Summary
여기, 형광 펩 티 드 대신 네이티브 단백질 분해성 기판으로 사용 되는 수정 된 zymographic 기법에 대 한 자세한 프로토콜 선물이. 전기 이동 법 형광 펩 티 드 zymograms에 생물 학적 샘플의 이전 zymographic 기법 보다는 프로 테아의 광범위의 검색 수 있습니다.
Abstract
이 방법의 목적은 복잡 한 생물 학적 샘플의 분해 활동을 측정 하는 것입니다. 샘플 분자량 분해성 기판 임베디드 해결 젤 통해 전기 이동 법을 사용 하 여 구분 됩니다. 이 방법은 다릅니다 전통적인 젤 zymography에서 담금질된 fluorogenic 펩 티 드 covalently 전체 길이 단백질, 젤라틴 또는 카 세 인 등 대신 해결 젤에 통합 됩니다. Fluorogenic 펩 티 드의 사용에는 추가 착 단계 없이 분해 활동의 직접 감지 수 있습니다. 생물 학적 샘플 내에서 효소 쪼개 침묵과 fluorogenic 펩 티 드, 형광에 있는 증가 결과로. 젤에 형광 신호 다음 표준 형광 젤 스캐너로 몇 군데 이며 densitometry를 사용 하 여 계량 합니다. 분해성 기판으로 펩 티 드를 사용 하 여 크게 zymographic 기술로 감지 가능한 프로 테아 제를 확장합니다.
Introduction
젤 zymography은 생물 학적 샘플, 체액 세포 배양1,2,3등 분해 활동을 측정 하는 생물학 기술입니다. 샘플 그들의 분자 무게 분해성 기판 임베디드 polyacrylamide 젤을 통해 전기 이동 법으로 구분 됩니다. 젤라틴, 카 세 인, 콜라겐과 엘라 스 틴, 매트릭스 metalloproteinases (MMPs)-1,-2,-3,-7,-8,-9, 및-11, cathepsins1,2 의 다양 한 뿐만 아니라의 활동을 측정 하기 위해 사용 된 일반적인 분해성 기판 포함 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8. 후 전기 이동 법, 효소 renatured와 젤 내 단백질을 저하 될 수. 전통적인 젤 zymography, 젤 Coomassie 파란 등 단백질 염료와 스테인드 하 고 효소 활동 즉, 흰색 밴드 (단백질의 저하)는 진한 파란색 배경에 신호의 손실으로 감지 합니다.
여기, 우리는 젤 zymography, 있는 분해성 기판은 짧은, fluorogenic 펩 티 드 covalently polyacrylamide 젤 (그림 1)에 통합 하는 대체 방법에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 분해성 기판으로 합성 펩 티 드의 대체 기본 단백질9전통적인 젤 zymography에 비해 프로 테아의 광범위의 검색 수 있습니다. Fluorogenic 펩 티 드의 공유 결합을 펩 티 드 보급 및 이전 방법9,10관찰 하는 젤 전기 이동 법 동안 마이그레이션 방지 합니다. 또한, fluorogenic 기판의 사용은 추가 얼룩-얼룩 단계 없이 프로 테아 제 활동의 직접 검출을 수 있습니다. 이 방법의 전반적인 목표는 zymogram 젤에서 fluorogenic 펩 티 드의 공유 결합을 통해 생물학 견본에서 효소 활동의 탐지.
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Protocol
1입니다. 해결 젤 층의 준비
- 10 %polyacrylamide 젤 솔루션 표 1에 의하여 해결을 준비 합니다. 즉시 그들의 추가 시작 중 합 반응으로 젤을 따르기 이전 Tetramethylethylenediamine (TEMED)와 암모늄 Persulfate (AP)를 추가 합니다.
- 10% 해결 젤 솔루션 빈 1.5 m m 미니 젤 카세트 절반 방법 (5 mL)을 작성.
- 레벨 젤 생산 및 거품 방지 polyacrylamide 젤의 맨 소 프로 파 놀 (~ 500 µ L)의 얇은 레이어를 추가 합니다. 남은 polyacrylamide 솔루션을 사용 하 여 중 합 반응의 진행 상황을 추적할. 때 튜브에 polyacrylamide가 완전히 경화, 반응은 완료 (40 분)입니다.
2. Azido-PEG3-maleimide 링커 분자의 준비
- 첫 번째 해결 젤 레이어 polymerizing 동안-20 ° C 저장에서 azido-PEG3-maleimide 키트를 검색 하 고 실내 온도 도달 하는 구성 요소를 허용. 각 키트에는 두 개의 구성 요소가 있습니다. 유리병 1 maleimide-NHS 에스테 르를, 회색 단색 미색에 포함 되어 있습니다. 유리병 2 azido-PEG3-아민, 약간 노란색 오일에 포함 되어 있습니다.
참고: 저자 제안만 시간 (1-2 시간)의 짧은 기간 동안 저장할 수로 25 mg azido-PEG3-maleimide 키트를 사용 하 여-20 ° C에서 저하을 시작 하기 전에 준비 되 고 후. 25 밀리 그램 10 펩 티 드 젤을 생산 하기 위해 충분 하다. 준비의 3 주 안에 젤을 사용 합니다. - 제조업체에서 권장 하는 디 메 틸 sulfoxide (DMSO) 및 30에 대 한 소용돌이의 볼륨에서 유리병 2의 구성 요소를 분해 s 액체 되도록 잘 혼합 되어있다.
- 파문 bar가 포함 된 깨끗 하 고 마른 100 mL 둥근 바닥 플라스 크에 유리병 1의 내용을 전송 합니다.
참고: 아세톤과 플라스 크를 헹 구 고 습기 반응에 방해가 되지 않도록 하려면 사용 하기 전에 완전히 건조. - 즉시 플라스 크의 입으로는 주사기 구멍 수는 막으로 고무 심장 마 개를 삽입 합니다. 플라스 크에 들어가기에서 습기를 방지 하기 위해 신속 하 게 작동 합니다.
- 삽입 2 18 게이지 횡 경 막에 바늘 주사기 하 고 하나는 불활성 가스 탱크 (예: 아르곤 가스)를 연결 합니다. 3 분 믹스에 대 한 플라스 크를 채우기 위해 불활성 가스 튜브 1 2 불활성 가스에서 방지 하 고 바람직하지 않은 반응 제품의 구성 요소를 허용 합니다.
주의: 두 번째 주사기 바늘 불활성 가스로 채우고 플라스 크에서 흐름을 플라스 크에 포함 된 대기 공기 수 있도록 통풍구를 제공 하는. 환기 바늘을 포함 하는 것을 잊지 마세요! - 불활성 가스에서 종료 하 고 바늘에서 분리. 주사기를 사용 하 여 플라스 크에 유리병 2의 전체 내용을 삽입할.
- 바늘과 주사기를 제거 하 고 교 반 하면서 실 온에서 30 분 동안 혼합 구성 요소를 허용 합니다.
- 고무 심장 마 개를 제거 하 고 깨끗 한 5 mL 원심 분리기 튜브에 콘텐츠를 전송. Azido-PEG3-maleimide 솔루션은 실 온에서 1 시간 안에 사용 되어야 한다.
3. 젤 레이어를 해결 하는 펩 티 드의 준비
- 첫 번째 해결 젤 레이어 생산은, 일단 소 프로 파 놀 레이어 붓는 다. 젤 상단 pipetting 1 mL 젤 상단에 있는 이온된 수로 린스 하 고 물을 붓는 다.
- -80 ° C 저장소에서 thiol 기능성된 형광 펩 티 드를 검색 하 고 실 온에서 해 동 있습니다.
참고: 앞에서 설명한11,12thiol 기능성된 펩 티 드를 준비 될 수 있다. 상업적으로 이용 가능한 펩 티 드 또한 사용 될 수 있습니다 하지만 maleimide thiol 있도록 터미널 시스테인 잔류물의 추가 클릭 반응 필요. 10 m m 재고 농도에 펩 티 드를 분해 하 고 반복된 freeze-thaw 주기를 제한 하는 작은 (30 uL) aliquots에서-80 ° C에서 그것을 저장. - Azido-PEG3-maleimide 링커 분자 및 표 1에 의하여 형광 펩 티 드를 포함 하는 젤 솔루션 해결 10%를 준비 합니다. 즉시 그들의 추가 시작 중 합 반응으로 젤을 따르기 이전 APS와 TEMED를 추가 합니다.
- 펩 티 드 젤 솔루션을 해결 절반 젤 카세트 (3 mL)의 나머지 부분을 채우십시오.
참고: 다중 층 해결 젤 접근 펩 티 드와 각 젤에 필요한 링커의 줄어듭니다. 펩 티 드 해결 젤 층의 크기는 필요에 따라 분자 무게의 더 큰 범위에 맞게 조정할 수 있습니다. - 레벨 젤 생산 및 거품 방지 polyacrylamide 젤의 맨 소 프로 파 놀 (~ 500 µ L)의 얇은 층을 플라스틱. 남은 polyacrylamide 솔루션을 사용 하 여 중 합 반응의 진행 상황을 추적할. 때 튜브에 polyacrylamide가 완전히 경화, 반응은 완료 (40 분)입니다.
참고: 형광 펩타이드는 빛에 민감한. 젤 젤 준비, 전기, 세탁 및 개발 하는 동안 photobleaching를 방지 하기 위해 알루미늄 호 일로 덮여 유지. - 소 프로 파 놀 레이어 부 어 해결 단계 3.1에서 이온된 수 젤 펩 티 드의 상단을 씻어.
- 경우 4 단계로 진행 즉시는 젤을 사용 하 여, 그렇지 않으면, 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)는 젤 밖으로 건조 하지 않도록 플라스틱 상자에 4 ° C에서 x 1의 100 mL에 준비 된 젤을 담가. Photobleaching를 방지 하기 위해 알루미늄 호 일에 상자를 포장. 젤은 사용 전에 최대 3 주 동안 PBS에 저장할 수 있습니다.
4입니다. 겹쳐 쌓이는 젤의 준비
- 표 1당 5%의 스태킹 젤 솔루션을 준비 합니다. 즉시 그들의 추가 시작 중 합 반응으로 젤을 따르기 이전 APS와 TEMED를 추가 합니다.
- 겹쳐 쌓이는 젤 솔루션 젤 카세트 (~ 2 mL)의 남은 빈 부분을 채우십시오.
- 신속 하 게 1.5 m m 젤 빗 쌓기 젤 레이어 삽입, 확신 없는 거품 남아 있다 우물 아래 갇혀. 남은 polyacrylamide 솔루션을 사용 하 여 중 합 반응의 진행 상황을 추적할. 때 튜브에 polyacrylamide가 완전히 경화, 반응 완료 (~ 10 분)입니다.
- 부드럽게 빗 및 테이프 젤 카세트의 뒷면에서 제거 합니다.
5입니다. 전기 이동 법에 대 한 생물 학적 샘플의 준비
- 비 감소 조건2아래 설명 되어 있는 대로 조절된 세포, 세포 lysates, 조직 homogenates, 언론과 MMP 표준 준비. 샘플이 열 하지 마십시오.
- 예를 들어 다음과 같이 조건된 셀 미디어를 준비 하십시오.
- 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 문화 미디어에 6 잘 플레이트에 플레이트 40, 000 셀/cm2 셀. 24 시간 동안 습도 챔버 (5% CO2 37 ° C에서)에 셀을 품 어 고 합류 70-80%에 도달 하도록 허용 합니다.
참고: 셀 24 시간 후 원하는 confluency를 도달 하지 않은 경우 추가 24 시간에 대 한 10 %FBS 문화 매체에서 성장 하도록 허용 합니다. - PBS로 두 번 셀을 세척 하 고 혈 청 자유로운 문화 매체의 2 개 mL를 추가. 추가 24 시간 동안 습도 챔버 (5% CO2 37 ° C에서)에 셀을 품 어.
- 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 각 우물에서 바른된 미디어를 수집 합니다. 어떤 세포 파편을 제거 하려면 3 분 1200 rpm에서 미디어 원심 상쾌한 고 15 mL, 10 kDa 분자량 컷오프 원심 필터 단위를 사용 하 여 집중. X g 진동 물통 회전자에서 15 분 또는 고정된 각도 터에 15 분 동안 5000 x g 4000에서 필터 단위 원심
참고:이 단계는 선택 사항 하지만 펩 티 드 zymography 젤에서 분해 밴드의 강도 향상 시킬 수 있습니다. - 신선한 1.5 mL 원심 분리기 튜브에 집중 된 여과 액을 전송 합니다. 최대 3 개의 freeze-thaw 주기-80 ° C에서 약 수와 매장 샘플.
- 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 문화 미디어에 6 잘 플레이트에 플레이트 40, 000 셀/cm2 셀. 24 시간 동안 습도 챔버 (5% CO2 37 ° C에서)에 셀을 품 어 고 합류 70-80%에 도달 하도록 허용 합니다.
- 계량 표준 단백질 정량화 분석 결과 사용 하 여 단백질 콘텐츠 (예: BCA, Bradford 분석 실험, 등).
6. 펩 티 드 Zymography 젤에서 전기 이동 법 생물의 샘플
- 기존의 zymography 샘플 버퍼에서 샘플을 분해 (62.5 mM Tris HCl, pH 6.8, 25% 글리세롤, 4 %SDS, 0.01 %bromophenol 블루). 세포 및 조직 샘플 잘 당 총 단백질의 ~ 30 µ g을 사용 하는 것이 좋습니다, 그리고 MMP 표준 단백질의 50-100 ng.
- 추가 1의 400 mL 젤 기구 하 트리 스-글리신 SDS 실행 버퍼 x. 잘 당 샘플의 최대 35 µ L을 로드 합니다. 1.5 시간 또는 분자량 표준 관심의 프로 테아 제 펩 티 드 (이 보이는 오렌지 색상) 젤 레이어를 해결 내는 나타냅니다 때까지 4 ° C에서 120 V에서 샘플을 실행 합니다.
참고: 대부분 MMPs와 그들의 이체 35-100 kDa의 범위 내에서을. 분자량 표준 나타냅니다 그 무게 젤 레이어를 해결 하는 펩 티 드 내, 전기 이동 법 중지 될 수 있습니다. 동일한 원리는 알려진된 분자 무게와 프로 테아의 다른 클래스에 적용할 수 있습니다. 분자 무게의 더 큰 범위에 걸쳐 여러 프로 테아 제를 감지 하는에 관심이 있다면, 해결 젤 계층의 크기를 줄일 하 고 펩 티 드 해결 젤 계층의 크기를 증가. - 전기 이동 법, 플라스틱 카세트에서는 젤을 제거 하 고 2.5% 트라이 톤 X-100, 1 µ M ZnCl2, 그리고 50 m m에서 5 mM CaCl2 renaturing 버퍼에 부드러운 동요에서 실내 온도에 3 시간 10 분 대 한 젤을 씻어 Tris HCl, pH 7.5
- 전송 개발 버퍼 솔루션을 포함 하는 1% 트라이 톤 X-100, 1 µ M ZnCl2 젤 및 50 mM Tris HCl, 신선한 개발 15 분 바꾸기 위한 pH 7.5에에서 5mm CaCl2 솔루션을 버퍼링 하 고 24 시간 동안 부드러운 동요에서 37 ° C에서 젤을 품 어 는 젤 솔루션에서 submersed 완벽 하 게는 다는 것을 확인.
7. 영상 펩 티 드 Zymography의 젤
- 24 시간 후에 형광을 사용 하 여 이미지 젤 젤 스캐너/영상 적절 한 여기 및 방출 필터를 사용 하 여. 예를 들어 대표적인 결과에 표시 된 펩 티 드 젤 Fluorescein로 활용 하 고 488의 여기 필터를 사용 하 여 몇 군데 있었다 nm와 521의 방출 필터 nm. 당신의 fluorophore에 대 한 적절 한 필터를 사용 하 여 분해 활동의 탐지를 극대화할 것입니다.
참고: 이미지 또한 ethidium 평범한 사람으로 물 DNA 젤의 이미지를 위해 자주 사용 하는 UV transilluminator을 갖춘 젤 영상을 함께 취할 수 있습니다. 젤 UV transilluminator를 사용 하 여 이미지 (365 nm) 설정 및 590의 방출 필터 nm. - ImageJ13설명 되어 있는 대로 사용 하 여 밴드 농도의 densitometric 평가 실시 합니다.
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Representative Results
여기 설명 하는 방법을 사용 하 여, 두 개의 형광 효소 분해 펩 티 드 polyacrylamide 젤에 통합 했다: GGPQG↓IWGQK(PEG)2C (텍스트와 그림을 통해 QGIW로 약식)와 GPLA↓CpMeOBzlWARK(PEG)2 C (텍스트와 그림을 통해 LACW로 약식). ↓ 분열의 위치를 나타냅니다. QGIW는 콜라겐은-난 파생 시퀀스 세포 collagenases14을 탐지 하도록 설계 되었습니다. LACW는 MMP 14 MMP 1115의 검출에 대 한 최적화 된 시퀀스입니다. 펩 티 드 dabcyl (끄는) 및 fluorescein (fluorophore) N-hydroxysuccinimide (NHS)-에스테 르를 사용 하 여 표시 됩니다 아민 화학11. 적절 한 형광 냉각 및 표준 버퍼에 용 해는 새로운 fluorogenic 펩 티 드를 개발 하는 것이 어려울 수 있습니다. 따라서, C 터미널 시스테인을 포함 하도록 상용 형광 효소 기질에서 펩 티 드 순서를 적응은 종종 새로운 fluorogenic 센서를 개발 하는 성공적인 전략. 설명 하기 위해 복잡 한 효소 혼합물을 분리 하는 펩 티 드 zymography의 기능은, 바른된 미디어는 두 다른 암 세포 선에서 수집 되었다. HT1080 fibrosarcoma 세포와 MDA-MB-231 유 방 선 암 세포 10 %FBS 미디어에서 24 시간 후 미디어 추가 24 시간 동안 혈 청 자유로운 미디어와 대체 되었다 도금 했다. 바른된 미디어 샘플 수집 그리고 10 kDa 분자량 컷오프 원심 필터 단위를 사용 하 여 집중. 미디어의 단백질 콘텐츠는 표준 µBCA 분석 결과 사용 하 여 측정 했다. 바른된 미디어에서 단백질의 30 µ g electrophoresed 했다. 긍정적인 컨트롤로 우물 유형 나 세균성 콜라 (100 µ g) 또는 정화, MMP 9 활성화 (125 기)도 포함 됐다. 젤 젤 (그림 2) 내 분해성 기판의 MMP 분열 수 있도록 버퍼를 개발에 24 h에 대 한 인 큐베이 팅 되었고 그 후 몇 군데. 형광 이미징만 단일 밴드 QGIW 젤 (그림 2D14) 내에서 분명 했다 동안 수많은 밴드 LACW 펩 티 드 젤 (그림 2A14), 내 표시 했다 밝혔다. LACW 젤 젤라틴 zymography (그림 2G14), 비해 더 분해 밴드, 프로 테아 제 보다 생물 학적 샘플 내 존재의 넓은 범위를 검색 하는 펩 티 드 zymography의 능력을 보여주는 검색 수 있었다 네이티브 기질을 사용 하 여 전통적인 방법입니다.
MMPs 시각화 된 밴드의 정체성을 확인 하려면 펩 티 드 zymography 젤 중 20 µ M를 포함 하는 개발 버퍼에서 incubated 했다 GM6001, 넓 스펙트럼 MMP 억제제 또는 10 µ M E-64, 일반 cathepsin 억제제. GM6001와 LACW 펩 티 드의 치료 젤 (그림 2B14) E-64 (그림 2C14) 치료 했다 아무 뚜렷한 효과 밴드의 강도 감소. GM6001와 QGIW 펩 티 드 젤의 치료 이전 본된 밴드 (그림 2E14)의 완전 한 제거 귀착되는. 예상 대로 E-64 어떤 효과 (그림 2F14)는 하지 않았다. 둘 다 펩 티 드 젤에서 GM6001 저해 MMP 9 활동 순화 하지만 미치지 않았다 세균 콜라 활동, 형광의 시각화 된 증가 MMPs 시험된 생체 내 존재에 의해 분해 활동의 결과 추가 확인 샘플입니다.
현재 골드 표준, 젤라틴 zymography, 펩 티 드 zymography의 감도 비교 하는 민감도 분석 정화, 활성화 된 MMP-9를 사용 하 여 실시 했다. MMP-9 (1-250 ng)의 직렬 희석 LACW, QGIW 및 젤라틴 zymography 젤 (그림 3A14) electrophoresed 했다. 개발 및 형광 이미징, 밴드 농도 ImageJ로 계량 했다 및 정규화 된 밴드 강도 플롯 최대 신호 (그림 3B 의 50%를 생산 하는 EC50 값의 농도 계산 하기 위해 생성 된 14). LACW 펩 티 드 젤 17.28 EC50 값 MMP 9의 작은 농도 감지할 수 있었다 59.50의 값 QGIW 및 젤라틴 zymograms에 비해 ng, ng 및 31.85 ng, 각각. 이러한 데이터는 펩 티 드 zymography 사용 하 여 일치 하거나 젤라틴 같은 네이티브 기판의 감도 한계를 초과 수 있습니다 나타냅니다.
그림 1: 형광 펩 티 드 zymography 프로세스의 도식. (A) 멀티 레이어 polyacrylamide 젤 해결의 준비. 젤 솔루션 해결 표준 10%는 펩 티 드 zymography 젤의 첫 번째 레이어를 형성 하는 데 사용 됩니다. 담금질, 형광 펩 티 드를 포함 된 레이어를 젤 두 번째 10% 해결 하 고는 azido-PEG3-maleimide 링커 분자는 다음 첫 번째 레이어 위에 생산. 최종 상위 계층 5% 겹쳐 쌓이는 젤입니다. (B) 표준 전기 비 감소에서 조건 기능성 polyacrylamide 젤에서 샘플 포함 하는 효소를 분리 하는 데 사용 됩니다. SDS를 제거 하 고 renature에 단백질은 젤 세척 된다. 젤 다음 수 프로 테아 제는 fluorogenic 펩 티 드, 증가 형광의 결과로 다니엘을 37 ℃에서 24 h에 대 한 개발 버퍼에서 알을 품는. 이 형광, 효소 활동, 해당 488 nm의 여기 및 521의 방출에서 형광 젤 영상 장치를 사용 하 여 캡처된 다음 nm (Biotechniques 및 미래 과학14허가 적응). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 세포 분 비 프로 테아 제 인간 암 세포 선에서의 탐지. 콜라 효소 (100 µ g), MMP 9의 분석 (125 기) 셀 미디어 HT1080 fibrosarcoma (30 µ g) 및 LACW 및 QGIW 펩 티 드 젤 MDA-MB-231 선 암 유 방 암 (30 µ g) 셀 라인에서 조절 하 고. 젤은 DMSO (차량 통제) (& D)로 치료, GM6001 (B & E) 취급 또는 E-64 (C & F)으로 처리 있었다. (G) HT1080 및 MDA-MB-231의 젤라틴 zymogram 조절 셀 미디어 (Biotechniques, 미래 과학14허가 적응). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 펩타이드와 젤라틴 Zymograms의 MMP 9 감도의 비교. (A) QGIW (맨 위), LACW (가운데)와 젤라틴 (아래) zymography 젤 MMP 9의 직렬 희석을 복종 되었다. (B) 정규화 밴드 농도 MMP 9 농도 대 한 플롯 되었고 4 개의 매개 변수 슬로프 곡선에 맞게. EC50 값 절반 최대 신호에서 농도 나타냅니다. 결과 n으로 표시 되는 = 3, SD (Biotechniques 및 미래 과학14허가 적응) 의미. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 결심 젤 | ||||
| 재고 하자마자 | 최종 하자마자 | 5 젤 | 10 젤 | |
| 아크릴 아 미드/비스-아크릴 (19:1) | 40% | 10% | 10 mL | 20 mL |
| Tris HCl pH 8.7 | 1 M | 0.375 M | 15 mL | 30 mL |
| 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS) | 20% | 0.10% | 200 Μ L | 400 Μ L |
| 이온된 H2O | -- | -- | 14.4 mL | 28.7 mL |
| TEMED | -- | -- | 40 Μ L | 80 Μ L |
| APS | 10% | 0.10% | 400 Μ L | 800 Μ L |
| 총 볼륨 | 40 mL | 80 mL | ||
| 펩 티 드 해결 젤 | ||||
| 재고 하자마자 | 최종 하자마자 | 5 젤 | 10 젤 | |
| 아크릴 아 미드/비스-아크릴 (19:1) | 40% | 10% | 5 mL | 10 mL |
| Tris HCl pH 8.7 | 1 M | 0.375 M | 7.5 mL | 15 mL |
| 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS) | 20% | 0.10% | 100 Μ L | 200 Μ L |
| 이온된 H2O | -- | -- | 6.5 Μ L | 13 mL |
| 형광 성 펩 티 드 | 10 m m | 75 Μ M | 150 Μ L | 300 Μ L |
| Azido-PEG3-Maleimide CrossLinker | 75 m m | 1.5 m m | 400 Μ L | 800 Μ L |
| TEMED | -- | -- | 20 Μ L | 40 uL |
| APS | 10 | 0.10% | 200 Μ L | 400 Μ L |
| 총 볼륨 | 20 mL | 40 mL | ||
| 겹쳐 쌓이는 젤 | ||||
| 재고 하자마자 | 최종 하자마자 | 5 젤 | 10 젤 | |
| 아크릴 아 미드/비스-아크릴 (19:1) | 40% | 5% | 2.5 mL | 5 mL |
| Tris HCl pH 6.9 | 1 M | 0.125 M | 2.5 mL | 5 mL |
| 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS) | 20% | 0.10% | 100 Μ L | 200 Μ L |
| 이온된 H2O | -- | -- | 14.75 mL | 29.5 mL |
| TEMED | -- | -- | 50 Μ L | 100 Μ L |
| APS | 10% | 0.10% | 100 Μ L | 200 Μ L |
| 총 볼륨 | 20 mL | 40 mL | ||
표 1: 형광 펩 티 드 zymography 젤을 준비 하기 위한 시 약 테이블. 농도 및 다층 펩 티 드 zymography의 준비에 대 한 볼륨 젤.
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Discussion
현재 zymographic 기법으로 polyacrylamide 젤 베이스의 검출에 대 한 기본 기판의 설립에 의존합니다. 이러한 기술을 광범위 하 게 사용을 얻고 있다, 하는 동안 그들은 여전히 프로 테아 제 감지할 수의 숫자에 제한 됩니다. 여기, 프로토콜은 형광, 효소 분해 펩 티 드에 polyacrylamide 젤 해결에 통합 하는 설명 했다. 사용 하 여 연결 공유는 azido-PEG3-maleimide 링커 분자 수 있습니다 분리 및 다양 한 프로 테아의 검출 보다 현재 네이티브 기판으로 달성. 형광 펩 티 드의 높게 가변 자연 연구원 그들의 프로 테아 제 관심의 대상 기판 설계 하는 능력을 준다. 수많은 펩 티 드 기질 다양 한 프로 테아 제 펩 티 드 라이브러리를 사용 하 여에 대 한 확인 되었습니다 그리고 상용 소스 사용자 지정 펩 티 드 제조의 성장 수가 있다. 적절 한 형광 냉각 및 표준 버퍼에 용 해는 새로운 fluorogenic 펩 티 드를 개발 하는 것이 어려울 수 있습니다. 따라서 상업적으로에서 펩 티 드 순서를 적응 C 터미널 시스테인을 포함 하도록 사용 가능한 형광 효소 기판은 종종 새로운 fluorogenic 센서를 개발 하는 성공적인 전략.
이 프로토콜을 완료 하는 동안 한다 주의 형광 펩 티 드 젤을 처리 하는 동안 검색 된 형광 신호를 크게 줄일 수 있습니다이 빛에 과도 한 노출 방지 하기 위해. 또한, 각 젤에 사용 하는 펩 티 드의 현재 농도 75 µ M. 이 낮은 농도 펩 티 드, 펩 티 드를 초과 azido-PEG3-maleimide 솔루션 적어도 20 모 랄에서 솔루션에 추가 되어야 합니다 염두에 유지 보존 하기 위해 조정할 수 있습니다. Azido-PEG3-maleimide 키트 3 크기에 구입할 수 있다 (25, 100 및 1000 mg). 저자에 준비 솔루션-20 ° c.에 시간의 짧은 기간에만 저장할 수 있습니다 25 밀리 그램 키트를 구입 하는 것이 좋습니다. 또한, 25 밀리 그램 키트 준비의 3 주 이내 사용 해야 하는 10 펩 티 드 젤을 준비 해도 됩니다.
Zymography의 제한 중 하나입니다 시각화 된 효소 분자 무게에 상당한 중복으로 인해 밴드의 정확한 id를 분별에 어려움. 미래 연구, 그것 됩니다 보조 분석 질량 분석16,17같은 기술을 사용 하 여 자신의 정체성을 중요. Zymography의 또 다른 한계는 SDS와 전기 이동 법에 의해 부분 변성 시키기 다음 그들의 활성 구조를 단백질을 refolding 이다. 이러한 프로세스는 proteolytically 비활성 단백질을 활성 렌더링 protease의 활성 구조에 변화를 일으킬 수 있습니다. 예를 들어 프로-MMP-2 억제 프로 도메인 그대로 인해 불구 하 고 젤라틴 zymograms에서 검출 될 수 있다 중간 활성 폼에는 renaturation 하. 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA) 같은 보충 방법 또는 서 몰아내고 정체성과 관심의 효소의 전체 존재를 확인 하기 위해 사용할 수 있습니다.
이 문서는 현재 zymographic 기술의 감도 향상을 위한 형광 펩 티 드 기판의 사용을 보여줍니다. 순화 된 MMP-9를 사용 하 여, 농도 기온 변화도 분석 LACW, QGIW 및 젤라틴 zymography 젤 비교를 실시 했다. 현재, 젤라틴 zymography은는 표준 기술에 gelatinases (MMP-2-9)는 감지 생물학 견본에서. 3 기판의 EC50 값을 비교, LACW 펩 티 드 젤 낮은 값, 높은 감도 나타내는 했다. 특정 프로 테아의 탐지를 위한 다른 펩 티 드 시퀀스를 활용 하 여 잠재적으로 더욱 이러한 감도 높일 수 있다. 4-aminophenylmercuric 아세테이트 (APMA) 또는 헤 파 린 같은 MMP 활성화 에이전트는 젤의 치료 또한 앞에서 설명한18으로 약한 신호를 향상 사용할 수 있습니다.
생물학 학문을 위한 효소 활동의 측정 뿐만 아니라 효소 분해 펩 티 드 또한 종종 조직 공학, 약물 전달 응용 프로그램에 대 한 가교 합성 hydrogels 사용 됩니다. 제어 저하는 이러한 응용 프로그램에 대 한 중요 합니다. 현재, 이러한 펩 티이 드의 저하 속도 론 단일, 정제 효소를 사용 하 여 특징입니다. 그러나, 세포는 실제로 생산 하 고 이러한 펩 티이 드의 분열에 대 한 책임은 어떤 효소를 결정 어려운 결정 되었습니다. 세포 및 조직 관련 효소 출시 계량 펩 티 드 zymography 사용 하 여 이러한 펩타이드 가교 시퀀스의 합리적인 디자인에 크게 도움이 됩니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
자금에 오하이오 주립 대학 대학의 공학, 생명 공학 부, 그리고 종합 암 센터-아서 G. 제임스 암 병원과 리처드 J. Solove 연구소에 의해 제공.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mm Empty Gel Cassettes | ThermoFisher Scientific | NC2015 | |
| 1.5 mm, 10 well Empty Gel Cassette Combs | ThermoFisher Scientific | NC3510 | |
| 1x Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 10-010-049 | |
| 20% SDS Solution | Ambion | AM9820 | |
| 3x Zymography Sample Buffer | Bio-Rad | 1610764 | |
| 40% (w/v) Acrylamide/Bis (19:1) | Ambion | AM9022 | |
| 6 Well Tissue Culture Plates | ThermoFisher Scientific | 087721B | |
| Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit (10 kDa MWCO) | Sigma-Aldrich | UFC201024 | |
| Ammounium Persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Azido-PEG3-Maleimide Kit | Click Chemistry Tools | AZ107 | |
| Calcium Chloride | ThermoFisher Scientific | BP510100 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Fisher Scientific | BP231 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A416P | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| N N N' N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1645050 | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standard | Bio-Rad | 161-0374 | |
| PrecisionGlide Hypodermic Needles | Fisher Scientific | 14-826 | |
| Round Bottom Flask (100 mL) | Fisher Scientific | 50-873-144 | |
| Septum Rubber Stopper | Fisher Scientific | 50-872-546 | |
| Sterile Slip Tip Syringe (1 mL) | Fisher Scientific | 14-823-434 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Trizma hydrochlroide | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Typhoon 9410 Molecular Imager | GE Amersham | 8149-30-9410 | |
| Zinc Chloride | Sigma-Aldrich | 208086 |
References
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