder tidligere undersøgelser på, at CH-296 er kun vigtigt under, men ikke før, transduktion33,38. Endelig, vi puls gen-modificerede celle produkter med PGE2 at forbedre engraftment og vedholdenhed i vivo, som tidligere har været vist for menneskelige og rettighedsbegrebet primat CD34+ HSPC produkter40,41.

LVs integrerer tilfældigt i genomet, som gør deres forgænger, gammaretroviral vektorer (RVs). Selvom mindre kliniske forsøg data er tilgængelig for LVs end for autocampere, tyder aktuelle resultater på, at LV tilgange bærer betydeligt lavere risiko for celle forandringer på grund af LVS pattedyrsceller mutagenese; RV strategier anvendes mindre ofte på grund af denne risiko42. En yderligere begrænsning er, at effektiviteten af genet ændring er mindre end 100%, og en del af gen-modificerede celler vil ikke vare in vivo. For eksempel, en 60% gen-modificerede HSPC produkt kan resultere i 30% langsigtede engrafting, gen-modificerede celler. Når det er muligt, er gene therapy strategier præsenteret her designet til at overvinde denne begrænsning ved at indføre transgener, der giver terapeutiske virkning, selv når udtrykt i et mindretal af hæmatopoietisk oprindelse celler8,43 .

Fremtiden er lys for LV-baserede HSPC ændring tilgange. Vi bruger rutinemæssigt denne protokol til at "gen-mark" celler, aktivering af sporing in vivo1. Vi har også tilpasset denne strategi for at sammenligne LV varianter inden for de samme dyr. Sådanne "konkurrencedygtig" transplantationer giver mulighed for en sammenligning af forskellige vektorer (f.eks., at identificere dem med bedre effektivitet) og transgener (f.eks. til at spore forskellige HSPC delmængder eller sammenligne dem i sygdomsmodeller). Bevæger sig fremad, mener vi, at LV genterapi i HSPCs fortsat vil være et vigtigt redskab sammen med gen-redigering metoder, især i situationer hvor store genetiske ladninger stabilt skal udtrykkes for levetiden af et individ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Forfatterne takke Helen Crawford for at forberede dette manuskript, Jim Woolace til grafisk design, og Veronica Nelson og Devikha Chandrasekaran for at deltage i udviklingen af protokollen. Udviklingen af denne protokol blev støttet af tilskud fra NIH National Institute for allergi og smitsomme sygdomme (R01 AI135953 og AI138329 til H.P.K.) og National Heart, Lung og Blood Institute (R01 HL136135, HL116217, P01 HL122173 og U19 HL129902 til H.P.K.), samt NIH P51 OD010425 og dels gennem NIH/NCI Cancer Center, støtte Grant P30 CA015704. H.P.K. er en Markey Molekylær medicin Investigator og modtaget støtte som konstituerende modtageren af José Carreras/E. Donnall Thomas begavet stol til kræftforskning og Fred Hutch begavet stol for celle og Gene Therapy.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Stemspam SFEM II ("HSPC") Media StemCell 09655
Hank's Balanced Salt Solution Gibco 14175095
Phosphate-Buffered Saline Gibco 14190-144
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140-122
Dimethyl Sulfoxide Sigma Aldrich D2650-100
100% Ethanol Decon labs M18027161M
Cyclosporine Sigma 30024-25MG
500 mM EDTA Invitrogen 15575-038
Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum Sigma Aldrich PS-0500-A
CH-296/ RetroNectin (2.5 mL, 1 µg/µL) TaKaRA T100B
Bovine Serum Albumin Sigma A7906-100g
HEPES Sigma H9897
Rat anti-mouse IgM magnetic beads Miltenyi Biotec 130-047-301
Recombinant HumanStem Cell Factor (SCF) Peprotech 300-07
Recombinant Human Thrombopoietin (TPO) Peprotech 300-18
