Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Voorbereiding en genetische modificatie van Nonhuman primaat hematopoietische stamcellen en voorlopercellen

Published: February 15, 2019 doi: 10.3791/58933
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,2,3, 1,2
1Stem Cell and Gene Therapy Program, Fred Hutchinson Cancer Research Center, 2Department of Medicine, University of Washington, 3Department of Pathology, University of Washington

Summary

Het doel van dit protocol is het isoleren van niet-menselijke primaten CD34+ cellen uit primer beenmerg, gen-wijzigen van deze cellen met lentivirale vectoren, en voor te bereiden een product infusie in de autologe host. Het protocol van de totale lengte is ongeveer 48 uur.

Abstract

Hematopoietische stamcellen en voorlopercellen transplantatie van de cel (HSPC) is een therapie van de hoeksteen voor leukemie en andere kankers voor bijna een halve eeuw, ten grondslag ligt aan de enige bekende remedie van infectie van het humaan immunodeficiëntie virus (HIV-1) en toont enorme belofte in de behandeling van genetische ziekten zoals bèta-thalassemie. Onze fractie heeft ontwikkeld van een protocol bij de therapie van het gen van de HSPC van het model in niet-menselijke primaten (NHPs), zodat wetenschappers voor het optimaliseren van veel van de dezelfde reagentia en technieken die worden toegepast in de kliniek. Hier, we worden methoden beschreven voor het zuiveren van CD34+ HSPCs en lange termijn aanhoudende deelverzamelingen van hematopoietische stamcellen (HSC) uit primer beenmerg (BM). Dezelfde technieken kunnen worden toegepast voor het zuiveren van andere bronnen van de HSPC (bijvoorbeeld gemobiliseerde Perifere bloedstamcellen [PBSCs]). Geschetst is een 2 daagse-protocol waarin cellen zijn gezuiverd, gekweekt, bewerkt met lentivirus (LV) en voorbereid voor infusie terug in de autologe host. Belangrijkste uitlezingen succes omvatten de zuiverheid van de CD34+ HSPC bevolking, de mogelijkheid van gezuiverde HSPCs vormen morfologisch verschillende kolonies in halfvaste media, en, belangrijker nog, gene wijziging efficiëntie. Het belangrijkste voordeel van de therapie van het gen van de HSPC is de mogelijkheid om een bron van langlevende cellen die aanleiding tot alle soorten van hematopoietische cellen geven. Als zodanig hebben deze methoden zijn gebruikt om model therapieën voor genetische ziekten, kanker en infectieziekten. In elk geval, wordt therapeutische werkzaamheid vastgesteld door de verbetering van de functie van verschillende HSPC nageslacht, met inbegrip van rode bloedcellen, T-cellen, B-cellen en/of myeloïde deelverzamelingen. De methoden om te isoleren, wijzigen en HSPC te bereiden producten zijn rechtstreeks toepasselijk en vertaalbare aan meerdere ziektes in menselijke patiënten.

Introduction

De therapie van het gen van de cel van de stam is een krachtig middel om aan te pakken van een breed scala van menselijke pathologie. De therapie van het gen van de HSPC is een bijzonder aantrekkelijk benadering, als gevolg van i) het relatieve gemak van het verzamelen van deze cellen van de patiënten, ii) de schat aan kennis die beschikbaar is met betrekking tot cel oppervlakte fenotypes en ex vivo cultuur parameters, en, als het veld groeit, omdat iii) het presenteert wetenschappers met een steeds groter wordende toolbox van gene wijziging strategieën die zijn toegesneden op de verschillende ziekten van belang. We zijn actief onderzoekt HSPC gene therapie benaderingen vanuit meerdere invalshoeken, met inbegrip van de fundamentele wetenschap van HSPC biologie, de engraftment van HSPCs gen gemodificeerde in preklinische in vivo modellen, en de toepassing op relevante patiënt populaties. Wij en anderen hebben gekenmerkt het fenotype cel oppervlakte van functioneel verschillende HSPC deelverzamelingen1,2,3, de mobilisatie en de conditionering regimes die maximaliseren van de opbrengst van de HSPC en engraftment terwijl het minimaliseren van toxiciteit4,5, en het gen wijziging en bewerken van gene strategieën die zijn aangepast aan een breed scala van kwaadaardige, genetische en infectieziekten6,7,8, 9,10. De functie en de engraftment van HSPCs gen-gewijzigd kunnen worden geëvalueerd in een aantal kleine - en grote-dierlijke modellen, waaronder muizen, honden en NHPs. In het bijzonder zijn Waterprogramma modellen voordelig omdat vele reagentia, bijvoorbeeld antilichamen specifiek voor de HSPC cel oppervlakte eiwitten zoals CD34 en CD90, kunnen door elkaar worden gebruikt in mens en Waterprogramma cellen. Bovendien, in tegenstelling tot de muizen, grote dieren zoals NHPs toestaan een nauwere onderlinge aanpassing van de omvang van de genetische modificatie nodig zijn voor de klinische werkzaamheid. Ten slotte NHPs zijn de gouden standaard voor het modelleren van menselijke aandoeningen zoals HIV-1 infectie11 en een opkomende modelsysteem voor kandidaat-antikanker en anti-HIV immuuntherapie12,13.

Het doel van dit protocol is te schetsen van de methoden voor het zuiveren, genetisch te wijzigen, en het voorbereiden van NHP HSPC infusie producten. Hoewel buiten het toepassingsgebied van dit protocol, wij hebben eerder aangetoond dat deze producten in autologe Waterprogramma hosts engraft, aanleiding geven tot alle hematopoietische geslachten, en therapeutische werking in een brede waaier van ziekte modellen1. Wij hebben ook gekenmerkt van de tentiemechanismen van enten HSPCs en bouwde een platform voor het bijhouden van de kinetiek, mensenhandel en fenotype van individuele HSPCs en hun nakomelingen, volgende autologe transplantatie1,14. De hier gepresenteerde methoden zijn ontwikkeld met de volgende doelstellingen: i) te isoleren van zeer zuivere HSPCs en lange termijn enten HSC deelverzamelingen, ii) om te houden van de primitieve HSCs tijdens ex vivo cultuur, en iii) bij het efficiënt gen-wijzig beide bulk HSPCs of lange termijn enten HSC deelverzamelingen. We gebruiken magnetische-bijgewoonde (MACS), cel-Sorteren en fluorescentie-activated cell sorting (FACS), om te isoleren van de fenotypische/functioneel verschillende HSPC populaties, consistent met de methoden van vele groepen2,15, 16. Het onderhoud van primitieve HSCs in cultuur (dat wil zeggen, het minimaliseren van de differentiatie van deze cellen in gepleegd progenitoren die aanleiding tot volledig geven gedifferentieerde lymfoïde en myeloïde subsets) is een essentieel aspect van het protocol beschreven hier. Hoewel we eerder benaderingen om te vouwen HSPCs gekenmerkt hebben met behoud van een primitieve fenotype17,18, hier beschrijven we een protocol dat is gericht op het behoud van de HSCs via een minimale (48 uur) en gedefinieerd ex vivo cultuur.

De efficiënte wijziging van HSPCs en HSC deelverzamelingen is een centrale doelstelling van dit protocol. Verschillende benaderingen hebben we gemeld, twee behoren tot verreweg het meest onderzocht in klinische proeven: LV-gemedieerde genetische modificatie en nuclease-gemedieerde gene bewerken van1,6,19. Bewerken van Gene strategieën gebruikt u een van een aantal nuclease platformen specifiek wijzigen een gerichte gen van belang, bijvoorbeeld, C-C chemokine receptor type 5 (CCR5) voor de behandeling van HIV-infectie7,19 of Bcl11A voor de behandeling Hemoglobinopathieën6. Hier, richten we ons op LV-gemedieerde genetische modificatie, waarin transgene lading semirandomly in het genoom1,8,20 integreren. Een belangrijk voordeel van LV benaderingen is de mogelijkheid om grote hoeveelheden van genetisch materiaal (tot 8 of 9 kilobases) leveren. Hoewel bewerken van gene strategieën worden ontwikkeld te richten op een transgenic van belang om te integreren alleen op een opgegeven locus door donor van homologe recombinatie (HDR), vereisen deze methoden verdere ontwikkeling in vitro en in kleine dierlijke modellen. In tegenstelling, hebben LV vectoren is gebruikt uitgebreid in NHPs en patiënten21,22. Nog belangrijker is, kan het protocol hier beschreven, die gebruik maakt primer BM als startende HSPC bron, gemakkelijk en in grote lijnen aangepast worden, bijvoorbeeld isoleren van PBSCs. Zoals hierboven beschreven, is we profiteren van de hoge mate van genetische gelijkenis tussen NHPs en mens te gebruiken reagentia die voor beide soorten gelden. Ten slotte, deze benadering is aangepast om aan te passen andere hematopoietische deelverzamelingen, namelijk T cellen12,23,24; de komst van doeltreffend T-cel immunotherapie benaderingen heeft leunde zwaar op hetzelfde platform LV die in dit protocol wordt gebruikt. Deze methoden zijn geschikt voor elke onderzoeker kochten HSPC biologie of LV-gemedieerde genetische modificatie. Bijvoorbeeld, de HSPC zuivering protocol hier gepresenteerd kan worden gebruikt te karakteriseren roman HSC-verrijkt deelverzamelingen, zoals eerder beschreven van1,15,25. Ook worden de LV transductie methoden hier gepresenteerd ook kunnen toegepast en verder ontwikkeld voor talloze andere celtypes en experimentele vragen, zowel in in vitro en in vivo modellen.

Kortom presenteren we methoden om te isoleren en Waterprogramma HSPCs genetisch te wijzigen. Deze methoden kunnen gemakkelijk aan te passen voor andere soorten en andere bronnen van HSPCs. Dit grondig doorgelicht protocol toont grote belofte in de modellering van de effectieve therapieën voor talrijke ziekten bij de mens.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Autologe Waterprogramma transplantaties, priming (mobilisatie), de verzameling cellen en genetische modificatie worden uitgevoerd conform eerder gepubliceerde protocollen26. Alle experimentele procedures worden beoordeeld en goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité van het Fred Hutchinson Cancer Research Center en de Universiteit van Washington (Protocol #3235 - 01). Alle studies worden uitgevoerd in strikte overeenstemming met de aanbevelingen in de gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren van het National Institutes of Health ("de gids"); dieren werden willekeurig toegewezen aan de studies.

1. de verrijking van CD34+ HSPCs en overnachting cultuur (dag -1)

  1. Oogst BM en conditie het.
    1. Mobiliseren NHPs met granulocyt kolonie-stimulerende factor (GCSF) voor 4 dagen zoals eerder beschreven26.
    2. Het verdoven van de dieren met 100 mg/kg van ketamine en dexmedetomidine (0,5 mg/mL stockoplossing) 0,03 mL/kg. Beheren pijnstillers (bijvoorbeeld buprenorfine SR) op het moment van de loting.
    3. Met clippers, scheren van de dieren haren uit het proximale einde van het opperarmbeen en/of het bovenbeen bone(s) en scrub de huid met jodium gebaseerde scrub of een soortgelijke antiseptische oplossing, afgewisseld met alcohol, en herhaal 3 x. Infundeer als een extra verdoving, het beenvlies met bupivacaine (2 mg per site, 5 mg/mL voorraad).
    4. Plaats de naald aspiratie beenmerg (16 G) op de site periosteal post (Wallenberg holte) en doorboren de huid penetreren de Wallenberg holte met behulp van een roterende beweging. Verwijder de stilet van de naald aspiratie en reserveren in een steriele veld voor verder gebruik.
      Opmerking: Kies de periosteal post-site aan de Wallenberg holte in een gebied van het bot die niet wordt gedekt door spieren en waar de vorm/landschap van het bot is ofwel zichtbaar of gemakkelijk kan worden gevoeld door de huid (vaak naar proximaal of DISTAAL eind van het bot).
    5. De BM-naald, hechten een ingevulde spuit met een mengsel van anticoagulatie citraatoplossing dextrose (ACD-A) en heparine (20 USP/mL, 1 mL per 9 mL beenmerg kan worden geïnd).
    6. Trek de zuiger terug terwijl voorzichtig rocken de ledematen en draaien, om de spuit te mengen aspirate en antistollingsmiddel doorroeren. Draaien van de naald en verplaatst het hele aspiratie en terugtrekking voor toegang tot een groter percentage van cellen in het beenmerg-ruimte.
    7. Zodra het monster is verzameld, verwijderen van de naald en druk uitoefenen op de site van de aspiratie tot het bloeden stopt.
      Opmerking: Afhankelijk van het benodigde volume, kunnen beenmerg van één tot vier ledematen (twee humeri, twee dijbeen) worden vastgesteld tijdens één collectie. Niet meer dan 20 mL moeten worden verzameld van elke ledemaat, en het totale volume verzameld moet vormen niet meer dan 10% van het gewicht van het dier (10 mL/kg).
    8. Als aangeblazen ontvangen meerdere ledematen, combineren en opnemen van het volume.
    9. Laat de Waterprogramma herstellen postanesthesia.
      1. De resultaten van dexmedetomidine met 0,03 mL/kg atipamezole (5 mg/mL stockoplossing) terugdraaien na de ingreep. Bieden pijnstillers (bijvoorbeeld buprenorfine SR) zoals voorgeschreven door klinische veterinair personeel voor ten minste 48 uur na de ingreep, of langer, naar eigen goeddunken van de klinische dierenarts, op basis van klinische symptomen.
      2. Het dier terug naar haar kooi na de ingreep en volgen het elke 15-20 min, totdat het dier kundig voor zitten is op haar eigen. Het dier dagelijks door dierenarts personeel volgen totdat vaststaat dat de aspiratie natuurgebieden zijn genezen. Bovendien controleren op tekenen van ontsteking, infectie of pijn.
    10. Parallel aan de cel verwerking, conditie van de dezelfde Waterprogramma met myeloablative totale lichaam bestraling (TBI): 1,020 cGy tegen een tarief van 7 cGy/min. beheren bestraling in gespreide doses over de 2 dagen vóór de infusie van de cel.
  2. Hemolyze de BM.
    1. Verdeel de BM in 50 mL conische buizen (10-12 mL per buis) en voeg hemolytische buffer om het volume op 50 mL (tabel 1). Incubeer de cellen bij kamertemperatuur (RT) tot ze lysed maar niet langer dan 7 min. Centrifuge bij 800 x g gedurende 5 min en gecombineerd het supernatant van de pellet(s), 2-5 mL van de volume/buis verlaten. Resuspendeer de pellet in het residuele volume.
      Opmerking: Monsters met succes lysed veranderen van kleur, van een donker rood tot een transparant licht rood.
    2. Voeg 10-15 mL hemolytische buffer/pellet. Verwijder eventuele bloedstolsels met behulp van 70 µm cel vulinrichtingen. Hemolytische toevoegen tot 50 mL buffer, Incubeer gedurende 5 min op RT en spin bij 800 x g gedurende 5 min.
    3. Gecombineerd het supernatant en resuspendeer de cellen in 10 mL MACS buffer (tabel 1). Filtreer opnieuw door een zeef van de cel 70 µm. Spoel de buis en filter met 40 mL MACS buffer tot 50 mL.
  3. Verrijken van de CD34+ cellen van de hemolyzed witte bloedcellen (WBCs), met behulp van standaard protocollen.
    1. Draai de cellen bij 800 x g gedurende 15 min. Check de buizen om ervoor te zorgen dat er geen cel swirls zijn duidelijk in de top/midden. Als cellen bevinden zich boven de pellet, spin weer een hogere snelheid (maximaal 1000 x g maximale) en voor maximaal 10 min.
    2. Gecombineerd het supernatant en resuspendeer het in 10 mL of minder voor MACS buffer, vaststellend van het exacte volume. Telt de cellen bij een verdunning van het 1:100 of 1:1,000 met een hemocytometer of een geautomatiseerde cel teller.
      Opmerking: Deze totale WBC telling is de pre verrijking tellen.
    3. Toevoegen van MACS buffer om de concentratie van de cel tot 1 x 108 cellen/mL. Indien nodig, eerst stappen 1.3.1 - 1.3.2 (bijvoorbeeld als gevolg van een lage telling van de pre verrijking). Reserveren van 5 x 106 cellen in MACS buffer voor HSC subset kleuring (pre verrijking monster).
    4. Unconjugated anti-CD34 antistof (kloon 12,8, Tabel of Materials)27 toevoegen aan de resterende pre verrijking cellen om een eindconcentratie van 40 µg/mL (1 x 108 cellen/mL). Incubeer de celsuspensie bij 4 ° C op een buis rotator (Zie de Tabel van materialen) voor 25-30 min.
    5. Gebruik MACS buffer draaien de cellen bij 800 x g gedurende 5 min. te brengen van het volume op 50 mL gecombineerd het supernatant, resuspendeer de cellen in 50 mL buffer van MACS, en spin opnieuw bij 800 x g gedurende 5 min.
    6. Degas 100 mL voor MACS buffer met twee buizen, inwikkeling van de luchtinlaat met vetvrij papier, voor 25-30 min filteren of tot klaar voor gebruik.
    7. Berekenen van de benodigde hoeveelheid magnetische kralen: 1 mL kralen/109 cellen. Gecombineerd het supernatant en resuspendeer de cellen tot 108 cellen/mL, nadat de kralen zijn toegevoegd. Bijvoorbeeld: 3 x 109 cellen + 3 mL van kralen + 27 mL MACS buffer tot 30 mL van totale volume.
    8. Incubeer de celsuspensie bij 4 ° C op een buis rotator voor 25-30 min.
    9. Tijdens het verwerven van magneten voor de kolommen; wilt u gebruiken 0,6 x 109 cellen per kolom. Plaats de kolommen aan de magneet en plaats een conische tube van 50 mL onder elke kolom voor het verzamelen van de stroom door. Een conische tube van 15 mL en de plunjer voorbereiden voor elke kolom voor elutie (stap
    10. Wanneer de incubatie in stap 1.3.8 voltooid is, de MACS buffer toevoegen aan 50 mL en draai bij 800 x g gedurende 5 min. Aspirate het supernatant en resuspendeer de cellen in ontgaste MACS buffer (2 mL per kolom). Pipet zachtjes om te voorkomen dat de invoering van de bubbels.
    11. Zonder de kolom te droog, voeg 1 mL van ontgaste MACS buffer toe aan elke kolom, gevolgd door 2 mL celsuspensie. Spoelen van het filter en de originele buis met ontgaste MACS buffer en verdeel de oplossing even tussen kolommen (6 mL/kolom); dan, voeg 7 mL ontgaste MACS buffer voor de definitieve wassen.
    12. Zachtjes trekken de kolom uit de buurt van de magneet (druk de bovenste rug) en de laatste drip verzamelen in de buis doorstroming. Voeg 5 mL van ontgaste MACS buffer aan elke kolom en de plunjer om de cellen in de steriele conische buis uit stap 1.3.9 Elueer toe te passen. Verzamelen iedere vloeistof niet nadat belletjes verschijnen.
  4. De cellen in de verrijkte zowel de doorstroming (FT) collectie buizen bij een verdunningsverhouding van 1:10 tellen. Houden van de cellen op het ijs. Aliquot 1 x 106 cellen uit de Fractie CD34-verrijkt en 5 x 106 cellen uit de FT breuken voor analyse door stroom cytometry. De FT breuk bij 4 ° C worden opgeslagen totdat de kwaliteitscontrole (stap 2) is gesloten.
    Opmerking: Het aantal CD34+ cellen vereiste voor succesvolle multilineage engraftment in het Waterprogramma afhankelijk van de frequentie van de HSC-verrijkt CD34 is+CD90+CD45RA- deelverzameling. Op basis van een gemiddelde frequentie van 3% - 5% en de minimum eis van 122,000 CD34+CD90+CD45RA- cellen per kilogram lichaam gewicht1, het is aanbevolen om door te gaan met een totaal van ten minste 2,5 x 106 en maximaal 10 x 10 6 CD34+ cellen per kilogram lichaamsgewicht.
  5. Toevoegen van MACS buffer naar de CD34+ fractie verrijkt tot een 50 mL in totaal, spin bij 800 x g gedurende 5 min, gecombineerd het supernatant en resuspendeer de cellen tot 106 cellen/mL in HSPC media (tabel 1).
    1. Plaat van de cellen bij een dichtheid van 106 cellen/mL in ontlucht, weefselkweek (TC)-behandeld T-75 kolven, 10-20 mL per fles, en broeden ze 's nachts in een 37 ° C, 5% CO2 incubator. Rusten de kolven in de lengte (niet opstaan).
      Opmerking: Indien gewenst, aanvullende CD34+ cellen of CD34- FT kan worden cryopreserved in 90% warmte-geïnactiveerd foetale runderserum (FBS) + 10% dimethylsulfoxide (DMSO) met een concentratie van 1 x 10,6 tot en met 5 x 106 cellen/mL, dan langzaam-gekoeld op - 80 ° C (bijvoorbeeld met behulp van bevriezing containers). De terugwinning van de gemiddelde opbrengst van cryopreserved cellen is afhankelijk van de CD34+ zuiverheid en vaak varieert van 50% tot 80% met een levensvatbaarheid van > 80%.

2. controle van de kwaliteit van CD34-verrijkt cellen (dag -1)

  1. Voorbereiding van monsters voor stroom cytometry.
    1. Monsters van elke fase van de isolatie (pre verrijkings-, FT, en CD34-verrijkt breuken) in FACS buffer bij een concentratie van 10 x 106 cellen/mL bovengenoemde gereserveerd resuspendeer en breng 100 µL van elke celsuspensie (tabel 1) tot een koker FACS.
      Opmerking: Controlemonsters dient voor de aanpassing van voorwaartse scatter (FSC), naast scatter (SSC), en autofluorescence in elk kanaal fluorescentie onbevlekt cellen van elke fase van de isolatie (bv 5 x 10,5 cellen). Daarnaast zal één gebeitste compensatie kralen voor elke fluorescerende-geconjugeerde antilichaam moeten aanpassen voor de vergoeding tussen aangrenzende kanalen (tabel 2 en tabel 3).
    2. Toevoegen van de gewenste antilichamen (bijvoorbeeld anti-CD45, anti-CD34 anti-CD45RA en anti-CD90), volgens de instructies van de fabrikant, voor een test (1 x 106 cellen in 100 µL) (tabel 3). Incubeer gedurende 20 min bij 4 ° C. Voeg 3 mL van FACS buffer en spin bij 800 x g gedurende 5 min, gecombineerd het supernatant resuspendeer in 100 µL van FACS buffer en analyseren op een passende stroom cytometer (stap 2.2).
  2. De stroom cytometer/cel sorter voorbereiden op analyse.
    Opmerking:     het wordt aanbevolen om de analyses uit te voeren op dezelfde machine die wordt gebruikt voor de cel sorteren in stap 2.3.
    1. Het genereren van een protocol met inbegrip van FSC/SSC, CD45/CD34 en CD45RA/CD90 (drie stroom percelen). Klik met de rechtermuisknop op een perceel van stroom en de bevolking hiërarchieoverzicht toe te voegen.
    2. Klik met de linkermuisknop op het perceel van FSC/SSC, selecteert u de veelhoek gate-functie, en tekenen van een hek om vuil en dode cellen te sluiten. Markeer de nieuwe poort en hernoem het naar Scatter in het Inspector-venster.
      Opmerking: Dit wordt automatisch genoemd als P1.
    3. Klik met de rechtermuisknop in het midden van de CD45/CD34 stroom plot, navigeer naar de Toon van de bevolking, en poort van het perceel op scatter. Alleen al trekt een rechthoekige hek rond de CD45intCD34+ cellen uitsluiten niet-CD34 cellen en nonhematopoietic cellen, als goed als resterende bloedplaatjes en erytrocyten (CD45-). De naam van de poort te wijzigen CD34+.
    4. De CD45RA/CD90 stroom plot op de CD34 Gate+ bevolking. Tekenen van drie onafhankelijke subgates rond CD90+CD45RA- cellen (verrijkt voor HSCs), CD90-CD45RA- cellen (verrijkt voor multipotente en erytro-myeloïde voorlopercellen [MP/s/EMPs]) en CD90-CD45RA + cellen (verrijkt voor lympho-myeloïde voorlopercellen [LMPs]). Hernoem de poorten naar HSCen MPP-EMP LMP, respectievelijk.
    5. Als alles klaar is, zorgt ervoor dat de bevolking hiërarchie zes hiërarchisch georganiseerde vermeldingen in de volgende volgorde bevat: 1) alle gebeurtenissen; 2) scatter; 3) CD34+; 4) HSC; 5) MPP-EMP; 6) LMP. Zorg ervoor dat de stroom percelen en de vorm van de poort kijken zoals geïllustreerd in Figuur 4.
    6. Onbevlekt pre verrijking WBCs om aan te passen de spanning voor FSC, SSC en alle kanalen van de fluorescentie (tabel 2, monster 5) worden uitgevoerd. Voer één gebeitste compensatie kralen om aan te passen de compensatie tussen aangrenzende kanalen (tabel 2, monsters 1-4). Run alle resterende onbevlekt en gekleurd monsters met de aangepaste en gecompenseerd protocol, document CD34 verrijking efficiëntie (tabel 2, monsters 6-9).
      Opmerking: Houd het eindmonster (tabel 2, monster 10) voor de gelijktijdige flow analyse en de cel sorteren in stap 2.4.
  3. Configureer de sorteerder van de cel voor de soort-zuivering van CD34 deelverzamelingen in kolonie-vormende cel (CFC) testen.
    Opmerking:     of een andere machine is gebruikt voor analyse (stap 2.2), het protocol betreffende de cel sorter zoals eerder beschreven in stappen 2.2.1 - 2.2.5 ingesteld.
    1. De kruisspanning hoek/voor de linker - en rechterkant stromen in de cel sorter software om te storten van cellen op 15 mL tubes met CFC medium. Configureer de hoek van de stroom van de kant om te voorkomen dat de afwijking. Stapsgewijze, fine-tunen van de hoek van de bolle kant stream totdat de gesorteerde cellen hit de CFC-medium en niet de kant van de buis omdat zeer weinig cellen worden gesorteerd.
    2. In de Browser, open de map Global werkbladen en maak een nieuwe soort-lay-out met behulp van de knop in het hoofdmenu van het browservenster. Wijzig de vermelding in de collectie apparaat drop-down menu 2buizen, de vermelding in het Precision drop-down menu 4-weg zuiverheid of eencellige en de Target-gebeurtenissen ingesteld op 800-1200 cellen. Klik met de linkermuisknop op het veld sorteren-locatie (links of rechts), selecteer de ingang toevoegen in het menu en kies de bevolking om te sorteren in het menu.
  4. Sorteren van de cellen voor CFC testen.
    Opmerking:     sorteren voor de CFC-assays wordt alleen uitgevoerd met cellen uit het CD34 verrijkte product (tabel 2, monster 10).
    1. Monster 10 laden, 2.000-3.000 gebeurtenissen registreren en boete-aanpassen van de poorten van de soort aanpassen aan de signaal sterkte en doel populaties.
    2. Wanneer de setup voltooid is, verwerven cellen (tabel 2, monster 10). Verwerven van gegevens zoals beschreven in stap 2.2.3, de stroomsnelheid tot 500-1000 cellen/s aanpassen en sorteren van 800-1200 cellen vanaf i) de Scatter gate, ii) de CD34+ gate, iii) de HSC-poort, iv) de MPP-EMP-poort en v) de LMP-poort in afzonderlijke buizen met 3,6 mL CFC media.
      Opmerking: Sorteren voor CFC assays wordt alleen uitgevoerd met cellen uit het CD34 verrijkte product (tabel 3, monster 10). Cellen uit de Scatter en de CD34+ poorten moeten worden gesorteerd op individueel, overwegende dat HSCs, MPP-EMPs en LMPs, en kan gelijktijdig worden gesorteerd in de linker en rechter buis houder positie.
    3. Vortex en afzien van 1 mL celsuspensie aan elk van de 3 x 3.5 cm steriel, nontissue, petrischalen cultuur behandeld. Incubeer de cellen bij 37 ° C gedurende 10-14 dagen in een secundaire container (bijvoorbeeldeen 15 cm petrischaal).
    4. Rekenen op dagen 10-11 postplating, afzonderlijke kolonies van alle drie platen per voorwaarde, op basis van morfologie van de kolonie.

3. genetische modificatie van CD34+ HSPCs en overnachting herstel (dag 0)

  1. Verdun 2,5 mL 1 µg/µL CH-296 oplossing voor 50 µg Fe/mL in 50 mL Henks evenwichtige zoutoplossing (HBSS, zie de Tabel van de materialen).
  2. Kolven voorbereiden op de LV transductie.
    1. Bepalen van het geschatte aantal nontissue-cultuur (niet-TC)-kolven nodig (meestal van de graven van cel bepaald in stap 1.4) behandeld. Wilt u 1 x 107 cellen in 10 mL van de media per T-75 kolf plaat (1 x 108 totaal aantal cellen zou vereisen 10 kolven) en omvatten één niet-TC-behandelde 12-well plaat (mock transductie voorwaarde). Steriele HBSS en 50 µg/mL CH-296 voorraad uit stap 3.1 aan elke kolf/plaat, met een concentratie van 2 µg/cm2toevoegen. Gebruik voor T-75 kolven, 3 mL 50 µg Mo/mL CH-296 + 7 mL HBSS; gebruik voor de 12-well plaat, 160 µL van 50 µg Mo/mL-CH-296 + 340 µL van HBSS per putje.
    2. Laat de gerechten op RT ongestoord zitten op een schone bankje of in de kap voor 2 h. Aspirate de CH-296 te vervangen door een vergelijkbaar volume van steriele HBSS + 2% bovien serumalbumine (BSA). Incubeer bij RT gedurende 30 min, gecombineerd de HBSS/BSA en de afwas met een vergelijkbaar volume van steriele HBSS met 2,5% 1 M HEPES, pH 7.0. Gecombineerd onmiddellijk voorafgaand aan de cellen (stap 3.4) plating.
      Opmerking: Volgende stap 3.2.2, laat niet de platen/kolven te drogen. Platen met steriele HBSS + 2,5% 1 M HEPES berusten bij 4 ° C's nachts (dwz, bereiden op dag -1).
  3. Oogst en transduce de CD34+ cellen van dag -1.
    1. Spoel met behulp van een pipet 10 mL, losjes Adherente cellen door de herhaalde, zachte spoelen van elke kolf cultuur met steriele HBSS. Ervoor te zorgen dat alle cellen zal losmaken (indien nodig, tik/klap de kolf om los van de cellen).
    2. Centrifugeer de cellen bij 800 x g gedurende 5 min, gecombineerd het supernatant en resuspendeer de cellen in de signaaltransductie media tot een concentratie van 1 x 106 cellen/mL. Zodra alle cellen zijn verzameld, bepalen het aantal cellen, met behulp van een hemocytometer of geautomatiseerde cel teller.
    3. Voeg 1 mL celsuspensie (1 x 106 cellen) aan één putje van de plaat van de 12-well CH-296-coated (voor de mock-getransduceerde controlemonster). Verdeel de rest van de cellen onder de T-75 kolven (stap 3.2.2), het toevoegen van ongeveer 10 mL (1 x 107 cellen) per fles. De cellen te houden aan de CH-296 coating door incuberen bij 37 ° C, 5% CO2 voor 30 min, met de caps ontlucht toestaan.
    4. Ontdooi virus-geconditioneerd media (VCM, Tabel van materialen) en bepaal de titer in infectieuze-eenheden per milliliter (IU/mL)28,29,30,31,32 . De juiste hoeveelheid VCM Voeg aan elke maatkolf T-75 uit stap 3.3.3 en Incubeer de cellen bij 37 ° C, 5% CO2.
      Opmerking: Het uitvoeren van een interne signaaltransductie, na een nacht bebroeden; Als u een dubbele transductie uitvoert, herhaalt deze stepapproximately 6 - 8 h na de eerste transductie zonder een wassen/herstel fase en, vervolgens, na een nacht bebroeden. Bijvoorbeeld, voor een kolf (1 x 107 cellen) met een gewenste menigvuldigheid van infectie (MOI) van 10, voeg 1 mL virus titered op 1 x 108 IU/mL.

4. cel oogst en voorbereiding voor infusie (dag 1)

  1. Het oogsten van de cellen.
    1. Verzamelen getransduceerde en mock cellen zoals beschreven in stappen 3.3.1 - 3.3.2. Sequentiële wast met 10 mL HBSS, de wasbeurten overbrengen naar de conische buis met de cellen uit te voeren. Zorg ervoor dat alle cellen zijn verwijderd uit de kolven, tikken/slapping de kolven indien nodig.
    2. Centrifugeer de schorsingen van de cel bij 800 x g gedurende 5 min, gecombineerd het supernatant en resuspendeer de pellet in 1 mL HBSS. Combineer de buizen met cellen van dezelfde voorwaarde. Spoel elk met 10 mL HBSS en voeg dat aan de celsuspensie. Het bepalen van de graven van de cel met behulp van een hemocytometer. Zodat de cel totaal volume 50 mL in HBSS en centrifugeer bij 800 x g gedurende 5 min.
  2. Pulse prostaglandine E2 (PGE2) en reagentia voor het product van de infusie te bereiden.
    1. Gecombineerd het supernatant en resuspendeer de getransduceerde cellen (niet mock) naar 5 x 106/mL in HSPC media zonder cytokines. 10 mM PGE2 toevoegen om een eindconcentratie van 10 µM. Incubeer de cellen op het ijs voor 2 h, zachtjes wervelende hen elke 30 min.
    2. Tijdens stap 4.2.1, warmte-inactivering van autologe serum (Tabel of Materials), de container verpakken in vetvrij papier en het aan het broeden bij 56 ° C gedurende 30 min. bereiden 2% autologe serum in HBSS (500 µL van warmte-geïnactiveerd serum + 24,5 mL HBSS), mix ze goed, en het bewaren van het mengsel op het ijs tot gebruik. Ook, tijdens stap 4.2.1, oogst mock-getransduceerde cellen in een 12-well plaat door pipetteren krachtig op en neer de cellen. De celsuspensie aan een conische tube van 15 mL toevoegen, was ze 3 x met 1 mL HBSS, en de wasbeurten aan de dezelfde conische tube van 15 mL toevoegen.
    3. Na 2 h PGE2 incubatietijd, wassen de cellen 2 x door centrifugeren hen bij 800 x g gedurende 5 min en het supernatant te verwijderen. Na de tweede wash, resuspendeer de cellen in een passende hoeveelheid HBSS voor het tellen, met behulp van een hemocytometer of een geautomatiseerde cel teller.
      Opmerking: Cellen klomp vaak na een puls PGE2, waardoor voor minder betrouwbaar cel telt. Als dat zo is, gebruikt u de telling van de cel uit stap 4.1.2 in plaats van vanaf stap 4.2.3.
  3. Mock en getransduceerde cellen voor de kwaliteitscontrole (stap 5) van de infusie-product reserveren: 5 x 10,5 tot en met 1 x 106 cellen voor stroom cytometry/cel sorteren (stap 5.1 en 5.3) en ongeveer 1 x 106 cellen voor vloeibare cultuur (stap 5.2) en kolonie polymerase-kettingreactie (PCR) (stap 5.4).
  4. De infusie product voor te bereiden.
    1. Met de rest van de getransduceerde cellen, het voeren van een derde wassen in 50 mL HBSS, gecombineerd het supernatant en resuspendeer de cellen in 10 mL HBSS + 2% autologe serum (bereid in stap 4.2.2). Trekken de 10 mL oplossing in een 20 mL spuit uitgerust met een 16.5 G naald. Wassen van de buis met 10 mL HBSS + 2% auto serum en trekken het wassen in de dezelfde spuit toe zodat het totale volume 20 mL. Dop van de injectiespuit met de dop van de naald, label van de spuit, en plaats deze op het ijs voor vervoer/infusie.
    2. Het product getransduceerde cel inblazen in de autologe host, gelegen binnen een geaccrediteerde dierlijk onderzoeksfaciliteit, via een centraal veneuze katheter33,34. Controleren van de getransplanteerde dieren volledige bloedcel graven (CBCs) en bloed oplossingen en het uitvoeren van de studie-specifieke gen-markering testen op maat van het project1,6,19.

5. kwaliteitscontrole

Opmerking: Stroom cytometry en cel sorteren worden uitgevoerd nadat de cellen worden toegediend in de dieren als onderdeel van de follow-up wordt beschreven in stap 4.4.2. Stroom cytometrische data onmiddellijk na de transplantatie wordt gebruikt om te bepalen van de samenstelling van fenotypische gedefinieerde stam en progenitor cel subsets in de infusie product (stap 5.1 en 5.3), overwegende dat de analyse van CFC testen 12-14 dagen wordt uitgevoerd postinfusion om de efficiëntie van de genetische modificatie door (stap 5.4) PCR van de kolonie.

  1. Stroom cytometry en CFC sortering van de infusie-product uitvoeren.
    1. Analyseren van de cellen door stroom cytometry en sorteren-zuiveren CD34 deelverzamelingen voor CFC testen, zoals beschreven in sectie 2. Zaad CFC testen van mock en getransduceerde CD34 cellen (de infusie product na de PGE2 pols).
    2. Sorteren van een maximum van 800 cellen per voorwaarde en vortex, plaat, cultuur, en tellen van CFC-assays zoals beschreven in stap 2.4. Kies na het tellen, de kolonies van de CFC-tests uit te voeren van PCR zoals beschreven in stap 5.4 van de kolonie.
  2. Vloeibare cultuur
    1. De cellen van de plaat voor vloeibare cultuur in HSPC media op 1 x 106/mL in niet-TC-behandelde platen. Op dagen 2, 5 en 12 posttransduction, oogst en de cellen voor stroom cytometry tellen. Cel sorteren voor CFC testen is niet vereist.
    2. Replate 33% van de cellen in verse HSPC media op 1 x 106/mL op 2 en 5 dagen. 33% van de cellen in de DNA-extractie buffer bevriezen voor kwantitatieve PCR in real time. Gebruik 33% van de cellen voor stroom cytometry zoals beschreven in stap 2.1 en 2.2.
    3. Deze gegevens uit stap 5.2.2 gebruiken voor het analyseren van de fenotypische samenstelling van hematopoietische nakomelingen. Bepaal de frequentie van CD34 + cellen en fenotypische gedefinieerde deelverzamelingen zoals beschreven in stap 2.2.2 binnen elk monster. Vergelijk de samenstelling van CD34+ cellen tussen de voorwaarden voor het vaststellen van het effect van genetische modificatie.
      Opmerking: CD34+ cellen moeten handhaven hun uitdrukking in de hele cultuur en bevatten alle fenotypische deelverzamelingen. Een verlies van CD90+CD45RA- cellen of een oververtegenwoordiging van phenotypical deelverzamelingen indirecte of directe gevolgen van genetische modificatie kan aangeven.
  3. Transgenic expressie (bv., groen fluorescent proteïne [GFP]) door stroom cytometry (optioneel en afhankelijk van de experimentele opstelling), aanpassing van het protocol uit stap 2.2 te kwantificeren.
    1. Drie stroom percelen weergegeven: WS/transgenic toevoegen (bijvoorbeeld WS/GFP). Poort van het eerste perceel op HSCs, de tweede op MP/s;-EMPs, en de derde op perceel LMPs. elke versus transgenic (bijvoorbeeld GFP) en maken van poorten genoemd HSC-GFP+, MPP-EMP-GFP+en LMP-GFP+, respectievelijk.
    2. Als alles klaar is, de hiërarchie van de bevolking heeft aan negen hiërarchisch georganiseerde vermeldingen in de volgende volgorde: 1) alle gebeurtenissen; 2) scatter; 3) CD34+; 4) HSC; 5) HSC-GFP+; 6) MPP-EMP; 7) MPP-EMP-GFP+; 8) LMP; 9) LMP-GFP+.
      Opmerking: Elke transgenic expressie verderop in vloeibare cultuur (bijvoorbeeld dagen 5 en 12) de gene wijziging efficiëntie bepaald door PCR van de kolonie in stap 5.4 beter zal weerspiegelen. Eerdere tijdstippen in vloeibare cultuur kunnen de transgenic expressie, als gevolg van beroepopleiding LVs overschatten. Ook zal stroom-sorteren GFP+ cellen voor CFC testen op dag 1 resulteren in veel valse positieve koloniën.
  4. Uitvoeren van PCR van de kolonie.
    1. Na het tellen in stappen 2.4.4 en 5.1.1, kies één kolonies in 50 µL van DNA-extractie-buffer, met behulp van een 10 µL of 20 µL Pipetteer en Pipetteer op en neer naar de koloniën overbrengen in een buis van een 8-buis PCR strip cap. Kies acht kolonies van deze mock voorwaarde en 88 kolonies van de getransduceerde voorwaarde voor het genereren van een volledige 96-wells-plaat. Voeg 50 µL voor DNA-extractie-buffer toe aan elk putje.
    2. Uittreksel van DNA van de kolonies, met behulp van een thermocycler en het volgende programma: 65 ° C/20 min., 99 ° C/10 min en een 4 ° C houdt. Naar wilt verplaatsen de DNA-20 ° C zo spoedig mogelijk voor optimale kwaliteit.
    3. Voeren te kwantificeren LV-getransduceerde cellen, vergelijking van het aantal kolonies in LV+ , Lenti F/R primers, met totale kolonies, met behulp van actine F/R en controle inleidingen (Tabel of Materials) PCR van de kolonie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Het protocol dat hierboven beschreven is ontworpen om te isoleren en gen-Wijzig Waterprogramma CD34+ HSPCs, die vervolgens terug in de autologe gastheer (Figuur 1 en Figuur 2) kan worden toegediend. Wanneer dit protocol volgen, we meestal verkrijgen tot 8 x 109 totale WBCs primer BM van FM makaken en soms het dubbele van dat bedrag van rhesus makaken. In beide soorten, het aantal CD34+ HSPCs die we verrijken is evenredig aan de ingang van de totale telling van WBC (Figuur 3). Eerdere bevindingen tonen aan dat de totale CD34+ HSPC product bevat cellen die niet waar, op lange termijn enten HSCs. Vandaar, we hebben stroom cytometry-gebaseerde technieken (Figuur 4) ontwikkeld en CFC assays (figuren 5-6) gebruiken om te identificeren op lange termijn HSCs en geëngageerd voorlopercellen deelverzamelingen in culturen. In tegenstelling tot ware HSCs, zal gepleegd progenitoren aanhouden voor een relatief korte periode in vivo. Tot slot de LV-gemedieerde gene wijziging strategie resulteert in robuuste gene markering gekweekte CD34+ HSPCs. Deze cellen worden gecontroleerd tot 2 weken in cultuur, voor een deel aan het verminderen van het aantal "valse positieve" cellen die nonintegrated LV vectoren GFP-express. Omdat deze cellen niet voor een stabiel geïntegreerde kopie van de LV-vector in het cellulaire genoom zorgt, verdunt ze uit over de 12-daagse vloeibare cultuur assay (Figuur 7).

Figure 1
Figuur 1: productie van een product van autologe, gen-gewijzigd NHP HSPC. Het protocol isoleert CD34+ HSPCs (dag -1), gene-wijzigt deze cellen (dag 0), en bereidt een infusie product (dag 1) in een loop van de tijd 48u. Vorming van de kolonie, vloeibare cultuur, en de naburige ex vivo tests voor een extra 2 weken, blijven om het karakteriseren van deze producten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: tijdlijn van gebeurtenissen. De gemiddelde tijd voor het uitvoeren van elke individuele stap van het protocol, over ongeveer 2 dagen. De timing van afzonderlijke stappen, is afhankelijk van de bron van de cel van de stam (stap 1 van het protocol) en/of het type van genetische modificatie (stap 3 van het protocol). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: witte bloedcel en CD34 opbrengst uit primer FM en rhesus makaak beenmerg. Verrijkt CD34+ HSPC telt (stap 1.4 van het protocol) als een functie van de graven van de totale witte bloedcel (stap 1.3.3 van het protocol) van 10 FM Makaken (pleinen) en zes rhesus makaken (driehoeken). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: strategie voor de kwaliteitscontrole van CD34-verrijkt en gene gemodificeerde producten Gating. Total witte bloedcellen ("pre verrijking") en vervolgens CD34-verrijkt HSPCs zijn gekleurd met antilichamen specifiek voor CD34, CD45, CD90 en CD45RA, om het aantal HSC-, MPP - WERKNR_ en LMP-verrijkt CD34 deelverzamelingen kwantificeren. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5: morfologie van CD34+ cellen voor en na de genetische modificatie. Top panelen: drie representatieve helderveld beelden van HSPC kolonie testen. Onderste panelen: GFP fluorescentie overeenkomt met elke helderveld afbeelding hierboven. Schaal bar = 1 mm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 6
Figuur 6: kolonie-vormende cel (CFC) potentieel van CD34+ cellen en sorteren-gezuiverd deelverzamelingen. Na de zuivering van de soort voor CFC testen van HSPC deelverzamelingen op dag -1 (afdelingen 1 en 2 van het protocol) en dag 1 (punt 5 van het protocol), single kolonies zijn scoorde gebaseerd op morfologische kenmerken. CFU-MIX = mix van myeloïde (wit) en erythroid (rood) de cellen; BFU-E = alleen erythroid cellen; CFU-G = granulocyten; CFU-GM = granulocyten en macrofagen/monocyten; CFU-M = macrofagen/monocyten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 7
Figuur 7: vertegenwoordiger stroom cytometrische gegevens uit genetische gemodificeerde cellen die in vloeibare cultuur. Percentage van CD34+ HSPCs na transductie met een uiting van het GFP LV vector. Cellen worden gekweekt voor maximaal 2 weken na transductie. Een afname van de GFP+ gebeurtenissen na verloop van tijd weerspiegelt een verlies van GFP signaal uit cellen die nonintegrated LV vectoren. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Naam Inhoud
Hemolytische Buffer 150 mM ammoniumchloride, 12 mM natriumbicarbonaat, 0.1 mM EDTA in tweemaal gedestilleerd water (ddH2van O)
Commerciële Buffer Met fosfaat gebufferde zoutoplossing (1 X) pH 7,2, 0,5% BSA, 2 mM EDTA
FACS buffer Met fosfaat gebufferde zoutoplossing (1 X) pH 7,2, 2% foetale runderserum
HBSS + 2% BSA Henks evenwichtig zoutoplossing, 2% bovien serumalbumine
HSPC Media StemSpan SFEM II, 1% penicilline/streptomycine, 100 ng/mL elke recombinante menselijke TPO, SCF, FLT-3
Transductie Media StemSpan SFEM II, 1% penicilline/streptomycine, 100 ng/mL elke recombinante menselijke TPO, SCF, FLT-3, 1 µg/mL Cyclosporine, 4 mg/mL tijdje sulfaat

Tabel 1: Buffer en media formuleringen.

ID PE PECF594 APC-Cy7 V450 Beschrijving
1 CD90 Compensatie kralen
2 CD34 Compensatie kralen
3 CD45RA Compensatie kralen
4 CD45 Compensatie kralen
5 Onbevlekt WBCs voordat CD34-verrijking
6 CD90 CD34 CD45RA CD45 Gekleurd WBCs voordat CD34-verrijking
7 Onbevlekt WBCs van doorstroming (FT)
8 CD90 CD34 CD45RA CD45 Gekleurd WBCs van doorstroming (FT)
9 Onbevlekt WBCs van CD34-verrijkt product
10 CD90 CD34 CD45RA CD45 Gekleurd product WBCs van CD34-verrijkt

Tabel 2: Vertegenwoordiger stroom paneel voor de kwaliteitscontrole van CD34-verrijkt en gene gemodificeerde cel producten.

Antigeen Kloon Fluorescerende Laser Filter
CD45 D058-1284 V450 395 nm 450/40 nm
CD90 5.00E + 10 PE 488 nm of 532 nm 585/42 nm
CD34 563 PE-CF594 488 nm of 532 nm 610/20 nm
CD45RA 5H 9 APC-Cy7 633 nm 780/60 nm
V450: violet 450 nm; PE: Phycoerythrin; PE -CF594: merknaam van Biotium; APC: Allophycocyanin-cyanine 7

Tabel 3: Antilichaam-kleuring paneel voor kwaliteitscontrole door stroom cytometry en cel sorteren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

LV vector engineering is de best gekarakteriseerd methode gen-wijzigen celtypes zoals CD34+ HSPCs, voor latere transplantatie in vivo. Het protocol hier beschreven is ontworpen om te maximaliseren van het aantal genetische gemodificeerde HSPCs, die nog bestaan op lange termijn in vivo, en klinische voordelen bieden aan patiënten met verschillende genetische, kwaadaardige en besmettelijke ziekten. Hoewel bewerken van gene strategieën in het afgelopen decennium opgedoken, LV gemodificeerde cellen zijn de beste studeerde in vitro in diermodellen en patiënten1,8,20,21,22.

Op basis van onze uitgebreide ervaring met dit protocol, de verrijking van pure CD34+ HSPCs (d.w.z., > 80% van de CD34+ cellen in het product gesorteerde cel) is een cruciaal aspect van succes. Omdat deze cellen zijn afgeleid uit een gemengde populatie van totale BM WBCs, bevatten lage-zuiverheid culturen cellen die niet op lange termijn engraft zal, op zijn beurt het verlagen van de dosis van ware stamcellen die in het autologe gastheer zijn toegediend. Bovendien zorgt voor kwalitatief hoogwaardige LV VCM de hoogste efficiëntie van genetische modificatie.

Adres leemte in de zuiverheid van verrijkte CD34+ HSPC producten, het is vaak nuttig voor het valideren van de kwaliteit van de reagentia die gebruikt voor het isoleren van deze cellen, namelijk het anti-CD34 antilichaam (die onze fractie zuivert het huis van een hybridoma cellenvariëteit), en magnetische kralen die antilichaam-geëtiketteerden cellen te binden. Het is raadzaam een MOI van 10, met een optie om te herhalen dit transductie (MOI 10 x 2). Bovenal moet de MOI empirisch, worden vastgesteld na een evaluatie van de kwaliteit van VCM, met inbegrip van de titratie van elke vector op een gestandaardiseerde titering cellijn zoals HT108029. Nog belangrijker is, kunnen verschillende VCM-producerende laboratoria cellijnen van verschillende titering, met inbegrip van HOS30, HeLA31en 293T32, die kunnen beperken de mogelijkheid om te vergelijken titers tussen voorzieningen gebruiken. We liever een vector met de assay, retiter om te berekenen van de meest nauwkeurige hoeveelheid VCM efficiënt gen-wijzigen CD34+ HSPC target cellen. Eenmaal kwalitatief hoogwaardige CD34+ HSPCs en VCM zijn verkregen, signaaltransductie efficiëntie en engraftment worden verder versterkt in drie afzonderlijke stappen. Ten eerste, de toevoeging van ciclosporine transductie media aids in de vroege stappen van vector transductie en integratie in target cellen35,36, terwijl tijdje sulfaat afstotend afneemt krachten tussen de lentivirale vector deeltjes en de cel-oppervlakte33,37. Ten tweede, behandeling van de platen met een recombinant fibronectine fragment (bijvoorbeeld RetroNectin, CH-296) verhoogt de efficiëntie van de transductie en verbetert ook het potentieel van in vivo engraftment van genetische gemodificeerde HSPCs 33,38, 39. Met name, suggereren vorige studies dat CH-296 alleen belangrijk tijdens, maar niet vóór, signaaltransductie33,38 is. Tot slot, we pulse gene gemodificeerde cel producten met PGE2 ter verbetering van engraftment en persistentie in vivo, zoals eerder is gebleken voor menselijke en niet-menselijke primaten CD34+ HSPC producten40,41.

LVs integreert willekeurig in het genoom, net zoals hun voorganger, gammaretroviral vectoren (RVs). Hoewel minder klinische proefgegevens beschikbaar voor LVs dan voor RVs is, suggereren huidige bevindingen dat LV benaderingen substantieel lagere risico's van cel transformaties als gevolg van LV dat mutagenese dragen; RV strategieën worden minder vaak gebruikt als gevolg van deze risico-42. Een verdere beperking is dat de efficiëntie van genetische modificatie minder dan 100 is %, en een deel van de genetische gemodificeerde cellen zal niet blijven bestaan in vivo. Bijvoorbeeld, een 60% gene gemodificeerde HSPC product kan resulteren in 30% lange termijn enten, gene gemodificeerde cellen. Waar mogelijk, zijn de gen-therapie strategieën gepresenteerde ontworpen om deze beperking ondervangen door de invoering van de transgenen waarmee de therapeutische werking, zelfs indien uitgedrukt in een minderheid van hematopoietische-oorsprong cellen8,43 .

De toekomst is helder voor LV gebaseerde HSPC wijziging benaderingen. We gebruiken routinematig dit protocol om te "gene-mark" cellen, waardoor bijhouden in vivo1. Ook hebben we deze strategie om te vergelijken LV varianten binnen hetzelfde dier aangepast. Dergelijke "concurrerende" transplantaties mogelijk een vergelijking van verschillende vectoren (bijvoorbeeld om te identificeren die met een beter rendement) en transgenen (bijvoorbeeld bijhouden van verschillende subgroepen van de HSPC te vergelijken in ziekte modellen). Vooruit, wij zijn van mening dat LV gentherapie in HSPCs blijft een essentieel instrument naast gene bewerken benaderingen, met name in situaties waar grote genetische lading stabiel moeten worden uitgedrukt voor de levensduur van een individu.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs bedanken Helen Crawford voor het opstellen van dit manuscript, Jim Woolace voor grafische vormgeving, en Veronica Nelson en Devikha Chandrasekaran voor deelname aan de ontwikkeling van het protocol. De ontwikkeling van dit protocol werd gesteund door subsidies van de NIH National Institute of Allergy en besmettelijke ziekten (R01 AI135953 en AI138329 naar H.P.K.) en het National Heart, Lung en bloed Instituut (R01 HL136135, HL116217, P01 HL122173 en U19 HL129902 naar H.P.K.), evenals NIH P51 OD010425 en deels door de NIH/NCI Cancer Center, steun Grant P30 CA015704. H.P.K. is een Markey-moleculaire geneeskunde-Detective en steun gekregen als de inaugurele ontvanger van de José Carreras/E. Donnall Thomas begiftigd stoel voor kankeronderzoek en de Fred Hutch begiftigd stoel voor cel en Gene Therapy.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Stemspam SFEM II ("HSPC") Media StemCell 09655
Hank's Balanced Salt Solution Gibco 14175095
Phosphate-Buffered Saline Gibco 14190-144
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140-122
Dimethyl Sulfoxide Sigma Aldrich D2650-100
100% Ethanol Decon labs M18027161M
Cyclosporine Sigma 30024-25MG
500 mM EDTA Invitrogen 15575-038
Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum Sigma Aldrich PS-0500-A
CH-296/ RetroNectin (2.5 mL, 1 µg/µL) TaKaRA T100B
Bovine Serum Albumin Sigma A7906-100g
HEPES Sigma H9897
Rat anti-mouse IgM magnetic beads Miltenyi Biotec 130-047-301
Recombinant HumanStem Cell Factor (SCF) Peprotech 300-07
Recombinant Human Thrombopoietin (TPO) Peprotech 300-18
Recombinant Human FMS-like tyrosine kinase 3 (FLT-3) Peprotech 300-19
Protamine sulfate Sigma P-4505
14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube Corning 352059
Colony Gel 1402 ReachBio 1402
QuadroMACS Separators Miltenyi Biotec 130-090-976
MACS L25 Columns Miltenyi biotec 130-042-401
10 mM PGE2 Cayman Chemical 14753-5mg
TC-treated T-75 flasks Bioexpress T-3001-2
Non-TC-treated T-75 flasks Thermo-Fisher 13680-57
20 mL syringes BD Biosciences 302830
16.5 G needles BD Precision 305198
Syringe Tip Cap BD Biosciences 305819
QuickExtract DNA Solution Epicentre QE09050
8-tube strip cap PCR Tubes USA scientific 1402-2708
96-well Thermocycler Thermo-Fisher 4375786
Pre-Separation filters Miltenyi Biotec 130-041-407
Strainer, Cell; BD Falcon; Sterile; Nylon mesh; Mesh size: 70um; Color: white; 50/CS fisher scientific 352350
Ultracomp ebeads eBioscience 01-2222-42
MACSmix Tube Rotator Miltenyi 130-090-753
3 mL Luer-Lock Syringes Thermo-Fisher 14823435
35 mm x 10 mm cell culture dish Corning 430165
60 mm x 15 mm cell culture dish Corning 430196
150 mm x 25 mm cell culture dish Corning 430599
Non TC treated flasks Falcon 353133
Qiagen DNA extraction Qiagen 51104
PE Anti-Human CD90 (Thy1) Clone:5E10 Biolegend 328110
PE-CF594 Mouse Anti-Human CD34 Clone:563 BD horizon 562449
APC-H7 Mouse Anti-Human CD45RA Clone: 5H9 BD Pharmingen 561212
V450 Mouse Anti-NHP CD45 Clone:d058-1283 BD Biosciences 561291
Autologous Serum Collected from autologous host and cryopreserved prior to mobilization and collection of CD34+ HSPCs N/A Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).
Virus-Conditioned Media (VCM) Kiem Lab, FHCRC Co-operative Center for Excellence in Hematology (CCEH) N/A Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).
Anti-CD34 antibody, Clone 12.8 Kiem Lab N/A Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).
Lenti F primer: AGAGATGGGTGCGAGAGCGTCA Integrated DNA Technologies N/A Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).
Lenti R primer: TGCCTTGGTGGGTGCTACTCCTAA Integrated DNA Technologies N/A Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).
Actin F primer: TCCTGTGGCACTCACGAAACT Integrated DNA Technologies N/A Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).
Actin R primer: GAAGCATTTGCGGTGGACGAT Integrated DNA Technologies N/A Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Radtke, S., et al. A distinct hematopoietic stem cell population for rapid multilineage engraftment in nonhuman primates. Science Translational Medicine. 9 (414), eaan1145 (2017).
  2. Majeti, R., Park, C. Y., Weissman, I. L. Identification of a hierarchy of multipotent hematopoietic progenitors in human cord blood. Cell Stem Cell. 1 (6), 635-645 (2007).
  3. Notta, F., et al. Isolation of single human hematopoietic stem cells capable of long-term multilineage engraftment. Science. 333 (6039), 218-221 (2011).
  4. Hoggatt, J., et al. Rapid mobilization reveals a highly engraftable hematopoietic stem cell. Cell. 172 (1-2), 191-204 (2018).
  5. Chandrasekaran, D., Nakamoto, B., Watts, K. L., Kiem, H. P., Papayannopoulou, T. Modeling promising nonmyeloablative conditioning regimens in nonhuman primates. Human Gene Therapy. 25 (12), 1013-1022 (2014).
  6. Humbert, O., Peterson, C. W., Norgaard, Z. K., Radtke, S., Kiem, H. P. A nonhuman primate transplantation model to evaluate hematopoietic stem cell gene editing strategies for beta-hemoglobinopathies. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 8, 75-86 (2018).
  7. Peterson, C. W., et al. Differential impact of transplantation on peripheral and tissue-associated viral reservoirs: Implications for HIV gene therapy. PLoS Pathogens. 14 (4), e1006956-e1006956 (2018).
  8. Zhen, A., et al. Long-term persistence and function of hematopoietic stem cell-derived chimeric antigen receptor T cells in a nonhuman primate model of HIV/AIDS. PLoS Pathogens. 13 (12), e1006753 (2017).
  9. Moffett, H. F., et al. Hit-and-run programming of therapeutic cytoreagents using mRNA nanocarriers. Nature Communications. 8 (1), 389 (2017).
  10. Burtner, C. R., et al. Intravenous injection of a foamy virus vector to correct canine SCID-X1. Blood. 123 (23), 3578-3584 (2014).
  11. Evans, D. T., Silvestri, G. Nonhuman primate models in AIDS research. Current Opinion in HIV and AIDS. 8 (4), 255-261 (2013).
  12. Taraseviciute, A., et al. Chimeric antigen receptor T cell-mediated neurotoxicity in nonhuman primates. Cancer Discovery. 8 (6), 750-763 (2018).
  13. McGary, C. S., et al. CTLA-4(+)PD-1(-) memory CD4(+) T cells critically contribute to viral persistence in antiretroviral therapy-suppressed, SIV-infected rhesus macaques. Immunity. 47 (4), 776-788 (2017).
  14. Beard, B. C., Adair, J. E., Trobridge, G. D., Kiem, H. P. High-throughput genomic mapping of vector integration sites in gene therapy studies. Methods in Molecular Biology. 1185, 321-344 (2014).
  15. Zonari, E., et al. Efficient ex vivo engineering and expansion of highly purified human hematopoietic stem and progenitor cell populations for gene therapy. Stem Cell Reports. 8 (4), 977-990 (2017).
  16. Doulatov, S., et al. Revised map of the human progenitor hierarchy shows the origin of macrophages and dendritic cells in early lymphoid development. Nature Immunology. 11 (7), 585-593 (2010).
  17. Fares, I., et al. Cord blood expansion. Pyrimidoindole derivatives are agonists of human hematopoietic stem cell self-renewal. Science. 345 (6203), 1509-1512 (2014).
  18. Gori, J. L., et al. Endothelial cells promote expansion of long-term engrafting marrow hematopoietic stem and progenitor cells in primates. Stem Cells Translational Medicine. 6 (3), 864-876 (2017).
  19. Peterson, C. W., et al. Long-term multilineage engraftment of autologous genome-edited hematopoietic stem cells in nonhuman primates. Blood. 127 (20), 2416-2426 (2016).
  20. Peterson, C. W., et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 3, 16007 (2016).
  21. Thompson, A. A., et al. Gene therapy in patients with transfusion-dependent beta-thalassemia. The New England Journal of Medicine. 378 (16), 1479-1493 (2018).
  22. Eichler, F., et al. Hematopoietic stem-cell gene therapy for cerebral adrenoleukodystrophy. The New England Journal of Medicine. 377 (17), 1630-1638 (2017).
  23. Paul, B., et al. Efficient enrichment of gene-modified primary T cells via CCR5-targeted integration of mutant dihydrofolate reductase. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 5 (9), 347-357 (2018).
  24. Levine, B. L., Miskin, J., Wonnacott, K. Global manufacturing of CAR T cell therapy. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 4, 92-101 (2017).
  25. Masiuk, K. E., et al. Improving gene therapy efficiency through the enrichment of human hematopoietic stem cells. Molecular Therapy. 25 (9), 2163-2175 (2017).
  26. Trobridge, G. D., et al. Efficient transduction of pigtailed macaque hematopoietic repopulating cells with HIV-based lentiviral vectors. Blood. 111 (12), 5537-5543 (2008).
  27. Beard, B. C., et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354 (2010).
  28. Horn, P. A., et al. Efficient lentiviral gene transfer to canine repopulating cells using an overnight transduction protocol. Blood. 103 (10), 3710-3716 (2004).
  29. Adair, J. E., et al. Semi-automated closed system manufacturing of lentivirus gene-modified haematopoietic stem cells for gene therapy. Nature Communications. 7, 13173 (2016).
  30. Kutner, R. H., Zhang, X. Y., Reiser, J. Production, concentration and titration of pseudotyped HIV-1-based lentiviral vectors. Nature Protocols. 4 (4), 495-505 (2009).
  31. Salmon, P., Trono, D. Production and titration of lentiviral vectors. Current Protocols in Human Genetics. 54 (1), (2007).
  32. Geraerts, M., Willems, S., Baekelandt, V., Debyser, Z., Gijsbers, R. Comparison of lentiviral vector titration methods. BMC Biotechnology. 6, 34 (2006).
  33. Kiem, H. P., et al. Improved gene transfer into baboon marrow repopulating cells using recombinant human fibronectin fragment CH-296 in combination with interleukin-6, stem cell factor, FLT-3 ligand, and megakaryocyte growth and development factor. Blood. 92 (6), 1878-1886 (1998).
  34. Morton, W. R., Knitter, G. H., Smith, P. M., Susor, T. G., Schmitt, K. Alternatives to chronic restraint of nonhuman primates. Journal of the American Veterinary Medical Association. 191 (10), 1282-1286 (1987).
  35. Noser, J. A., et al. Cyclosporine increases human immunodeficiency virus type 1 vector transduction of primary mouse cells. Journal of Virology. 80 (15), 7769-7774 (2006).
  36. Uchida, N., Hsieh, M. M., Washington, K. N., Tisdale, J. F. Efficient transduction of human hematopoietic repopulating cells with a chimeric HIV1-based vector including SIV capsid. Experimental Hematology. 41 (9), 779-788 (2013).
  37. Cornetta, K., Anderson, W. F. Protamine sulfate as an effective alternative to polybrene in retroviral-mediated gene-transfer: implications for human gene therapy. Journal of Virological Methods. 23 (2), 187-194 (1989).
  38. Goerner, M., et al. The use of granulocyte colony-stimulating factor during retroviral transduction on fibronectin fragment CH-296 enhances gene transfer into hematopoietic repopulating cells in dogs. Blood. 94 (7), 2287-2292 (1999).
  39. Dao, M. A., Hashino, K., Kato, I., Nolta, J. A. Adhesion to fibronectin maintains regenerative capacity during ex vivo culture and transduction of human hematopoietic stem and progenitor cells. Blood. 92 (12), 4612-4621 (1998).
  40. North, T. E., et al. Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis. Nature. 447 (7147), 1007-1011 (2007).
  41. Goessling, W., et al. Prostaglandin E2 enhances human cord blood stem cell xenotransplants and shows long-term safety in preclinical nonhuman primate transplant models. Cell Stem Cell. 8 (4), 445-458 (2011).
  42. Booth, C., Gaspar, H. B., Thrasher, A. J. Treating immunodeficiency through HSC gene therapy. Trends in Molecular Medicine. 22 (4), 317-327 (2016).
  43. Humbert, O., et al. Rapid immune reconstitution of SCID-X1 canines after G-CSF/AMD3100 mobilization and in vivo gene therapy. Blood Advances. 2 (9), 987-999 (2018).

Tags

Genetica kwestie 144 hematopoietische cellen van de stam en voorlopercellen gentherapie Haematopoiese niet-menselijke primaten model cel isolatie lentivirale vectoren
Voorbereiding en genetische modificatie van Nonhuman primaat hematopoietische stamcellen en voorlopercellen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Radtke, S., Perez, A. M.,… More

Radtke, S., Perez, A. M., Venkataraman, R., Reddy, S., Haworth, K. G., Humbert, O., Kiem, H. P., Peterson, C. W. Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (144), e58933, doi:10.3791/58933 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter