Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

התאמת גנים של גזע Hematopoietic פרימוס Nonhuman, ובתאים והכנה

Published: February 15, 2019 doi: 10.3791/58933
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,2,3, 1,2
1Stem Cell and Gene Therapy Program, Fred Hutchinson Cancer Research Center, 2Department of Medicine, University of Washington, 3Department of Pathology, University of Washington

Summary

המטרה של פרוטוקול זה היא כדי לבודד במוסר הפרימטים CD34+ תאים ממח העצם כאשר הבחינה, ג'ין-לשנות את התאים האלה עם וקטורים lentiviral, וכדי להתכונן מוצר אינפוזיה לתוך המארח עצמיים. האורך פרוטוקול הכולל הוא כ- 48 שעות.

Abstract

השתלת תא (HSPC) hematopoietic של גזע, קדמון היה טיפול אבן הפינה של לוקמיה, סרטן אחרים במשך כמעט חצי מאה, ביסוד התרופה היחידה הידועה של זיהום וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV-1), ואני מראה הבטחה עצומה הטיפול במחלות גנטיות כגון בטא תלסמיה. הקבוצה שלנו פיתחה פרוטוקול טיפול גנטי HSPC דגם במוסר פרימטים (NHPs), מאפשרת למדענים למטב את רבים של ריאגנטים אותו טכניקות מוחלים במרפאה. כאן, אנו מתארים שיטות לטיהור CD34+ HSPCs, לטווח ארוך שמירת תאי גזע hematopoietic (HSC) קבוצות משנה של מח העצם כאשר הבחינה (מוניטור). טכניקות זהה יכול להיות מועסק ולטיהור מקורות HSPC אחרים (למשל, גויסו דם היקפיים בתאי גזע [PBSCs]). בקווים כלליים הוא פרוטוקול 2 יום שבו תאים מטוהרים, תרבותי, שונה עם lentivirus (LV), הכין אינפוזיה בחזרה לתוך המארח עצמיים. המפרט מפתח להצלחה כוללים את טוהר CD34+ HSPC האוכלוסייה, היכולת של HSPCs מטוהרים להקים מושבות נפרדות מורפולוגית מדיה חצי קשות, ויעילות, והכי חשוב, ג'ין השינוי. היתרון המפתח כדי ריפוי גנטי HSPC היא היכולת לספק מקור של תאים חיים ארוכים להצמיח כל סוגי תאים hematopoietic. ככזה, שיטות אלה שימשו מודל טיפולים עבור סרטן, מחלות גנטיות מחלות זיהומיות. בכל מקרה, היעילות הטיפולית היא הוקמה על ידי שיפור הפונקציה צאצאי HSPC ברורים, לרבות תאי דם אדומים, תאי T, תאים B, ו/או מיאלואידית קבוצות משנה. השיטות לבודד אותו, לשנות, להכין HSPC המוצרים הם ישירות הרלוונטיים לתרגום מרובים למחלות בחולים אנושיים.

Introduction

ריפוי גנטי בתאי גזע הוא אמצעי רב עוצמה כדי לטפל מגוון רחב של פתולוגיות אנושי. ריפוי גנטי HSPC היא גישה אטרקטיביים במיוחד, בשל i) בקלות יחסית של איסוף תאים אלה מחולים, ii) שפע של ידע זה אינו זמין לגבי פנוטיפים פני שטח התא, ex-vivo תרבות פרמטרים,, כשדה מתרחב, כי השלישי) הוא מציג מדענים עם ארגז הכלים ההולכת וגדלה של אסטרטגיות שינוי גנטי המותאמים במחלות שונות של עניין. אנו לחקור באופן פעיל HSPC ג'ין גישות טיפול מזוויות מרובות, כולל המדע הבסיסיים של ביולוגיה HSPC, את engraftment של ג'ין-השתנה HSPCs במודלים פרה ויוו, היישום לאוכלוסיות החולה הרלוונטיים. אנחנו ואחרים שאפיינו את תא השטח גן # מושגים בסיסיים של נפרדים פונקציונלית HSPC קבוצות משנה1,2,3, גיוס משטרי מיזוג למקסם את התשואה HSPC engraftment תוך מזעור רעילות4,5והגן השינוי ואסטרטגיות לעריכת ג'ין יש כבר למידותיו של מגוון רחב של ממאירות, גנטית, מחלות זיהומיות6,7,8, 9,10. ניתן להעריך את תפקוד ואת engraftment של HSPCs ג'ין-לאחרונה במספר דגמים קטנים, גדולים-מוצרים מהחי, כולל עכברים, כלבים ו NHPs. בפרט, מודלים NHP הם יתרון כי נוגדנים רבים, למשל, נוגדנים ספציפיים עבור חלבונים פני שטח התא HSPC כמו CD34 ו- CD90, ניתן להשתמש בקבצים של האדם ותאים NHP. יתר על כן, בניגוד עכברים, חיים גדולים, כגון NHPs מאפשרים הערכה קרובה יותר של הסקאלה של התאמת גנים הדרושים עבור יעילות קלינית. לבסוף, NHPs תקן זהב עבור עיצוב אנושי פתולוגיות כגון זיהום ב- HIV-111 והם מערכת מודל המתעוררים המועמד נגד סרטן, אנטי-איידס immunotherapies12,13.

המטרה של פרוטוקול זה הוא מתאר שיטות טיהור, גנטית שינוי והכנת המוצרים אינפוזיה NHP HSPC. למרות שמחוץ להיקף של פרוטוקול זה, אנחנו בעבר הראו כי מוצרים אלה engraft ב hosts NHP עצמיים, להצמיח כל שושלות hematopoietic, מספקים יעילות טיפולית במגוון רחב של דגמים המחלה1. יש גם שאפיינה את clonality של engrafting HSPCs ואנו נבנה פלטפורמה כדי לעקוב אחר קינטיקה, סחר, של פנוטיפ של HSPCs בודדים, הצאצאים שלהם, עצמיים השתלת הבאות1,14. השיטות המובאות כאן פותחו עם היעדים הבאים: i) כדי לבודד HSPCs מאוד טהור ו לטווח ארוך engrafting HSC קבוצות משנה, ii) כדי לשמור על HSCs פרימיטיביים במהלך ex-vivo תרבות, ו- iii) לשינוי ביעילות ג'ין-גם בתפזורת HSPCs או לטווח ארוך קבוצות משנה של מועדון הכדורגל מונפלייה engrafting. אנו מעסיקים מגנטי בסיוע-מיון תא (מקינטוש), וכן תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS), לבודד phenotypically/פונקציונלית ברורים HSPC אוכלוסיות, בקנה אחד עם שיטות רבות קבוצות2,15, 16. קיום פרימיטיבי HSCs בתרבות (קרי, למזער את הבידול של תאים אלה לתוך אבות מחויבת לתת עלייה במלואה הבדיל קבוצות משנה הלימפה ואת מיאלואידית) היא היבט חיוני של הפרוטוקול המתואר כאן. למרות שאנחנו בעבר אפיינו גישות כדי להרחיב את HSPCs תוך שמירה על פנוטיפ פרימיטיביים17,18, כאן, אנו מתארים פרוטוקול זה מתמקד שמירה על HSCs ויה מינימלי (h 48) ומוגדר ex-vivo תרבות.

השינוי יעיל של HSPCs ומועדון הכדורגל מונפלייה קבוצות משנה היא המטרה המרכזית של פרוטוקול זה. בין מספר גישות דיווחנו, שניכם עד כה הניסויים הקליניים ובדוקים ביותר ב: שינוי ג'ין בתיווך LV, בתיווך נוקלאז גן לעריכת6,1,19. אסטרטגיות לעריכת גן אחד של מספר פלטפורמות נוקלאז לשינוי במיוחד גן יישוב עניין, לדוגמה, C-C כימוקין קולטן הקלד 5 (CCR5) לטיפול ב- HIV זיהום7,19 או Bcl11A לטיפול פתולוגיות של המוגלובין6. כאן, אנו מתמקדים שינוי ג'ין בתיווך LV, שבו מטענים הטרנסגניים להשתלב semirandomly8,1,20הגנום. יתרון מפתח של LV גישות היא היכולת לספק כמויות גדולות של חומר גנטי (עד 8 או 9 kilobases). למרות אסטרטגיות לעריכת ג'ין מפותחים למטרה transgene עניין לשלב רק בשעה לוקוס שצוין על-ידי רקומבינציה הומולוגית התורם (HDR), שיטות אלה דורשים יותר לפיתוח במבחנה, במודלים של בעלי חיים קטנים. לעומת זאת, LV וקטורים נעשה שימוש נרחב ב- NHPs וב -חולים21,22. חשוב, הפרוטוקול המתואר כאן, שמשתמשת בשלה מוניטור כמקור HSPC ההתחלתי, ניתן בקלות, בהרחבה להתאים, למשל, לבודד PBSCs. כמתואר לעיל, עלינו לנצל של רמה גבוהה של דמיון גנטי בין NHPs לבין בני האדם להשתמש ריאגנטים הרלוונטיים בשני המינים. לבסוף, הותאם בגישה זו כדי לשנות קבוצות משנה hematopoietic אחרים, כלומר T תאים12,23,24; כניסתו של גישות חיסוני יעיל של T-cell הסתמכה בכבדות על פלטפורמה זהה LV מנוצל פרוטוקול זה. שיטות אלה מתאימים עבור כל חוקר מעוניין HSPC ביולוגיה או שינוי בתיווך LV ג'ין. לדוגמה, פרוטוקול טיהור HSPC המובאת כאן יכול לשמש כדי לאפיין את הרומן מועשר-מועדון הכדורגל מונפלייה קבוצות משנה, כפי שתואר לעיל15,1,25. באופן דומה, התמרה חושית LV השיטות המובאות כאן יכול באופן דומה להיות מיושם, פיתוח נוסף עבור רבים סוגי תאים אחרים, שאלות ניסיוני, שניהם במודלים במבחנה ו ויוו.

