Summary
Vi præsenterer her, en detaljeret protokol for en modificeret zymographic teknik hvor fluorescerende peptider bruges som de nedbrydelige substrat i stedet for native proteiner. Elektroforese af biologiske prøver i fluorescerende peptid zymograms giver mulighed for påvisning af en bredere vifte af proteaser end tidligere zymographic teknikker.
Abstract
Formålet med denne metode er at måle den proteolytiske aktivitet af komplekse biologiske prøver. Prøverne er adskilt af Molekylær vægt ved hjælp af elektroforese gennem en løsning gel indlejret med et nedbrydeligt substrat. Denne metode adskiller sig fra traditionelle gel zymography, idet en slukket fluorogenic peptid er kovalent indarbejdet i den løse gel i stedet for fuld længde proteiner, såsom gelatine eller kasein. Brug af fluorogenic peptider muliggør direkte påvisning af proteolytiske aktivitet uden yderligere farvning skridt. Enzymer i biologiske prøver kløver bratkølet fluorogenic peptid, hvilket resulterer i en stigning i fluorescens. Den fluorescerende signal i geler er derefter afbildet med en standard fluorescerende gel scanner og kvantificeres ved hjælp af densitometri. Brugen af peptider som nedbrydeligt underlaget i høj grad udvider de mulige proteaser påvises med zymographic teknikker.
Introduction
Gel zymography er en biologisk teknik, der anvendes til at måle proteolytiske aktivitet inden for biologiske prøver, kropsvæsker eller celle kultur medier1,2,3. Prøverne er adskilt af deres molekylære vægte med elektroforese gennem en polyacrylamid gel indlejret med et nedbrydeligt substrat. Fælles nedbrydeligt substrater inkluderer gelatine, kasein, kollagen og elastin, som har været brugt til at måle aktivitet af matrix metalloproteinases (MMPs) -1, -2, -3, -7, -8, -9 og -11, ud over en række cathepsins1,2 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8. efter elektroforese, enzymerne, der er renatured og lov til at nedbryde protein i gelen. I traditionelle gel zymography, gelen er plettet med et protein farvestof, såsom Coomassie blå, og protease aktivitet registreres som et tab af signal, dvs. hvid bands (nedbrydning af protein) på en blå baggrund.
Her, beskriver vi en protokol for en alternativ metode til gel zymography, hvor de nedbrydelige substrat er en kort, fluorogenic peptid kovalent indarbejdet i polyacrylamid gel (figur 1). Substitution af syntetiske peptider som de nedbrydelige substrater giver mulighed for påvisning af en bredere vifte af proteaser i forhold til traditionelle gel zymography med native proteiner9. Kovalente sammenkædning af fluorogenic peptid forhindrer peptid diffusion og migration under gelelektroforese observeret med tidligere metoder9,10. Derudover muliggør brugen af en fluorogenic substrat direkte påvisning af protease aktivitet uden yderligere farvning og de-farvning trin. Det overordnede mål med denne metode er påvisning af protease aktivitet i biologiske prøver via den kovalente indarbejdelse af fluorogenic peptider i zymogram geler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse af det løse Gel lag
- Forberede en 10% polyacrylamid løse gelopløsning ifølge tabel 1. Tilføje Tetramethylethylenediamine (TEMED) og Ammonium persulfat (APS) umiddelbart før hælde gelen som deres tilsætning indleder polymerisation reaktion.
- Fyld en tom 1,5 mm mini gel kassette halvvejs (5 mL) med 10% løsning gelopløsning.
- Tilføje et tyndt lag af isopropanol (~ 500 µL) til toppen af polyacrylamid gel til at producere en plan gel og forhindre bobler. Bruge sidesten polyacrylamid løsningen til at spore fremskridt af polymerisation reaktion. Når polyacrylamid i røret er helt størknet, er reaktionen komplet (~ 40 min).
2. fremstilling af Azido-PEG3-maleimide Linker molekyle
- Mens den første løsning gel lag polymeriserende, hente azido-PEG3-maleimide-kit fra-20 ° C opbevaring og tillade komponenter at nå stuetemperatur. Der er to komponenter i hvert kit. Hætteglasset 1 indeholder en maleimide-NHS ester, en off-white til grå solid. Hætteglasset 2 indeholder azido-PEG3-Amin, en anelse olie.
Bemærk: Forfatterne foreslår at bruge 25 mg azido-PEG3-maleimide kit som det gemmes kun i korte perioder (1-2 timer) ved-20 ° C efter forberedes før det begynder at nedbrydes. 25 mg er tilstrækkelig til at producere 10 peptid geler. Bruge geler senest 3 uger efter forberedelse. - Opløse hætteglas 2 komponenter i fabrikanten anbefalede mængde dimethylsulfoxid (DMSO) og vortex for 30 s til at sikre væskerne har været blandet godt.
- Overføre indholdet af hætteglasset 1 i en ren, tør 100 mL runde-bunden kolbe indeholdende en røre bar.
Bemærk: Skyl kolben med acetone og tørre helt, før brugen for at forhindre fugt i at forstyrre reaktionen. - Straks indsætte en gummiprop på septum med en membran, der kan være punkteret med en sprøjte ind i munden af kolben. Arbejde hurtigt for at forhindre fugt i at trænge ind i kolben.
- Indsæt to 18 gauge sprøjten nåle ind i mellemgulvet og slutte et til en inaktiv gastank (fx argon gas). Tillad inaktiv gas at fylde kolbe i 3 min. Mix komponenter af hætteglas 1 og 2 under anvendelse af inaktiv gas for at forhindre uønskede reaktionsprodukter.
Forsigtig: Den anden sprøjte nål er at give en udluftningsanordning, hvorved den atmosfæriske luft indeholdt i kolben til at flyde ud af kolben, som fyldes med inaktiv gas. Glem ikke at inkludere en udluftningsanordning nål! - Slukke inaktiv gas og frigøre det fra nålen. Ved hjælp af en sprøjte, injicere de hele indholdet af hætteglasset 2 i kolben.
- Fjerne både nåle og sprøjte og tillade komponenterne til at blande i 30 min. ved stuetemperatur under omrøring.
- Fjerne septum gummiprop og overføre indholdet til en ren 5 mL centrifugeglas. Azido-PEG3-maleimide-løsningen skal bruges inden for 1 time ved stuetemperatur.
3. forberedelse af peptid løsning Gel lag
- Når den første løsning gel lag har polymeriserede, hæld isopropanol lag. Skyl toppen af gelen af pipettering 1 mL deioniseret vand på toppen gel og derefter hæld vandet.
- Hente den thiol-functionalized fluorescerende peptid fra-80 ° C opbevaring og lad den tø op ved stuetemperatur.
Bemærk: En thiol-functionalized peptid kan tilberedes, som tidligere beskrevet11,12. Kommercielt tilgængelige peptider kan også bruges, men kræver tilsætning af en terminal cystein rester til at aktivere maleimide-thiol Klik reaktion. Opløse peptid til en bestand koncentration på 10 mM og opbevar den ved-80 ° C i små (30 uL) prøver at begrænse gentagne fryse-tø cykler. - Forberede en 10% løsning gelopløsning indeholdende azido-PEG3-maleimide linker molekyle og den fluorescerende peptid ifølge tabel 1. Tilsæt TEMED og APS umiddelbart før hælde gelen som deres tilsætning indleder polymerisation reaktion.
- Fylde halvdelen af den resterende del af gel kassette (3 mL) med peptid løsning gelopløsning.
Bemærk: En multi-lag løsning gel tilgang reducerer mængden af peptid og linker nødvendigt for hver gel. Størrelsen af peptid løsning gel lag kan justeres til at rumme en større række molekylvægte, inden for efter behov. - Med pipette udtages et tyndt lag af isopropanol (~ 500 µL) til toppen af polyacrylamid gel til at producere en plan gel og forhindre bobler. Bruge sidesten polyacrylamid løsningen til at spore fremskridt af polymerisation reaktion. Når polyacrylamid i røret er helt størknet, er reaktionen komplet (~ 40 min).
Bemærk: Den fluorescerende peptid er lysfølsomt. Holde geler dækket med aluminiumsfolie at undgå photobleaching under gel forberedelse, elektroforese, vask og udvikling. - Hæld laget isopropanol og skyl toppen af peptid løsning gel med deioniseret vand som i trin 3.1.
- Hvis benytter geler straks, Fortsæt til trin 4, ellers fordybe de forberedte geler i 100 mL 1 x fosfatbufferet saltopløsning (PBS) ved 4 ° C i en plastic kasse til at forhindre geler mod udtørring. Wrap boksen i aluminiumsfolie at forhindre photobleaching. Gels kan opbevares i PBS i op til 3 uger før brug.
4. forberedelse af stabling Gel
- Forbered en 5% stabling gelopløsning ifølge tabel 1. Tilsæt TEMED og APS umiddelbart før hælde gelen som deres tilsætning indleder polymerisation reaktion.
- Fylde den resterende tomme del af gel kassette (~ 2 mL) med den stabling gelopløsning.
- Indsætte hurtigt en 1,5 mm gel kam i laget stabling gel, og sørg for ingen bobler blive fanget under brøndene. Bruge sidesten polyacrylamid løsningen til at spore fremskridt af polymerisation reaktion. Når polyacrylamid i røret er helt størknet, er reaktionen komplet (~ 10 min).
- Fjern forsigtigt kam og tape fra bagsiden af gel kassette.
5. forberedelse af biologiske prøver til elektroforese
- Forbered konditioneret celle medier, cellelysater, væv homogeniseret og MMP standarder som beskrevet andetsteds under ikke-reducerende forhold2. Ikke varme prøver.
- For eksempel, forberede konditioneret celle medier som følger:
- Plade 40.000 celler/cm2 celler i en 6-godt plade i 10% føtal bovint serum (FBS) kultur medier. Inkuber celler i en fugtig kammer (5% CO2 ved 37 ° C) i 24 timer og tillade dem at nå frem til 70-80% sammenløb.
Bemærk: Hvis cellerne ikke har nået den ønskede confluency efter 24 timer, tillade dem at vokse i 10% FBS kultur medier en yderligere 24 timer. - Cellerne vaskes to gange med PBS og der tilsættes 2 mL serum-fri kultur medier. Inkuber celler i en fugtig kammer (5% CO2 ved 37 ° C) i en yderligere 24 timer.
- Ved hjælp af en serologisk pipette, indsamle konditioneret medierne fra hver brønd. Der centrifugeres medierne på 1200 rpm i 3 minutter for at fjerne enhver celle debris. Tage supernatanten og koncentrere sig, ved hjælp af en 15 mL, 10 kDa molekylvægt cutoff centrifugal filterenhed. Der centrifugeres filter enheder på 4.000 x g i 15 min. i en swingende spand rotor eller 5.000 x g i 15 min. i en fast vinkel rotor.
Bemærk: Dette trin er valgfrit, men kan øge intensiteten af proteolytiske bands i peptid zymography geler. - Overføre koncentreret filtratet til en frisk 1,5 mL centrifugeglas. Alikvot og store prøver ved-80 ° C i op til tre fryse-tø cykler.
- Plade 40.000 celler/cm2 celler i en 6-godt plade i 10% føtal bovint serum (FBS) kultur medier. Inkuber celler i en fugtig kammer (5% CO2 ved 37 ° C) i 24 timer og tillade dem at nå frem til 70-80% sammenløb.
- Kvantificere proteinindhold ved hjælp af en standard protein kvantificering assay (fx BCA, Bradford Assay, osv.).
6. elektroforese af biologiske prøver i peptid Zymography geler
- Opløse prøver i konventionelle zymography prøvebuffer (62.5 mM Tris-HCl, pH 6,8, 25% glycerol, 4% SDS, 0,01% bromophenol blå). Celle og væv prøver, anbefales ~ 30 µg af total protein pr. brønd, og 50-100 ng af protein for MMP standarder.
- Der tilsaettes 400 mL 1 x Tris-glycin SDS kører Buffer til apparatet gel. Ilæg op til 35 µL af prøven pr. brønd. Køre prøverne på 120 V ved 4 ° C, i 1,5 time eller indtil molekylvægt standarder anføres, at proteaser af interesse inden for peptid løsning gel lag (som har en synlig orange farve).
Bemærk: De fleste MMPs og deres varianter henhører under rækken af 35-100 kDa. Når molekylvægt standarder anføres, at vægtene inden for peptid løsning gel lag, kan elektroforese stoppes. Det samme princip kan anvendes på andre klasser af proteaser med kendte Molekylær vægt. Hvis der er en interesse i at opdage flere proteaser over en større række molekylvægte, inden for, reducere størrelsen af den løse gel lag og øge størrelsen af peptid løsning gel lag. - Efter elektroforese, fjerne geler fra plast kassetten og vaske geler tre gange i 10 min. ved stuetemperatur under blid agitation i renaturing buffer indeholdende 2,5% Triton X-100, 1 µM ZnCl2og 5 mM CaCl2 i 50 mM Tris-HCl, pH 7,5.
- Overførsel geler til et udviklende bufferopløsning indeholdende 1% Triton X-100, 1 µM ZnCl2 og 5 mM CaCl2 i 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 for 15 min. Erstat med friske udvikle buffer løsning og inkuberes geler ved 37 ° C under blid agitation i 24 timer , Sørg for geler er fuldt nedsænket i løsningen.
7. billeddannelse af peptid Zymography geler
- Efter 24 timer gel billede geler ved hjælp af en fluorescerende scanner/imager ved hjælp af passende excitations- og filtre. For eksempel peptid geler vist i de repræsentative resultater er konjugeret med Fluorescein og blev afbildet ved hjælp af en excitation filter af 488 nm og en emission filter af 521 nm. Ved hjælp af passende filtre for din fluorophore vil maksimere påvisning af proteolytiske aktivitet.
Bemærk: Billeder kan også tages med en gel imager udstyret med en UV transilluminator, ofte bruges til billeddannelse af DNA geler farves med ethidiumbromid. Billede geler ved hjælp af UV-transilluminator (365 nm) indstilling og en emission filter af 590 nm. - Gennemføre densitometric evaluering af bandet intensitet ved hjælp af ImageJ som beskrevet andetsteds13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjælp af metoden beskrevet her, to fluorescerende protease-nedbrydeligt peptider blev indarbejdet i polyacrylamidgeler: GGPQG↓IWGQK(PEG)2C (forkortet som QGIW hele tekst og tal) og GPLA↓CpMeOBzlWARK(PEG)2 C (forkortet som LACW hele tekst og tal). ↓ Angiver stedet for kavalergang. QGIW er en kollagen-jeg stammer sekvens designet til at detektere cellulære collagenases14. LACW er en sekvens, der er blevet optimeret til påvisning af MMP-14 og MMP-1115. Peptider er mærket med dabcyl (quencher) og fluorescein (fluorophore) ved hjælp af N-hydroxysuccinimide (NHS) - ester - Amin kemi11. Det kan være vanskeligt at udvikle nye fluorogenic peptider, der har tilstrækkelig fluorescens dæmper og er opløseligt i standard buffere. Tilpasse peptid sekvenser fra kommercielt tilgængelige fluorescerende protease substrater til også at omfatte en C terminal cystein er derfor ofte en vellykket strategi for at udvikle nye fluorogenic sensorer. For at demonstrere peptid zymography evne til at adskille komplekse protease blandinger, blev konditioneret medier indsamlet fra to forskellige kræft cellelinjer. HT1080 fibrosarcoma celler og MDA-MB-231 bryst adenocarcinom celler blev forgyldt i 10% FBS medie i 24 timer, hvorefter medierne blev erstattet med serum-gratis medier for en yderligere 24 timer. Konditioneret media prøver blev indsamlet og koncentreret ved hjælp af 10 kDa molekylvægt cutoff centrifugal filter enheder. Proteinindholdet i medierne blev målt ved hjælp af en standard µBCA assay. 30 µg protein fra konditioneret medier var electrophoresed. Som positive kontroller, brønde med type jeg bakteriel collagenase (100 µg) eller renset, aktiveret MMP-9 (125 ng) blev også medtaget. Geler var inkuberes i 24 timer med at udvikle buffer til at tillade MMP kløvningen af de nedbrydelige substrater i geler (figur 2) og derefter afbildet. Fluorescerende imaging afsløret talrige bands var synlige inden for LACW peptid geler (figur 2A14), mens kun en enkelt band var synlige inden for QGIW geler (figur 2D14). I forhold til gelatine zymography (figur 2 g14) var LACW geler i stand til at opdage mere proteolytiske bands, demonstrerer peptid zymography evne til at opdage en bredere vifte af proteaser stede i biologiske prøver end traditionelle metoder ved hjælp af indfødte substrater.
For at bekræfte identiteten af de visualiserede bands som MMPs, peptid zymography geler blev udruget i udvikling buffer indeholdende enten 20 µM GM6001, en bredspektret MMP hæmmer eller 10 µM E-64, en generel cathepsin hæmmer. Behandling af LACW peptid geler med GM6001 (figur 2B14) faldt intensiteten af bands, mens behandling med E-64 (figur 2 c14) havde ingen mærkbar effekt. Behandling af QGIW peptid geler med GM6001 resulterede i komplet ablation af de tidligere set bands (figur 2E14). Som forventet, havde E-64 ikke nogen effekt (figur 2F14). I begge peptid geler, GM6001 hæmmet renset MMP-9 aktivitet men påvirkede ikke bakteriel collagenase aktivitet, yderligere bekræfter, at visualiseret stigningen i fluorescens var et resultat af proteolytiske aktivitet af MMPs inden for de afprøvede biologiske prøver.
For at sammenligne følsomheden af peptid zymography til den nuværende guld standard, gelatine zymography, blev en følsomhedsanalyse foretaget ved hjælp af renset, aktiveret MMP-9. Serielle fortyndinger af MMP-9 (1-250 ng) var electrophoresed i LACW, QGIW og gelatine zymography geler (figur 3A14). Efter udvikling og fluorescerende imaging, band intensiteter var kvantificeres med ImageJ og parceller af normaliserede band intensitet blev genereret for at beregne EF50 værdier-den koncentration, der producerer 50% af den maksimale signal (figur 3B 14). LACW peptid gels var i stand til at opdage de mindste koncentrationer af MMP-9, EF50 værdi 17,28 ng, i forhold til QGIW og gelatine zymograms med værdier af 59.50 ng og 31.85 ng, henholdsvis. Disse data viser, at brugen af peptid zymography kan matche eller eksponeringsgrænser følsomhed af indfødte substrater som gelatine.
Figur 1: skematisk af fluorescerende peptid zymography proces. (A) forberedelse af multi-lag polyacrylamid løsning gel. En standard 10% løsning gelopløsning bruges til at danne det første lag af peptid zymography gel. En anden 10% løsning gel lag, der indeholder en bratkølet, fluorescerende peptid og en azido-PEG3-maleimide linker molekyle er derefter polymeriserede oven på det første lag. Den endelige øverste lag er en 5% stabling gel. (B) Standard elektroforese under ikke-reducerende betingelser bruges til at adskille protease-holdige prøver i de functionalized polyacrylamidgeler. Geler er vasket at fjerne SDS og tillade proteiner til renaturere. Geler er derefter inkuberes i en udvikling buffer i 24 timer ved 37 ° C, så proteaser til kløver fluorogenic peptider, hvilket resulterer i øget fluorescens. Denne fluorescens, tilsvarende med protease aktivitet, derefter fanget ved hjælp af en fluorescerende gel imager på en excitation af 488 nm og emission af 521 nm (Adapted med tilladelse fra Biotechniques og fremtidens videnskab14). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: påvisning af celle-udskilles proteaser i menneskelige cancer cellelinjer. Analyse af collagenase enzym (100 µg), MMP-9 (125 ng) og konditioneres celle medier fra HT1080 fibrosarcoma (30 µg) og MDA-MB-231 adenocarcinom breast cancer (30 µg) cellelinjer i LACW og QGIW peptid geler. Gels blev behandlet med DMSO (køretøj kontrol) (A & D), behandles med GM6001 (B & E) eller behandlet med E-64 (C & F). (G) gelatine zymogram af HT1080 og MDA-MB-231 aircondition celle medier (Adapted med tilladelse fra Biotechniques og fremtidens videnskab14). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: sammenligning af MMP-9 følsomhed af peptid og gelatine Zymograms. (A) QGIW (top), LACW (midt) og gelatine (nederst) zymography geler blev udsat for serielle fortyndinger af MMP-9. (B) normaliseret band støtteintensiteter var plottes MMP-9-koncentration og passer til en fire parameter variable skråning kurve. EF50 værdier angiver koncentration på halv maksimalt signal. Resultaterne er repræsenteret som n = 3, mener SD (Adapted med tilladelse fra Biotechniques og fremtidens videnskab14). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Løse Gel | ||||
| Bestanden koncentreret | Endelige koncentreret | 5 geler | 10 gels | |
| Acrylamid/Bis-acrylamid (19:1) | 40% | 10% | 10 mL | 20 mL |
| Tris-HCl pH 8.7 | 1 M | 0.375 M | 15 mL | 30 mL |
| Sodium Dodecyl sulfat (SDS) | 20% | 0,10% | 200 ΜL | 400 ΜL |
| Ionbyttet H2O | -- | -- | 14.4 mL | 28,7 mL |
| TEMED | -- | -- | 40 ΜL | 80 ΜL |
| APS | 10% | 0,10% | 400 ΜL | 800 ΜL |
| Samlede volumen | 40 mL | 80 mL | ||
| Peptid løsning Gel | ||||
| Bestanden koncentreret | Endelige koncentreret | 5 geler | 10 gels | |
| Acrylamid/Bis-acrylamid (19:1) | 40% | 10% | 5 mL | 10 mL |
| Tris-HCl pH 8.7 | 1 M | 0.375 M | 7,5 mL | 15 mL |
| Sodium Dodecyl sulfat (SDS) | 20% | 0,10% | 100 ΜL | 200 ΜL |
| Ionbyttet H2O | -- | -- | 6.5 ΜL | 13 mL |
| Fluorescerende peptid | 10 mM | 75 ΜM | 150 ΜL | 300 ΜL |
| Azido-PEG3-Maleimide CrossLinker | 75 mM | 1,5 mM | 400 ΜL | 800 ΜL |
| TEMED | -- | -- | 20 ΜL | 40 uL |
| APS | 10 | 0,10% | 200 ΜL | 400 ΜL |
| Samlede volumen | 20 mL | 40 mL | ||
| Stabling Gel | ||||
| Bestanden koncentreret | Endelige koncentreret | 5 geler | 10 gels | |
| Acrylamid/Bis-acrylamid (19:1) | 40% | 5% | 2,5 mL | 5 mL |
| Tris-HCl pH 6.9 | 1 M | 0,125 M | 2,5 mL | 5 mL |
| Sodium Dodecyl sulfat (SDS) | 20% | 0,10% | 100 ΜL | 200 ΜL |
| Ionbyttet H2O | -- | -- | 14,75 mL | 29,5 mL |
| TEMED | -- | -- | 50 ΜL | 100 ΜL |
| APS | 10% | 0,10% | 100 ΜL | 200 ΜL |
| Samlede volumen | 20 mL | 40 mL | ||
Tabel 1: reagens tabel for at forberede fluorescerende peptid zymography geler. Koncentrationer og mængder til forberedelse af multi-lag peptid zymography gel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nuværende zymographic teknikker stole på inkorporering af indfødte substrater i polyacrylamidgeler til påvisning af proteolyse. Mens disse teknikker har vundet udbredelse, er de stadig begrænset antallet af proteaser de kan opdage. Her, blev en protokol, der beskrevet i hvilke fluorescerende, protease-nedbrydeligt peptider er indarbejdet i polyacrylamid løsning gel. Kovalente kobling ved hjælp af en azido-PEG3-maleimide linker molekyle muliggør adskillelse og påvisning af en bredere vifte af proteaser end er i øjeblikket opnåelige med indfødte substrater. Fluorescerende peptider meget afstemmelige art giver forskere mulighed for at designe substrater, der kan målrette deres proteaser af interesse. Talrige peptid substrater er blevet identificeret for en bred vifte af proteaser ved hjælp af peptid biblioteker, og der er et stigende antal kommercielle kilder fremstiller brugerdefinerede peptider. Det kan være vanskeligt at udvikle nye fluorogenic peptider, der har tilstrækkelig fluorescens dæmper og er opløseligt i standard buffere. Derfor tilpasse peptid sekvenser fra kommercielt tilgængelige fluorescerende protease substrater til også at omfatte en C-terminale cystein er ofte en vellykket strategi for at udvikle nye fluorogenic sensorer.
Samtidig med at udfylde denne protokol, bør pleje tages mens håndtering fluorescerende peptid gels at forhindre overdreven udsættelse for lys, som dette kan reducere det fundne fluorescerende signal. Derudover er den aktuelle koncentration af peptid bruges i hver gel 75 µM. Dette kan justeres til lavere koncentrationer at bevare peptid, holde for øje, at den azido-PEG3-maleimide løsning skal føjes til løsning i mindst en 20 molar overskydende til peptid. Azido-PEG3-maleimide-kit kan købes i 3 størrelser (25, 100 og 1000 mg). Forfatterne anbefaler køb 25 mg kit som den fremstillet opløsning kan kun gemmes i korte perioder ved-20 ° C. Derudover er en 25 mg kit tilstrækkelig til at forberede 10 peptid geler, som skal anvendes inden for 3 uger af forberedelse.
En af begrænsningerne i zymography er vanskeligheden ved kræsne det nøjagtige identitet af visualiseret protease bands som følge af betydelige overlapning i Molekylær vægt. Fremover undersøgelser, vil det være afgørende at foretage sekundær analyse for at fastslå deres identitet ved hjælp af teknikker såsom massespektrometri16,17. En anden begrænsning af zymography er, hvorved man genfolder af proteiner til deres aktive kropsbygning efter delvis denaturering af SDS og elektroforese. Disse processer kan forårsage en ændring i den aktive kropsbygning af protease, gengivelse proteolytically inaktive proteiner, aktiv. For eksempel pro-MMP-2 kan påvises i gelatine zymograms trods de hæmmende Pro domæne intakt skyldig til sin genopretning til en aktiv mellemform. Supplerende metoder som enzymmaerket assay (ELISA) eller Western blotting kan bruges til at fastslå identitet og samlede tilstedeværelsen af en protease af interesse.
Denne artikel viser brugen af fluorescerende peptid substrater for at øge følsomheden af nuværende zymographic teknikker. Bruger renset MMP-9, blev en koncentration gradient analyse foretaget sammenligning LACW, QGIW og gelatine zymography geler. I øjeblikket, gelatine zymography er guldstandarden teknik som gelatinases (MMP-2 og -9) registreres i biologiske prøver. Sammenligning EF50 værdierne af de tre substrater, havde LACW peptid geler de laveste værdier, der angiver den højeste følsomhed. Udnytte forskellige peptid sekvenser designet til påvisning af specifikke proteaser kan potentielt forbedre disse følsomheder endnu længere. Behandling af geler med MMP aktiverende agent som 4-aminophenylmercuric acetat (APMA) eller heparin kan også bruges til at øge et svagt signal som tidligere beskrevet18.
Ud over måling af protease aktivitet for biologiske undersøgelser bruges protease-nedbrydeligt peptider også ofte til crosslinking syntetiske hydrogels til tissue engineering og narkotika sikkerhedsudvidede programmer. Kontrolleret nedbrydning er kritisk for disse programmer. I øjeblikket, nedbrydning kinetik af disse peptider er karakteriseret ved hjælp af enkelt, renset enzymer. Dog har bestemme hvilke enzymer celler rent faktisk producere og er ansvarlig for spaltning af disse peptider været vanskeligt at afgøre. Brugen af peptid zymography at kvantificere celle og væv-specifikke enzym udgivelse vil i høj grad støtte i den rationelt design af disse peptid crosslinking sekvenser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Ydes støtte ved The Ohio State University College of Engineering, Biomedical Engineering Department og Comprehensive Cancer Center - Arthur G. James Cancer Hospital og Richard J. Solove Research Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mm Empty Gel Cassettes | ThermoFisher Scientific | NC2015 | |
| 1.5 mm, 10 well Empty Gel Cassette Combs | ThermoFisher Scientific | NC3510 | |
| 1x Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 10-010-049 | |
| 20% SDS Solution | Ambion | AM9820 | |
| 3x Zymography Sample Buffer | Bio-Rad | 1610764 | |
| 40% (w/v) Acrylamide/Bis (19:1) | Ambion | AM9022 | |
| 6 Well Tissue Culture Plates | ThermoFisher Scientific | 087721B | |
| Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit (10 kDa MWCO) | Sigma-Aldrich | UFC201024 | |
| Ammounium Persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Azido-PEG3-Maleimide Kit | Click Chemistry Tools | AZ107 | |
| Calcium Chloride | ThermoFisher Scientific | BP510100 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Fisher Scientific | BP231 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A416P | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| N N N' N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1645050 | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standard | Bio-Rad | 161-0374 | |
| PrecisionGlide Hypodermic Needles | Fisher Scientific | 14-826 | |
| Round Bottom Flask (100 mL) | Fisher Scientific | 50-873-144 | |
| Septum Rubber Stopper | Fisher Scientific | 50-872-546 | |
| Sterile Slip Tip Syringe (1 mL) | Fisher Scientific | 14-823-434 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Trizma hydrochlroide | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Typhoon 9410 Molecular Imager | GE Amersham | 8149-30-9410 | |
| Zinc Chloride | Sigma-Aldrich | 208086 |
References
- Vandooren, J., Geurts, N., Martens, E., Vanden Steen, P. E., Opdenakker, G. Zymography methods for visualizing hydrolytic enzymes. Nature Methods. 10 (3), 211-220 (2013).
- Toth, M., Fridman, R. Assessment of Gelatinases (MMP-2 and MMP-9) by Gelatin Zymography. Methods in Molecular Medicine. 57, (2001).
- Heussen, C., Dowdle, E. B. Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates. Analytical Biochemistry. 102 (1), 196-202 (1980).
- Gogly, B., Groult, N., Hornebeck, W., Godeau, G., Pellat, B. Collagen zymography as a sensitive and specific technique for the determination of subpicogram levels of interstitial collagenase. Analytical Biochemistry. 255 (2), 211-216 (1998).
- Inanc, S., Keles, D., Oktay, G. An improved collagen zymography approach for evaluating the collagenases MMP-1, MMP-8, and MMP-13. BioTechniques. 63 (4), 174-180 (2017).
- Perera, H. K. I. Detection of Aspartic Proteinase Activities Using Gel Zymography. Zymography. , 43-52 (2017).
- van Beurden, P. A. M. S. noek-, Vonden Hoff, J. W. Zymographic techniques for the analysis of matrix metalloproteinases and their inhibitors. BioTechniques. 38 (1), 73-83 (2005).
- Oliver, G. W., Stetler-Stevenson, W. G., Kleiner, D. E., Zymography, Zymography, Casein Zymography, and Reverse Zymography: Activity Assays for Proteases and their Inhibitors. Proteolytic Enzymes. Springer Lab Manual. , Springer. Berlin, Heidelberg. 63-76 (1999).
- Deshmukh, A. A., Weist, J. L., Leight, J. L. Detection of proteolytic activity by covalent tethering of fluorogenic substrates in zymogram gels. BioTechniques. 64 (5), 203-210 (2018).
- Yasothornsrikul, S., Hook, V. Y. Detection of proteolytic activity by fluorescent zymogram in-gel assays. BioTechniques. 28 (6), 1172-1173 (2000).
- Leight, J. L., Alge, D. L., Maier, A. J., Anseth, K. S. Direct measurement of matrix metalloproteinase activity in 3D cellular microenvironments using a fluorogenic peptide substrate. Biomaterials. 34 (30), 7344-7352 (2013).
- Leight, J. L., Tokuda, E. Y., Jones, C. E., Lin, A. J., Anseth, K. S. Multifunctional bioscaffolds for 3D culture of melanoma cells reveal increased MMP activity and migration with BRAF kinase inhibition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (17), 5366-5371 (2015).
- Ren, Z., Chen, J., Khalil, R. A. Zymography as a Research Tool in the Study of Matrix Metalloproteinase Inhibitors. Methods in Molecular Biology. 1626, Clifton, N.J. 79-102 (2017).
- Nagase, H., Fields, G. B. Human matrix metalloproteinase specificity studies using collagen sequence-based synthetic peptide. Biopolymers. 40 (4), 399-416 (1996).
- Mucha, A., et al. Membrane Type-1 Matrix Metalloprotease and Stromelysin-3 Cleave More Efficiently Synthetic Substrates Containing Unusual Amino Acids in Their P1′ Positions. Journal of Biological Chemistry. 273 (5), 2763-2768 (1998).
- Thimon, V., Belghazi, M., Labas, V., Dacheux, J. -L., Gatti, J. -L. One- and two-dimensional SDS-PAGE zymography with quenched fluorogenic substrates provides identification of biological fluid proteases by direct mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 375 (2), 382-384 (2008).
- Sun, X., Salih, E., Oppenheim, F. G., Helmerhorst, E. J. Activity-based mass spectrometric characterization of proteases and inhibitors in human saliva. Proteomics. Clinical Applications. 3 (7), 810-820 (2009).
- Yu, W., Woessner, J. F. Heparin-Enhanced Zymographic Detection of Matrilysin and Collagenases. Analytical Biochemistry. 293 (1), 38-42 (2001).
