Summary
Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para uma técnica modificada de zymographic na qual fluorescentes peptídeos são usados como substrato degradável no lugar de proteínas nativas. Eletroforese de amostras biológicas em Zimogramas peptídeo fluorescente permite a detecção de uma gama maior de proteases que as técnicas de zymographic anterior.
Abstract
A finalidade desse método é medir a atividade proteolítica de amostras biológicas complexas. As amostras são separadas por peso molecular usando electroforese através de um gel de resolução incorporado com um substrato degradável. Esse método difere zimografia tradicional gel, em que um peptídeo extinto fluorogenic covalentemente é incorporado o gel de resolução em vez de proteínas de comprimento total, tais como gelatina ou de caseína. Uso dos peptides fluorogenic permite a detecção direta de atividade proteolítica sem etapas adicionais de coloração. As enzimas dentro as amostras biológicas cleave o peptídeo fluorogenic temperada, resultando em um aumento na fluorescência. O sinal fluorescente no gel é então fotografada com um scanner padrão gel fluorescente e quantificados utilizando densitometria. O uso de peptídeos como substrato degradável grandemente expande as proteases possíveis detectáveis com técnicas de zymographic.
Introduction
Zimografia gel é uma técnica biológica usada para medir a atividade proteolítica dentro de amostras biológicas, tais como fluidos corporais ou meios de cultura de células a1,2,3. As amostras são separadas por seus pesos moleculares com a eletroforese através de um gel de polyacrylamide incorporado com um substrato degradável. Substratos degradáveis comuns incluem gelatina, caseína, colágeno e elastina, que foram utilizados para medir a atividade de metaloproteinases de matriz (MMPs) -1, -2, -3, -7, -8, -9 e -11, além de uma variedade de cathepsins1,2 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8. após eletroforese, as enzimas são renatured e permitido para degradar a proteína dentro do gel. Em zimografia tradicional gel, o gel está manchado com uma tintura de proteína, tais como o azul de Coomassie, e atividade de protease é detectada como uma perda de sinal, ou seja, branco de bandas (degradação da proteína) em um fundo azul escuro.
Aqui, descrevemos um protocolo para um método alternativo de zimografia de gel, em que o substrato degradável é um curto-circuito, fluorogenic peptídeo covalentemente incorporado o gel de poliacrilamida (Figura 1). A substituição de peptídeos sintéticos como os substratos degradáveis permite a detecção de uma gama maior de proteases em comparação com o tradicional gel zimografia com proteínas nativas9. Ligação covalente do peptide fluorogenic impede a difusão do peptide e migração durante a electroforese do gel observado com anteriores métodos9,10. Além disso, o uso de um substrato fluorogenic permite detecção direta de atividade de protease sem coloração adicionais e passos de coloração. O objectivo geral deste método é a detecção de atividade de protease em amostras biológicas através a incorporação covalente de peptídeos fluorogenic em géis de zymogram.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. preparação da camada de Gel de resolução
- Prepare uma poliacrilamida 10% resolução solução de gel, conforme tabela 1. Adicione o tempted (TEMED) e persulfato de amónio (APS) imediatamente antes de derramar o gel como sua adição inicia a reação de polimerização.
- Encha uma gaveta de mini gel vazio 1,5 mm (5 mL) a meio caminho com a solução 10% de gel de resolução.
- Adicione uma camada fina de isopropanol (~ 500 µ l) na parte superior do gel de polyacrylamide para produzir um gel de nível e evitar bolhas. Use a solução de poliacrilamida sobra para rastrear o progresso da reação de polimerização. Quando a poliacrilamida no tubo completamente solidificada, a reação é completa (~ 40 min).
2. preparação da molécula de vinculador Azido-PEG3-maleimide
- Enquanto a primeira camada de gel de resolução é a polimerização, recuperar o azido-PEG3-maleimide kit de armazenamento-20 ° C e permitir que os componentes atingir a temperatura. Existem dois componentes em cada kit. Frasco 1 contém um éster maleimide-NHS, um off-White para cinza sólida. Frasco 2 contém azido-PEG3-amina, um óleo ligeiramente amarelo.
Nota: Os autores sugerem usando o kit de azido-PEG3-maleimide de 25 mg, como só pode ser armazenado por curtos períodos de tempo (1-2 horas) a-20 ° C após estar preparado antes de começar a degradar. 25 mg é suficiente para produzir 10 géis de peptídeo. Use o gel dentro de 3 semanas de preparação. - Dissolver os componentes do frasco 2 no fabricante recomendado volume de Dimetilsulfóxido (DMSO) e vórtice por 30 s para garantir os líquidos foram bem misturados.
- Transferi o conteúdo do frasco 1 para um balão de fundo redondo de 100ml limpo e seco, contendo uma barra de agitação.
Nota: Lavar o balão com acetona e secar completamente antes do uso para evitar a umidade de interferir com a reação. - Imediatamente coloque uma rolha de septo de borracha com um diafragma que pode ser perfurado com uma seringa na boca do balão. Trabalhe rapidamente para impedir a entrada no balão de umidade.
- Inserir dois 18 calibre seringa de agulhas para o diafragma e se conectar a um tanque de gás inerte (por exemplo, gás argônio). Permitir que o gás inerte para encher o balão de 3 min. Misture os componentes de frascos 1 e 2 sob gás inerte para evitar que os produtos de reação indesejável.
Atenção: A segunda agulha da seringa é fornecer um respirador, permitindo assim que o ar atmosférico contido no balão para fluir para fora do balão como enche de gás inerte. Não se esqueça de incluir uma agulha de ventilação! - Desligar o gás inerte e desconectá-lo da agulha. Usando uma seringa, injete o conteúdo total do frasco 2 para o balão.
- Retire as agulhas e seringa e permitir que os componentes misturar durante 30 min à temperatura ambiente, agitando.
- Remova o bujão de septo de borracha e transferir o conteúdo para um tubo de centrifugação de limpeza 5 mL. A solução de azido-PEG3-maleimide deve ser usada dentro de 1 hora em temperatura ambiente.
3. preparação do Peptide resolver a camada de Gel
- Uma vez que a primeira camada de gel de resolução tem polimerizado, despeje a camada de isopropanol. Lave a parte superior do gel por pipetagem 1 mL de água desionizada na parte superior do gel e em seguida, despeje a água.
- Recuperar o peptídeo fluorescente thiol-acrescida de armazenamento-80 ° C e deixe-a descongelar à temperatura ambiente.
Nota: O peptídeo thiol-acrescida pode ser preparado como descrito anteriormente,11,12. Peptídeos disponíveis comercialmente também podem ser usados, mas exigem a adição de um resíduo de cisteína terminal para permitir que o maleimide-tiol clique reação. Dissolver o peptídeo a uma concentração das ações de 10 mM e armazená-lo a-80 ° C em pequenas alíquotas (30 uL) para limitar a ciclos repetidos de congelamento-descongelamento. - Prepare um 10% de solução de solução de gel que contém a molécula de vinculador azido-PEG3-maleimide e o peptídeo fluorescente conforme tabela 1. Adicione o TEMED e APS imediatamente antes de derramar o gel como sua adição inicia a reação de polimerização.
- Encha metade da parte restante da fita gel (3 mL) com o peptídeo resolver a solução de gel.
Nota: Uma abordagem multi-camada de gel de resolução reduz a quantidade de peptídeos e vinculador necessária para cada gel. O tamanho da camada de gel de resolução de peptídeo pode ser ajustado para acomodar uma maior gama de pesos moleculares, conforme necessário. - Pipete uma camada fina de isopropanol (~ 500 µ l) para o topo do gel de poliacrilamida para produzir um gel de nível e evitar bolhas. Use a solução de poliacrilamida sobra para rastrear o progresso da reação de polimerização. Quando a poliacrilamida no tubo completamente solidificada, a reação é completa (~ 40 min).
Nota: O peptídeo fluorescente é sensível à luz. Manter os géis cobertos com papel alumínio para evitar fotobranqueamento durante o desenvolvimento, a electroforese, a lavagem e a preparação do gel. - Despeje a camada de isopropanol e enxaguar o topo do peptide resolvendo gel com água desionizada, como no passo 3.1.
- Se usar o gel imediatamente, avance para o passo 4, caso contrário, mergulhe os géis preparados em 100 mL de 1x solução salina tamponada fosfato (PBS) a 4 ° C em uma caixa de plástico para evitar que os géis de secar. Embrulhe a caixa em papel de alumínio para evitar fotobranqueamento. Géis podem ser armazenados em PBS por até 3 semanas antes do uso.
4. preparação do Gel de empilhamento
- Prepare uma solução de gel de empilhamento de 5% conforme tabela 1. Adicione o TEMED e APS imediatamente antes de derramar o gel como sua adição inicia a reação de polimerização.
- Preencha a parte restante vazia da fita gel (~ 2 mL) com a solução de gel de empilhamento.
- Inserir rapidamente um pente de gel de 1,5 mm para a camada de gel de empilhamento, certificar-se de que não há bolhas permanecem presas sob os poços. Use a solução de poliacrilamida sobra para rastrear o progresso da reação de polimerização. Quando a poliacrilamida no tubo completamente solidificada, a reação é completa (~ 10 min).
- Remova cuidadosamente o pente e a fita na parte de trás da fita gel.
5. preparação de amostras biológicas para eletroforese
- Prepare a mídia celular condicionado, lisados celulares, tecido homogenates e padrões MMP conforme descrito em outro lugar sob condições de não-redução2. Não aqueça as amostras.
- Por exemplo, prepare a mídia celular condicionado como segue:
- Placa 40.000 células/cm2 células em uma placa de 6 em 10% de soro fetal bovino (FBS) meios de cultura. Incubar as células em uma câmara umidificada (5% CO2 a 37 ° C) por 24 horas e permitir que alcancem a confluência de 70-80%.
Nota: Se as células não tem atingido a confluência desejada após 24 horas, permita-lhes a crescer em meios de cultura FBS de 10% para um adicional de 24 horas. - Lavar as células duas vezes com PBS e adicionar 2 mL de soro livre de meios de cultura. Incube as células em uma câmara umidificada (5% CO2 a 37 ° C) por um adicional de 24 horas.
- Usando uma pipeta sorológica, colete os meios condicionados de cada poço. Centrifugue a mídia a 1200 rpm por 3 minutos remover os detritos de células. Leve o sobrenadante e concentrar-se usando um 15ml, kDa 10 unidade de filtro centrífugo corte de peso molecular. Centrifugar as unidades de filtro em 4.000 x g durante 15 minutos em um rotor de balde oscilante ou 5.000 x g, durante 15 min em um rotor de ângulo fixo.
Nota: Este passo é opcional, mas pode aumentar a intensidade das bandas proteolíticas os géis de zimografia de peptídeo. - Transferi o filtrado concentrado para um tubo de centrífuga de 1,5 mL. Alíquota e armazenamento de amostras a-80 ° C por até três ciclos de congelamento e descongelamento.
- Placa 40.000 células/cm2 células em uma placa de 6 em 10% de soro fetal bovino (FBS) meios de cultura. Incubar as células em uma câmara umidificada (5% CO2 a 37 ° C) por 24 horas e permitir que alcancem a confluência de 70-80%.
- Quantificar o teor de proteínas usando um ensaio de quantificação de proteína padrão (por exemplo, BCA, ensaio de Bradford, etc.).
6. eletroforese de biológico amostras em peptídeo zimografia géis
- Dissolver amostras no amortecedor da amostra zimografia convencional (62,5 mM Tris-HCl, pH 6,8, 25% de glicerol, SDS de 4%, 0,01% bromofenol). Para as amostras de células e tecidos, recomenda-se ~ 30 µ g de proteína total por bem e 50-100 ng de proteína para padrões MMP.
- Adicione 400 mL de 1 x Tris-glicina SDS executando o Buffer para o aparelho de gel. Carrega até 35 µ l de amostra por bem. Execute os exemplos em 120 V a 4 ° C por 1,5 horas ou até que os padrões de peso molecular indicam que as proteases de interesse dentro do peptide resolver a camada de gel (que tem uma cor laranja visível).
Nota: a maioria das MMPs e suas variantes abrangidos pela faixa de 35-100 kDa. Quando os padrões de peso molecular indicam que os pesos são dentro do peptide resolver a camada de gel, electroforese pode ser parada. O mesmo princípio pode ser aplicado a outras classes de proteases com conhecidos pesos moleculares. Se houver interesse na detecção de várias proteases sobre uma maior gama de pesos moleculares, reduzir o tamanho da camada de gel de resolução e aumentar o tamanho da camada de gel de resolução de peptídeo. - Após eletroforese, remover os géis de fita plástica e lave géis três vezes por 10 min cada à temperatura sob agitação suave em tampão de renaturing contendo 2,5% Triton X-100, 1 µM ZnCl2e 5 mM CaCl2 em 50 mM Tris-HCl, pH 7,5.
- Géis de transferência para uma solução-tampão em desenvolvimento contendo 1% Triton X-100, 1 µM ZnCl2 e 5 mM CaCl2 em 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 15 min. substituir com fresco desenvolvendo solução de buffer e incubar gel a 37 ° C, sob agitação suave durante 24 horas , certificando-se que os geles são totalmente submersas na solução.
7. imagem latente do peptídeo zimografia geles
- Após 24 horas, géis de imagem usando uma fluorescente de gel scanner/imager usando os filtros apropriados de excitação e emissão. Por exemplo, os géis de peptídeo mostrados nos resultados representativos são conjugados com fluoresceína e foi fotografados usando um filtro de excitação de 488 nm e um filtro de emissão de 521 nm. Usar os filtros adequados para seu fluoróforo irá maximizar a detecção de atividade proteolítica.
Nota: Imagens também podem ser tomadas com um gel de tonalizador equipado com um transiluminador de UV, muitas vezes usado para o tratamento de imagens de DNA géis corados com brometo de etídio. Imagem do gel usando o transiluminador UV (365 nm) configuração e um filtro de emissão de 590 nm. - Conduzir a avaliação densitométricos das intensidades de banda usando o ImageJ conforme descrito em outro lugar13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Usando o método descrito aqui, dois péptidos protease-degradáveis fluorescentes foram incorporados em géis de poliacrilamida: GGPQG↓IWGQK(PEG)2C (abreviado como QGIW ao longo do texto e figuras) e GPLA↓CpMeOBzlWARK(PEG)2 C (abreviado como LACW ao longo do texto e figuras). ↓ indica o local de clivagem. QGIW é um colágeno-que derivei sequência projetada para detectar colagenases celular14. LACW é uma sequência que foi otimizada para a detecção de MMP-14 e MMP-1115. Os peptídeos são rotulados com dabcyl (quencher) e fluoresceína (fluoróforo) usando N-Hidroxisuccinimida (NHS) - éster - amina química11. Pode ser difícil desenvolver novos peptídeos fluorogenic que têm fluorescência adequada têmpera é solúvel nos buffers padrão. Portanto, adaptação de sequências peptídicas dos substratos da protease fluorescentes comercialmente disponível para incluir uma cisteína terminal C é muitas vezes uma estratégia bem sucedida para desenvolver novos sensores fluorogenic. Para demonstrar a capacidade do peptídeo zimografia para separar misturas complexas de protease, condicionada mídia foi coletada em duas linhas de células de câncer diferente. HT1080 Fibrossarcoma células e células de adenocarcinoma de mama MDA-MB-231 foram banhadas em mídia FBS 10% por 24 horas, após o qual a mídia foi substituida por mídia livre de soro de um adicional de 24 horas. Exemplos de mídia condicionados foram coletados e concentraram usando 10 unidades de filtro centrífugo corte de peso molecular de kDa. O teor de proteínas dos meios de comunicação foi medido usando um ensaio µBCA padrão. 30 µ g de proteína de mídia condicionadas foram electrophoresed. Como controles positivos, poços com tipo bacteriano colagenase (100 µ g) ou purificada, ativado MMP-9 (125 ng) também foram incluídos. Os géis foram incubados durante 24 h no desenvolvimento de buffer para permitir a clivagem MMP de substratos degradáveis dentro do gel (Figura 2) e então fotografados. Imagem fluorescente revelou que inúmeras bandas eram visíveis dentro os géis de peptídeo LACW (2A Figura14), enquanto apenas uma única banda era aparente dentro de géis QGIW (2D figura14). Em comparação com gelatina zimografia (2 figura14), LACW géis foram capazes de detectar mais bandas proteolíticas, demonstrando a capacidade de peptídeo zimografia de detectar uma gama maior de proteases presentes em amostras biológicas do que métodos tradicionais usando substratos nativos.
Para verificar a identidade das bandas visualizadas como MMPs, géis de zimografia peptídeo foram incubadas em tampão de desenvolvimento contendo qualquer 20 µM GM6001, um inibidor MMP largo espectro, ou 10 µM E-64, um inibidor de catepsina geral. Tratamento do peptide LACW gel com GM6001 (Figura 2B14) diminuiu a intensidade das bandas, enquanto o tratamento com E-64 (Figura 214) não teve nenhum efeito discernível. Tratamento dos géis de peptídeo QGIW com GM6001 resultou em ablação completa das bandas vistas anteriormente (Figura 2E14). Como esperado, o E-64 não teve qualquer efeito (Figura 2F14). Em ambos os géis de peptídeo, GM6001 inibida purificado atividade MMP-9 mas não afetou atividade bacteriana colagenase, ainda mais, verificar que o visualizado aumento na fluorescência foi resultado da atividade proteolítica por MMPs presentes dentro o biológico testado amostras.
Para comparar a sensibilidade do peptídeo zimografia ao atual padrão-ouro, zimografia de gelatina, uma análise de sensibilidade foi realizada utilizando purificado, registrados MMP-9. Diluições em série de MMP-9 (1-250 ng) foram electrophoresed em LACW, QGIW e gelatina zimografia geles (3A figura14). Após o desenvolvimento e imagem fluorescente, intensidades de banda foram quantificadas com ImageJ e parcelas de intensidade normalizada banda foram geradas para calcular CE50 valores, a concentração que produz 50% do sinal máximo (Figura 3B 14). LACW peptídeo géis foram capazes de detectar as menores concentrações de MMP-9, com um valor de50 CE de 17,28 ng, em comparação com QGIW e gelatina Zimogramas com valores de 59,50 ng e 31.85 ng, respectivamente. Estes dados indicam que o uso do peptídeo zimografia pode igualar ou exceder os limites de sensibilidade de substratos nativos como gelatina.
Figura 1: esquemático do processo de zimografia fluorescente do peptide. (A) preparação da poliacrilamida de multi camada gel de resolução. Um padrão 10% solução de gel de resolução é usado para formar a primeira camada do gel zimografia peptídeo. Uma segunda resolução de 10% gel camada contendo um peptídeo extinto, fluorescente e uma molécula de vinculador azido-PEG3-maleimide então é polimerizada em cima da primeira camada. A camada superior final é um gel de empilhamento de 5%. (B) padrão electroforese sob não-reduzir condições é usado para separar amostras contendo protease nos géis de poliacrilamida funcionalizados. Os geles são lavados para remover SDS e permitir que as proteínas de renaturalização. Os geles são depois incubados em um buffer de desenvolvimento por 24 h a 37 ° C, permitindo que as proteases para decompor os peptídeos fluorogenic, resultando em aumento da fluorescência. Esta fluorescência, correspondente com a atividade da protease, é então capturada usando um gerador de imagens de gel fluorescente em uma excitação de 488 nm e emissão de 521 nm (adaptado com permissão da Bahia e a ciência do futuro14). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: deteção de proteases secretadas por células em linhas de células cancerosas humanas. Análise da enzima colagenase (100 µ g), MMP-9 (125 ng) e condicionado a mídia de célula de HT1080 Fibrossarcoma (30 µ g) e linhas de células de câncer (30 µ g) MDA-MB-231 adenocarcinoma da mama em géis de peptídeo LACW e QGIW. Géis foram tratados com DMSO (controle do veículo) (A & D), tratados com GM6001 (B & E) ou tratados com E-64 (C & F). (G) zymogram de gelatina de HT1080 e MDA-MB-231 condicionado mídia célula (adaptado com permissão da Bahia e a ciência do futuro14). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: comparação da sensibilidade de MMP-9 do Peptide e gelatina Zimogramas. (A) QGIW (topo), LACW (médio) e géis de zimografia de gelatina (inferior) foram submetidas a diluições em série de MMP-9. (B) Normalized banda intensidades foram plotadas contra a concentração de MMP-9 e apto a uma curva de inclinação variável parâmetro quatro. CE50 valores indicam concentração no meio o sinal máximo. Os resultados são representados como n = 3, significa SD (adaptado com permissão da Bahia e a ciência do futuro14). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Gel de resolução | ||||
| Conc. de estoque | Conc. final | 5 géis | 10 géis | |
| Acrilamida/Bis-acrilamida (19:1) | 40% | 10% | 10 mL | 20 mL |
| Tris-HCl pH 8,7 | 1 M | 0,375 M | 15 mL | 30 mL |
| Dodecil sulfato de sódio (SDS) | 20% | 0,10% | 200 Μ l | 400 Μ l |
| Desionizada H2O | -- | -- | 14,4 mL | 28,7 mL |
| TEMED | -- | -- | 40 Μ l | 80 Μ l |
| APS | 10% | 0,10% | 400 Μ l | 800 Μ l |
| Volume total | 40 mL | 80 mL | ||
| Gel de resolução do peptide | ||||
| Conc. de estoque | Conc. final | 5 géis | 10 géis | |
| Acrilamida/Bis-acrilamida (19:1) | 40% | 10% | 5 mL | 10 mL |
| Tris-HCl pH 8,7 | 1 M | 0,375 M | 7,5 mL | 15 mL |
| Dodecil sulfato de sódio (SDS) | 20% | 0,10% | 100 Μ l | 200 Μ l |
| Desionizada H2O | -- | -- | Μ l 6.5 | 13 mL |
| Peptídeo fluorescente | 10 mM | 75 ΜM | 150 Μ l | 300 Μ l |
| Agente reticulante azido-PEG3-Maleimide | 75 mM | 1.5 mM | 400 Μ l | 800 Μ l |
| TEMED | -- | -- | 20 Μ l | 40 uL |
| APS | 10 | 0,10% | 200 Μ l | 400 Μ l |
| Volume total | 20 mL | 40 mL | ||
| Gel de empilhamento | ||||
| Conc. de estoque | Conc. final | 5 géis | 10 géis | |
| Acrilamida/Bis-acrilamida (19:1) | 40% | 5% | 2,5 mL | 5 mL |
| Tris-HCl pH 6,9 | 1 M | 0,125 M | 2,5 mL | 5 mL |
| Dodecil sulfato de sódio (SDS) | 20% | 0,10% | 100 Μ l | 200 Μ l |
| Desionizada H2O | -- | -- | 14,75 mL | 29,5 mL |
| TEMED | -- | -- | 50 Μ l | 100 Μ l |
| APS | 10% | 0,10% | 100 Μ l | 200 Μ l |
| Volume total | 20 mL | 40 mL | ||
Tabela 1: tabela de reagente para a preparação de peptídeo fluorescente géis zimografia. As concentrações e volumes para a preparação do gel zimografia peptídeo multi-camada.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
As técnicas atuais de zymographic contam com a incorporação de substratos nativos em gel de poliacrilamida para a detecção de proteólise. Enquanto estas técnicas têm alcançado uso generalizado, eles ainda são limitados no número de proteases podem detectar. Aqui, um protocolo foi descrito em quais peptídeos fluorescentes, protease-degradáveis são incorporados a resolução de gel de poliacrilamida. Ligações covalentes acoplamento usando uma molécula de vinculador azido-PEG3-maleimide permite a separação e a detecção de uma ampla variedade de proteases do que é atualmente atingíveis com substratos nativos. A natureza altamente sintonizável de peptídeos fluorescentes proporciona pesquisadores a capacidade de projetar os substratos que podem direcionar suas proteases de interesse. Foram identificados vários substratos de peptídeo para uma grande variedade de proteases usando bibliotecas de peptídeo, e há um número crescente de fontes comerciais fabricação personalizados peptídeos. Pode ser difícil desenvolver novos peptídeos fluorogenic que têm fluorescência adequada têmpera é solúvel nos buffers padrão. Portanto, adaptando-se comercialmente sequências peptídicas de substratos da protease fluorescente disponível para incluir uma cisteína C-terminal é muitas vezes uma estratégia bem sucedida para desenvolver novos sensores fluorogenic.
Quando completar esse protocolo, tenha cuidado durante a manipulação de géis de peptídeo fluorescente para evitar a exposição excessiva à luz, como isto pode significativamente reduzir o sinal detectado fluorescente. Além disso, a concentração atual de peptídeo usado em cada gel é 75 µM. Isto pode ser ajustado para diminuir as concentrações para conservar o peptídeo, mantendo em mente que a solução de azido-PEG3-maleimide deve ser adicionada à solução pelo menos um molar 20 em excesso para o peptídeo. O kit de azido-PEG3-maleimide pode ser comprado em 3 tamanhos (25, 100 e 1000 mg). Os autores recomendam a compra do kit de 25 mg, como a solução preparada apenas pode ser armazenada em curtos períodos de tempo a-20 ° C. Além disso, um kit de 25 mg é suficiente para preparar 10 géis de peptídeo, que devem ser usados dentro de 3 semanas de preparação.
Uma das limitações de zimografia é a dificuldade de discernir a identidade exata das bandas de protease visualizado devido a uma sobreposição significativa em pesos moleculares. No futuro estudos, será essencial para realizar análises secundárias para determinar sua identidade usando técnicas tais como espectrometria de massa16,17. Outra limitação de zimografia é a dobrar de proteínas para sua conformação ativa após desnaturação parcial por SDS e eletroforese. Estes processos podem causar uma mudança na conformação ativa da protease, processamento de proteínas proteoliticamente inativas, ativo. Por exemplo, pro-MMP-2 pode ser detectado em Zimogramas gelatina, apesar de ter o devido intacto do pro-domínio inibitório para sua renaturalização de uma forma intermediária de ativa. Métodos complementares como o ensaio imunoenzimático (ELISA) ou borrões ocidentais pode ser usado para determinar a identidade e a presença total de uma protease de interesse.
Este artigo demonstra a utilização de substratos de peptídeo fluorescente para melhorar a sensibilidade das técnicas de zymographic atual. Usando purificada MMP-9, uma gradiente de concentração de análise foi realizada comparando LACW, QGIW e gelatina zimografia géis. Atualmente, zimografia de gelatina é a técnica de padrão ouro pelo qual o gelatinases (MMP-2 e -9) são detectados em amostras biológicas. Comparando os valores de50 CE de três substratos, géis de peptídeo LACW tinham os menores valores, indicando a maior sensibilidade. Utilizar sequências peptídicas diferentes concebidas para a detecção de proteases específicas potencialmente pode aumentar ainda mais estas sensibilidades. Tratamento dos géis com um agente de ativação MMP tais como acetato de 4-aminophenylmercuric (APMA) ou heparina também pode ser usado para aumentar um sinal fraco como descrito anteriormente,18.
Além da medição da atividade de protease para estudos biológicos, péptidos protease-degradáveis são também frequentemente utilizados para reticulação hidrogel sintético para aplicações de entrega de engenharia e drogas de tecido. Degradação controlada é crítica para estas aplicações. Atualmente, a cinética de degradação destes peptídeos são caracterizadas usando enzimas única, purificadas. No entanto, determinar quais enzimas células realmente produzem e são responsáveis pela clivagem destes peptides tem sido difícil de determinar. O uso de peptídeo zimografia quantificar células e liberação de enzima de tecido-específica ajudarão grandemente na concepção racional destas sequências de reticulação do peptide.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Financiamento concedido pela The Ohio estado Universidade faculdade de engenharia, departamento de engenharia biomédica e a Comprehensive Cancer Center - Hospital de câncer de James Arthur G. e Richard J. Solove Research Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mm Empty Gel Cassettes | ThermoFisher Scientific | NC2015 | |
| 1.5 mm, 10 well Empty Gel Cassette Combs | ThermoFisher Scientific | NC3510 | |
| 1x Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 10-010-049 | |
| 20% SDS Solution | Ambion | AM9820 | |
| 3x Zymography Sample Buffer | Bio-Rad | 1610764 | |
| 40% (w/v) Acrylamide/Bis (19:1) | Ambion | AM9022 | |
| 6 Well Tissue Culture Plates | ThermoFisher Scientific | 087721B | |
| Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit (10 kDa MWCO) | Sigma-Aldrich | UFC201024 | |
| Ammounium Persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Azido-PEG3-Maleimide Kit | Click Chemistry Tools | AZ107 | |
| Calcium Chloride | ThermoFisher Scientific | BP510100 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Fisher Scientific | BP231 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A416P | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| N N N' N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1645050 | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standard | Bio-Rad | 161-0374 | |
| PrecisionGlide Hypodermic Needles | Fisher Scientific | 14-826 | |
| Round Bottom Flask (100 mL) | Fisher Scientific | 50-873-144 | |
| Septum Rubber Stopper | Fisher Scientific | 50-872-546 | |
| Sterile Slip Tip Syringe (1 mL) | Fisher Scientific | 14-823-434 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Trizma hydrochlroide | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Typhoon 9410 Molecular Imager | GE Amersham | 8149-30-9410 | |
| Zinc Chloride | Sigma-Aldrich | 208086 |
References
- Vandooren, J., Geurts, N., Martens, E., Vanden Steen, P. E., Opdenakker, G. Zymography methods for visualizing hydrolytic enzymes. Nature Methods. 10 (3), 211-220 (2013).
- Toth, M., Fridman, R. Assessment of Gelatinases (MMP-2 and MMP-9) by Gelatin Zymography. Methods in Molecular Medicine. 57, (2001).
- Heussen, C., Dowdle, E. B. Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates. Analytical Biochemistry. 102 (1), 196-202 (1980).
- Gogly, B., Groult, N., Hornebeck, W., Godeau, G., Pellat, B. Collagen zymography as a sensitive and specific technique for the determination of subpicogram levels of interstitial collagenase. Analytical Biochemistry. 255 (2), 211-216 (1998).
- Inanc, S., Keles, D., Oktay, G. An improved collagen zymography approach for evaluating the collagenases MMP-1, MMP-8, and MMP-13. BioTechniques. 63 (4), 174-180 (2017).
- Perera, H. K. I. Detection of Aspartic Proteinase Activities Using Gel Zymography. Zymography. , 43-52 (2017).
- van Beurden, P. A. M. S. noek-, Vonden Hoff, J. W. Zymographic techniques for the analysis of matrix metalloproteinases and their inhibitors. BioTechniques. 38 (1), 73-83 (2005).
- Oliver, G. W., Stetler-Stevenson, W. G., Kleiner, D. E., Zymography, Zymography, Casein Zymography, and Reverse Zymography: Activity Assays for Proteases and their Inhibitors. Proteolytic Enzymes. Springer Lab Manual. , Springer. Berlin, Heidelberg. 63-76 (1999).
- Deshmukh, A. A., Weist, J. L., Leight, J. L. Detection of proteolytic activity by covalent tethering of fluorogenic substrates in zymogram gels. BioTechniques. 64 (5), 203-210 (2018).
- Yasothornsrikul, S., Hook, V. Y. Detection of proteolytic activity by fluorescent zymogram in-gel assays. BioTechniques. 28 (6), 1172-1173 (2000).
- Leight, J. L., Alge, D. L., Maier, A. J., Anseth, K. S. Direct measurement of matrix metalloproteinase activity in 3D cellular microenvironments using a fluorogenic peptide substrate. Biomaterials. 34 (30), 7344-7352 (2013).
- Leight, J. L., Tokuda, E. Y., Jones, C. E., Lin, A. J., Anseth, K. S. Multifunctional bioscaffolds for 3D culture of melanoma cells reveal increased MMP activity and migration with BRAF kinase inhibition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (17), 5366-5371 (2015).
- Ren, Z., Chen, J., Khalil, R. A. Zymography as a Research Tool in the Study of Matrix Metalloproteinase Inhibitors. Methods in Molecular Biology. 1626, Clifton, N.J. 79-102 (2017).
- Nagase, H., Fields, G. B. Human matrix metalloproteinase specificity studies using collagen sequence-based synthetic peptide. Biopolymers. 40 (4), 399-416 (1996).
- Mucha, A., et al. Membrane Type-1 Matrix Metalloprotease and Stromelysin-3 Cleave More Efficiently Synthetic Substrates Containing Unusual Amino Acids in Their P1′ Positions. Journal of Biological Chemistry. 273 (5), 2763-2768 (1998).
- Thimon, V., Belghazi, M., Labas, V., Dacheux, J. -L., Gatti, J. -L. One- and two-dimensional SDS-PAGE zymography with quenched fluorogenic substrates provides identification of biological fluid proteases by direct mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 375 (2), 382-384 (2008).
- Sun, X., Salih, E., Oppenheim, F. G., Helmerhorst, E. J. Activity-based mass spectrometric characterization of proteases and inhibitors in human saliva. Proteomics. Clinical Applications. 3 (7), 810-820 (2009).
- Yu, W., Woessner, J. F. Heparin-Enhanced Zymographic Detection of Matrilysin and Collagenases. Analytical Biochemistry. 293 (1), 38-42 (2001).