לסיכום, אנו מציגים שיטות כדי לבודד ולשנות גנטית NHP HSPCs. שיטות אלה ניתן להתאים בקלות עבור מינים אחרים ומקורות אחרים של HSPCs. פרוטוקול זה ביסודיות vetted מציגה הבטחה גדולה הדגמים של טיפולים אפקטיבי עבור מחלות אנושיות רבות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

עצמיים NHP השתלות, הטרמה (גיוס), האוסף של תאים, שינוי ג'ין מתנהלים בקנה אחד עם פרוטוקולים שפורסמו בעבר26. בכל ההליכים ניסיוני נבדקו ואושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה את פרד האצ'ינסון לחקר הסרטן, באוניברסיטת וושינגטון (פרוטוקול #3235 - 01). כל מחקרים מבוצעים בהתאמה קפדנית עם ההמלצות במדריך על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה של מכוני הבריאות הלאומיים ("מדריך"); חיות חולקו באופן אקראי למחקרים.

1. העשרת CD34+ HSPCs ותרבות לילה (יום-1)

  1. הקציר מוניטור, במצב זה.
    1. לגייס את NHPs עם גורם מגרה המושבה גרנולוציט (GCSF) ארבעה ימים כפי שתואר לעיל26.
    2. לסמם את החיות עם 100 מ"ג/ק"ג של קטמין, 0.03 נקודות mL/kg של dexmedetomidine (מניות 0.5 מ"ג/מ"ל). לנהל משככי כאבים (למשל, SR. הבופרנורפין) בזמנו של ההגרלה.
    3. בעזרת קוצץ, לגלח את השיער של בעל החיים מהקצה הפרוקסימלית של עצם הזרוע ו/או עצם הירך bone(s), לשפשף את העור עם פילינג המבוסס על יוד או פתרון חיטוי דומה, לסירוגין עם אלכוהול, וחזור על 3 x. כחומר הרדמה נוספים, להחדיר קרום העצם נמשך (2 מ ג לכל אתר, מניות 5 מ"ג/מ"ל).
    4. מקמו את המחט השאיפה של מח העצם (16 גרם) האתר ערך חידוש (מדולרי חלל), לחדור את העור, חודר את חלל מדולרי באמצעות תנועה מסתובב. הסר את stylet של המחט השאיפה, להזמין אותו בתוך שדה סטרילי לשימוש נוסף.
      הערה: לבחור חידוש כניסה לאתר חלל מדולרי באזור עצם זה אינו מכוסה על ידי השרירים ואיפה הנוף/הצורה של העצם או גלוי או יכול להיות מורגש בקלות דרך העור (בדרך כלל לקראת סיום צינתור או דיסטלי של העצם).
    5. כדי שהמחט מוניטור, צרף שמולאו מראש המזרק המכיל תערובת של פתרון דקסטרוז ציטראט קרישה (ACD-A) והפרין (20 USP/mL, mL 1 לכל 9 מ של מח להיות שנאספו).
    6. לצייר על הבוכנה בחזרה תוך בעדינות נדנדה האיבר וסיבובו, כדי להתסיס את המזרק לערבב וביופסיה, נוגד קרישה. לסובב את המחט ולמקם אותו ברחבי השאיפה נסיגה לגשת אחוז גדול יותר של תאים בתוך מח.
    7. ברגע המדגם נאסף, הסר את המחט והפעילו לחץ לאתר השאיפה עד התחנות דימום.
      הערה: בהתאם לנפח הדרוש, ניתן למשוך מח עצם מאחת עד ארבע הגפיים (שני humeri, שני עצמות הירך) במהלך אוסף יחיד. לא יותר מ 20 מ ל צריכים להיאסף אבר כל, ומהווים הנפח הכולל שנאסף צריך לא יותר מ- 10% ממשקל של החיה (10 מ"ל/ק"ג).
    8. אם קבלת aspirates של הגפיים מרובים, לשלב והקלטה של אמצעי האחסון.
    9. תן postanesthesia לשחזר את NHP.
      1. להפוך את ההשפעות של dexmedetomidine עם atipamezole 0.03 נקודות מ"ל/ק"ג (5 מ"ג/מ"ל מניות) לאחר ההליך. לספק משככי כאבים (למשל, SR. הבופרנורפין) כפי שנקבע על ידי צוות וטרינרי קליניים לפחות 48 שעות לאחר הניתוח או ארוך יותר, שיקול דעתו של וטרינר קליני, בהתבסס על סימנים קליניים.
      2. להחזיר את החיה בכלוב הביתה לאחר ההליך, לפקח עליו כל 15-20 דקות, עד החיה הוא מסוגל לשבת משלו. לפקח על החיה מדי יום על ידי צוות וטרינר עד נקבע כי האתר השאיפה נרפא. בנוסף, לפקח על סימנים של דלקת, זיהום או כאבים.
    10. במקביל התא עיבוד, להתנות את NHP אותו עם myeloablative גופית (TBI): 1,020 cGy בשיעור של 7 cGy לדקה מנהל הקרנה במינון fractionated במהלך הימים 2 לפני תא אינפוזיה.
  2. Hemolyze את מוניטור.
    1. לחלק ויטביע את צינורות חרוט 50 מ ל (10-12 mL למחזור) ולהוסיף מאגר היילוד כדי להביא את אמצעי האחסון 50 מ ל (טבלה 1). דגירה התאים בטמפרטורת החדר (RT) עד הם lysed אך לא יותר מ במשך 7 דקות צנטריפוגה ב 800 x גרם במשך 5 דקות, וארוקן את תגובת שיקוע של pellet(s), עוזב 2-5 מ של אמצעי אחסון/צינור. Resuspend בגדר באמצעי האחסון שיורית.
      הערה: דוגמאות lysed בהצלחה לשנות צבע, אדום כהה כדי אדום בהיר שקוף.
    2. להוסיף 10-15 מ של היילוד מאגר/גלולה. הסר כל קרישי דם באמצעות 70 strainers תא מיקרומטר. להוסיף היילוד מאגר עד 50 מ ל, תקופת דגירה של 5 דקות ב RT ו ספין-800 x גרם במשך 5 דקות.
    3. וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend התאים 10 מ"ל MACS מאגר (טבלה 1). לסנן שוב דרך מסננת תא 70 מיקרומטר. יש לשטוף את שפופרת ואת מסנן זה עם 40 מ"ל של מקינטוש מאגר עד 50 מ.
  3. להעשיר את CD34+ תאים מחלון hemolyzed כדוריות הדם הלבנות (WBCs) באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים.
    1. לסובב התאים ב 800 x גרם במשך 15 דקות הסימון הצינורות כדי לוודא כי אין מערבולות תא ניכרות באמצע/העליון. אם התאים נמצאים מעל בגדר, ספין שוב במהירות גבוהה יותר (עד 1,000 x g המרבי), עבור עד 10 דקות.
    2. וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend זה ב 10 מ"ל או פחות מאגר MACS, וציין את עוצמת הקול המדויק. לספור התאים לדילול בטחונות או 1:1,000 באמצעות hemocytometer או מונה הניתן תא אוטומטית.
      הערה: זו ספירת הכולל הוא המונה העשרה מראש.
    3. להוסיף מאגר MACS להביא את הריכוז תא עונה 1 פרק 108 תאים/מ ל.... במידת הצורך, תחילה חזור על שלבים 1.3.1 - 1.3.2 (למשל, עקב מספר קדם העשרה נמוך). שומרים 5 x 106 תאים במקינטוש המאגר עבור ערכה HSC מכתים (דוגמה העשרה מראש).
    4. מוסיפים נוגדן (שיבוט 12.8, טבלה של חומרים) נגד unconjugated-CD3427 לתאים טרום העשרה הנותרים כדי ריכוז סופי של 40 µg/mL (1 x 108 תאים/mL). דגירה התליה תא ב 4 ° C ב rotator הרכבת התחתית (ראה את הטבלה של חומרים) למשך 25-30 דקות.
    5. מאגר מקינטוש לשימוש כדי להביא את אמצעי האחסון 50 מ ל, לסובב את התאים ב 800 x גרם במשך 5 דק. תשאף את תגובת שיקוע, resuspend התאים 50 מ של מאגר MACS, ומסתובב שוב ב x 800 גרם במשך 5 דקות.
    6. דגה 100 מ של מאגר מקינטוש עם שני לסנן צינורות, עוטף את כניסת אוויר עם נייר שעווה, למשך 25-30 דקות או עד מוכן לשימוש.
    7. חישוב הנפח של beads מגנטי: 1 מ"ל של חרוזים/109 תאים. וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend לתאים 108 תאים למ"ל, לאחר הוספת החרוזים. לדוגמה: 3 x 109 תאים + 3 מ"ל של חרוזים + 27 מ"ל של מקינטוש מאגר 30 מ של הנפח הכולל.
    8. דגירה התליה תא ב 4 ° C-מסובב צינור 25-30 דקות.
    9. במהלך רכישת מגנטים עבור העמודות; מתכנן להשתמש 0.6 x 109 תאים בכל עמודה. מניחים את העמודות על המגנט והצב צינור חרוטי 50 מ ל מתחת לכל עמודה כדי לאסוף את הזרימה. הכן צינור חרוטי 15 מ"ל, הבוכנה עבור כל עמודה עבור • תנאי (שלב
    10. עם השלמת הדגירה בשלב 1.3.8, להוסיף למאגר MACS 50 מ ל ספין-x 800 גרם עבור 5 דק. לשאוב תגובת שיקוע, resuspend את התאים במקינטוש degassed מאגר (2 מ"ל לכל עמודה). פיפטה בעדינות כדי להימנע מהחדרה בועות.
    11. מבלי לאפשר את העמודה להתייבש, להוסיף 1 מ"ל degassed MACS מאגר כל עמודה, ואחריו 2 מ"ל של התא השעיה. לשטוף את המסנן ואת הצינור המקורי עם מאגר מקינטוש degassed ולחלק את הפתרון באופן שווה בין עמודות (6 מ ל/עמודה); לאחר מכן, להוסיף 7 מ של מאגר מקינטוש degassed בשביל הכביסה הסופי.
    12. בעדינות למשוך את העמודה הרחק המגנט (דחיפה מאחור העליון) ולאסוף את הטפטפת האחרונה לתוך הצינור זרימה דרך. הוסף 5 מ של מאגר מקינטוש degassed כל עמודה ולהחיל על הבוכנה כדי elute את התאים לתוך הצינור חרוט סטרילי מהשלב 1.3.9. לא לאסוף את כל נוזל לאחר שהבועות מופיעות.
  4. לספור את התאים את מועשר והן זרימה דרך (FT) אוסף הצינורות ביחס דילול של 1:10. שמור את התאים על קרח. Aliquot עונה 1 פרק 106 תאים מן השבר מועשרת CD34 ו 5 x 106 תאים מן השברים מטרים לניתוח על ידי cytometry זרימה. אחסן את השבר מטרים ב 4 ° C עד בקרת האיכות (שלב 2) הסתיימה.
    הערה: מספר CD34+ תאים הדרוש מוצלח engraftment multilineage ב NHP תלויה תדירות CD34 מועשרת HSC+CD90+CD45RA– משנה. מבוסס על תדירות ממוצעת של 3% - 5%, את הדרישה המינימלית של 122,000 CD34+CD90+CD45RA– תאים לכל קילוגרם של הגוף משקל1, זה מומלץ להמשיך עם סכום כולל של פחות 2.5 x 106 עד 10 x 10 6 CD34+ תאים לכל קילוגרם של משקל גוף.
  5. להוסיף מקינטוש מאגר כדי CD34+ מועשר שבר 50 מל ' סך הכל, ספין-x 800 גרם עבור 5 דקות, וארוקן את תגובת שיקוע ועל resuspend לתאים 106 תאים למ"ל בתקשורת HSPC (טבלה 1).
    1. צלחת התאים-צפיפות של 106 תאים למ"ל בתרבות רקמה פרקו, (TC)-מבחנות T-75, 10-20 מ לכל מבחנה ובא דגירה אותם בן לילה ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 מיכלים. שאר המבחנות לאורכו (לא בעמידה).
      הערה: אם רצונך בכך, CD34 נוספים+ תאים או CD34– מטרים יכולים להיות cryopreserved 90% לא פעיל חום העובר שור סרום (FBS) + 10% דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד)-ריכוז של עונה 1 פרק 106 5 x 106 תאים/מ ל..., ולאחר מכן להאט מקורר- 80 ° C (למשל, באמצעות מכולות ההקפאה). התשואה ההחלמה הממוצע של תאים cryopreserved תלויה CD34+ טוהר, בדרך כלל נע בין 50% עד 80% עם הכדאיות של > 80%.

2. בקרת איכות תאי CD34 מועשרת (יום-1)

  1. להכין דגימות cytometry זרימה.
    1. Resuspend דגימות שאומנם כל שלב בידוד שהוזכרו לעיל (העשרה קדם מטרים, שברים מועשרת CD34) במאגר FACS-ריכוז של 10 x 106 תאים למ"ל ולהעביר µL 100 לכל תא השעיה (טבלה 1) צינור FACS.
      הערה: דגימות הבקרה צריכה לכלול תאים וללא רבב בכל שלב בידוד (למשל, 5 x 105 תאים) עבור ההתאמה של פיזור קדמי (FSC), לצד פיזור (האס) ו autofluorescence בכל אחד מהערוצים זריחה. בנוסף, חרוזים פיצוי שהוכתמו יחיד עבור כל נוגדן fluorochrome מצומדת יידרשו כדי לכוונן הפיצוי בין ערוצי סמוכים (טבלה 2 , טבלה 3).
    2. הוספת נוגדנים הרצוי (למשל, anti-CD45, אנטי-CD34, anti-CD45RA, אנטי-CD90), על פי הוראות היצרן, עבור מבחן אחד (1 x 10 תאים6 100 µL) (טבלה 3). תקופת דגירה של 20 דקות ב 4 º C. להוסיף 3 מ"ל של מאגר FACS, ספין-800 x גרם עבור 5 דקות, וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend ב µL 100 מאגר FACS, ולנתח על cytometer הזרימה המתאימה (שלב 2.2).
  2. להכין בסדרן תא cytometer זרימה לניתוח.
    הערה:     מומלץ לבצע הניתוח באותו מחשב שישמש עבור תא מיון בשלב 2.3.
    1. ליצור פרוטוקול כולל FSC/האס, CD45/CD34 ו CD45RA/CD90 (שלושה מגרשים זרימה). לחץ לחיצה ימנית על זרימה חלקה ומוסיפים את פריסת הירארכיה האוכלוסייה .
    2. לחיצה שמאלית על העלילה FSC/האס, בחר בתכונה שער מצולע, וצייר שער להוציא פסולת ותאים מתים. להאיר את השער החדש, שנה את פיזור בחלון המפקח.
      הערה: זה נקרא באופן אוטומטי כמו P1.
    3. לחץ לחיצה ימנית במרכז העלילה זרימת CD45/CD34, נווט כדי להראות אוכלוסיותולאחר שער העלילה על פיזור. צייר שער מלבני סביב CD45intCD34+ תאים תאים שאינם-CD34 תכלול ותאים nonhematopoietic, טוב כמו שיורית טסיות, אריתרוציטים (CD45–). לשנות את השער CD34+.
    4. שער העלילה זרימת CD45RA/CD90-CD34+ האוכלוסיה. לצייר שלוש עצמאית subgates סביב CD90+CD45RA תאים– (מועשר עבור HSCs), CD90–CD45RA תאים– (מועשר עבור multipotent ו- erythro-מיאלואידית אבות [MPPs/פעימה]), CD90–CD45RA + תאים (מועשר עבור lympho-מיאלואידית אבות [LMPs]). שנה את השערים כדי HSC MPP-EMP, LMP, בהתאמה.
    5. כשהפעולה תסתיים, להבטיח כי האוכלוסייה הירארכיה מכילה שש ערכי מאורגנים באופן היררכי לפי הסדר הבא: 1) כל האירועים; 2) פיזור; 3) CD34+; 4) HSC; 5) MPP-EMP; 6) LMP. ודא כי החלקות זרימה, צורת השער נראים כמופיע באיור4.
    6. הפעל WBCs העשרה מראש וללא רבב כדי להתאים את המתח FSC, האס של קרינה פלואורסצנטית כל הערוצים (טבלה 2, דגימת 5). הפעל את הפיצוי שהוכתמו יחיד חרוזים להתאמת הפיצוי בין ערוצי סמוכים (טבלה 2, דגימות 1-4). לרוץ כל הנותרים מוכתם והמוכתמות דגימות עם מנוכי עונתיות פיצוי פרוטוקול, לתעד CD34 העשרה יעילות (דוגמאותבטבלה 2, 6-9).
      הערה: שמור את הדגימה הסופי (טבלה 2, לדוגמה 10) כדי להפוך את ניתוח תזרים סימולטני התא מיון בשלב 2.4.
  3. להגדיר את סדרן התא ולטיהור המיון-קבוצות משנה CD34 לתוך המושבה יוצרי מבחני תא (CFC).
    הערה:     אם מכונה אחרת שימש לניתוח (שלב 2.2), להגדיר את הפרוטוקול ב סדרן התא תיאר כאמור בשלבים 2.2.1 - 2.2.5.
    1. להתאים את הזווית/המתח עבור הזרמים מצד שמאל ימין בתוכנה סדרן התא להפקיד תאים לתוך צינורות 15 מ"ל המכיל CFC בינוני. לקבוע את הזווית של הנחל בצד כדי למנוע חוסר התאמה. Step-wise, לכוונן את הזווית של הנחל הסיט את הצד עד בתאים ממוינים להכות המדיום CFC ואת לא הצד של הצינור כי מעט מאוד תאים ממוינים.
    2. בדפדפן, פתח את התיקיה גליונות עבודה גלובלי, וליצור מיון-פריסה חדשה באמצעות הלחצן בתפריט העליון של חלון הדפדפן. לשנות את הערך בתפריט הנפתח אוסף התקן כדי 2 צינורות, הערך בתפריט הנפתח דיוק 4-way טוהר או תא בודד ולהגדיר את האירועים היעד תאים 800-1,200. לחיצה שמאלית על השדה מיין-מיקום (שמאלי או ימני), בחר את הערך להוסיף בתפריט ובחרו האוכלוסייה כדי למיין מתוך התפריט.
  4. למיין את התאים עבור מבחני CFC.
    הערה:     מיון עבור מבחני CFC מבוצעת רק עם תאים מן המוצר CD34 מועשרת (טבלה 2, לדוגמה 10).
    1. לטעון לדוגמה 10, רושמים אירועים 2,000-3,000 והתאם פיין-השערים מיון כדי להתאים חוזק האות לאוכלוסייה היעד.
    2. עם השלמת ההתקנה, רוכשים תאים (טבלה 2, לדוגמה 10). לרכוש נתונים כמתואר בשלב 2.2.3, להתאים את קצב הזרימה ל- 500-1, 000 תאים/s ו למיין 800-1,200 תאים מהשער i) פיזור ii) CD34+ שער, iii) בשער מועדון הכדורגל מונפלייה, iv) השער MPP-EMP, ושער v) LMP לתוך צינורות נפרד המכיל מ 3.6 ל CFC מדיה.
      הערה: מיון עבור מבחני CFC מבוצעת רק עם תאים מן המוצר CD34 מועשרת (טבלה 3, לדוגמה 10). תאים מן פיזור CD34+ יש למיין השערים בנפרד, ואילו HSCs MPP-פעימה, LMPs ניתן למיין בו זמנית למצב בעל שפופרת ימינה ושמאלה.
    3. מערבולת ונותנות 1 מ"ל של השעיה תא לכל אחד nontissue סטרילי, 3 x 3.5 ס מ, שטופלו תרבות צלחות פטרי. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 10-14 ימים במיכל המשני (למשל, 15 ס מ פטרי).
    4. ימים 10-11 postplating, לספור מושבות נפרדות של כל שלוש הצלחות לכל תנאי, בהתבסס על מורפולוגיה המושבה.

3. ג'ין שינוי של CD34+ HSPCs ושחזור לילה (יום 0)

  1. למהול 2.5 מ ל 1 פתרון CH-296 µg/µL µg/mL 50 ב 50 מ של תמיסת מלח מאוזנת של האנק, (HBSS, ראה את הטבלה של חומרים).
  2. היכונו מבחנות התמרה חושית LV.
    1. לקבוע את המספר המשוער של תרבות-nontissue (הלא-TC)-מטופלים מבחנות הדרושים (בדרך כלל מן הסעיפים תא שנקבע בשלב 1.4). מתכנן צלחת תאים7 עונה 1 פרק 10 מ"ל של מדיה לכל T-75 את הבקבוק (1 x 108 תאים הכולל ידרוש 10 מבחנות) כוללים שאינם TC-מטופלים 12-ובכן לוח אחד (תנאי התמרה חושית מעושה). הוסף סטרילי HBSS ו- µg/mL 50 מניות CH-296 צעד 3.1 כל הבקבוק/צלחת, בכל ריכוז של µg/cm 22. T-75 המבחנות, להשתמש 3 מ"ל של µg/mL CH-296 + 7 מ של HBSS; לוח 12-ובכן, להשתמש µL 160 של 50 µg/mL CH-296 + 340 µL של HBSS לכל טוב.
    2. לאפשר את הכלים לשבת ללא הפרעה-RT על ספסל נקי או בשכונה עבור 2 ח' וביופסיה 296-CH ולהחליף אותו עם נפח דומה של HBSS סטרילי + 2% אלבומין שור (BSA). דגירה-RT למשך 30 דקות, וארוקן את HBSS/BSA, לשטוף את הכלים עם נפח דומה של HBSS סטרילי המכילה 2.5% 1 מ' HEPES, pH 7.0. האחות מייד לפני ציפוי התאים (שלב 3.4).
      הערה: בעקבות צעד 3.2.2, אינם מאפשרים הצלחות/המבחנות להתייבש. צלחות המכיל סטרילי HBSS + 2.5% 1 מ' HEPES נערכים 4 ° C בלילה (קרי, להכין ביום-1).
  3. הקציר, מגלי CD34 את+ תאים מיום-1.
    1. באמצעות פיפטה של 10 מ"ל, לשטוף תאים באופן רופף חסיד בשטיפת חוזרות ונשנות, עדין של כל תרבות הבקבוק עם HBSS סטרילי. ודא כי כל התאים תנתק (אם יש צורך, ברז/סטירה הבקבוק כדי לשחרר את התאים).
    2. Centrifuge התאים ב x 800 גרם במשך 5 דקות, וארוקן את תגובת שיקוע ולאחר resuspend את התאים בתקשורת התמרה חושית כדי ריכוז עונה 1 פרק 106 תאים/מ ל.... לאחר שנאסף כל התאים, לקבוע את הרוזן תא, באמצעות hemocytometer או מונה תא אוטומטית.
    3. להוסיף 1 מ"ל של התא השעיה (1 x 106 תאים) באר אחת של צלחת 12-ובכן CH-296-מצופה (עבור המדגם שליטה מוק-transduced). לחלק שאר התאים בין המבחנות T-75 (שלב 3.2.2), הוספת כ 10 מ ל (1 x 107 תאים) לכל את הבקבוק. לאפשר את התאים לדבוק הציפוי CH-296 מאת המקננת ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 למשך 30 דקות, עם פרקו את הפקקים.
    4. הפשרת ממוזגים-וירוס מדיה (VCM, טבלה של חומרים) ולקבוע את כייל ביחידות זיהומיות לכל מיליליטר (IU/mL)28,29,30,31,32 . להוסיף נפח מתאים של VCM כל הבקבוק T-75 מהשלב 3.3.3, דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.
      הערה: אם מבצע של התמרה חושית יחיד, דגירה בין לילה; אם ביצוע של התמרה חושית כפולה, חזור על זה stepapproximately 6 - 8 h לאחר התמרה חושית הראשונה ללא החלמה/שטיפת תלת פאזי ו, אז, דגירה בין לילה. לדוגמה, עבור בקבוק אחד (1 x 107 תאים) עם ריבוי הרצוי של זיהום (MOI) של 10, להוסיף 1 מ"ל של וירוס titered בכל עונה 1 פרק 10-8 IU/mL.

4. תא הקציר והכנה אינפוזיה (יום 1)

  1. לקצור את התאים.
    1. איסוף תאים transduced ו מעושה כמתואר בצעדים 3.3.1 - 3.3.2. ביצוע שוטף רציפים עם 10 מ"ל של HBSS, העברת שוטף את הצינור חרוט עם התאים. ודא כי כל התאים הוסרה מן המבחנות, הקשה/סטירות המבחנות במידת הצורך.
    2. Centrifuge את המתלים תא ב x 800 גרם במשך 5 דקות, וארוקן את תגובת שיקוע ולאחר resuspend בגדר ב 1 מ"ל של HBSS. לשלב את הצינורות המכילים תאים באותו המצב. לשטוף כל אחד עם 10 מ"ל של HBSS ולהוסיף את התליה תא. לקבוע את ספירת תאים באמצעות hemocytometer. להביא נפח התאים הכולל 50 מ ב- HBSS וצנטריפוגה ב x 800 גרם במשך 5 דקות.
  2. דופק פרוסטגלנדין E2 (PGE2) ולהכין ריאגנטים עבור המוצר אינפוזיה.
    1. וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend תאי transduced (לא תלעג) כדי 5 x 106/mL HSPC מדיה ללא ציטוקינים. להוסיף 10 מ מ PGE2 ריכוז סופי של 10 מיקרומטר. דגירה התאים על הקרח כבר שעתיים, בעדינות מתערבל אותם בכל 30 דקות.
    2. במהלך שלב 4.2.1, חום-בטל סרום עצמיים (טבלה של חומרים), גלישת המכולה בנייר שעווה ו המקננת זה ב 56 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות להכין סרום עצמיים 2% בתמהיל (500 µL של נסיוב להשבית חום + 24.5 מ של HBSS), HBSS אותם היטב, ו לאחסן את התערובת על הקרח עד השימוש. בנוסף, במהלך שלב 4.2.1, לקצור מוק-transduced תאים בצלחת 12-ובכן מאת pipetting התאים למעלה ולמטה נמרצות. להוסיף התליה תא צינור חרוטי 15 מ"ל, לשטוף אותם 3 x 1 מ של HBSS, ולהוסיף שוטף את הצינור חרוט באותה 15 מ"ל.
    3. לאחר שעתיים של PGE2 דגירה, לשטוף את התאים 2 x על ידי צריך שתוציאו אותם ב x 800 גרם במשך 5 דקות ומחיקת את תגובת שיקוע. לאחר השטיפה השנייה resuspend תאי אחסון מסוג המתאים של HBSS עבור ספירה, באמצעות hemocytometer או מונה הניתן תא אוטומטית.
      הערה: תאים נדבקות לעתים קרובות לאחר דופק PGE2, אשר יכול להפוך עבור ספירת פחות אמין. אם כן, השתמש. ספירת מהשלב 4.1.2 במקום האחד מהשלב 4.2.3.
  3. שמורת מעושה ותאי transduced לבקרת איכות (שלב 5) של המוצר אינפוזיה: 5 x 105 עונה 1 פרק 106 תאים עבור לזרום cytometry תא מיון (שלבים 5.1 ו- 5.3) של 1 x 106 תאים לתרבות נוזלי (שלב 5.2), המושבה תגובת שרשרת פולימראזית (PCR) (שלב 5.4).
  4. להכין את המוצר אינפוזיה.
    1. עם שאר התאים transduced, לבצע שטיפה השלישי ב- 50 מ של HBSS, וארוקן את תגובת שיקוע ולאחר resuspend התאים 10 מ"ל של HBSS + 2% סרום עצמיים (להכין בשלב 4.2.2). לצייר את הפתרון 10 מ"ל לתוך מזרק 20 מ ל מצויד עם מחט 16.5 גר'. לשטוף את הצינור עם 10 מ"ל של HBSS + 2% אוטומטי סרום וצייר לשטוף את תוך המזרק אותו להביא את הנפח הכולל 20 מ. קאפ המזרק בפקק מחט, לתייג את המזרק, ומניחים אותו על קרח על תחבורה/אינפוזיה.
    2. להשרות את המוצר תא transduced לתוך המחשב המארח עצמיים, ממוקם בתוך מתקן מחקר בבעלי חיים מוסמכים, דרך 33,מרכזי34. לפקח על החיות המושתלים מלאה תא ספירת דם (שלבי), בדיקות דם, הביוכימיה ולבצע מחקר ספציפי ג'ין-סימון מבחני למידותיו של פרויקט1,6,19.

5. בקרת איכות

הערה: Flow cytometry, מיון תא מבוצעות לאחר התאים מעורבבים לתוך החיות כחלק ההמשך שמתואר בשלב 4.4.2. זרימת הנתונים משמשים מיד לאחר השתלת כדי לקבוע את ההרכב של phenotypically מוגדרת קבוצות משנה של תא גזע, קדמון במוצר אינפוזיה (שלבים 5.1 ו- 5.3), בעוד הניתוח של מבחני CFC מתבצע בימים 12-14 cytometric postinfusion כדי לקבוע את היעילות שינוי ג'ין על ידי המושבה PCR (שלב 5.4).

  1. לבצע cytometry זרימה ומיון CFC של המוצר אינפוזיה.
    1. לנתח את התאים ידי cytometry זרימה ולטהר מיון-CD34 קבוצות משנה עבור מבחני CFC, כמתואר בסעיף 2. מבחני CFC זרע של תאי CD34 מדומה ו- transduced (המוצר אינפוזיה אחרי הדופק PGE2).
    2. מיון מספר מרבי של 800 תאים לכל מצב, מערבולת, צלחת, תרבות, ולספור מבחני CFC כפי שמתואר בשלב 2.4. לאחר ספירת, לבחור את המושבות של מבחני CFC לבצע המושבה PCR כפי שמתואר בשלב 5.4.
  2. תרבית נוזלית
    1. צלחת תאים לתרבות נוזלי בתקשורת HSPC-עונה 1 פרק 10 /mL6בצלחות שאינם TC-מטופלים. ימים 2, 5 ו- 12 posttransduction, הקציר, לספור את התאים עבור cytometry זרימה. תא מיון עבור מבחני CFC אינה נדרשת.
    2. בימים 2 ו-5, replate 33% של התאים בתקשורת HSPC טריים-עונה 1 פרק 106/mL. להקפיא 33% של התאים במאגר מיצוי DNA עבור ה-PCR כמותי בזמן אמת. השתמש 33% של התאים עבור cytometry זרימה כפי שתואר בשלבים 2.1 ו- 2.2.
    3. השתמש נתונים אלה מהשלב 5.2.2 כדי לנתח את הרכב פנוטיפי צאצאי hematopoietic. לקבוע את התדירות של תאי CD34 + ואת קבוצות משנה מוגדרים phenotypically כפי שמתואר בשלב 2.2.2 בתוך כל דגימה. להשוות את ההרכב של CD34+ תאים בין תנאי כדי לקבוע את ההשפעה של שינוי ג'ין.
      הערה: CD34+ תאים צריך לשמור על הביטוי שלהם לאורך כל התרבות כולה ומכילים כל קבוצות משנה פנוטיפי. הפסד של CD90+CD45RA– התאים או על overrepresentation של קבוצות משנה פנוטיפיות שהיו קיימות בעבר יכול להצביע על תופעות עקיף או ישיר של שינוי ג'ין.
  3. לכמת ביטוי transgene (למשל., ירוק חלבון פלואורסצנטי [GFP]) על ידי cytometry זרימה (אופציונלי, בהתאם את הגדרת הניסוי), התאמת הפרוטוקול משלב 2.2.
    1. להוסיף שלושה מגרשים זרימה מציג האס/transgene (למשל, האס/GFP). שער העלילה הראשונה על HSCs, השני על מגה-מנות בשנייה-פעימה, והשלישי על מגרש LMPs. כל נגד transgene (למשל, GFP) וליצור השערים בשם מועדון הכדורגל מונפלייה-GFP+MPP-EMP-GFP+, LMP-GFP+, בהתאמה.
    2. כשהפעולה תסתיים, האוכלוסייה הירארכיה חייב להכיל 9 ערכים מאורגנים באופן היררכי לפי הסדר הבא: 1) כל האירועים; 2) פיזור; 3) CD34+; 4) HSC; 5) מועדון הכדורגל מונפלייה-GFP+; 6) MPP-EMP; 7) MPP-EMP-GFP+; 8) LMP; 9) LMP-GFP+.
      הערה: כל ביטוי transgene מאוחר יותר בתרבות נוזלי (למשל, בימים 5 ו- 12) כדאי ישקפו את היעילות שינוי גנטי נקבע על ידי המושבה PCR בשלב 5.4. נקודות זמן קודמות בתרבות נוזלי עשוי מגזים הביטוי transgene, בשל אותו משולבות. באופן דומה, מיון זרימה GFP+ תאים עבור מבחני CFC ביום 1 תגרום במושבות רבות חיובי כוזב.
  4. לבצע המושבה ה-PCR.
    1. לאחר ספירת בשלבים 2.4.4 ו 5.1.1, לבחור אחת המושבות לתוך µL 50 מאגר הפקת דנ א, באמצעות µL של 10 או 20 µL פיפטה, פיפטה למעלה ולמטה כדי להעביר את המושבות שפופרת אחת של 8-PCR רצועת הצינורית. לקחת את המושבות שמונה לפי מצב מדומה מושבות 88 לפי מצב transduced כדי ליצור לוח מלא 96-ובכן אחד. להוסיף 50 µL מאגר מיצוי DNA מכל קידוח.
    2. לחלץ הדנ א של המושבות, תוך שימוש thermocycler של התוכנית הבאה: 65 מעלות צלזיוס/20 דקות, 99 ° C/10min ו 4 ° C החזק. מתכנן להעביר את ה-DNA ל-20 ° C בהקדם לקבלת איכות מיטבית.
    3. לבצע המושבה PCR לכמת תאים LV-transduced, השוואת מספר מושבות LV+ , באמצעות Lenti F/R תחל למושבות הכולל, באמצעות תחל אקטין F/R ושליטה (טבלה של חומרים).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הפרוטוקול המתואר לעיל נועד לבודד ולשנות ג'ין-NHP CD34+ HSPCs, אשר לאחר מכן להיות חדורים בחזרה לתוך המחשב המארח עצמיים (איור 1 ואיור 2). כאשר בעקבות פרוטוקול זה, אנו בדרך כלל להשיג עד 8 x 109 WBCs הכולל של מוניטור להתקפת מ שהצטיירה קופי מקוק, לפעמים, תכפיל את הסכום של קופי מקוק רזוס. בשני המינים, מספר CD34+ HSPCs אנחנו המעשירים הוא יחסי הקלט של הספירה הכוללת WBC (איור 3). ממצאים קודמים ידגים את השיטה CD34 הכולל+ HSPC מוצר כולל התאים שאינם אמת, לטווח ארוך engrafting HSCs. לפיכך, אנו פיתחו טכניקות המבוססות על זרימת-cytometry (איור 4), להשתמש CFC מבחני (דמויות 5-6) זהה HSCs לטווח ארוך ואת קבוצות משנה קדמון מחויבת בתרבויות. בניגוד HSCs נכון, יישמר אבות מחויבת לפרק זמן קצר יחסית ויוו. לבסוף, התוצאות אסטרטגיה שינוי בתיווך LV גן בגן חזקים סימון תרבותי CD34+ HSPCs. תאים אלה מנוטרים מעל עד 2 שבועות בתרבות, בין השאר כדי להפחית את מספר התאים "חיובי כוזב" המבטאים GFP מווקטורים LV nonintegrated. כי תאים אלה אינם נושאים עותק stably משולב של וקטור LV הגנום הסלולר, הם לדלל את מעל וזמינותו תרבית נוזלית 12 הימים (איור 7).

Figure 1
איור 1: ייצור של מוצר NHP HSPC עצמיים, ג'ין-השתנה. הפרוטוקול מבודד CD34+ HSPCs (יום-1), ג'ין-שינוי של תאים אלה (יום 0), ומכין מוצר אינפוזיה (יום א') במהלך זמן 48 שעות. היווצרות המושבה, תרבות נוזלי, וכל מה שקשור שמחוץ מבחני המשך נוספים עבור 2 שבועות, על מנת לאפיין מוצרים אלה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: השתלשלות האירועים. הזמן הממוצע לביצוע כל שלב בודדים של הפרוטוקול, על פני כ- 2 ימים. העיתוי של צעדים בודדים משתנה בהתאם מקור תאי הגזע (שלב 1 של הפרוטוקול) ו/או הסוג של שינוי ג'ין (שלב 3 לפרוטוקול). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: תא דם לבן, CD34 תשואות מ להתקפת שהצטיירה ו רזוס מקוק מח עצם. מועשר CD34+ HSPC נחשב (שלב 1.4 של הפרוטוקול) כפונקציה של סך לבן תא ספירת דם (שלב 1.3.3 לפרוטוקול) מ 10 שהצטיירה קופי מקוק (ריבועים) ו 6 קופי מקוק רזוס (משולשים). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: Gating אסטרטגיה לבקרת איכות של מוצרים מועשרים CD34, ג'ין-השתנה. סה כ תאי דם לבנים ("העשרה מראש"), לאחר מכן HSPCs מועשר CD34 מוכתמים נוגדנים ספציפיים עבור CD34, CD45, CD90 CD45RA, על מנת לכמת את המספר של מועדון הכדורגל מונפלייה - MPP-, EMP-, מועשרת LMP CD34 קבוצות משנה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: מורפולוגיה של CD34+ תאים לפני ואחרי שינוי ג'ין. טופ לוחות: שלוש תמונות brightfield הנציגה של מבחני המושבה HSPC. בתחתית לוחות: זריחה GFP המתאים לכל תמונה brightfield לעיל. סרגל קנה מידה = 1 מ מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6: המושבה יוצרי פוטנציאל התא (CFC) של CD34+ תאים, מטוהרים-מיון קבוצות משנה. בעקבות הטיהור מיון עבור CFC מבחני של קבוצות משנה HSPC ביום-1 (סעיפים 1 ו- 2 לפרוטוקול), יום 1 (סעיף 5 לפרוטוקול), אחת המושבות הם הבקיע מבוסס על מאפיינים מורפולוגיים. CFU-מיקס = שילוב של תאים מיאלואידים (לבן), תאים erythroid (אדום); BFU-E = רק erythroid תאים; CFU-G = גרנולוציטים; CFU-GM = גרנולוציטים ומונוציטים מקרופאגים /; CFU-M = מקרופאגים/ומונוציטים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 7
איור 7: נציג זרימת הנתונים cytometric מתאי מהונדס גנטי בתרבות נוזלי. אחוז CD34+ HSPCs בעקבות התמרה חושית עם LV GFP-להביע וקטור. תאים מתורבתים עד 2 שבועות בעקבות התמרה חושית. ירידה ברמת ה-GFP+ אירועים לאורך זמן משקף אובדן אות GFP מתאי נושא וקטורים LV nonintegrated. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

שם תוכן
מאגר היילוד 150 מ מ אמוניום כלוריד, 12 מ מ סודיום ביקרבונט, 0.1 מ מ EDTA במים מזוקק פעמיים (ddH2O)
מאגר מסחרי באגירה פוספט תמיסת מלח (1 X) pH 7.2, BSA 0.5%, EDTA 2 מ מ
מאגר FACS באגירה פוספט תמיסת מלח (1 X) pH 7.2, 2% עוברית סרום שור
HBSS + 2% BSA של האנק מאוזנת תמיסת מלח, 2% אלבומין שור
HSPC מדיה StemSpan SFEM II, 1% פניצילין/סטרפטומיצין, 100 ננוגרם למ"ל כל רקומביננטי FLT TPO, SCF, אנושי-3...
התמרה חושית מדיה StemSpan SFEM II, 1% פניצילין/סטרפטומיצין, 100 ננוגרם למ"ל כל רקומביננטי האנושי TPO, SCF, FLT-3, 1 µg/mL Cyclosporine, 4 ug/mL סולפט? מה לעזאזל קרה

טבלה 1: מאגר מדיה, ניסוחים.

מזהה PE PECF594 APC-Cy7 V450 תיאור
1 CD90 פיצוי חרוזים
2 CD34 פיצוי חרוזים
3 CD45RA פיצוי חרוזים
4 CD45 פיצוי חרוזים
5 WBCs מוכתם לפני CD34-העשרה
6 CD90 CD34 CD45RA CD45 ויטראז'ים WBCs לפני CD34-העשרה
7 WBCs וללא רבב של זרימה דרך (רגל)
8 CD90 CD34 CD45RA CD45 WBCs מוכתם של זרימה דרך (רגל)
9 המוצרים מועשרים WBCs של CD34 וללא רבב
10 CD90 CD34 CD45RA CD45 המוצר מועשרת WBCs של CD34 מוכתם

טבלה 2: זרימה נציג בלוח בקרת האיכות של מוצרים תא מועשרת CD34 ו ג'ין-השתנה.

אנטיגן שיבוט Fluorochrome לייזר מסנן
CD45 D058-1284 V450 395 nm 450/40 ננומטר
CD90 5.00E + 10 PE 488 ננומטר או 532 nm 585/42 nm
CD34 563 PE-CF594 488 ננומטר או 532 nm 610/20 ננומטר
CD45RA 5 שעות 9 APC-Cy7 633 ננומטר 780/60 ננומטר
V450: ויולט 450 ננומטר; PE: Phycoerythrin; PE -CF594: שם מסחרי של Biotium; APC: Allophycocyanin-cyanine 7

טבלה 3: מכתים נוגדן לוח עבור בקרת איכות על-ידי cytometry זרימה ומיון התא.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

LV וקטור הנדסה היא השיטה הכי מאופיין ג'ין-לשנות סוגי תאים כגון CD34+ HSPCs, כבר אין ויוו עוקבות. הפרוטוקול המתואר כאן מיועד על מנת למקסם את מספר גנים-לאחרונה HSPCs זה נמשכות לטווח ארוך ויוו, לספק יתרונות קליניים בחולים עם מחלות ממאירות, זיהומיות, גנטי שונות. למרות אסטרטגיות לעריכת ג'ין הופיעו בעשור האחרון, LV-השתנה תאים הם הטובים ביותר למד במבחנה, במודלים של בעלי חיים, מטופלים1,8,20,21,22.

על סמך ניסיוננו עם פרוטוקול זה, העשרת של CD34 טהור+ HSPCs (קרי, > 80% CD34+ תאי המוצר הסלולרי ממויינת) היא היבט חשוב של הצלחה. כי תאים אלה נגזרים מתוך אוכלוסייה מעורבת של WBCs מוניטור הכולל, תרבויות נמוך-טוהר עשויים לכלול תאים לא engraft לטווח ארוך, בתורו הורדת המינון של תאי גזע נכון כי הם שאנרגית המארח עצמיים. בנוסף, באיכות גבוהה LV VCM יבטיח את היעילות הגבוהה ביותר של שינוי ג'ין.

אל כתובת חסרונות בטוהר CD34 מועשר+ HSPC המוצרים, לעיתים זה שימושי לאמת את האיכות של ריאגנטים נהגו לבודד תאים אלה, כלומר אנטי-CD34 הנוגדן (אשר הקבוצה שלנו מטהרת בארגון משורת תאים ליפידים), ו beads מגנטי אשר מאגד התווית על-ידי הנוגדן התאים. אנו ממליצים על MOI של 10, עם אפשרות לחזור על זה התמרה חושית (MOI 10 x 2). חשוב, למשרד הפנים צריך להיקבע מדעית, בעקבות הערכה איכות של VCM, כולל טיטרציה של כל וקטור בשורה תא titering מתוקנן כגון HT108029. חשוב, מעבדות לייצור VCM שונות עשויים להשתמש שורות תאים נפרדים titering, כולל זונות30, הלה31293T32, אשר עשוי להגביל את היכולת להשוות בין titers בין מתקנים. אנו מעדיפים retiter וקטור עם וזמינותו, כדי לחשב את הכמות המדויקת ביותר של VCM לשינוי ביעילות ג'ין-CD34+ HSPC היעד תאים. פעם אחת באיכות גבוהה CD34+ HSPCs ו- VCM הושגו, התמרה חושית ויעילות engraftment עוד יותר משופר בשלושה צעדים ברורים. ראשית, התוספת של cyclosporine התמרה חושית לאיידס מדיה בשלבים המוקדמים של וקטור התמרה חושית ואינטגרציה לתוך היעד תאים35,36, בזמן? מה לעזאזל קרה סולפט מקטין דוחה כוחות בין הווקטור lentiviral חלקיקים לבין התא על פני השטח33,37. שנית, בטיפול צלחות עם fibronectin רקומביננטי שבר (למשל, RetroNectin, CH-296) מגדילה את היעילות התמרה חושית וגם משפר את הפוטנציאל engraftment ויוו של ג'ין-השתנה HSPCs 33,38, 39. ראוי לציין, מחקרים קודמים מצביעים כי CH-296 הוא רק חשוב במהלך, אבל לא לפני, התמרה חושית33,38. בסופו של דבר, אנחנו. דופק תא שעבר שינוי גנטי מוצרים עם PGE2 כדי לשפר את engraftment והתמדה ויוו, כפי שהוצג בעבר עבור הפרימטים במוסר ואנושי CD34+ HSPC המוצרים40,41.

הזינו אותו משלב באופן אקראי לתוך הגנום, כמו קודמו שלהם, gammaretroviral את המומנט (RVs). למרות נתונים ניסוי קליני פחות זמין עבור אותו מאשר עבור RVs, ממצאים הנוכחי מראים כי גישות LV לבצע נמוכות משמעותית סיכונים של המרות תא בשל מוטגנזה מכוונת insertional של LV; אסטרטגיות קרוואנים המשמשים לעתים רחוקות יותר בשל הסיכון הזה42. מגבלה נוספת היא כי היעילות של שינוי ג'ין הוא פחות מ- 100%, שיעור של תאים מהונדס גנטי לא יישמר ויוו. לדוגמה, מוצר 60% מהונדס גנטי HSPC עלול לגרום 30% engrafting לטווח ארוך, תאים שעבר שינוי גנטי. במידת האפשר, אסטרטגיות טיפול גנטי המובאת כאן נועדו להתגבר על מגבלה זו על ידי החדרת transgenes לספק יעילות טיפולית, אפילו כשאני לידי מיעוט של תאים hematopoietic-מקור8,43 .

העתיד הוא בהיר עבור HSPC מבוססי LV שינוי גישות. אנחנו באופן שגרתי להשתמש בפרוטוקול זה לתאים "ג'ין-סימן", המאפשרים מעקב אחר ויוו1. לשכיחה לנו אסטרטגיה זו כדי להשוות בין גרסאות LV בתוך אותה חיה. כזה השתלות "תחרותי" לאפשר השוואה של וקטורים שונים (למשל, כדי לזהות את אלה עם יעילות יותר) ו transgenes (למשל, לעקוב אחר קבוצות משנה HSPC שונים או להשוות אותם במודלים של המחלה). . להתקדם, אנו מאמינים כי טיפול גנטי LV ב HSPCs יישאר כלי חיוני לצד גישות לעריכת ג'ין, בעיקר במצבים איפה מטענים גנטיים גדול חייב stably להביע למשך כל החיים של הפרט.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

המחברים מודים הלן קרופורד על הכנת את כתב היד, ג'ים Woolace לעיצוב גרפי, ואת ורוניקה נלסון Devikha Chandrasekaran עבור השתתפות בפיתוח של הפרוטוקול. הפיתוח של פרוטוקול זה נתמך על ידי מענקים של NIH המכון הלאומי לאלרגיה, מחלות זיהומיות (R01 AI135953 ו- AI138329 כדי H.P.K.) הלאומי ללב, ריאות, ואת מכון דם (R01 HL136135, HL116217, P01 HL122173 ו U19 HL129902 אל H.P.K.), כמו גם NIH P51 OD010425, בחלקו דרך מרכז הסרטן NIH/NCI, תמיכה גרנט P30 CA015704. H.P.K. הוא חוקר רפואה מולקולרית מרקי קיבל תמיכה כנמען ההשבעה של חוסה קאררס/דגלס Donnall תומאס ניחן הכיסא לחקר הסרטן, הכיסא ניחן פרד. האץ ' תא, ריפוי גנטי.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Stemspam SFEM II ("HSPC") Media StemCell 09655
Hank's Balanced Salt Solution Gibco 14175095
Phosphate-Buffered Saline Gibco 14190-144
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140-122
Dimethyl Sulfoxide Sigma Aldrich D2650-100
100% Ethanol Decon labs M18027161M
Cyclosporine Sigma 30024-25MG
500 mM EDTA Invitrogen 15575-038
Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum Sigma Aldrich PS-0500-A
CH-296/ RetroNectin (2.5 mL, 1 µg/µL) TaKaRA T100B
Bovine Serum Albumin Sigma A7906-100g
HEPES Sigma H9897
Rat anti-mouse IgM magnetic beads Miltenyi Biotec 130-047-301
Recombinant HumanStem Cell Factor (SCF) Peprotech 300-07
Recombinant Human Thrombopoietin (TPO) Peprotech 300-18
Recombinant Human FMS-like tyrosine kinase 3 (FLT-3) Peprotech 300-19
Protamine sulfate Sigma P-4505
14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube Corning 352059
Colony Gel 1402 ReachBio 1402
QuadroMACS Separators Miltenyi Biotec 130-090-976
MACS L25 Columns Miltenyi biotec 130-042-401
10 mM PGE2 Cayman Chemical 14753-5mg
TC-treated T-75 flasks Bioexpress T-3001-2
Non-TC-treated T-75 flasks Thermo-Fisher 13680-57
20 mL syringes BD Biosciences 302830
16.5 G needles BD Precision 305198
Syringe Tip Cap BD Biosciences 305819
QuickExtract DNA Solution Epicentre QE09050
8-tube strip cap PCR Tubes USA scientific 1402-2708
96-well Thermocycler Thermo-Fisher 4375786
Pre-Separation filters Miltenyi Biotec 130-041-407
Strainer, Cell; BD Falcon; Sterile; Nylon mesh; Mesh size: 70um; Color: white; 50/CS fisher scientific 352350
Ultracomp ebeads eBioscience 01-2222-42
MACSmix Tube Rotator Miltenyi 130-090-753
3 mL Luer-Lock Syringes Thermo-Fisher 14823435
35 mm x 10 mm cell culture dish Corning 430165
60 mm x 15 mm cell culture dish Corning 430196
150 mm x 25 mm cell culture dish Corning 430599
Non TC treated flasks Falcon 353133
Qiagen DNA extraction Qiagen 51104
PE Anti-Human CD90 (Thy1) Clone:5E10 Biolegend 328110
PE-CF594 Mouse Anti-Human CD34 Clone:563 BD horizon 562449
APC-H7 Mouse Anti-Human CD45RA Clone: 5H9 BD Pharmingen 561212
V450 Mouse Anti-NHP CD45 Clone:d058-1283 BD Biosciences 561291
Autologous Serum Collected from autologous host and cryopreserved prior to mobilization and collection of CD34+ HSPCs N/A Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).
Virus-Conditioned Media (VCM) Kiem Lab, FHCRC Co-operative Center for Excellence in Hematology (CCEH) N/A Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).
Anti-CD34 antibody, Clone 12.8 Kiem Lab N/A Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).
Lenti F primer: AGAGATGGGTGCGAGAGCGTCA Integrated DNA Technologies N/A Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).
Lenti R primer: TGCCTTGGTGGGTGCTACTCCTAA Integrated DNA Technologies N/A Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).
Actin F primer: TCCTGTGGCACTCACGAAACT Integrated DNA Technologies N/A Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).
Actin R primer: GAAGCATTTGCGGTGGACGAT Integrated DNA Technologies N/A Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Radtke, S., et al. A distinct hematopoietic stem cell population for rapid multilineage engraftment in nonhuman primates. Science Translational Medicine. 9 (414), eaan1145 (2017).
  2. Majeti, R., Park, C. Y., Weissman, I. L. Identification of a hierarchy of multipotent hematopoietic progenitors in human cord blood. Cell Stem Cell. 1 (6), 635-645 (2007).
  3. Notta, F., et al. Isolation of single human hematopoietic stem cells capable of long-term multilineage engraftment. Science. 333 (6039), 218-221 (2011).
  4. Hoggatt, J., et al. Rapid mobilization reveals a highly engraftable hematopoietic stem cell. Cell. 172 (1-2), 191-204 (2018).
  5. Chandrasekaran, D., Nakamoto, B., Watts, K. L., Kiem, H. P., Papayannopoulou, T. Modeling promising nonmyeloablative conditioning regimens in nonhuman primates. Human Gene Therapy. 25 (12), 1013-1022 (2014).
  6. Humbert, O., Peterson, C. W., Norgaard, Z. K., Radtke, S., Kiem, H. P. A nonhuman primate transplantation model to evaluate hematopoietic stem cell gene editing strategies for beta-hemoglobinopathies. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 8, 75-86 (2018).
  7. Peterson, C. W., et al. Differential impact of transplantation on peripheral and tissue-associated viral reservoirs: Implications for HIV gene therapy. PLoS Pathogens. 14 (4), e1006956-e1006956 (2018).
  8. Zhen, A., et al. Long-term persistence and function of hematopoietic stem cell-derived chimeric antigen receptor T cells in a nonhuman primate model of HIV/AIDS. PLoS Pathogens. 13 (12), e1006753 (2017).
  9. Moffett, H. F., et al. Hit-and-run programming of therapeutic cytoreagents using mRNA nanocarriers. Nature Communications. 8 (1), 389 (2017).
  10. Burtner, C. R., et al. Intravenous injection of a foamy virus vector to correct canine SCID-X1. Blood. 123 (23), 3578-3584 (2014).
  11. Evans, D. T., Silvestri, G. Nonhuman primate models in AIDS research. Current Opinion in HIV and AIDS. 8 (4), 255-261 (2013).
  12. Taraseviciute, A., et al. Chimeric antigen receptor T cell-mediated neurotoxicity in nonhuman primates. Cancer Discovery. 8 (6), 750-763 (2018).
  13. McGary, C. S., et al. CTLA-4(+)PD-1(-) memory CD4(+) T cells critically contribute to viral persistence in antiretroviral therapy-suppressed, SIV-infected rhesus macaques. Immunity. 47 (4), 776-788 (2017).
  14. Beard, B. C., Adair, J. E., Trobridge, G. D., Kiem, H. P. High-throughput genomic mapping of vector integration sites in gene therapy studies. Methods in Molecular Biology. 1185, 321-344 (2014).
  15. Zonari, E., et al. Efficient ex vivo engineering and expansion of highly purified human hematopoietic stem and progenitor cell populations for gene therapy. Stem Cell Reports. 8 (4), 977-990 (2017).
  16. Doulatov, S., et al. Revised map of the human progenitor hierarchy shows the origin of macrophages and dendritic cells in early lymphoid development. Nature Immunology. 11 (7), 585-593 (2010).
  17. Fares, I., et al. Cord blood expansion. Pyrimidoindole derivatives are agonists of human hematopoietic stem cell self-renewal. Science. 345 (6203), 1509-1512 (2014).
  18. Gori, J. L., et al. Endothelial cells promote expansion of long-term engrafting marrow hematopoietic stem and progenitor cells in primates. Stem Cells Translational Medicine. 6 (3), 864-876 (2017).
  19. Peterson, C. W., et al. Long-term multilineage engraftment of autologous genome-edited hematopoietic stem cells in nonhuman primates. Blood. 127 (20), 2416-2426 (2016).
  20. Peterson, C. W., et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 3, 16007 (2016).
  21. Thompson, A. A., et al. Gene therapy in patients with transfusion-dependent beta-thalassemia. The New England Journal of Medicine. 378 (16), 1479-1493 (2018).
  22. Eichler, F., et al. Hematopoietic stem-cell gene therapy for cerebral adrenoleukodystrophy. The New England Journal of Medicine. 377 (17), 1630-1638 (2017).
  23. Paul, B., et al. Efficient enrichment of gene-modified primary T cells via CCR5-targeted integration of mutant dihydrofolate reductase. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 5 (9), 347-357 (2018).
  24. Levine, B. L., Miskin, J., Wonnacott, K. Global manufacturing of CAR T cell therapy. Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 4, 92-101 (2017).
  25. Masiuk, K. E., et al. Improving gene therapy efficiency through the enrichment of human hematopoietic stem cells. Molecular Therapy. 25 (9), 2163-2175 (2017).
  26. Trobridge, G. D., et al. Efficient transduction of pigtailed macaque hematopoietic repopulating cells with HIV-based lentiviral vectors. Blood. 111 (12), 5537-5543 (2008).
  27. Beard, B. C., et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354 (2010).
  28. Horn, P. A., et al. Efficient lentiviral gene transfer to canine repopulating cells using an overnight transduction protocol. Blood. 103 (10), 3710-3716 (2004).
  29. Adair, J. E., et al. Semi-automated closed system manufacturing of lentivirus gene-modified haematopoietic stem cells for gene therapy. Nature Communications. 7, 13173 (2016).
  30. Kutner, R. H., Zhang, X. Y., Reiser, J. Production, concentration and titration of pseudotyped HIV-1-based lentiviral vectors. Nature Protocols. 4 (4), 495-505 (2009).
  31. Salmon, P., Trono, D. Production and titration of lentiviral vectors. Current Protocols in Human Genetics. 54 (1), (2007).
  32. Geraerts, M., Willems, S., Baekelandt, V., Debyser, Z., Gijsbers, R. Comparison of lentiviral vector titration methods. BMC Biotechnology. 6, 34 (2006).
  33. Kiem, H. P., et al. Improved gene transfer into baboon marrow repopulating cells using recombinant human fibronectin fragment CH-296 in combination with interleukin-6, stem cell factor, FLT-3 ligand, and megakaryocyte growth and development factor. Blood. 92 (6), 1878-1886 (1998).
  34. Morton, W. R., Knitter, G. H., Smith, P. M., Susor, T. G., Schmitt, K. Alternatives to chronic restraint of nonhuman primates. Journal of the American Veterinary Medical Association. 191 (10), 1282-1286 (1987).
  35. Noser, J. A., et al. Cyclosporine increases human immunodeficiency virus type 1 vector transduction of primary mouse cells. Journal of Virology. 80 (15), 7769-7774 (2006).
  36. Uchida, N., Hsieh, M. M., Washington, K. N., Tisdale, J. F. Efficient transduction of human hematopoietic repopulating cells with a chimeric HIV1-based vector including SIV capsid. Experimental Hematology. 41 (9), 779-788 (2013).
  37. Cornetta, K., Anderson, W. F. Protamine sulfate as an effective alternative to polybrene in retroviral-mediated gene-transfer: implications for human gene therapy. Journal of Virological Methods. 23 (2), 187-194 (1989).
  38. Goerner, M., et al. The use of granulocyte colony-stimulating factor during retroviral transduction on fibronectin fragment CH-296 enhances gene transfer into hematopoietic repopulating cells in dogs. Blood. 94 (7), 2287-2292 (1999).
  39. Dao, M. A., Hashino, K., Kato, I., Nolta, J. A. Adhesion to fibronectin maintains regenerative capacity during ex vivo culture and transduction of human hematopoietic stem and progenitor cells. Blood. 92 (12), 4612-4621 (1998).
  40. North, T. E., et al. Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis. Nature. 447 (7147), 1007-1011 (2007).
  41. Goessling, W., et al. Prostaglandin E2 enhances human cord blood stem cell xenotransplants and shows long-term safety in preclinical nonhuman primate transplant models. Cell Stem Cell. 8 (4), 445-458 (2011).
  42. Booth, C., Gaspar, H. B., Thrasher, A. J. Treating immunodeficiency through HSC gene therapy. Trends in Molecular Medicine. 22 (4), 317-327 (2016).
  43. Humbert, O., et al. Rapid immune reconstitution of SCID-X1 canines after G-CSF/AMD3100 mobilization and in vivo gene therapy. Blood Advances. 2 (9), 987-999 (2018).

Tags

גנטיקה גיליון 144 Hematopoietic תאי גזע וקדמון ריפוי גנטי hematopoiesis דגם פרימוס במוסר לתא הבידוד וקטורים lentiviral
התאמת גנים של גזע Hematopoietic פרימוס Nonhuman, ובתאים והכנה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Radtke, S., Perez, A. M.,… More

Radtke, S., Perez, A. M., Venkataraman, R., Reddy, S., Haworth, K. G., Humbert, O., Kiem, H. P., Peterson, C. W. Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (144), e58933, doi:10.3791/58933 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter