Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

Påvisande av proteas aktivitet av fluorescerande peptid Zymography

doi: 10.3791/58938 Published: January 20, 2019

Summary

Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för en modifierad zymographic teknik som används fluorescerande peptider som nedbrytbart substrat i stället för infödda proteiner. Elektrofores av biologiska prover i fluorescerande peptid zymograms möjliggör detektering av ett bredare utbud av proteaser än tidigare zymographic tekniker.

Abstract

Syftet med denna metod är att mäta den proteolytiska aktiviteten av komplexa biologiska prover. Proverna är separerade med molekylvikt med elektrofores genom en lösa gel inbäddade med ett nedbrytbart substrat. Denna metod skiljer sig från traditionella gel zymography däri en kylda fluorogenic peptid är kovalent införlivas med lösa gelen istället för full längd proteiner, såsom gelatin eller kasein. Användning av fluorogenic peptiderna ger direkt detektering av proteolytiska aktivitet utan ytterligare åtgärder för färgning. Enzymer inom de biologiska proverna klyva den kylda fluorogenic peptiden, vilket resulterar i en ökning fluorescens. Fluorescerande signalen i gelerna är sedan avbildas med en fluorescerande standardgel scanner och kvantifieras med hjälp av densitometry. Användningen av peptider som nedbrytbart substrat expanderar kraftigt de möjliga proteaser kan upptäckas med zymographic tekniker.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Gel zymography är en biologisk teknik som används för att mäta proteolytiska aktivitet inom biologiska prover, såsom kroppsvätskor eller cell kultur media1,2,3. Proverna är åtskilda av deras molekylvikter med elektrofores genom en polyakrylamidgel inbäddade med ett nedbrytbart substrat. Gemensamma nedbrytbart substrat inkluderar gelatin, kasein, kollagen och elastin, som har använts för att mäta aktiviteten av matrix metalloproteinaser (MMP) -1, -2, -3, -7, -8, -9 och -11, förutom en mängd cathepsins1,2 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8. efter elektrofores, enzymerna renatured och tillåtas försämra proteinet i gelen. I traditionella gel zymography, gelen är målat med ett protein färgämne, såsom Coomassie Blue, och proteas aktivitet upptäcks som en förlust av signal, dvs vita band (nedbrytning av protein) på en Mörkblå bakgrund.

Här beskriver vi ett protokoll för en alternativ metod för gel zymography, där nedbrytbart substrat är en kort, fluorogenic peptid kovalent införlivas Polyakrylamidgelen (figur 1). Substitution av syntetiska peptider som de nedbrytbara substratesna möjliggör detektering av ett bredare utbud av proteaser jämfört med traditionella gel zymography med infödda proteiner9. Kovalent sammanlänkningen av fluorogenic peptiden förhindrar peptid diffusion och migration under gelelektrofores observerats med föregående metoder9,10. Dessutom möjliggör användning av ett fluorogenic substrat direkt påvisande av proteas aktivitet utan ytterligare färgning och de färgning steg. Det övergripande målet med denna metod är detektion av proteas aktivitet i biologiska prover via kovalenta införlivandet av fluorogenic peptider i zymogram geler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. beredning av lagrets lösa Gel

  1. Förbereda en 10% polyakrylamid lösa gellösningen enligt tabell 1. Tillsätt Tetramethylethylenediamine (TEMED) och Ammonium persulfatoxidation (APS) omedelbart före hälla gelen som deras tillägg initierar polymeriseringen reaktionen.
  2. Fyll en tom 1,5 mm mini gel kassett halvvägs (5 mL) med 10% lösa gellösningen.
  3. Lägg ett tunt lager av isopropanol (~ 500 µL) till toppen av Polyakrylamidgelen att producera en nivå gel och förhindra bubblor. Använda överblivna polyakrylamid lösning för att spåra förloppet för polymerisation reaktionen. När polyakrylamid i röret stelnat helt, är reaktionen komplett (~ 40 min).

2. upprättande av azid-PEG3-maleimide Linker molekylen

  1. Medan det första lösa gel lagret polymeriserande, Hämta azid-PEG3-maleimide kit från-20 ° C lagring och tillåta komponenterna för att uppnå rumstemperatur. Det finns två komponenter i varje kit. Injektionsflaska 1 innehåller en maleimide-NHS ester, en benvit till grå solid. Injektionsflaska 2 innehåller azid-PEG3-Amin, en svagt gul olja.
    Obs: Författarna föreslår med hjälp av 25 mg azid-PEG3-maleimide kit som det kan lagras bara i korta perioder (1-2 timmar) vid-20 ° C efter förbereds innan det börjar försämras. 25 mg är tillräckligt för att producera 10 peptid geler. Använd geler inom 3 veckor av förberedelser.
  2. Upplösa komponenterna i injektionsflaska 2 av tillverkaren rekommenderade volymen av dimetyl sulfoxid (DMSO) och virvel för 30 s att säkerställa vätskorna har blandats väl.
  3. Över innehållet i injektionsflaskan 1 till en ren, torr 100 mL runda-botten mätkolv som innehåller en uppståndelse bar.
    Obs: Skölj kolven med aceton och torka helt före användning för att förhindra fukt från att störa reaktionen.
  4. Sätt omedelbart en septum gummiproppen med en membran som kan punkteras med en spruta i munnen på kolven. Arbeta snabbt för att förhindra att fukt tränger in kolven.
  5. Infoga två 18 gauge spruta nålar in i membranet och Anslut en till en inert gastank (e.g. argongas). Tillåta inert gas att fylla kolven för 3 min. Blanda komponenterna i injektionsflaskor 1 och 2 under inert gas för att förhindra oönskade reaktionsprodukter.
    FÖRSIKTIGHET: Andra sprutans nål är att ge en vent, vilket innebär att de Atmosfärisk luft som finns i kolven att flöda ur kolven när den fylls med inert gas. Glöm inte att inkludera en vent nål!
  6. Stänga av inert gas och lossa det från nålen. Med en spruta, injicera hela innehållet i injektionsflaskan 2 i kolven.
  7. Ta bort både nålar och spruta och låta komponenterna blandas i 30 min i rumstemperatur under omrörning.
  8. Ta bort septum gummiproppen och överför innehållet till en ren 5 mL centrifugrör. Azid-PEG3-maleimide lösningen måste användas inom 1 timme i rumstemperatur.

3. beredning av peptiden lösa Gel lager

  1. När det första lösa gel lagret har polymeriserat, Häll av isopropanol lagret. Skölj toppen av gelen genom pipettering 1 mL avjoniserat vatten på toppen av gelen och häll sedan av vattnet.
  2. Hämta thiol-functionalized fluorescerande peptiden från-80 ° C lagring och låt den Tina i rumstemperatur.
    Obs: Thiol-functionalized peptiden kan förberedas som tidigare beskrivits11,12. Kommersiellt tillgängliga peptider kan också användas men kräva tillägg av en terminal cysteinrest att aktivera den maleimide-thiol Klicka reaktion. Lös upp peptiden till ett lager koncentration av 10 mM och lagra det vid-80 ° C i små (30 uL) delprover att begränsa upprepad frysning-tining cykler.
  3. Förbereda en 10% lösning gel lösning innehållande azid-PEG3-maleimide linker molekylen och fluorescerande peptiden enligt tabell 1. Tillsätt TEMED och APS omedelbart före hälla gelen som deras tillägg initierar polymeriseringen reaktionen.
  4. Fyll hälften av den återstående delen av gel kassetten (3 mL) med peptiden lösa gellösningen.
    Obs: En multi-layer lösa gel strategi minskar mängden peptid och länkare krävs för varje gel. Storleken på peptid lösa gel lagret kan justeras för att rymma en större rad molekylvikter som behövs.
  5. Pipettera tunt med isopropanol (~ 500 µL) till toppen av Polyakrylamidgelen att producera en nivå gel och förhindra bubblor. Använda överblivna polyakrylamid lösning för att spåra förloppet för polymerisation reaktionen. När polyakrylamid i röret stelnat helt, är reaktionen komplett (~ 40 min).
    Obs: Fluorescerande peptiden är ljuskänsligt. Hålla de geler som täckt med aluminiumfolie för att förhindra fotoblekning under gel förberedelse, elektrofores, tvätt och utveckling.
  6. Häll av isopropanol lagret och skölj toppen av peptiden lösa gel med avjoniserat vatten som i steg 3.1.
  7. Om använda gelerna omedelbart, Fortsätt till steg 4, annars, fördjupa de förberedda geler i 100 mL 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) vid 4 ° C i en plastlåda att förhindra gelen torkar ut. Wrap rutan i aluminiumfolie att förhindra fotoblekning. Geler kan lagras i PBS för upp till 3 veckor före användning.

4. beredning av stapling Gel

  1. Bered en 5% stapling gel enligt tabell 1. Tillsätt TEMED och APS omedelbart före hälla gelen som deras tillägg initierar polymeriseringen reaktionen.
  2. Fyll den tomma del av gel kassetten (~ 2 mL) med stapling gellösningen.
  3. Infoga snabbt en 1,5 mm gel kam i stapling gel lagret, att se till att inga bubblor kvar instängda under brunnarna. Använda överblivna polyakrylamid lösning för att spåra förloppet för polymerisation reaktionen. När polyakrylamid i röret stelnat helt, är reaktionen komplett (~ 10 min).
  4. Försiktigt bort kammen och tejpen på baksidan av gel kassetten.

5. beredning av biologiska prover för elektrofores

  1. Förbereda luftkonditionerade cell media, cell lysates, vävnad homogenates och MMP standarder som beskrivs på andra ställen under icke-reducerande förhållanden2. Värm inte prover.
  2. Till exempel förbereda luftkonditionerade cell media enligt följande:
    1. Platta 40 000 celler/cm2 -celler i en 6-väl plåt i 10% fetalt bovint serum (FBS) kultur media. Inkubera cellerna i en fuktig kammare (5% CO2 vid 37 ° C) under 24 timmar och låt dem att nå 70-80% sammanflödet.
      Obs: Om cellerna inte har uppnått den önskade konfluens efter 24 timmar, tillåta dem att växa i 10% FBS kultur media i ytterligare 24 timmar.
    2. Tvätta cellerna två gånger med PBS och tillsätt 2 mL av serum-fri kultur media. Inkubera cellerna i en fuktig kammare (5% CO2 vid 37 ° C) i ytterligare 24 timmar.
    3. Med serologisk pipett samla luftkonditionerade media från varje brunn. Centrifugera media vid 1200 rpm i 3 minuter för att ta bort eventuella cellfragment. Ta supernatanten och koncentrera dig med en 15 mL, 10 kDa molekylvikt cutoff centrifugal filterenheten. Centrifugera filter enheterna på 4000 x g i 15 min i en svängande hink-rotor eller 5 000 x g i 15 min i en fast vinkel rotor.
      Obs: Detta steg är valfritt men kan öka intensiteten av de proteolytiska banden i de peptid zymography gelerna.
    4. Överför koncentrerad filtratet till en fräsch 1,5 mL centrifugrör. Delprov och store prover vid-80 ° C i upp till tre frysning-tining cykler.
  3. Kvantifiera proteinhalten med en standard protein kvantifiering analys (t.ex. BCA, Bradford Assay, etc.).

6. elektrofores av biologiska prover i peptid Zymography geler

  1. Lös upp prover i konventionella zymography prov buffert (62,5 mM Tris-HCl, pH 6.8, 25% glycerol, 4% SDS, 0.01% bromofenolblått). För cell- och prover, ~ 30 µg totalt protein per brunn rekommenderas, och 50-100 ng av protein för MMP standarder.
  2. Tillsätt 400 mL 1 x Tris-glycin SDS kör buffert på gel-apparaten. Ladda upp till 35 µL prov per brunn. Kör exemplen på 120 V vid 4 ° C i 1,5 timmar eller tills molekylvikt normerna tyder på att proteaser av intresse inom peptiden lösa gel lager (som har en synlig orange färg).
    Obs: De flesta MMP och deras varianter faller inom intervallet 35-100 kDa. När molekylvikt normerna tyder på att dessa vikter inom peptiden lösa gel lager, kan elektrofores stoppas. Samma princip kan tillämpas på andra klasser av proteaser med känd molekylvikt. Om det finns ett intresse i att upptäcka flera proteaser över ett större antal olika molekylvikter, minska storleken på det lösa gel-lagret och öka storleken av lagrets peptid lösa gel.
  3. Efter elektrofores, ta bort gelen från plast kassett och tvätta gel tre gånger för varje 10 min i rumstemperatur under försiktig skakning i renaturing buffert innehållande 2,5% Triton x-100, 1 µM ZnCl2och 5 mM CaCl2 i 50 mM Tris-HCl, pH 7,5.
  4. Överföring geler till en utvecklande buffertlösning som innehåller 1% Triton x-100, 1 µM ZnCl2 och 5 mM CaCl2 i 50 mM Tris-HCl, pH 7.5 för 15 min. Ersätt med färska utveckla buffert lösning och inkubera geler vid 37 ° C under försiktig skakning i 24 timmar , att se till att gelerna är helt dränka i lösningen.

7. avbildning av peptid Zymography geler

  1. Efter 24 timmar gel bild geler med en fluorescerande scanner/imager använder lämpliga excitation och utsläpp filter. Till exempel peptid gelerna visas i de representativa resultat konjugeras med Fluorescein och var avbildas med en excitationsfilter av 488 nm och ett utsläpp filter av 521 nm. Med lämpliga filter för din fluorophore maximerar detektion av proteolytiska aktivitet.
    Obs: Bilder kan också tas med en gel kameran utrustad med en UV-transilluminator, används ofta för bildtagning av DNA geler färgas med etidiumbromid. Bild de geler som med hjälp av UV-transilluminator (365 nm) inställning och ett utsläpp filter på 590 nm.
  2. Genomföra Densitometrisk utvärdering av bandet stödnivåer använder ImageJ som beskrivs på andra ställen13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Med metoden som beskrivs här, två fluorescerande proteas-nedbrytbara peptider införlivades polyakrylamidgeler: GGPQG↓IWGQK(PEG)2C (förkortat QGIW i hela den text och siffror) och GPLA↓CpMeOBzlWARK(PEG)2 C (förkortat LACW i hela den text och siffror). ↓ anger platsen för klyvning. QGIW är en kollagen-jag härrör sekvens för att upptäcka cellulära kollagenaser14. LACW är en sekvens som har optimerats för detektion av MMP-14 och MMP-1115. Peptiderna är märkt med dabcyl (törstsläckare) och fluorescein (fluorophore) med N-hydroxysuccinimide (NHS) - ester - amine kemi11. Det kan vara svårt att utveckla nya fluorogenic peptider som har adekvat fluorescens snabbkylning och lösliga i standard buffertar. Anpassa peptid sekvenser från kommersiellt tillgängliga fluorescerande proteas substrat att inkludera en C terminal cystein är därför ofta en framgångsrik strategi att utveckla nya fluorogenic sensorer. För att demonstrera peptid zymography förmåga att separera komplexa proteas blandningar, samlades konditionerat media in från två olika cancer cellinjer. HT1080 fibrosarkom och MDA-MB-231 bröst adenocarcinom celler var klädd i 10% FBS media för 24 timmar, varefter media ersattes med serum-fria medier i ytterligare 24 timmar. Konditionerat media prover samlades och koncentrerat med 10 kDa molekylvikt cutoff centrifugal filterenheter. Proteinhalten i media mättes med en standard µBCA-analys. 30 µg av protein från luftkonditionerade medier var electrophoresed. Som positiva kontroller, brunnar med typ jag bakteriell kollagenas (100 µg) eller renat, aktiveras MMP-9 (125 ng) ingick också. Gelerna var inkuberas i 24 h utveckla buffert att MMP klyvning av de nedbrytbara substratesna inom gelerna (figur 2) och sedan avbildas. Fluorescerande imaging visade flera band var synligt inom de LACW peptid gelerna (figur 2A14), medan endast ett enda band var uppenbart inom QGIW geler (figur 2D14). I jämförelse med gelatin zymography (figur 2 g14) skulle LACW geler kunna upptäcka fler proteolytiska band, visar peptid zymography förmåga att upptäcka ett bredare utbud av proteaser inom biologiska prover än traditionella metoder använder infödda substrat.

För att verifiera identiteten hos de visualiserade band som MMP, peptid zymography geler inkuberades i utveckling buffert innehållande antingen 20 µM GM6001, ett brett spektrum MMP-hämmare, eller 10 µM e-64, en allmän cathepsin-hämmare. Behandling av LACW peptiden geler med GM6001 (figur 2B14) minskade intensiteten av musikbanden, medan behandling med e-64 (figur 2 c14) hade ingen urskiljbar effekt. Behandling av QGIW peptid gelerna med GM6001 resulterade i fullständig ablation av de tidigare sett band (figur 2E14). Som förväntat, hade e-64 inte någon effekt (figur 2F14). I båda peptid geler, GM6001 hämmade renat MMP-9 verksamhet men påverkade inte bakteriell kollagenas aktivitet, att ytterligare kontrollera att visualiseras ökningen av fluorescens var ett resultat av proteolytiska aktivitet av MMP inom testade biologiska prover.

För att jämföra känslighet peptid zymography till nuvarande guldmyntfoten, gelatin zymography, utfördes en känslighetsanalys med renat, aktiverade MMP-9. Seriespädningar av MMP-9 (1-250 ng) var electrophoresed i LACW, QGIW och gelatin zymography geler (figur 3A14). Efter utveckling och fluorescerande imaging, bandet stödnivåer kvantifierades med ImageJ och tomter av normaliserade bandet intensitet genererades för att beräkna EG50 värden-den koncentration som ger 50% av den maximala signalen (figur 3B 14). LACW peptid geler skulle kunna upptäcka de minsta koncentrationerna av MMP-9, med ett EG50 värde på 17,28 ng, jämfört med QGIW och gelatin zymograms med värden för 59,50 ng och 31.85 ng, respektive. Dessa data indikerar att användningen av peptid zymography kan matcha eller överskrida känslighet av infödda substrat som gelatin.

Figure 1
Figur 1: Schematisk av fluorescerande peptid zymography processen. (A) beredning av den multi-layer polyakrylamid lösa gel. Standard 10% lösa gel lösning används för att bilda det första lagret av peptid zymography gel. En andra 10% lösa gel lager som innehåller ett seghärdat, fluorescerande peptid och en azid-PEG3-maleimide linker molekyl är sedan polymeriseras ovanpå det första lagret. Det slutliga översta lagret är en 5% stapling gel. (B) Standard elektrofores under icke-reducerande förhållanden används för att separera proteas-innehållande prover i de functionalized polyakrylamidgeler. Gelerna tvättas bort SDS och låta proteinerna till renature. Gelerna inkuberas därefter i en utveckling buffert för 24 h vid 37 ° C, vilket gör att de proteaser klyva de fluorogenic peptider, vilket resulterar i ökad fluorescens. Denna fluorescens, motsvarande med proteas aktivitet, sedan fångas med en fluorescerande gel imager vid en magnetisering av 488 nm och utsläpp av 521 nm (anpassad med tillstånd från Biotechniques och framtiden vetenskap14). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Påvisande av cell-utsöndras proteaser i human cancer cellinjer. Analys av kollagenas enzym (100 µg), MMP-9 (125 ng) och luftkonditionerade cell media från HT1080 fibrosarkom (30 µg) och MDA-MB-231 adenocarcinom breast cancer (30 µg) cell linjer i LACW och QGIW peptid geler. Geler var behandlade med DMSO (fordonskontroll) (A & D), behandlade med GM6001 (B & E) eller behandlats med e-64 (C & F). (G) Gelatin zymogram HT1080 och MDA-MB-231 luftkonditionerade cell media (anpassad med tillstånd från Biotechniques och framtiden vetenskap14). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: jämförelse av MMP-9 känslighet peptid och Gelatin Zymograms. (A) QGIW (överst), LACW (mitten) och gelatin (nederst) zymography geler utsattes för seriespädningar av MMP-9. (B) Normalized bandet stödnivåer var plottas mot MMP-9-koncentration och passar till en fyra parametern variabel lutningen kurva. EG50 värden indikerar koncentrationen vid halva den maximala signalen. Resultaten är representerade som n = 3, menar SD (anpassad med tillstånd från Biotechniques och framtiden vetenskap14). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Att lösa Gel
Beståndet konc. Slutliga konc. 5 geler 10 geler
Akrylamid/Bis-akrylamid (19:1) 40% 10% 10 mL 20 mL
Tris-HCl pH 8,7 1 M 0,375 M 15 mL 30 mL
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) 20% 0,10% 200 ΜL 400 ΜL
Avjoniserat H2O -- -- 14,4 mL 28,7 mL
TEMED -- -- 40 ΜL 80 ΜL
APS 10% 0,10% 400 ΜL 800 ΜL
Totala volymen 40 mL 80 mL
Peptid lösa Gel
Beståndet konc. Slutliga konc. 5 geler 10 geler
Akrylamid/Bis-akrylamid (19:1) 40% 10% 5 mL 10 mL
Tris-HCl pH 8,7 1 M 0,375 M 7,5 mL 15 mL
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) 20% 0,10% 100 ΜL 200 ΜL
Avjoniserat H2O -- -- 6.5 ΜL 13 mL
Fluorescerande peptid 10 mM 75 ΜM 150 ΜL 300 ΜL
Azid-PEG3-Maleimide CrossLinker 75 mM 1,5 mM 400 ΜL 800 ΜL
TEMED -- -- 20 ΜL 40 uL
APS 10 0,10% 200 ΜL 400 ΜL
Totala volymen 20 mL 40 mL
Stapling Gel
Beståndet konc. Slutliga konc. 5 geler 10 geler
Akrylamid/Bis-akrylamid (19:1) 40% 5% 2,5 mL 5 mL
Tris-HCl pH 6,9 1 M 0,125 M 2,5 mL 5 mL
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) 20% 0,10% 100 ΜL 200 ΜL
Avjoniserat H2O -- -- 14.75 mL 29.5 mL
TEMED -- -- 50 ΜL 100 ΜL
APS 10% 0,10% 100 ΜL 200 ΜL
Totala volymen 20 mL 40 mL

Tabell 1: reagens tabell för att förbereda fluorescerande peptid zymography geler. Koncentrationer och volymer för beredning av flera lager peptid zymography gelen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Aktuella zymographic tekniker förlitar sig på införlivandet av infödda substrat i polyakrylamidgeler för detektion av proteolys. Medan dessa tekniker har samlat utbredd användning, är de fortfarande begränsade antal proteaser som de kan upptäcka. Här, beskrevs ett protokoll i som fluorescerande, proteas-degradable peptider är införlivade i polyakrylamid lösa gel. Kovalent koppling använder en azid-PEG3-maleimide linker molekyl möjliggör separation och detektion av ett bredare utbud av proteaser än är för närvarande uppnåeligt med infödda substrat. Mycket avstämbara beskaffenhet fluorescerande peptider ger forskare möjlighet att designa substrat som kan rikta sin proteaser sevärdheter. Talrika peptid substrat har identifierats för en mängd olika proteaser använder peptid bibliotek, och det finns ett växande antal kommersiella källor tillverkning anpassade peptider. Det kan vara svårt att utveckla nya fluorogenic peptider som har adekvat fluorescens snabbkylning och lösliga i standard buffertar. Anpassa peptid sekvenser från kommersiellt tillgängliga fluorescerande proteas substrat att inkludera en C-terminal cystein är därför ofta en framgångsrik strategi att utveckla nya fluorogenic sensorer.

Medan du slutför detta protokoll, bör försiktighet iakttas vid hantering av fluorescerande peptid geler att förhindra överdriven exponering för ljus som detta kan avsevärt minska den upptäckta fluorescerande signalen. Dessutom är den aktuella koncentrationen av peptid som används i varje gel 75 µM. Detta kan justeras för att lägre koncentrationer att bevara peptid, hålla i åtanke att azid-PEG3-maleimide lösningen måste läggas till lösningen i minst en 20 molar överflödigt att peptiden. Azid-PEG3-maleimide kit kan köpas i 3 storlekar (25, 100 och 1000 mg). Författarna rekommenderar att köpa i 25 mg kit som den beredda lösningen kan endast lagras på korta perioder vid-20 ° C. Dessutom räcker en 25 mg-kit att förbereda 10 peptid geler, som måste användas inom 3 veckor av förberedelser.

En av begränsningarna av zymography är svårigheten kräsna den exakta identiteten av visualiserade proteas band på grund av betydande överlappning i molekylvikt. I framtida studier, blir det kritiskt att genomföra sekundär analys för att fastställa sin identitet med hjälp av tekniker såsom masspektrometri16,17. En annan begränsning av zymography är att vika av proteiner till deras aktiv konformation efter partiell denaturering av SDS och elektrofores. Dessa processer kan orsaka en förändring i aktiv konformation av den proteas, rendering proteolytically inaktiva proteiner, aktiv. Exempelvis pro-MMP-2 kan upptäckas i gelatin zymograms trots hämmande Pro domän intakt förfallodatum till dess återställande till en aktiv mellanform. Kompletterande metoder som enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) eller Western blotting kan användas för att fastställa identitet och totala förekomsten av ett proteas sevärdheter.

Denna artikel visar användningen av fluorescerande peptid substrat för att öka känsligheten för aktuella zymographic tekniker. Med hjälp av renat MMP-9, utfördes en koncentrationsgradient analys jämföra LACW, QGIW och gelatin zymography geler. Gelatin zymography är för närvarande guldmyntfoten tekniken som gelatinases (MMP-2 och -9) upptäcks i biologiska prover. Jämföra EG50 värdena för de tre substratesna, hade LACW peptid geler de lägsta värdena, som anger den högsta känsligheten. Utnyttja olika peptid sekvenser avsedd för påvisande av specifika proteaser kan potentiellt öka dessa känsligheter ytterligare. Behandling av gelerna med MMP aktiverande agent som 4-aminophenylmercuric acetat (APMA) eller heparin kan också användas för att öka en svag signal som tidigare beskrivits18.

Förutom mätning av proteas aktivitet för biologiska studier används proteas-nedbrytbara peptider också ofta för crosslinking syntetiska hydrogeler för tissue engineering och drog leverans applikationer. Kontrollerad nedbrytning är avgörande för dessa program. För närvarande kännetecknas nedbrytning kineticsen av dessa peptider med enda, renade enzymer. Att bestämma vilka enzymer cellerna faktiskt producerar och ansvarar för klyvning av dessa peptider har dock svårt att avgöra. Användning av peptid zymography att kvantifiera cell och vävnadsspecifika enzym release kommer kraftigt stöd i rationell utformningen av dessa peptid crosslinking sekvenser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Finansiering tillhandahålls av The Ohio State University College of Engineering, Biomedical Engineering Department och den omfattande Cancer Center - Arthur G. James Cancer Hospital och Richard J. Solove Research Institute.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mm Empty Gel Cassettes ThermoFisher Scientific NC2015
1.5 mm, 10 well Empty Gel Cassette Combs ThermoFisher Scientific NC3510
1x Phosphate Buffered Saline Fisher Scientific 10-010-049
20% SDS Solution Ambion AM9820
3x Zymography Sample Buffer Bio-Rad 1610764
40% (w/v) Acrylamide/Bis (19:1) Ambion AM9022
6 Well Tissue Culture Plates ThermoFisher Scientific 087721B
Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit (10 kDa MWCO) Sigma-Aldrich UFC201024
Ammounium Persulfate Sigma-Aldrich A3678
Azido-PEG3-Maleimide Kit Click Chemistry Tools AZ107
Calcium Chloride ThermoFisher Scientific BP510100
Dimethyl Sulfoxide Fisher Scientific BP231
Isopropanol Fisher Scientific A416P
Micro BCA Protein Assay Kit ThermoFisher Scientific 23235
N N N' N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) Sigma-Aldrich T9281
PowerPac Basic Power Supply Bio-Rad 1645050
Precision Plus Protein Dual Color Standard Bio-Rad 161-0374
PrecisionGlide Hypodermic Needles Fisher Scientific 14-826
Round Bottom Flask (100 mL) Fisher Scientific 50-873-144
Septum Rubber Stopper Fisher Scientific 50-872-546
Sterile Slip Tip Syringe (1 mL) Fisher Scientific 14-823-434
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100
Trizma hydrochlroide Sigma-Aldrich T5941
Typhoon 9410 Molecular Imager GE Amersham 8149-30-9410
Zinc Chloride Sigma-Aldrich 208086

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vandooren, J., Geurts, N., Martens, E., Vanden Steen, P. E., Opdenakker, G. Zymography methods for visualizing hydrolytic enzymes. Nature Methods. 10, (3), 211-220 (2013).
  2. Toth, M., Fridman, R. Assessment of Gelatinases (MMP-2 and MMP-9) by Gelatin Zymography. Methods in Molecular Medicine. 57, (2001).
  3. Heussen, C., Dowdle, E. B. Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates. Analytical Biochemistry. 102, (1), 196-202 (1980).
  4. Gogly, B., Groult, N., Hornebeck, W., Godeau, G., Pellat, B. Collagen zymography as a sensitive and specific technique for the determination of subpicogram levels of interstitial collagenase. Analytical Biochemistry. 255, (2), 211-216 (1998).
  5. Inanc, S., Keles, D., Oktay, G. An improved collagen zymography approach for evaluating the collagenases MMP-1, MMP-8, and MMP-13. BioTechniques. 63, (4), 174-180 (2017).
  6. Perera, H. K. I. Detection of Aspartic Proteinase Activities Using Gel Zymography. Zymography. 43-52 (2017).
  7. van Beurden, P. A. M. S. noek-, Vonden Hoff, J. W. Zymographic techniques for the analysis of matrix metalloproteinases and their inhibitors. BioTechniques. 38, (1), 73-83 (2005).
  8. Oliver, G. W., Stetler-Stevenson, W. G., Kleiner, D. E., Zymography, Zymography, Casein Zymography, and Reverse Zymography: Activity Assays for Proteases and their Inhibitors. Proteolytic Enzymes. Springer Lab Manual. Springer. Berlin, Heidelberg. 63-76 (1999).
  9. Deshmukh, A. A., Weist, J. L., Leight, J. L. Detection of proteolytic activity by covalent tethering of fluorogenic substrates in zymogram gels. BioTechniques. 64, (5), 203-210 (2018).
  10. Yasothornsrikul, S., Hook, V. Y. Detection of proteolytic activity by fluorescent zymogram in-gel assays. BioTechniques. 28, (6), 1172-1173 (2000).
  11. Leight, J. L., Alge, D. L., Maier, A. J., Anseth, K. S. Direct measurement of matrix metalloproteinase activity in 3D cellular microenvironments using a fluorogenic peptide substrate. Biomaterials. 34, (30), 7344-7352 (2013).
  12. Leight, J. L., Tokuda, E. Y., Jones, C. E., Lin, A. J., Anseth, K. S. Multifunctional bioscaffolds for 3D culture of melanoma cells reveal increased MMP activity and migration with BRAF kinase inhibition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, (17), 5366-5371 (2015).
  13. Ren, Z., Chen, J., Khalil, R. A. Zymography as a Research Tool in the Study of Matrix Metalloproteinase Inhibitors. Methods in Molecular Biology. 1626, Clifton, N.J. 79-102 (2017).
  14. Nagase, H., Fields, G. B. Human matrix metalloproteinase specificity studies using collagen sequence-based synthetic peptide. Biopolymers. 40, (4), 399-416 (1996).
  15. Mucha, A., et al. Membrane Type-1 Matrix Metalloprotease and Stromelysin-3 Cleave More Efficiently Synthetic Substrates Containing Unusual Amino Acids in Their P1′ Positions. Journal of Biological Chemistry. 273, (5), 2763-2768 (1998).
  16. Thimon, V., Belghazi, M., Labas, V., Dacheux, J. -L., Gatti, J. -L. One- and two-dimensional SDS-PAGE zymography with quenched fluorogenic substrates provides identification of biological fluid proteases by direct mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 375, (2), 382-384 (2008).
  17. Sun, X., Salih, E., Oppenheim, F. G., Helmerhorst, E. J. Activity-based mass spectrometric characterization of proteases and inhibitors in human saliva. Proteomics. Clinical Applications. 3, (7), 810-820 (2009).
  18. Yu, W., Woessner, J. F. Heparin-Enhanced Zymographic Detection of Matrilysin and Collagenases. Analytical Biochemistry. 293, (1), 38-42 (2001).
Påvisande av proteas aktivitet av fluorescerande peptid Zymography
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Deshmukh, A. A., Weist, J. L., Leight, J. L. Detection of Protease Activity by Fluorescent Peptide Zymography. J. Vis. Exp. (143), e58938, doi:10.3791/58938 (2019).More

Deshmukh, A. A., Weist, J. L., Leight, J. L. Detection of Protease Activity by Fluorescent Peptide Zymography. J. Vis. Exp. (143), e58938, doi:10.3791/58938 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter