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Genetics

तैयारी और अमानवीय रहनुमा टेम स्टेम और जनक कोशिकाओं के जीन संशोधन

Published: February 15, 2019 doi: 10.3791/58933
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,2,3, 1,2
1Stem Cell and Gene Therapy Program, Fred Hutchinson Cancer Research Center, 2Department of Medicine, University of Washington, 3Department of Pathology, University of Washington

Summary

इस प्रोटोकॉल के लक्ष्य को गैर अमानवीय रहनुमा CD34+ कोशिकाओं को अलग कर रहा है प्रधान अस्थि मज्जा से, जीन के लिए-lentiviral वैक्टर के साथ इन कोशिकाओं को संशोधित करने के लिए, और ऑटोलॉगस मेजबान में अर्क के लिए एक उत्पाद तैयार करते हैं । कुल प्रोटोकॉल लंबाई लगभग ४८ एच है ।

Abstract

टेम स्टेम और जनक सेल (HSPC) ट्रांसप्लांटेशन ल्यूकेमिया और अन्य कैंसर के लिए लगभग आधा सदी के लिए एक आधारशिला चिकित्सा किया गया है, मानव इम्यूनो वायरस (एचआईवी-1) संक्रमण के एकमात्र ज्ञात इलाज पर निर्भर करता है, और में अपार वादा दिखाता है आनुवंशिक रोगों के उपचार जैसे बीटा thalassemia । हमारे समूह के मॉडल के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित की है HSPC मानव रहनुमाओं (NHPs) में जीन थेरेपी, वैज्ञानिकों को एक ही एजेंट और तकनीक है कि क्लिनिक में लागू कर रहे है के कई अनुकूलित करने की अनुमति । यहां, हम CD34 शुद्ध करने के लिए तरीकों का वर्णन+ HSPCs और दीर्घकालिक बनी टेम स्टेम सेल (HSC) प्रधान अस्थि मज्जा (बीएम) से सबसेट । समान तकनीक अंय HSPC स्रोतों की शुद्धि के लिए नियोजित किया जा सकता है (जैसे, परिधीय रक्त स्टेम सेल [PBSCs] जुटाए) । उल्लिखित एक 2 दिन प्रोटोकॉल जिसमें कोशिकाओं को शुद्ध कर रहे हैं, संस्कृति, lentivirus (एल. वी.) के साथ संशोधित, और ऑटोलॉगस मेजबान में वापस अर्क के लिए तैयार । सफलता की कुंजी readouts CD34+ HSPC जनसंख्या की शुद्धता, शुद्ध HSPCs की क्षमता आकृति विज्ञान मीडिया में semisolid अलग कालोनियों फार्म का, और सबसे महत्वपूर्ण बात, जीन संशोधन दक्षता शामिल हैं । HSPC जीन थेरेपी के लिए महत्वपूर्ण लाभ के लिए लंबे समय तक रहने वाले कोशिकाओं है कि सभी टेम कोशिका प्रकार को जंम दे के एक स्रोत प्रदान करने की क्षमता है । जैसे, इन तरीकों को कैंसर, आनुवंशिक रोगों, और संक्रामक रोगों के लिए मॉडल चिकित्सा के लिए इस्तेमाल किया गया है । प्रत्येक मामले में, चिकित्सकीय प्रभावकारिता लाल रक्त कोशिकाओं, टी कोशिकाओं, बी कोशिकाओं, और/या माइलॉयड सबसेट सहित विशिष्ट HSPC संतान के समारोह को बढ़ाने के द्वारा स्थापित किया गया है । HSPC उत्पादों को अलग करने, संशोधित करने और तैयार करने के तरीकों को मानव रोगियों में कई रोगों के लिए सीधे लागू और अनुवाद योग्य हैं ।

Introduction

स्टेम सेल जीन थेरेपी मानव विकृतियों की एक विस्तृत श्रृंखला का पता करने के लिए एक शक्तिशाली साधन है । HSPC जीन थेरेपी एक विशेष रूप से आकर्षक दृष्टिकोण है, मैं के कारण) रोगियों से इन कोशिकाओं को इकट्ठा करने के सापेक्ष आसानी, द्वितीय) ज्ञान है कि सेल सतह phenotypes और पूर्व vivo संस्कृति मानकों के बारे में उपलब्ध है धन, और, के रूप में क्षेत्र का विस्तार, क्योंकि iii) यह जीन संशोधन ब्याज के विभिंन रोगों के अनुरूप रणनीतियों के एक कभी बढ़ती toolbox के साथ वैज्ञानिकों को प्रस्तुत करता है । हम सक्रिय रूप से कई कोणों से HSPC जीन थेरेपी के दृष्टिकोण की जांच कर रहे हैं, HSPC जीवविज्ञान के बुनियादी विज्ञान सहित, engraftment में जीन संशोधित HSPCs के नैदानिक में vivo मॉडल, और प्रासंगिक रोगी आबादी के लिए आवेदन । हम और दूसरों को कार्यात्मक विशिष्ट HSPC के सेल सतह phenotype विशेषता है1,2,3, संघटन और कंडीशनिंग परहेजों है कि HSPC उपज और engraftment को अधिकतम जबकि ंयूनतम विषाक्तता4,5, और जीन संशोधन और जीन संपादन रणनीति है कि घातक, आनुवंशिक, और संक्रामक रोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए सिलवाया गया है6,7,8, 9,10. जीन-संशोधित HSPCs के फंक्शन और engraftment में चूहों, कुत्तों, और NHPs सहित छोटे-और बड़े जानवरों के मॉडलों की संख्या का मूल्यांकन किया जा सकता है । विशेष रूप से, NHP मॉडल लाभप्रद हैं क्योंकि कई रिएजेंट, उदाहरण के लिए, CD34 और CD90 जैसे HSPC सेल सतह प्रोटीन के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी, मानव और interchangeably कोशिकाओं में NHP इस्तेमाल किया जा सकता है । इसके अलावा, चूहों के विपरीत, इस तरह के NHPs के रूप में बड़े जानवरों नैदानिक प्रभावकारिता के लिए आवश्यक जीन संशोधन के पैमाने के एक करीब सन्निकटन की अनुमति. अंत में, NHPs ऐसे एचआईवी के रूप में मानव विकृतियों की मॉडलिंग के लिए सोने के मानक हैं-1 संक्रमण11 और उंमीदवार विरोधी और विरोधी के लिए एक उभरते मॉडल प्रणाली-एचआईवी immunotherapies12,13हैं ।

इस प्रोटोकॉल के प्रयोजन के लिए शुद्ध, आनुवंशिक रूप से संशोधित करने, और NHP HSPC अर्क उत्पादों की तैयारी के लिए तरीकों की रूपरेखा है । हालांकि इस प्रोटोकॉल के दायरे के बाहर, हम पहले से पता चला है कि इन उत्पादों ऑटोलॉगस NHP मेजबान में engraft, सभी टेम वंश को जंम दे, और रोग मॉडल1की एक व्यापक रेंज में चिकित्सीय प्रभावकारिता प्रदान करते हैं । हम भी engrafting HSPCs के clonality की विशेषता है और कैनेटीक्स, तस्करी, और व्यक्तिगत phenotype और उनकी संतान के HSPCs, ऑटोलॉगस प्रत्यारोपण1,14के बाद ट्रैक करने के लिए एक मंच का निर्माण किया । यहां प्रस्तुत तरीकों को निंनलिखित लक्ष्यों के साथ विकसित किया गया है: i) उच्च शुद्ध HSPCs और दीर्घकालिक engrafting HSC उपसमुच्चय, द्वितीय) को अलग करने के लिए पूर्व vivo संस्कृति के दौरान आदिम HSCs बनाए रखने के लिए, और iii) कुशलतापूर्वक जीन-संशोधित या तो थोक HSPCs या दीर्घकालिक engrafting HSC उपसमुच्चय । हम काम चुंबकीय सहायता सेल-छंटाई (एमएसीएस), साथ ही साथ प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल छँटाई (FACS), phenotypically को अलग करने के लिए/कार्यात्मक विशिष्ट HSPC आबादी, कई समूहों के तरीकों के साथ संगत2,15, 16. संस्कृति में आदिम HSCs के रखरखाव (यानी, प्रतिबद्ध progenitors में इन कोशिकाओं के भेदभाव को कम करने कि पूरी तरह से विभेदित लसीकावत् और माइलॉयड सबसेट को जंम दे) यहां वर्णित प्रोटोकॉल का एक आवश्यक पहलू है । हालांकि हम पहले HSPCs विस्तार करने के लिए दृष्टिकोण विशेषता है, जबकि एक आदिम phenotype17,18, यहां बनाए रखने, हम एक प्रोटोकॉल है कि एक ंयूनतम के माध्यम से HSCs को बनाए रखने पर ध्यान केंद्रित का वर्णन (४८ ज) और परिभाषित पूर्व vivo संस्कृति ।

HSPCs और HSC सबसेट के कुशल संशोधन इस प्रोटोकॉल का एक केंद्रीय लक्ष्य है । कई दृष्टिकोण हम रिपोर्ट किया है के अलावा, दो अब तक सबसे नैदानिक परीक्षणों में जांच की है: एल. वी.-मध्यस्थता जीन संशोधन और nuclease-मध्यस्थता जीन संपादन1,6,19. जीन संपादन रणनीतियों nuclease प्लेटफार्मों की संख्या में से एक का उपयोग विशेष रूप से ब्याज की एक लक्षित जीन को संशोधित करने के लिए, उदाहरण के लिए, सी सी chemokine रिसेप्टर प्रकार 5 (CCR5) एचआईवी संक्रमण के उपचार के लिए7,19 या Bcl11A उपचार के लिए की hemoglobinopathies6. यहां, हम LV-मध्यस्थता जीन संशोधन, जिसमें ट्रांसजेनिक कार्गो जीनोम1,8,20में semirandomly एकीकृत पर ध्यान केंद्रित । LV दृष्टिकोण का एक महत्वपूर्ण लाभ के लिए आनुवंशिक सामग्री की बड़ी मात्रा में वितरित करने की क्षमता है (अप करने के लिए 8 या 9 kilobases) । हालांकि जीन संपादन रणनीतियों के लिए ब्याज की एक transgene लक्ष्य मुताबिक़ दाता पुनर्संयोजन (HDR) द्वारा एक निर्दिष्ट लोकस में ही एकीकृत करने के लिए विकसित किया जा रहा है, इन तरीकों और इन विट्रो में और छोटे पशु मॉडल में विकास की आवश्यकता है । इसके विपरीत, LV वैक्टर NHPs में बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है और रोगियों में21,22। महत्वपूर्ण बात, प्रोटोकॉल यहां वर्णित है, जो एक प्रारंभिक HSPC स्रोत के रूप में प्रधानमंत्री बीएम का उपयोग करता है, आसानी से और मोटे तौर पर अनुकूलित किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, PBSCs को अलग करने के लिए । जैसा कि ऊपर वर्णित है, हम NHPs और मनुष्यों के बीच आनुवंशिक समानता के उच्च डिग्री का लाभ लेने के लिए है कि दोनों प्रजातियों के लिए लागू कर रहे है रिएजेंट का उपयोग करें । अंत में, इस दृष्टिकोण को संशोधित करने के लिए अनुकूलित किया गया है अंय टेम सबसेट, अर्थात् टी कोशिकाओं12,23,24; प्रभावोत्पादक टी के आगमन-सेल immunotherapy दृष्टिकोण एक ही LV इस प्रोटोकॉल में उपयोग मंच पर भरोसा किया है । इन पद्धतियों या तो HSPC जीव विज्ञान या एल. वी. मध्यस्थता जीन संशोधन में रुचि किसी भी शोधकर्ता के लिए उपयुक्त हैं । उदाहरण के लिए, यहां प्रस्तुत HSPC शुद्धि प्रोटोकॉल के लिए उपंयास HSC-समृद्ध उपसेट, के रूप में पहले वर्णित1,15,25विशेषताएं इस्तेमाल किया जा सकता है । इसी तरह, LV transduction तरीकों यहां प्रस्तुत इसी तरह लागू किया जा सकता है और आगे कई अंय सेल प्रकार और प्रयोगात्मक प्रश्न, दोनों में इन विट्रो में और vivo मॉडल के लिए विकसित की है ।

संक्षेप में, हम वर्तमान तरीकों को अलग और आनुवंशिक रूप से NHP HSPCs संशोधित । इन तरीकों को आसानी से अंय प्रजातियों और HSPCs के अंय स्रोतों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । यह अच्छी तरह से संचालित प्रोटोकॉल कई मानव रोगों के लिए प्रभावोत्पादक चिकित्सा की मॉडलिंग में महान वादा दिखाता है ।

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Protocol

ऑटोलॉगस NHP प्रत्यारोपण, भड़काना (जुड़ाव), कोशिकाओं के संग्रह, और जीन संशोधन पहले से प्रकाशित प्रोटोकॉल26के अनुरूप आयोजित कर रहे हैं । सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं की समीक्षा की और संस्थागत पशु देखभाल और फ्रेड Hutchinson कैंसर अनुसंधान केंद्र और वाशिंगटन विश्वविद्यालय (प्रोटोकॉल #3235-01) की उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित कर रहे हैं । सभी अध्ययनों की देखभाल और स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग के लिए गाइड में सिफारिशों के साथ सख्त अनुसार किया जाता है ("गाइड"); पशुओं को बेतरतीब ढंग से पढ़ाई के लिए सौंपा गया ।

1. CD34+ HSPCs और रातोंरात संस्कृति का संवर्धन (Day-1)

  1. हार्वेस्ट बीएम और यह हालत ।
    1. granulocyte कॉलोनी के साथ NHPs जुटाने-उत्तेजक फैक्टर (GCSF) 4 दिनों के लिए पहले वर्णित के रूप में26।
    2. ketamine के १०० मिलीग्राम/किलो और dexmedetomidine के ०.०३ मिलीलीटर/किलो के साथ जानवरों को बेहोश (०.५ मिलीग्राम/एमएल स्टॉक) । आकर्षित करने के समय में एनाल्जेसिक (जैसे, Buprenorphine SR) प्रशासन ।
    3. कतरनी का प्रयोग, humerus और/या फीमर हड्डी (ओं) के समीपस्थ अंत से जानवर के बाल दाढ़ी और आयोडीन-सफ़ाई या एक समान एंटीसेप्टिक समाधान, शराब के साथ वैकल्पिक के साथ त्वचा रगड़ना, और दोहराने 3x । एक अतिरिक्त संवेदनाहारी के रूप में, bupivacaine के साथ periosteum को भ्रमित (2 साइट प्रति मिलीग्राम, 5 मिलीग्राम/
    4. periosteal प्रवेश साइट (दिमाग़ी गुहा) पर अस्थि मज्जा आकांक्षा सुई (16 ग्राम) की स्थिति और त्वचा पियर्स, एक घूर्णन गति का उपयोग कर दिमाग़ी गुहा मर्मज्ञ । आकांक्षा सुई के stylet निकालें और इसे आगे उपयोग के लिए एक बाँझ क्षेत्र में आरक्षित ।
      नोट: हड्डी के एक क्षेत्र में दिमाग़ी गुहा के लिए periosteal प्रवेश साइट का चयन करें कि मांसपेशियों और जहां आकार/हड्डी के परिदृश्य या तो दिखाई है या आसानी से त्वचा के माध्यम से महसूस किया जा सकता है (आमतौर पर समीपस्थ या हड्डी के बाहर के छोर की ओर) के माध्यम से कवर नहीं है ।
    5. बीएम सुई करने के लिए, एक थक्कारोधी साइट्रेट डेक्सट्रोज समाधान (एसीडी-ए) और हेपरिन (20 खासियत/एमएल, मज्जा के 9 मिलीलीटर प्रति 1 मिलीलीटर के एकत्र होने के मिश्रण युक्त सिरिंज संलग्न) ।
    6. गोताख़ोर वापस ड्रा जबकि धीरे अंग कमाल और यह घूर्णन, महाप्राण और थक्कारोधी मिश्रण करने के लिए सिरिंज आंदोलन करने के लिए. सुई घुमाएँ और मज्जा अंतरिक्ष के भीतर कोशिकाओं का एक बड़ा प्रतिशत का उपयोग करने के लिए आकांक्षा और वापसी के दौरान यह स्थिति ।
    7. एक बार नमूना एकत्र किया जाता है, सुई हटाने और रक्तस्राव बंद हो जाता है जब तक आकांक्षा साइट के लिए दबाव लागू होते हैं ।
      नोट: आवश्यक मात्रा के आधार पर, एक से चार अंगों (दो humeri, दो femurs) से अस्थि मज्जा एक संग्रह के दौरान तैयार किया जा सकता है । कोई 20 से अधिक मिलीलीटर प्रत्येक अंग से एकत्र किया जाना चाहिए, और कुल एकत्र मात्रा पशु के वजन का कोई 10% से अधिक का गठन करना चाहिए (10 मिलीलीटर/
    8. यदि कई अंगों से aspirates प्राप्त करने, गठबंधन और मात्रा रिकॉर्ड ।
    9. चलो NHP जाउंगी postanesthesia.
      1. प्रक्रिया के बाद ०.०३ मिलीलीटर/किलो atipamezole (5 मिलीग्राम/एमएल स्टॉक) के साथ dexmedetomidine के प्रभाव रिवर्स । नैदानिक पशु चिकित्सक के विवेक पर, नैदानिक पशुचिकित्सा के आधार पर (जैसे, Buprenorphine SR) नैदानिक चिकित्सा स्टाफ द्वारा निर्धारित प्रक्रिया या अब के बाद के रूप में उपलब्ध कराने के लिए, क्लिनिकल संकेत पर आधारित ।
      2. प्रक्रिया के बाद अपने घर पिंजरे में पशु लौटें और यह हर 15-20 मिनट की निगरानी, जब तक पशु अपने आप पर बैठने में सक्षम है । पशु चिकित्सक कर्मचारियों द्वारा दैनिक निगरानी जब तक यह तय है कि आकांक्षा साइट (ओं) को चंगा कर रहे हैं । इसके अलावा, सूजन, संक्रमण, या दर्द के किसी भी लक्षण के लिए निगरानी ।
    10. सेल प्रोसेसिंग के समानांतर में, हालत myeloablative कुल शरीर विकिरण (TBI) के साथ एक ही NHP: १,०२० cGy की दर से 7 cGy/न्यूनतम सेल अर्क से पहले 2 दिनों में fractionated खुराक में विकिरण प्रशासन ।
  2. Hemolyze ने बी. एम.
    1. बीएम को ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूबों (10-12 मिलीलीटर प्रति ट्यूब) में विभाजित करें और रक्तलायी बफ़र को ५० मिलीलीटर (तालिका 1) में लाने के लिए जोड़ें । कमरे के तापमान (आरटी) पर कोशिकाओं की मशीन जब तक वे लीजड ड रहे हैं, लेकिन अब से 7 min. केंद्रापसारक के लिए ८०० एक्स जी में 5 मिनट के लिए और गोली (ओं) से supernatant महाप्राण, जा रहा है 2-5 मिलीलीटर की मात्रा/ अवशिष्ट मात्रा में गोली resuspend ।
      नोट: सफलतापूर्वक लीजड ड नमूने रंग, एक गहरे लाल से एक पारदर्शी प्रकाश लाल करने के लिए बदल जाते हैं ।
    2. रक्तलायी बफर की 10-15 मिलीलीटर जोड़ें/ ७० µm सेल उपभेदों का उपयोग कर किसी भी रक्त के थक्के निकालें । रक्तलायी बफर जोड़ें ५० मिलीलीटर, आरटी में 5 मिनट के लिए मशीन, और 5 मिनट के लिए ८०० x g पर स्पिन ।
    3. महाप्राण supernatant और एमएसीएस बफर (तालिका 1) के 10 मिलीलीटर में कोशिकाओं resuspend । एक ७० µm सेल छलनी के माध्यम से फिर से फ़िल्टर । ट्यूब कुल्ला और ५० मिलीलीटर के लिए एमएसीएस बफर के ४० मिलीलीटर के साथ यह फिल्टर ।
  3. CD34+ कोशिकाओं hemolyzed सफेद रक्त कोशिकाओं (WBCs) मानक प्रोटोकॉल का उपयोग करने से समृद्ध ।
    1. 15 मिनट के लिए ८०० x g पर कोशिकाओं स्पिन । ट्यूबों की जांच करें सुनिश्चित करें कि कोई सेल भंवर शीर्ष में स्पष्ट/ यदि कोशिकाओं गोली के ऊपर मौजूद हैं, एक उच्च गति पर फिर से स्पिन (अप करने के लिए १,००० x g अधिकतम) और के लिए 10 मिनट के लिए ।
    2. महाप्राण supernatant और यह 10 मिलीलीटर या एमएसीएस बफर के कम में resuspend, सटीक मात्रा टिप्पण । एक 1:100 या 1:1000 कमजोर पड़ने पर एक hemocytometer या एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग कर कोशिकाओं गिनती ।
      नोट: इस कुल WBC गिनती पूर्व संवर्धन गिनती है ।
    3. 1 x 108 कोशिकाओं/एमएल के लिए सेल एकाग्रता लाने के लिए एमएसीएस बफर जोड़ें । यदि आवश्यक हो, पहले दोहराएं कदम 1.3.1-1.3.2 (उदाहरण के लिए, एक कम पूर्व संवर्धन गिनती के कारण) । रिजर्व 5 x 106 HSC सबसेट धुंधला (पूर्व संवर्धन नमूना) के लिए एमएसीएस बफर में सेल ।
    4. जोड़ें unconjugated विरोधी CD34 एंटीबॉडी (क्लोन १२.८, सामग्री की मेज)27 शेष पूर्व संवर्धन कोशिकाओं को ४० µ जी के अंतिम एकाग्रता के लिए/एमएल (1 x 108 कोशिकाओं/एमएल) । एक ट्यूब रोटेटर पर 4 डिग्री सेल्सियस पर सेल निलंबन की मशीन ( सामग्री की मेजदेखें) 25-30 मिनट के लिए ।
    5. ५० मिलीलीटर के लिए वॉल्यूम लाने और 5 min. महाप्राण के लिए ८०० x g पर कक्षों स्पिन करने के लिए mac बफ़र का उपयोग करें supernatant, mac बफ़र की ५० मिलीलीटर में कक्षों को पुनर्स्थगित, और 5 मिनट के लिए ८०० x g पर फिर से स्पिन ।
    6. दो फिल्टर ट्यूबों के साथ एमएसीएस बफर के Degas १०० मिलीलीटर, मोम पेपर के साथ हवा प्रवेश लपेटन, 25-30 मिनट के लिए या जब तक उपयोग के लिए तैयार है ।
    7. के चुंबकीय मोती की आवश्यक मात्रा की गणना: मोतियों की 1 मिलीलीटर/ मोतियों को जोड़े जाने के बाद supernatant को महाप्राण करें और कोशिकाओं को 108 कोशिकाओं को फिर से सस्पेंड करें । उदाहरण के लिए: 3 x 109 कोशिकाओं + 3 मोतियों की मिलीलीटर + 27 कुल मात्रा के 30 मिलीलीटर के लिए एमएसीएस बफर की मिलीलीटर ।
    8. 25-30 मिनट के लिए एक ट्यूब रोटेटर पर 4 डिग्री सेल्सियस पर सेल सस्पेंशन की मशीन ।
    9. कॉलम के लिए अधिग्रहण मैग्नेट के दौरान; प्रति कॉलम ०.६ x 109 कोशिकाओं का उपयोग करने की योजना है । चुंबक पर कॉलम प्लेस और प्रत्येक स्तंभ के नीचे एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब के माध्यम से प्रवाह इकट्ठा करने के लिए स्थान । एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब और गोताख़ोर रेफरेंस के लिए प्रत्येक कॉलम के लिए तैयार (step
    10. जब कदम 1.3.8 में मशीन पूरा हो गया है, ५० मिलीलीटर के लिए एमएसीएस बफर जोड़ें और 5 मिनट के लिए ८०० x g पर स्पिन महाप्राण supernatant और degassed एमएसीएस बफर (प्रति कॉलम 2 मिलीलीटर) में कोशिकाओं resuspend । पिपेट धीरे बुलबुले शुरू करने से बचने के लिए ।
    11. स्तंभ को शुष्क चलाने की अनुमति दिए बिना, प्रत्येक स्तंभ के लिए 1 मिलीलीटर degassed एमएसीएस बफ़र जोड़ें, सेल निलंबन के 2 मिलीलीटर के बाद । degassed एमएसीएस बफर के साथ फिल्टर और मूल ट्यूब कुल्ला और कॉलम के बीच समान रूप से समाधान विभाजित (6 एमएल/ फिर, अंतिम धोने के लिए degassed एमएसीएस बफर के 7 मिलीलीटर जोड़ें ।
    12. धीरे स्तंभ चुंबक से दूर खींच (ऊपर वापस धक्का) और प्रवाह के माध्यम से ट्यूब में पिछले ड्रिप इकट्ठा । प्रत्येक स्तंभ के लिए degassed एमएसीएस बफर के 5 मिलीलीटर जोड़ें और कदम 1.3.9 से बाँझ शंकु ट्यूब में कोशिकाओं को elute करने के लिए गोताख़ोर लागू होते हैं । बुलबुले प्रकट होने के बाद किसी भी तरल इकट्ठा मत करो ।
  4. दोनों समृद्ध और प्रवाह के माध्यम से (FT) संग्रह ट्यूबों में कोशिकाओं की गणना 1:10 के कमजोर पड़ने अनुपात में । कोशिकाओं को बर्फ पर रखें । Aliquot 1 x 106 कोशिकाओं से CD34-समृद्ध अंश और 5 x 106 कोशिकाओं से प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण के लिए फुट अंशों से । गुणवत्ता नियंत्रण (चरण 2) संपंन होने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर फुट अंश संग्रह ।
    नोट: NHP में सफल multilineage engraftment के लिए आवश्यक CD34+ कोशिकाओं की संख्या HSC-समृद्ध CD34+CD90+CD45RA- सबसेट की आवृति पर निर्भर है. 3% की एक औसत आवृत्ति-5% और ंयूनतम आवश्यकता के आधार पर १२२,००० CD34+CD90+CD45RA- कोशिकाओं के शरीर के वजन के प्रति किलोग्राम1, यह करने के लिए की कुल के साथ आगे बढ़ने की सिफारिश की है २.५ x 106 और 10 x 10 6 CD34+ शरीर के वजन के प्रति किलोग्राम कोशिकाओं ।
  5. एमएसीएस जोड़ें CD34 करने के लिए बफर कुल में ५० मिलीलीटर के लिए समृद्ध अंश, 5 मिनट के लिए ८०० x g पर स्पिन, महाप्राण supernatant, और HSPC मीडिया (तालिका 1) में 106 कोशिकाओं/एमएल के लिए कोशिकाओं resuspend ।
    1. थाली में 106 कोशिकाओं/एमएल के घनत्व पर वेंट, ऊतक संस्कृति (टीसी)-इलाज टी-७५ कुप्पी, कुप्पी प्रति 10-20 मिलीलीटर, और उंहें एक ३७ ° c, 5% CO2 मशीन में रातोंरात गर्मी । आराम की कुप्पी लंबाई (खड़े नहीं) ।
      नोट: यदि वांछित, अतिरिक्त CD34+ कोशिकाओं या CD34 फुट में cryopreserved जा सकता है ९०% गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) 10% dimethyl sulfoxide (DMSO) 1 x 106 से 5 x 106 कोशिकाओं/एमएल के एक एकाग्रता पर, तो धीमी गति से ठंडा- ८० ° c (जैसे, ठंड कंटेनरों का उपयोग करके) । cryopreserved कोशिकाओं की औसत वसूली उपज CD34 पर निर्भर है+ शुद्धता और सामांयतः ५०% से ८०% से पर्वतमाला > 80% की व्यवहार्यता के साथ ।

२. CD34-समृद्ध कोशिकाओं का गुणवत्ता नियंत्रण (Day-1)

  1. प्रवाह cytometry के लिए नमूने तैयार करें ।
    1. FACS बफर में 10 x 106 कोशिकाओं की एक एकाग्रता पर (पूर्व संवर्धन, एफटी, और CD34-समृद्ध अंशों) उपर्युक्त प्रत्येक आइसोलेशन चरण से आरक्षित resuspend (एक FACS ट्यूब करने के लिए प्रत्येक कोशिका निलंबन (तालिका 1) के १०० µ एल स्थानांतरण ।
      नोट: नियंत्रण नमूनों में प्रत्येक आइसोलेशन स्टेज (उदा., 5 x 105 कक्ष) को फॉरवर्ड स्कैटर (FSC), साइड स्कैटर (SSC), और प्रत्येक प्रतिदीप्ति चैनल में autofluorescence के समायोजन के लिए unstained कक्षों को शामिल करना चाहिए. इसके अलावा, प्रत्येक fluorochrome के लिए एक दाग मुआवजा मोती-संयुग्मित एंटीबॉडी के लिए आसंन चैनलों के बीच में मुआवजा के लिए समायोजित करने की आवश्यकता होगी (तालिका 2 और तालिका 3) ।
    2. वांछित एंटीबॉडी जोड़ें (जैसे, विरोधी CD45, विरोधी CD34, विरोधी CD45RA, और विरोधी CD90), निर्माता के निर्देशों के अनुसार, एक परीक्षण के लिए (1 x 10 १०० µ एल में6 कोशिकाओं) (तालिका 3). 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए मशीन । FACS बफर के 3 मिलीलीटर जोड़ें और 5 मिनट के लिए ८०० x g पर स्पिन, महाप्राण supernatant, FACS बफर के १०० µ एल में resuspend, और एक उचित प्रवाह cytometer (चरण २.२) पर विश्लेषण ।
  2. विश्लेषण के लिए फ्लो cytometer/सेल सॉर्टर तैयार करें ।
    नोट:     यह चरण २.३ में सॉर्टिंग कक्ष के लिए उपयोग किया जाएगा जो एक ही मशीन पर विश्लेषण करने के लिए अनुशंसित है ।
    1. FSC/SSC, CD45/CD34, और CD45RA/CD90 (तीन प्रवाह भूखंडों) सहित एक प्रोटोकॉल जनरेट करें । एक प्रवाह भूखंड पर राइट-क्लिक करें और जनसंख्या पदानुक्रम लेआउट जोड़ें ।
    2. FSC/SSC भूखंड पर बाएं क्लिक करें, बहुभुज गेट सुविधा का चयन करें, और मलबे और मृत कोशिकाओं को बाहर करने के लिए एक गेट ड्रा । नए गेट को हाइलाइट करें और इसे इंस्पेक्टर विंडो में बिखराव का नाम दें ।
      नोट: यह स्वचालित रूप से P1 के रूप में पद है ।
    3. CD45/CD34 प्रवाह भूखंड के केंद्र में राइट-क्लिक करें, आबादी दिखानेके लिए नेविगेट, और तितर बितर पर भूखंड गेट । गैर-CD34 कोशिकाओं और nonhematopoietic कोशिकाओं, साथ ही अवशिष्ट प्लेटलेट्स और एरिथ्रोसाइट्स (CD45-) को बाहर करने के लिए CD45intCD34+ कोशिकाओं के चारों ओर एक आयताकार गेट ड्रा । गेट का नाम बदलकर CD34+कर दें ।
    4. गेट द CD45RA/CD90 फ्लो प्लॉट पर CD34+ जनसंख्या । CD90 के आसपास तीन स्वतंत्र उपफाटकों ड्रा+CD45RA- कोशिकाओं (HSCs के लिए समृद्ध), CD90-CD45RA- कोशिकाओं (multipotent और एरतरो-माइलॉयड progenitors के लिए समृद्ध [MPPs/EMPs]), और CD90-CD45RA + सेल (lympho-माइलॉयड progenitors [LMPs]) के लिए समृद्ध । HSC, करेंटली-EMP, और LMP, क्रमशः के लिए द्वार का नाम बदलें ।
    5. पूर्ण होने पर, सुनिश्चित करें कि जनसंख्या पदानुक्रम में निम्न क्रम में छः पदानुक्रमित रूप से व्यवस्थित प्रविष्टियाँ हैं: 1) सभी ईवेंट्स; 2) तितर बितर; 3) CD34+; ४) HSC; ५) करेंटली-EMP; ६) LMP. सुनिश्चित करें कि प्रवाह भूखंडों और गेट के आकार के रूप में चित्र 4में सचित्र देखो ।
    6. FSC, एसएससी, और सभी प्रतिदीप्ति चैनल (तालिका 2, नमूना 5) के लिए वोल्टेज को समायोजित करने के लिए दाग पूर्व संवर्धन WBCs भागो । एक दाग मुआवजा मोतियों को चलाने के लिए आसंन चैनलों के बीच में मुआवजा समायोजित (तालिका 2, नमूने 1-4) । CD34 संवर्धन दक्षता (तालिका 2, नमूने 6-9) दस्तावेज़ के लिए समायोजित और मुआवजा प्रोटोकॉल के साथ सभी शेष दाग और दाग नमूने भागो ।
      नोट: एक साथ प्रवाह विश्लेषण और चरण २.४ में सॉर्टिंग कक्ष के लिए अंतिम नमूना (तालिका 2, नमूना 10) रखें ।
  3. CD34 उपक्रमों की सॉर्ट-शुद्धि के लिए सेल सॉर्टर (सीएफसी) की परख करने के लिए कॉंफ़िगर करें ।
    नोट:     यदि कोई भिन्न मशीन विश्लेषण (चरण २.२) के लिए उपयोग किया गया है, तो पहले चरण 2.2.1-2.2.5 में बताए गए के रूप में कक्ष सॉर्टर पर प्रोटोकॉल सेट करें ।
    1. समायोजित करें कोण/वोल्टेज के लिए बाएं और दाएं साइड स्ट्रीम सेल सॉर्टर सॉफ्टवेयर में कोशिकाओं को जमा करने के लिए 15 मिलीलीटर युक्त ट्यूब सीएफसी मध्यम । ग़लत संरेखण को रोकने के लिए पार्श्व स्ट्रीम के कोण को कॉंफ़िगर करें । कदम-वार, ठीक-ट्यूना साइड स्ट्रीम के कोण जब तक हल कोशिकाओं सीएफसी मध्यम और नहीं ट्यूब के पक्ष मारा क्योंकि बहुत कुछ कोशिकाओं को हल कर रहे हैं ।
    2. ब्राउज़र में, वैश्विक कार्यपत्रक फ़ोल्डर खोलें, और ब्राउज़र विंडो के शीर्ष मेनू में बटन का उपयोग कर एक नया सॉर्ट-लेआउट बनाएं । संग्रह डिवाइस में प्रविष्टि बदलें ड्रॉप-डाउन मेनू करने के लिए 2 ट्यूबों, सटीक ड्रॉप-डाउन मेनू में प्रविष्टि करने के लिए 4-way शुद्धता या एकल कक्ष और ८००-१,२०० कक्षों के लिए लक्ष्य ईवेंट्स सेट करें । सॉर्ट-स्थान फ़ील्ड (बाएं या दाएं) पर बाएं क्लिक करें, मेनू में प्रविष्टि जोड़ें का चयन करें, और मेनू से सॉर्ट करने के लिए जनसंख्या चुनें ।
  4. सीएफसी परख के लिए कोशिकाओं को क्रमबद्ध करें ।
    नोट:     सीएफसी परख के लिए छंटाई केवल CD34-समृद्ध उत्पाद (तालिका 2, नमूना 10) से कोशिकाओं के साथ प्रदर्शन किया है ।
    1. लोड नमूना 10, रिकॉर्ड २,०००-३,००० घटनाओं, और ठीक-सिग्नल की शक्ति और लक्ष्य आबादी फिट करने के लिए क्रमबद्ध गेट्स समायोजित करें ।
    2. सेटअप पूर्ण होने पर, कक्ष (तालिका 2, नमूना 10) प्राप्त करें । चरण 2.2.3 में वर्णित के रूप में डेटा प्राप्त करें, प्रवाह दर को समायोजित करने के लिए ५००-१,००० कक्ष/और मैं से ८००-१,२०० कोशिकाओं को क्रमबद्ध) कैटरिंग गेट, द्वितीय) CD34+ गेट, iii) HSC गेट, iv) करेंटली-EMP गेट, और वी) LMP गेट अलग ट्यूब में सीएफसी के ३.६ मिलीलीटर युक्त मीडिया.
      नोट: सीएफसी परख के लिए छंटाई केवल CD34-समृद्ध उत्पाद (तालिका 3, नमूना 10) से कोशिकाओं के साथ प्रदर्शन किया है । तितर बितर और CD34+ गेट्स से कोशिकाओं को अलग से हल किया जाना चाहिए, जबकि HSCs, करेंटली-EMPs, और LMPs एक साथ छोड़ दिया और सही ट्यूब धारक की स्थिति में हल किया जा सकता है ।
    3. भंवर और 3 एक्स ३.५ सेमी बाँझ, गैर ऊतक, संस्कृति का इलाज पेट्री व्यंजन में से प्रत्येक के लिए सेल निलंबन के 1 मिलीलीटर बांटना । एक माध्यमिक कंटेनर में 10-14 दिनों के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं की मशीन (जैसे, एक 15 सेमी पेट्री डिश) ।
    4. दिन 10-11 postplating पर, शर्त के अनुसार सभी तीन प्लेटों से व्यक्तिगत कालोनियों गिनती, कॉलोनी आकृति विज्ञान पर आधारित है ।

3. CD34 के जीन संशोधन+ HSPCs और रात भर वसूली (0 दिन)

  1. 1 µ g/µ l CH-२९६ समाधान के २.५ मिलीलीटर को पतला करने के लिए ५० µ g/एमएल के ५० मिलीलीटर में है हांक संतुलित नमक समाधान (HBSS, सामग्री की तालिकादेखें) ।
  2. LV transduction के लिए कुप्पी तैयार करें ।
    1. गैर-ऊतक-संस्कृति की अनुमानित संख्या (नॉन-टीसी)-उपचारित कुप्पी की आवश्यकता (आमतौर पर चरण १.४ में निर्धारित कक्ष गणना से) । योजना के लिए 1 x 10 टी मीडिया के 10 मिलीलीटर में7 कोशिकाओं T-७५ कुप्पी (1 x 108 कुल कोशिकाओं 10 कुप्पी) की आवश्यकता होती है और एक गैर टीसी-12-अच्छी तरह से इलाज प्लेट (नकली transduction हालत) शामिल हैं । 2 µ g/cm2की एकाग्रता में बाँझ HBSS और ५० µ g/mL CH-२९६ शेयर प्रत्येक कुप्पी/प्लेट से ३.१ चरण में जोड़ें । टी-७५ कुप्पी के लिए, HBSS के ५० µ g/ml CH-२९६ + 7 मिलीलीटर की 3 मिलीलीटर का उपयोग करें; 12-वेल प्लेट के लिए, HBSS के ५० µ g/mL CH-२९६ + ३४० µ l का १६० µ l का उपयोग करें ।
    2. व्यंजन की अनुमति दें एक साफ बेंच पर आर टी पर परेशान बैठने के लिए या 2 h. महाप्राण CH-२९६ के लिए हुड में और यह बाँझ HBSS + 2% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) के एक समान मात्रा के साथ प्रतिस्थापित करें । 30 मिनट के लिए आर टी पर मशीन, महाप्राण HBSS/BSA, और २.५% 1 एम HEPES, पीएच ७.० युक्त बाँझ HBSS की एक समान मात्रा के साथ बर्तन धोने । महाप्राण तुरंत पहले कोशिकाओं (चरण ३.४) चढ़ाना करने के लिए ।
      नोट: चरण 3.2.2 के बाद, बाहर सूखी करने के लिए प्लेटें/ प्लेटें युक्त बाँझ HBSS + २.५% 1 M HEPES रात भर 4 ° c में आयोजित कर रहे हैं (यानी, दिन पर तैयार-1).
  3. हार्वेस्ट और transduce दिन-1 से CD34+ कोशिकाओं ।
    1. एक 10 मिलीलीटर पिपेट का प्रयोग, दोहराया द्वारा ढीले अनुयाई कोशिकाओं कुल्ला, बाँझ HBSS के साथ प्रत्येक संस्कृति कुप्पी के कोमल धोने. सुनिश्चित करें कि सभी कोशिकाओं को अलग होगा (यदि आवश्यक हो, नल/कुप्पी के लिए कोशिकाओं को ढीला करने के लिए) ।
    2. 5 मिनट के लिए ८०० x g पर कोशिकाओं के केंद्रापसारक, महाप्राण supernatant, और transduction मीडिया में कोशिकाओं 1 x 106 कोशिकाओं की एक एकाग्रता के लिए resuspend/ एक बार सभी कोशिकाओं को एकत्र किया गया है, सेल गिनती निर्धारित करते हैं, एक hemocytometer या स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग कर ।
    3. सेल निलंबन के 1 मिलीलीटर (1 x 106 कोशिकाओं) CH-२९६-लेपित 12-अच्छी तरह से प्लेट (नकली-transduced नियंत्रण नमूना के लिए) के एक अच्छी तरह से जोड़ें । टी के बीच कोशिकाओं के शेष भाग-७५ कुप्पी (कदम 3.2.2), लगभग 10 मिलीलीटर (1 x 107 कोशिकाओं) की कुप्पी प्रति जोड़ने । कोशिकाओं की अनुमति दें CH-२९६ कोटिंग के लिए ३७ ° c, 5% CO2 पर 30 मिनट के लिए, टोपी के साथ वेंट के द्वारा पालन करने के लिए ।
    4. गल वायरस कंडीशन्ड मीडिया (VCM, सामग्री की तालिका) और milliliter प्रति संक्रामक इकाइयों में titer निर्धारित (IU/एमएल)28,29,30,31,३२ . कदम 3.3.3 से प्रत्येक टी-७५ कुप्पी के लिए VCM की उचित मात्रा जोड़ें और ३७ डिग्री सेल्सियस, 5% सह2पर कोशिकाओं की मशीन ।
      नोट: यदि एक एकल transduction प्रदर्शन, रात भर गर्मी; यदि एक डबल transduction प्रदर्शन, दोहराएं इस stepapproximately 6-8 एक धोने/वसूली चरण के बिना पहले transduction के बाद एच और, फिर, रात भर गर्मी । उदाहरण के लिए, एक कुप्पी के लिए (1 x 107 कोशिकाओं) संक्रमण की एक वांछित बहुलता (MOI) के साथ 10, 1 x 108 IU/एमएल में वायरस titered के 1 मिलीलीटर जोड़ें ।

4. सेल हार्वेस्ट और अर्क के लिए तैयारी (1 दिन)

  1. कोशिकाओं फसल ।
    1. transduced और नकली कोशिकाओं के रूप में कदम में वर्णित 3.3.1-3.3.2 लीजिए । HBSS के 10 मिलीलीटर के साथ अनुक्रमिक धोया प्रदर्शन, की कोशिकाओं के साथ शंकु ट्यूब के लिए बहाकर स्थानांतरित । सुनिश्चित करें कि सभी कोशिकाओं की कुप्पी से हटा दिया गया है, अगर आवश्यक हो तो दोहन/
    2. 5 मिनट के लिए ८०० x g पर सेल सस्पेंशन केंद्रापसारक, महाप्राण supernatant, और HBSS के 1 मिलीलीटर में गोली resuspend । एक ही शर्त से कोशिकाओं युक्त ट्यूबों का मिश्रण । HBSS के 10 मिलीलीटर के साथ प्रत्येक कुल्ला और सेल निलंबन करने के लिए कि जोड़ें । एक hemocytometer का उपयोग करते हुए कक्ष गणना निर्धारित करें । HBSS में ५० मिलीलीटर के लिए कुल सेल मात्रा लाओ और 5 मिनट के लिए ८०० x g पर केंद्रापसारक ।
  2. पल्स प्रोस्टाग्लैंडीन E2 (PGE2) और अर्क उत्पाद के लिए रिएजेंट तैयार करते हैं.
    1. महाप्राण को HSPC के बिना साइटोकिंस मीडिया में 5 x 106/mL को supernatant और transduced कोशिकाओं को पुनर्निलंबित (नकली नहीं) । 10 मिमी के एक अंतिम एकाग्रता के लिए PGE2 जोड़ें 10 µ एम. 2 एच के लिए बर्फ पर कोशिकाओं को गर्मी, धीरे उन्हें हर 30 मिनट घूमता.
    2. चरण 4.2.1 के दौरान, हीट-निष्क्रिय ऑटोलॉगस सीरम (सामग्री की तालिका), मोम पेपर में कंटेनर लपेटन और 30 मिनट के लिए ५६ डिग्री सेल्सियस पर यह मशीनिंग तैयार करें HBSS में 2% ऑटोलॉगस सीरम (५०० µ l की गर्मी निष्क्रिय सीरम + २४.५ मिलीलीटर के HBSS), उन्हें अच्छी तरह से मिश्रण, और उपयोग जब तक बर्फ पर मिश्रण की दुकान । इसके अलावा, चरण 4.2.1 के दौरान, फसल नकली-transduced कोशिकाओं में एक 12-अच्छी तरह से कोशिकाओं को pipetting करके ऊपर और नीचे जोरदार । एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब के लिए सेल निलंबन जोड़ें, उन्हें HBSS के 1 मिलीलीटर के साथ 3x धोने, और एक ही 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब करने के लिए बहाकर जोड़ें ।
    3. PGE2 मशीन के 2 ज के बाद, उंहें 5 मिनट के लिए ८०० x g पर केंद्रापसारक द्वारा कोशिकाओं को धो और supernatant खारिज । दूसरे धोने के बाद, एक hemocytometer या एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग कर, गिनती के लिए HBSS की एक उचित मात्रा में कोशिकाओं को फिर से सस्पेंड ।
      नोट: कोशिकाओं को अक्सर एक PGE2 पल्स, जो कम विश्वसनीय सेल गिनती के लिए कर सकते है के बाद का झुरमुट । यदि ऐसा है, तो चरण 4.1.2 से चरण 4.2.3 से एक के बजाय कक्ष गणना का उपयोग करें ।
  3. आरक्षित गुणवत्ता नियंत्रण के लिए नकली और transduced कोशिकाओं (चरण 5) अर्क उत्पाद के: 5 x 105 से 1 x 106 प्रवाह cytometry के लिए कोशिकाओं/(चरण ५.१ और ५.३) और लगभग 1 x 10 तरल संस्कृति के लिए6 कोशिकाओं (चरण ५.२) और कॉलोनी पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) (स्टेप ५.४) ।
  4. अर्क उत्पाद तैयार करें ।
    1. transduced कोशिकाओं के शेष के साथ, HBSS के ५० मिलीलीटर में एक तिहाई धोने प्रदर्शन, supernatant महाप्राण, और HBSS + 2% ऑटोलॉगस सीरम (चरण 4.2.2 में तैयार) के 10 मिलीलीटर में कोशिकाओं remainder । एक १६.५ जी सुई के साथ लगे एक 20 मिलीलीटर सिरिंज में 10 मिलीलीटर समाधान ड्रा । HBSS + 2% ऑटो सीरम के 10 मिलीलीटर के साथ ट्यूब धो और एक ही सिरिंज में धोने आकर्षित करने के लिए कुल मात्रा 20 मिलीलीटर लाने के लिए । टोपी सुई टोपी के साथ सिरिंज, लेबल सिरिंज, और यह परिवहन के लिए बर्फ पर जगह/
    2. ऑटोलॉगस मेजबान में transduced सेल उत्पाद को भ्रमित, एक केंद्रीय शिरापरक कैथेटर३३,३४के माध्यम से एक मांयता प्राप्त पशु अनुसंधान सुविधा के भीतर स्थित है । प्रत्यारोपण पशुओं की निगरानी पूरी रक्त कोशिका गिनती (CBCs) और रक्त chemistries और अध्ययन विशेष जीन अंकन परियोजना1,6,19के अनुरूप परख प्रदर्शन करते हैं ।

5. गुणवत्ता नियंत्रण

नोट: कोशिकाओं को जानवरों में कदम 4.4.2 में वर्णित अनुवर्ती के भाग के रूप में संचार कर रहे हैं के बाद प्रवाह cytometry और कक्ष छँटाई किया जाता है. प्रवाह cytometric डेटा तुरंत प्रत्यारोपण के बाद प्रयोग किया जाता है phenotypically परिभाषित स्टेम और अर्क उत्पाद में जनक सेल सबसेट की संरचना का निर्धारण करने के लिए (५.१ कदम और ५.३), जबकि सीएफसी परख के विश्लेषण 12-14 दिन प्रदर्शन किया है postinfusion कॉलोनी पीसीआर (स्टेप ५.४) द्वारा जीन-संशोधन दक्षता निर्धारित की जाए.

  1. प्रदर्शन फ्लो cytometry और सीएफसी अर्क उत्पाद की छंटाई ।
    1. द्वारा कोशिकाओं का विश्लेषण प्रवाह cytometry और प्रकार-शुद्ध सीएफसी परख के लिए CD34 उपसमुच्चय, के रूप में खंड 2 में वर्णित है । नकली और transduced CD34 कोशिकाओं से बीज सीएफसी परख (PGE2 पल्स के बाद अर्क उत्पाद) ।
    2. शर्त और भंवर, प्लेट, संस्कृति प्रति ८०० कोशिकाओं की एक अधिकतम तरह, और २.४ कदम में वर्णित के रूप में सीएफसी परख गिनती । गिनती के बाद, ५.४ कदम में वर्णित के रूप में कॉलोनी पीसीआर प्रदर्शन करने के लिए सीएफसी परख से कालोनियों उठाओ ।
  2. लिक्विड कल्चर
    1. HSPC मीडिया में तरल संस्कृति के लिए प्लेट कोशिकाओं 1 x 10 में गैर-टीसी-इलाज प्लेटों में6/mL । दिन पर 2, 5, और 12 posttransduction, फसल और प्रवाह cytometry के लिए कोशिकाओं की गिनती । सीएफसी परख के लिए छंटाई सेल की आवश्यकता नहीं है ।
    2. दिन 2 और 5, नए HSPC मीडिया में 1 x 106/mL. में कोशिकाओं की प्लेट ३३% पर मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर के लिए डीएनए निष्कर्षण बफर में कोशिकाओं के ३३% फ्रीज । चरण २.१ और २.२ में वर्णित के रूप में प्रवाह cytometry के लिए ३३% कक्षों का उपयोग करें ।
    3. टेम संतति की phenotypic रचना का विश्लेषण करने के लिए स्टेप 5.2.2 से इन आंकड़ों का प्रयोग करें । प्रत्येक नमूने के भीतर चरण -8 में वर्णित के रूप में CD34 + कोशिकाओं और phenotypically परिभाषित उपसेट की आवृत्ति का निर्धारण. जीन संशोधन के प्रभाव का निर्धारण करने के लिए शर्तों के बीच CD34+ कोशिकाओं की संरचना की तुलना करें ।
      नोट: CD34+ कोशिकाओं को पूरी संस्कृति भर में अपनी अभिव्यक्ति बनाए रखने और सभी phenotypic सबसेट शामिल करना चाहिए । CD90+CD45RA- कोशिकाओं या phenotypical सबसेट के एक प्रतिनिधित्व का नुकसान अप्रत्यक्ष या प्रत्यक्ष जीन संशोधन के प्रभाव का संकेत कर सकते हैं ।
  3. मात्रा transgene अभिव्यक्ति (जैसे, ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन [GFP]) द्वारा प्रवाह cytometry (वैकल्पिक और प्रायोगिक सेटअप पर निर्भर करता है), २.२ कदम से प्रोटोकॉल अनुकूल ।
    1. ssc/transgene (उदा., ssc/GFP) दिखा रहा है तीन प्रवाह भूखंडों को जोड़ें । गेट HSCs पर पहला भूखंड, MPPs पर दूसरा-EMPs, और तीसरे पर LMPs. भूखंड प्रत्येक बनाम transgene (जैसे, GFP) और बनाने के द्वार HSC-GFP+, करेंटली-EMP-GFP+, और LMP-GFP+, क्रमशः ।
    2. पूर्ण होने पर, जनसंख्या पदानुक्रम में निम्न क्रम में नौ पदानुक्रमित रूप से व्यवस्थित प्रविष्टियाँ शामिल करने के लिए है: 1) सभी घटनाओं; 2) तितर बितर; 3) CD34+; ४) HSC; 5) HSC-GFP+; ६) करेंटली-EMP; 7) करेंटली-EMP-GFP+; 8) LMP; ९) LMP-GFP+.
      नोट: किसी भी transgene अभिव्यक्ति बाद में तरल संस्कृति में (जैसे, 5 दिन और 12) बेहतर जीन संशोधन ५.४ कदम में कॉलोनी पीसीआर द्वारा निर्धारित दक्षता प्रतिबिंबित करेगा । पहले तरल संस्कृति में समय अंक transgene अभिव्यक्ति का अनुमान लगा सकता है, unintegrateded LVs के कारण । इसी तरह, प्रवाह-छंटाई GFP+ 1 दिन पर सीएफसी परख के लिए कोशिकाओं को कई झूठी सकारात्मक कालोनियों में परिणाम होगा ।
  4. कॉलोनी पीसीआर प्रदर्शन ।
    1. चरण 2.4.4 और 5.1.1 में गिनती के बाद, डीएनए निष्कर्षण बफर के ५० µ एल में एकल कालोनियों उठाओ, एक 10 µ एल या 20 µ एल पिपेट का उपयोग कर, और ऊपर और नीचे पिपेट एक 8 ट्यूब पीसीआर पट्टी टोपी की एक ट्यूब के लिए कालोनियों हस्तांतरण करने के लिए । transduced हालत से नकली हालत और ८८ कालोनियों से आठ कालोनियों उठाओ एक पूर्ण ९६ अच्छी तरह से थाली उत्पंन करने के लिए । एक अच्छी तरह से डीएनए निष्कर्षण बफर के ५० µ एल जोड़ें ।
    2. एक thermocycler और निम्न प्रोग्राम का उपयोग कर, कालोनियों से डीएनए निकालें: ६५ ° c/20 मिनट, ९९ ° c/10 मिनट, और एक 4 डिग्री सेल्सियस पकड़ो । के लिए डीएनए ले जाने की योजना-20 ° c जितनी जल्दी हो सके इष्टतम गुणवत्ता के लिए ।
    3. lv-transduced कोशिकाओं के लिए कॉलोनी पीसीआर प्रदर्शन, lv+ कालोनियों की संख्या की तुलना, लेंती एफ/आर प्राइमरों का उपयोग कर, कुल कालोनियों के लिए, Actin एफ/आर और नियंत्रण प्राइमरों (सामग्री की तालिका) का उपयोग कर ।

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Representative Results

ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल को अलग और जीन संशोधित NHP CD34+ HSPCs, जो बाद में वापस ऑटोलॉगस मेजबान में संचार किया जा सकता है (चित्रा 1 और चित्रा 2) के लिए डिज़ाइन किया गया है । जब इस प्रोटोकॉल के बाद, हम आम तौर पर प्राप्त करने के लिए 8 एक्स 109 कुल WBCs से प्रधान बीएम से बेनी मकाक और, कभी-कभार, रीसस मकाक से उस राशि दोगुनी. दोनों प्रजातियों में, CD34+ HSPCs है कि हम समृद्ध की संख्या कुल WBC गिनती (चित्रा 3) के इनपुट के लिए आनुपातिक है । पिछले निष्कर्षों कि कुल CD34+ HSPC उत्पाद शामिल कोशिकाओं है कि सच नहीं हैं, दीर्घकालिक engrafting HSCs । इसलिए, हम प्रवाह-cytometry-तकनीक (चित्रा 4) और सीएफसी परख (आंकड़े 5-6) का उपयोग करने के लिए विकसित किया है लंबी अवधि के HSCs की पहचान और संस्कृतियों में प्रतिबद्ध जनक सबसेट । सच HSCs के विपरीत, प्रतिबद्ध progenitors vivo में एक अपेक्षाकृत कम समय अवधि के लिए बनी रहेगी । अंत में, LV मध्यस्थता जीन संशोधन रणनीति में मजबूत जीन अंकन में कल्चरल CD34+ HSPCs । इन कोशिकाओं को संस्कृति में 2 सप्ताह तक पर नजर रखी, भाग में कर रहे है की संख्या को कम करने के लिए "झूठी सकारात्मक" कोशिकाओं है कि एक्सप्रेस GFP से एकीकृत एल. वी. वैक्टर । क्योंकि इन कोशिकाओं को सेलुलर जीनोम में LV वेक्टर के एक छुरा एकीकृत प्रतिलिपि नहीं ले, वे बाहर 12 दिन तरल संस्कृति परख (7 चित्रा) पर पतला होगा ।

Figure 1
चित्रा 1: एक ऑटोलॉगस का उत्पादन, जीन संशोधित NHP HSPC उत्पाद । प्रोटोकॉल CD34+ HSPCs (day-1) को अलग करता है, इन कोशिकाओं (दिन 0) जीन को संशोधित करता है, और एक ४८ ज समय पाठ्यक्रम पर एक अर्क उत्पाद (1 दिन) तैयार करता है । कॉलोनी गठन, तरल संस्कृति, और संबंधित पूर्व vivo परख एक अतिरिक्त 2 सप्ताह के लिए जारी है, क्रम में इन उत्पादों की विशेषता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: घटनाओं की समयरेखा । प्रोटोकॉल के प्रत्येक व्यक्ति के चरण को लगभग 2 दिनों में निष्पादित करने का औसत समय । व्यक्तिगत कदम के समय स्टेम सेल स्रोत (प्रोटोकॉल के चरण 1) और/या जीन संशोधन के प्रकार (प्रोटोकॉल के चरण 3) के आधार पर बदलता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: सफेद रक्त कोशिका और CD34 से उपज प्रधान बेनी और रीसस के समूल अस्थि मज्जा । 10 बेनी मकाक (चौकों) और छह रीसस मकाक (त्रिकोण) से समृद्ध CD34+ HSPC गिनती (प्रोटोकॉल के चरण १.४) कुल सफेद रक्त कोशिका गिनती (प्रोटोकॉल के चरण 1.3.3) के एक समारोह के रूप में । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: CD34-समृद्ध और जीन-संशोधित उत्पादों की गुणवत्ता नियंत्रण के लिए गेटिंग रणनीति । कुल सफेद रक्त कोशिकाओं ("पूर्व संवर्धन") और बाद में CD34-समृद्ध HSPCs CD34 के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ दाग रहे हैं, CD45, CD90, और CD45RA, क्रम में HSC की संख्या-, करेंटली-, EMP-, और LMP-समृद्ध CD34 सबसेट की मात्रा को बढ़ाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: पहले और जीन संशोधन के बाद CD34+ कोशिकाओं की आकृति विज्ञान । शीर्ष पैनलों: तीन प्रतिनिधि HSPC कॉलोनी परख से brightfield छवियां । नीचे पैनलों: GFP प्रतिदीप्ति ऊपर प्रत्येक brightfield छवि को इसी । स्केल बार = 1 मिमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: कॉलोनी बनाने सेल (सीएफसी) CD34 की क्षमता+ कोशिकाओं और क्रमबद्ध-शुद्ध सबसेट । दिन पर HSPC उपसमुच्चय से सीएफसी परख के लिए क्रमबद्ध शुद्धि के बाद 1 (अनुभाग 1 और प्रोटोकॉल के 2) और 1 दिन (प्रोटोकॉल की धारा 5), एकल कालोनियों रूपात्मक विशेषताओं के आधार पर बनाए जाते हैं । CFU-मिश्रण = माइलॉयड (सफेद) और erythroid (लाल) कोशिकाओं के मिश्रण; BFU-E = केवल erythroid कक्ष; CFU-जी = granulocytes; CFU-GM = granulocytes and मैक्रोफेज/monocytes; CFU-M = मैक्रोफेज/monocytes. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्रा 7: प्रतिनिधि प्रवाह जीन से डेटा cytometric तरल संस्कृति में संशोधित कोशिकाओं । GFP-व्यक्त करने वाले LV वेक्टर के साथ CD34+ HSPCs म् transduction का प्रतिशत । कोशिकाओं को 2 सप्ताह के लिए transduction निंनलिखित के लिए संस्कृति रहे हैं । GFP में कमी+ समय के साथ घटनाओं GFP के एक नुकसान को प्रतिबिंबित करता है, जो एकीकृत एल वी वैक्टर ले कोशिकाओं से संकेत । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

नाम सामग्री
रक्तलायी बफर १५० मिमी अमोनियम क्लोराइड, 12 मिमी सोडियम बिकारबोनिट, डबल आसुत जल में ०.१ मिमी EDTA (ddH2ओ)
वाणिज्यिक बफर फॉस्फेट-बफर खारा (1x) पीएच ७.२, ०.५% BSA, 2 मिमी EDTA
FACS बफर फॉस्फेट-बफर खारा (1x) पीएच ७.२, 2% भ्रूण गोजातीय सीरम
HBSS + २% BSA है हांक संतुलित नमक समाधान, 2% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन
HSPC मिडिया StemSpan SFEM II, 1% पेनिसिलिन/Streptomycin, १०० एनजी/एमएल प्रत्येक रिकॉमबिनेंट मानव टीपीओ, एससीएफ, FLT-3
Transduction मिडिया StemSpan SFEM II, 1% पेनिसिलिन/Streptomycin, १०० एनजी/एमएल प्रत्येक रिकॉमबिनेंट मानव टीपीओ, एससीएफ, FLT-3, 1 µ जी/एमएल Cyclosporine, 4 यूजी/एमएल Protamine सल्फेट

तालिका 1: बफ़र और मीडिया योगों ।

Id पीई PECF594 APC-Cy7 V450 विवरण
1 CD90 मुआवजा मोती
2 CD34 मुआवजा मोती
3 CD45RA मुआवजा मोती
4 CD45 मुआवजा मोती
5 CD34-संवर्धन से पहले दाग WBCs
6 CD90 CD34 CD45RA CD45 सना WBCs से पहले CD34-संवर्धन
7 प्रवाह के माध्यम से दाग WBCs (फुट)
8 CD90 CD34 CD45RA CD45 सना WBCs फ्लो-थ्रू (FT)
9 CD34-समृद्ध उत्पाद के दाग WBCs
10 CD90 CD34 CD45RA CD45 CD34-समृद्ध उत्पाद की सना WBCs

तालिका 2: CD34-समृद्ध और जीन संशोधित सेल उत्पादों की गुणवत्ता नियंत्रण के लिए प्रतिनिधि प्रवाह पैनल ।

Antigen क्लोन Fluorochrome लेजर फ़िल्टर
CD45 D058-1284 V450 ३९५ एनएम 450/40 एनएम
CD90 5.00 ई + 10 पीई ४८८ एनएम या ५३२ एनएम 585/42 एनएम
CD34 ५६३ पे-CF594 ४८८ एनएम या ५३२ एनएम 610/20 एनएम
CD45RA 5H9 APC-Cy7 ६३३ एनएम 780/60 एनएम
V450: वायलेट ४५० एनएम; पे: Phycoerythrin; PE-CF५९४: Biotium से ट्रेडमार्क नाम; APC: Allophycocyanin-cyanine 7

तालिका 3: एंटीबॉडी-प्रवाह cytometry और सेल छंटाई द्वारा गुणवत्ता नियंत्रण के लिए पैनल धुंधला ।

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Discussion

LV वेक्टर इंजीनियरिंग, vivo में क्रमिक प्रत्यारोपण के लिए CD34+ HSPCs जैसे सेल प्रकारों को जीन-संशोधित करने के लिए सर्वोत्तम-विशेषता पद्धति है । प्रोटोकॉल यहां वर्णित जीन संशोधित HSPCs की संख्या को अधिकतम करने के लिए डिज़ाइन किया गया है कि vivo में लंबे समय तक बनी रहती है, और विभिंन घातक, संक्रामक, और आनुवंशिक रोगों के साथ रोगियों को नैदानिक लाभ प्रदान करते हैं । हालांकि जीन संपादन रणनीतियों पिछले दशक में उभरा है, LV-संशोधित कोशिकाओं सबसे अच्छा इन विट्रो में अध्ययन कर रहे हैं, पशु मॉडल में, और रोगियों में1,8,20,21,22।

इस प्रोटोकॉल के साथ हमारे व्यापक अनुभव के आधार पर, शुद्ध CD34 के संवर्धन+ HSPCs (यानी, > CD34+ कोशिकाओं के क्रमबद्ध सेल उत्पाद में 80%) सफलता का एक महत्वपूर्ण पहलू है । क्योंकि इन कोशिकाओं को कुल बीएम WBCs की एक मिश्रित जनसंख्या से प्राप्त कर रहे हैं, कम शुद्धता संस्कृतियों कोशिकाओं है कि लंबे समय engraft नहीं होगा शामिल हो सकते हैं, सही स्टेम कोशिकाओं है कि ऑटोलॉगस मेजबान में संचार कर रहे है की खुराक कम बारी में । इसके अतिरिक्त, उच्च गुणवत्ता LV VCM जीन संशोधन की उच्चतम दक्षता सुनिश्चित करेगा ।

समृद्ध CD34+ HSPC उत्पादों की शुद्धता में कमियों का पता करने के लिए, अक्सर इन कोशिकाओं को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया एजेंट की गुणवत्ता को मान्य करने के लिए उपयोगी है, अर्थात् विरोधी CD34 एंटीबॉडी (जो हमारे समूह एक hybridoma सेल लाइन से घर में शुद्ध), और चुंबकीय मोती जो एंटीबॉडी-लेबल कोशिकाओं बांध । हम इस transduction (MOI 10 x 2) को दोहराने के विकल्प के साथ 10 में से एक MOI की सलाह देते हैं । महत्वपूर्ण बात, MOI empirically निर्धारित किया जाना चाहिए, VCM के एक गुणवत्ता मूल्यांकन के बाद, titering29जैसे एक मानकीकृत HT1080 सेल लाइन पर प्रत्येक वेक्टर के अनुमापन सहित. महत्वपूर्ण रूप से, विभिन्न VCM-उत्पादक प्रयोगशालाओं में HOS30, हेला31और 293T३२सहित विशिष्ट titering सेल लाइनों का उपयोग कर सकते हैं, जो सुविधाओं के बीच titers की तुलना करने की क्षमता को सीमित कर सकते हैं । हम परख के साथ एक सदिश retiter करना पसंद करते हैं, क्रम में करने के लिए VCM की सबसे सटीक राशि की गणना करने के लिए कुशलता से जीन संशोधित CD34+ HSPC लक्ष्य कोशिकाओं । एक बार उच्च गुणवत्ता CD34+ HSPCs और VCM प्राप्त किया गया है, transduction दक्षता और engraftment आगे तीन अलग चरणों में बढ़ाया जाता है । सबसे पहले, cyclosporine के अतिरिक्त transduction मीडिया एड्स के प्रारंभिक चरणों में वेक्टर transduction और एकीकरण के लक्ष्य कोशिकाओं में३५,३६, जबकि protamine सल्फेट lentiviral वेक्टर के बीच प्रतिकारक बलों कम हो जाती है कणों और सेल सतह३३,३७। दूसरा, एक रिकॉमबिनेंट fibronectin टुकड़ा के साथ प्लेटों के इलाज (जैसे, RetroNectin, CH-२९६) transduction क्षमता बढ़ जाती है और यह भी में सुधार के vivo engraftment क्षमता की जीन संशोधित HSPCs ३३,३८, ३९. विशेष रूप से, पिछले अध्ययनों का सुझाव है कि CH-२९६ के दौरान ही महत्वपूर्ण है, लेकिन पहले नहीं, transduction३३,३८। अंत में, हम पल्स जीन-PGE2 के साथ सेल उत्पादों को संशोधित करने के लिए engraftment और vivo में हठ बढ़ाने के लिए, के रूप में पहले मानव और गैर अमानवीय रहनुमा CD34+ HSPC उत्पादों४०,४१के लिए दिखाया गया है ।

LVs जीनोम में बेतरतीब ढंग से एकीकृत करता है, के रूप में उनके पूर्ववर्ती, gammaretroviral वैक्टर (RVs) । हालांकि कम नैदानिक परीक्षण डेटा RVs के लिए की तुलना में LVs के लिए उपलब्ध है, वर्तमान निष्कर्षों का सुझाव है कि एल. वी. के. आर. वी. रणनीतियों कम अक्सर इस जोखिम४२के कारण प्रयोग किया जाता है । एक और सीमा है कि जीन संशोधन की क्षमता से कम है १००%, और जीन संशोधित कोशिकाओं का अनुपात vivo में नहीं बनी रहेगी । उदाहरण के लिए, एक ६०% जीन संशोधित HSPC उत्पाद 30% दीर्घकालिक engrafting, जीन संशोधित कोशिकाओं में परिणाम हो सकता है । जब भी संभव हो, जीन थेरेपी रणनीतियों यहां प्रस्तुत transgenes कि चिकित्सीय प्रभावकारिता प्रदान शुरू करने से इस सीमा पर काबू पाने के लिए डिज़ाइन कर रहे हैं, यहां तक कि जब टेम के एक अल्पसंख्यक में व्यक्त-मूल कोशिकाओं8,४३ .

भविष्य LV-आधारित HSPC संशोधन दृष्टिकोण के लिए उज्ज्वल है । हम नियमित रूप से इस प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए "जीन-मार्क" कोशिकाओं, vivo1में ट्रैकिंग सक्षम करने से । हम भी एक ही जानवर के भीतर LV वेरिएंट की तुलना करने के लिए इस रणनीति को अनुकूलित किया है । इस तरह के "प्रतियोगी" प्रत्यारोपण अलग वैक्टर की तुलना की अनुमति (जैसे, बेहतर दक्षता के साथ उन की पहचान करने के लिए) और transgenes (जैसे, विभिन्न HSPC उपसेट को ट्रैक या उन्हें रोग मॉडल में तुलना करने के लिए). आगे बढ़ रहा है, हम मानते है कि HSPCs में LV जीन थेरेपी जीन संपादन दृष्टिकोण के साथ एक अनिवार्य उपकरण रहेगा, विशेष रूप से स्थितियों में जहां बड़े आनुवंशिक कार्गो छुरा एक व्यक्ति के जीवनकाल के लिए व्यक्त किया जाना चाहिए ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक इस पांडुलिपि, ग्राफिक डिजाइन के लिए जिम Woolace, और वेरोनिका नेल्सन और Devikha Chandrasekaran प्रोटोकॉल के विकास में भाग लेने के लिए तैयार करने के लिए हेलेन क्रॉफर्ड धंयवाद । इस प्रोटोकॉल का विकास NIH राष्ट्रीय एलर्जी और संक्रामक रोगों के संस्थान (R01 AI135953 और AI138329 से H.P.K.) और राष्ट्रीय हार्ट, फेफड़े, और रक्त संस्थान (R01 HL136135, HL116217, P01 HL122173, और U19 से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था HL129902 to H.P.K.), साथ ही NIH P51 OD010425 और, भाग में NIH के माध्यम से NCI कैंसर केंद्र, सहायता अनुदान P30 CA015704. H.P.K. एक Markey आणविक दवा अन्वेषक है और जोस Carreras के उद्घाटन प्राप्तकर्ता के रूप में समर्थन प्राप्त/ई. Donnall थॉमस संपंन चेयर कैंसर अनुसंधान के लिए और फ्रेड हच सेल और जीन थेरेपी के लिए संपंन कुर्सी ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Stemspam SFEM II ("HSPC") Media StemCell 09655
Hank's Balanced Salt Solution Gibco 14175095
Phosphate-Buffered Saline Gibco 14190-144
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140-122
Dimethyl Sulfoxide Sigma Aldrich D2650-100
100% Ethanol Decon labs M18027161M
Cyclosporine Sigma 30024-25MG
500 mM EDTA Invitrogen 15575-038
Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum Sigma Aldrich PS-0500-A
CH-296/ RetroNectin (2.5 mL, 1 µg/µL) TaKaRA T100B
Bovine Serum Albumin Sigma A7906-100g
HEPES Sigma H9897
Rat anti-mouse IgM magnetic beads Miltenyi Biotec 130-047-301
Recombinant HumanStem Cell Factor (SCF) Peprotech 300-07
Recombinant Human Thrombopoietin (TPO) Peprotech 300-18
Recombinant Human FMS-like tyrosine kinase 3 (FLT-3) Peprotech 300-19
Protamine sulfate Sigma P-4505
14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube Corning 352059
Colony Gel 1402 ReachBio 1402
QuadroMACS Separators Miltenyi Biotec 130-090-976
MACS L25 Columns Miltenyi biotec 130-042-401
10 mM PGE2 Cayman Chemical 14753-5mg
TC-treated T-75 flasks Bioexpress T-3001-2
Non-TC-treated T-75 flasks Thermo-Fisher 13680-57
20 mL syringes BD Biosciences 302830
16.5 G needles BD Precision 305198
Syringe Tip Cap BD Biosciences 305819
QuickExtract DNA Solution Epicentre QE09050
8-tube strip cap PCR Tubes USA scientific 1402-2708
96-well Thermocycler Thermo-Fisher 4375786
Pre-Separation filters Miltenyi Biotec 130-041-407
Strainer, Cell; BD Falcon; Sterile; Nylon mesh; Mesh size: 70um; Color: white; 50/CS fisher scientific 352350
Ultracomp ebeads eBioscience 01-2222-42
MACSmix Tube Rotator Miltenyi 130-090-753
3 mL Luer-Lock Syringes Thermo-Fisher 14823435
35 mm x 10 mm cell culture dish Corning 430165
60 mm x 15 mm cell culture dish Corning 430196
150 mm x 25 mm cell culture dish Corning 430599
Non TC treated flasks Falcon 353133
Qiagen DNA extraction Qiagen 51104
PE Anti-Human CD90 (Thy1) Clone:5E10 Biolegend 328110
PE-CF594 Mouse Anti-Human CD34 Clone:563 BD horizon 562449
APC-H7 Mouse Anti-Human CD45RA Clone: 5H9 BD Pharmingen 561212
V450 Mouse Anti-NHP CD45 Clone:d058-1283 BD Biosciences 561291
Autologous Serum Collected from autologous host and cryopreserved prior to mobilization and collection of CD34+ HSPCs N/A Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).
Virus-Conditioned Media (VCM) Kiem Lab, FHCRC Co-operative Center for Excellence in Hematology (CCEH) N/A Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).
Anti-CD34 antibody, Clone 12.8 Kiem Lab N/A Beard, B. C. et al. Efficient and stable MGMT-mediated selection of long-term repopulating stem cells in nonhuman primates. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2345-2354, (2010).
Lenti F primer: AGAGATGGGTGCGAGAGCGTCA Integrated DNA Technologies N/A Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).
Lenti R primer: TGCCTTGGTGGGTGCTACTCCTAA Integrated DNA Technologies N/A Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).
Actin F primer: TCCTGTGGCACTCACGAAACT Integrated DNA Technologies N/A Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).
Actin R primer: GAAGCATTTGCGGTGGACGAT Integrated DNA Technologies N/A Peterson, C. W. et al. Multilineage polyclonal engraftment of Cal-1 gene-modified cells and in vivo selection after SHIV infection in a nonhuman primate model of AIDS. Mol Ther Methods Clin Dev. 3 16007, (2016).

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आनुवंशिकी १४४ अंक टेम स्टेम और जनक कोशिकाओं जीन थेरेपी hematopoiesis अमानवीय रहनुमा मॉडल सेल अलगाव lentiviral वैक्टर
तैयारी और अमानवीय रहनुमा टेम स्टेम और जनक कोशिकाओं के जीन संशोधन
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Radtke, S., Perez, A. M., Venkataraman, R., Reddy, S., Haworth, K. G., Humbert, O., Kiem, H. P., Peterson, C. W. Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (144), e58933, doi:10.3791/58933 (2019).

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