Recombinant Human FMS-like tyrosine kinase 3 (FLT-3) Peprotech 300-19
Protamine sulfate Sigma P-4505
14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube Corning 352059
Colony Gel 1402 ReachBio 1402
QuadroMACS Separators Miltenyi Biotec 130-090-976
MACS L25 Columns Miltenyi biotec 130-042-401
10 mM PGE2 Cayman Chemical 14753-5mg
TC-treated T-75 flasks Bioexpress T-3001-2
Non-TC-treated T-75 flasks Thermo-Fisher 13680-57
20 mL syringes BD Biosciences 302830
16.5 G needles BD Precision 305198
Syringe Tip Cap BD Biosciences 305819
QuickExtract DNA Solution Epicentre QE09050
8-tube strip cap PCR Tubes USA scientific 1402-2708
96-well Thermocycler Thermo-Fisher 4375786
Pre-Separation filters Miltenyi Biotec 130-041-407
Strainer, Cell; BD Falcon; Sterile; Nylon mesh; Mesh size: 70um; Color: white; 50/CS fisher scientific 352350
Ultracomp ebeads eBioscience 01-2222-42
MACSmix Tube Rotator Miltenyi 130-090-753
3 mL Luer-Lock Syringes Thermo-Fisher 14823435
35 mm x 10 mm cell culture dish Corning 430165
60 mm x 15 mm cell culture dish Corning 430196
150 mm x 25 mm cell culture dish Corning 430599
Non TC treated flasks Falcon 353133
Qiagen DNA extraction Qiagen 51104
PE Anti-Human CD90 (Thy1) Clone:5E10 Biolegend 328110
PE-CF594 Mouse Anti-Human CD34 Clone:563 BD horizon 562449
APC-H7 Mouse Anti-Human CD45RA Clone: 5H9 BD Pharmingen 561212
V450 Mouse Anti-NHP CD45 Clone:d058-1283 BD Biosciences 561291
Autologous Serum Collected from autologous host and cryopreserved prior to mobilization and collection of CD34+ HSPCs N/A Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).
Virus-Conditioned Media (VCM) Kiem Lab, FHCRC Co-operative Center for Excellence in Hematology (CCEH) N/A Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).
Anti-CD34 antibody, Clone 12.8 Kiem Lab N/A Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).
Lenti F primer: AGAGATGGGTGCGAGAGCGTCA Integrated DNA Technologies N/A Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).
Lenti R primer: TGCCTTGGTGGGTGCTACTCCTAA Integrated DNA Technologies N/A Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).
Actin F primer: TCCTGTGGCACTCACGAAACT Integrated DNA Technologies N/A Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).
Actin R primer: GAAGCATTTGCGGTGGACGAT Integrated DNA Technologies N/A Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Radtke, S., et al. A distinct hematopoietic stem cell population for rapid multilineage engraftment in nonhuman primates. Science Translational Medicine. 9 (414), eaan1145 (2017).
  2. Majeti, R., Park, C. Y., Weissman, I. L. Identification of a hierarchy of multipotent hematopoietic progenitors in human cord blood. Cell Stem Cell. 1 (6), 635-645 (2007).
  3. Notta, F., et al. Isolation of single human hematopoietic stem cells capable of long-term multilineage engraftment. Science. 333 (6039), 218-221 (2011).
  4. Hoggatt, J., et al. Rapid mobilization reveals a highly engraftable hematopoietic stem cell. Cell. 172 (1-2), 191-204 (2018).
  5. Chandrasekaran, D., Nakamoto, B., Watts, K. L., Kiem, H. P., Papayannopoulou, T. Modeling promising nonmyeloablative conditioning regimens in nonhuman primates. Human Gene Therapy. 25 (12), 1013-1022 (2014).
  6. Humbert, O., Peterson, C. W., Norgaard, Z. K., Radtke, S., Kiem, H. P. A nonhuman primate transplantation model to evaluate hematopoietic stem cell gene editing strategies for beta-hemoglobinopathies. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 8, 75-86 (2018).
  7. Peterson, C. W., et al. Differential impact of transplantation on peripheral and tissue-associated viral reservoirs: Implications for HIV gene therapy. PLoS Pathogens. 14 (4), e1006956-e1006956 (2018).
  8. Zhen, A., et al. Long-term persistence and function of hematopoietic stem cell-derived chimeric antigen receptor T cells in a nonhuman primate model of HIV/AIDS. PLoS Pathogens. 13 (12), e1006753 (2017).
  9. Moffett, H. F., et al. Hit-and-run programming of therapeutic cytoreagents using mRNA nanocarriers. Nature Communications. 8 (1), 389 (2017).
  10. Burtner, C. R., et al. Intravenous injection of a foamy virus vector to correct canine SCID-X1. Blood. 123 (23), 3578-3584 (2014).
  11. Evans, D. T., Silvestri, G. Nonhuman primate models in AIDS research. Current Opinion in HIV and AIDS. 8 (4), 255-261 (2013).
  12. Taraseviciute, A., et al. Chimeric antigen receptor T cell-mediated neurotoxicity in nonhuman primates. Cancer Discovery. 8 (6), 750-763 (2018).
  13. McGary, C. S., et al. CTLA-4(+)PD-1(-) memory CD4(+) T cells critically contribute to viral persistence in antiretroviral therapy-suppressed, SIV-infected rhesus macaques. Immunity. 47 (4), 776-788 (2017).
  14. Beard, B. C., Adair, J. E., Trobridge, G. D., Kiem, H. P. High-throughput genomic mapping of vector integration sites in gene therapy studies. Methods in Molecular Biology. 1185, 321-344 (2014).
  15. Zonari, E., et al. Efficient ex vivo engineering and expansion of highly purified human hematopoietic stem and progenitor cell populations for gene therapy. Stem Cell Reports. 8 (4), 977-990 (2017).
  16. Doulatov, S., et al. Revised map of the human progenitor hierarchy shows the origin of macrophages and dendritic cells in early lymphoid development. Nature Immunology. 11 (7), 585-593 (2010).
  17. Fares, I., et al. Cord blood expansion. Pyrimidoindole derivatives are agonists of human hematopoietic stem cell self-renewal. Science. 345 (6203), 1509-1512 (2014).
  18. Gori, J. L., et al. Endothelial cells promote expansion of long-term engrafting marrow hematopoietic stem and progenitor cells in primates. Stem Cells Translational Medicine. 6 (3), 864-876 (2017).
  19. Peterson, C. W., et al. Long-term multilineage engraftment of autologous genome-edited hematopoietic stem cells in nonhuman primates. Blood. 127 (20), 2416-2426 (2016).
  20. Peterson, C. W., et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 3, 16007 (2016).
  21. Thompson, A. A., et al. Gene therapy in patients with transfusion-dependent beta-thalassemia. The New England Journal of Medicine. 378 (16), 1479-1493 (2018).
  22. Eichler, F., et al. Hematopoietic stem-cell gene therapy for cerebral adrenoleukodystrophy. The New England Journal of Medicine. 377 (17), 1630-1638 (2017).
  23. Paul, B., et al. Efficient enrichment of gene-modified primary T cells via CCR5-targeted integration of mutant dihydrofolate reductase. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 5 (9), 347-357 (2018).
  24. Levine, B. L., Miskin, J., Wonnacott, K. Global manufacturing of CAR T cell therapy. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 4, 92-101 (2017).
  25. Masiuk, K. E., et al. Improving gene therapy efficiency through the enrichment of human hematopoietic stem cells. Molecular Therapy. 25 (9), 2163-2175 (2017).
  26. Trobridge, G. D., et al. Efficient transduction of pigtailed macaque hematopoietic repopulating cells with HIV-based lentiviral vectors. Blood. 111 (12), 5537-5543 (2008).
  27. Beard, B. C., et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354 (2010).
  28. Horn, P. A., et al. Efficient lentiviral gene transfer to canine repopulating cells using an overnight transduction protocol. Blood. 103 (10), 3710-3716 (2004).
  29. Adair, J. E., et al. Semi-automated closed system manufacturing of lentivirus gene-modified haematopoietic stem cells for gene therapy. Nature Communications. 7, 13173 (2016).
  30. Kutner, R. H., Zhang, X. Y., Reiser, J. Production, concentration and titration of pseudotyped HIV-1-based lentiviral vectors. Nature Protocols. 4 (4), 495-505 (2009).
  31. Salmon, P., Trono, D. Production and titration of lentiviral vectors. Current Protocols in Human Genetics. 54 (1), (2007).
  32. Geraerts, M., Willems, S., Baekelandt, V., Debyser, Z., Gijsbers, R. Comparison of lentiviral vector titration methods. BMC Biotechnology. 6, 34 (2006).
  33. Kiem, H. P., et al. Improved gene transfer into baboon marrow repopulating cells using recombinant human fibronectin fragment CH-296 in combination with interleukin-6, stem cell factor, FLT-3 ligand, and megakaryocyte growth and development factor. Blood. 92 (6), 1878-1886 (1998).
  34. Morton, W. R., Knitter, G. H., Smith, P. M., Susor, T. G., Schmitt, K. Alternatives to chronic restraint of nonhuman primates. Journal of the American Veterinary Medical Association. 191 (10), 1282-1286 (1987).
  35. Noser, J. A., et al. Cyclosporine increases human immunodeficiency virus type 1 vector transduction of primary mouse cells. Journal of Virology. 80 (15), 7769-7774 (2006).
  36. Uchida, N., Hsieh, M. M., Washington, K. N., Tisdale, J. F. Efficient transduction of human hematopoietic repopulating cells with a chimeric HIV1-based vector including SIV capsid. Experimental Hematology. 41 (9), 779-788 (2013).
  37. Cornetta, K., Anderson, W. F. Protamine sulfate as an effective alternative to polybrene in retroviral-mediated gene-transfer: implications for human gene therapy. Journal of Virological Methods. 23 (2), 187-194 (1989).
  38. Goerner, M., et al. The use of granulocyte colony-stimulating factor during retroviral transduction on fibronectin fragment CH-296 enhances gene transfer into hematopoietic repopulating cells in dogs. Blood. 94 (7), 2287-2292 (1999).
  39. Dao, M. A., Hashino, K., Kato, I., Nolta, J. A. Adhesion to fibronectin maintains regenerative capacity during ex vivo culture and transduction of human hematopoietic stem and progenitor cells. Blood. 92 (12), 4612-4621 (1998).
  40. North, T. E., et al. Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis. Nature. 447 (7147), 1007-1011 (2007).
  41. Goessling, W., et al. Prostaglandin E2 enhances human cord blood stem cell xenotransplants and shows long-term safety in preclinical nonhuman primate transplant models. Cell Stem Cell. 8 (4), 445-458 (2011).
  42. Booth, C., Gaspar, H. B., Thrasher, A. J. Treating immunodeficiency through HSC gene therapy. Trends in Molecular Medicine. 22 (4), 317-327 (2016).
  43. Humbert, O., et al. Rapid immune reconstitution of SCID-X1 canines after G-CSF/AMD3100 mobilization and in vivo gene therapy. Blood Advances. 2 (9), 987-999 (2018).

Tags

Genetik spørgsmålet 144 hæmatopoietisk stilk og stamfader celler genterapi bloddannelsen rettighedsbegrebet primat model celle isolation lentiviral vektorer
Forberedelse og gen modifikation af ikkemenneske primat hæmatopoietisk stamceller og stamceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Radtke, S., Perez, A. M.,… More

Radtke, S., Perez, A. M., Venkataraman, R., Reddy, S., Haworth, K. G., Humbert, O., Kiem, H. P., Peterson, C. W. Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (144), e58933, doi:10.3791/58933 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter