Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

Floresan peptid Zymography tarafından proteaz aktivitesinin algılama

doi: 10.3791/58938 Published: January 20, 2019

Summary

Burada, floresan peptidler yerli protein yerine parçalanabilir substrat olarak kullanıldığı bir değiştirilmiş zymographic teknik için detaylı bir iletişim kuralı mevcut. Elektroforez floresan peptid zymograms Biyolojik örneklerin daha önceki zymographic teknikleri geniş proteaz tespiti sağlar.

Abstract

Bu yöntemin amacı karmaşık biyolojik örneklerin proteolitik aktivite ölçmek etmektir. Örnekleri moleküler ağırlık kullanarak Elektroforez ile parçalanabilir bir substrat gömülü bir çözme jel ile ayrılır. Bu yöntem bir yüzeyi fluorogenic peptid kovalent jelatin veya kazein gibi tam uzunlukta proteinler yerine çözme jel içine dahil geleneksel jel zymography farklıdır. Fluorogenic peptidler proteolitik aktivite ek boyama adımları olmadan doğrudan algılama sağlar. Biyolojik örnekler içinde enzimler floresans içinde bir artış kaynaklanan çeliklerini fluorogenic peptid ayırmak. Jelleri floresan sinyalin sonra Standart Floresan jel tarayıcıyla görüntüsü ve Dansitometresi kullanarak sayılabilir. Parçalanabilir substrat olarak peptidler kullanımı büyük ölçüde zymographic teknikleri ile tespit mümkün proteaz genişletir.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Jel zymography biyolojik örnekleri, vücut sıvıları veya hücre kültür medya1,2,3gibi içinde proteolitik aktivite ölçmek için kullanılan biyolojik bir tekniktir. Örnekleri onların moleküler ağırlıkları aracılığıyla parçalanabilir bir substrat ile gömülü bir polyacrylamide jel elektroforez ile ayrılır. Jelatin, kazein, kolajen ve elastin, matriks metalloproteinazların (MMPs) -1, -2, -3 -7 -8, -9 ve cathepsins1,2 çeşitli ek -11 etkinliğini ölçmek için kullanılan ortak parçalanabilir yüzeylerde dahil , 4 , 5 , 6 , 7 , 8. sonra Elektroforez, enzim renatured vardır ve jel içinde protein düşmesine izin. Geleneksel jel zymography, jel Coomassie mavi gibi bir protein boya lekeli ve proteaz aktivitesi Yani, beyaz şeritler (protein yıkımı) koyu mavi zemin üzerine sinyal, bir kaybı algılanır.

Burada, jel zymography parçalanabilir substrat kısa bir fluorogenic peptid kovalent polyacrylamide jel (Şekil 1) dahil olduğu, alternatif bir yöntem için bir protokol açıklayın. Sentetik peptidler ikame olarak parçalanabilir yüzeylerde proteaz geleneksel jel zymography yerli protein9ile karşılaştırıldığında daha geniş olarak algılanmasını sağlar. Fluorogenic peptid kovalent bağ peptid difüzyon ve geçiş sırasında jel elektroforez ile önceki yöntemleri9,10gözlenen engeller. Ayrıca, bir fluorogenic substrat kullanımı ek boyama ve de-boyama adımları proteaz aktivitesinin doğrudan algılama sağlar. Bu yöntem genel amacı fluorogenic peptidler zymogram jeller, kovalent Incorporation aracılığıyla biyolojik örneklerde proteaz aktivitesinin algılama olduğunu.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. çözme jel katman hazırlanması

  1. Jel çözüm Tablo 1göre çözme bir % 10 polyacrylamide hazırlayın. Tetramethylethylenediamine (TEMED) ve amonyum Persülfat (APS) onların ek polimerizasyon reaksiyonu başlatır gibi hemen jel dökme önce ekleyin.
  2. Bir boş 1.5 mm mini jel kaset yarı yolda (5 mL) % 10 çözme jel çözüm ile doldurun.
  3. Bir düzey jel üretmek ve kabarcıklar önlemek için polyacrylamide jel üstüne ince bir tabaka halinde isopropanol (~ 500 µL) ekleyin. Artık polyacrylamide çözüm polimerizasyon reaksiyonu ilerlemesini izlemek için kullanın. Ne zaman tüp içinde polyacrylamide tamamen katılaşmış, tam (~ 40 dk) tepkidir.

2. Azido-PEG3-maleimide bağlayıcı molekül hazırlanması

  1. İlk çözme jel katman polymerizing, azido-PEG3-maleimide seti-20 ° C depolama--dan almak ve oda sıcaklığında ulaşmak bileşenleri sağlar. Her kit içinde iki bileşeni vardır. Şişe 1 maleimide-NHS ester, bir off-beyaz gri katı için içerir. Şişe 2 azido-PEG3-Amin, biraz sarı yağ içerir.
    Not: Yazarlar yalnızca kısa bir süre (1-2 saat) için saklanabilir gibi 25 mg azido-PEG3-maleimide kiti kullanmanızı-20 ° C'de aşağılamak başlamadan önce sonra hazırlıklı olmak öneririz. 25 mg 10 peptid jelleri üretmek yeterli olur. Jelleri hazırlık 3 hafta içinde kullanın.
  2. Şişe 2 bileşenlerinde hacmi dimetil sülfoksit (DMSO) ve 30 için girdap tavsiye üreticisi dağıtılması sıvılar sağlamak için s-var karışık şey.
  3. Şişe 1 içeriği bir heyecan çubuğunu içeren bir temiz, Kuru 100 mL yuvarlak alt şişesi aktarın.
    Not: şişeye aseton ile durulayın ve nem ile reaksiyonu engellemesini önlemek için kullanım önce kurumasını.
  4. Hemen bir kauçuk septum tıpa şırıngayla balonun ağız içine delinmiş bir diyafram ile ekleyin. Hızlı nem şişeye girmesini önlemek için çalışın.
  5. Ekle iki 18 gauge iğne diyafram şırınga ve bir asal gaz tankı (Örneğin argon gazı) birine bağlayın. 3 dk. Mix şişeye doldurmak için asal gaz tüpleri 1 ve 2 inert gaz altında istenmeyen reaksiyon ürünleri önlemek için bileşenleri sağlar.
    Dikkat: İkinci şırınga iğne böylece inert gaz ile doldurur gibi dışarı şişeye akmaya balonun içindeki atmosferik hava izin veren bir havalandırma sağlamaktır. Havalandırma iğne eklemeyi unutmayın!
  6. İnert gaz kapalı kapa ve iğneden bağlantısını kesin. Bir Ģırınga kullanarak, şişe 2 tam içeriğini balonun enjekte.
  7. İğne ve şırınga kaldırmak ve karıştırma sırasında oda sıcaklığında 30 dakika karıştırmak bileşenleri sağlar.
  8. Ve içeriği bir temiz 5 mL santrifüj tüpü transfer kauçuk septum tıpa çıkarın. Azido-PEG3-maleimide çözüm oda sıcaklığında 1 saat içinde kullanılmalıdır.

3. jel katman çözme peptid hazırlanması

  1. Sonra ilk çözme jel katman polimerli, isopropanol katman dökün. Pipetting 1 mL deiyonize su üstünde jel tarafından jel üst durulama ve sonra suyu dökün.
  2. -80 ° C depodan thiol functionalized floresan peptid almak ve oda sıcaklığında erimek izin.
    Not: Thiol functionalized peptid11,12daha önce açıklandığı gibi hazır olun. Piyasada bulunan peptidler de kullanılabilir ama maleimide thiol etkinleştirmek için terminal sistein kalıntıları eklenmesi tıklatın tepki gerektirir. 10 mM bir hisse senedi konsantrasyon için peptid erimesi ve tekrar tekrar donma-çözülme çevrimleri sınırlamak için küçük (30 uL) aliquots içinde-80 ° C'de saklayın.
  3. % 10 azido-PEG3-maleimide bağlayıcı molekül ve Tablo 1göre floresan peptid içeren jel çözüm çözme hazırlayın. TEMED ve APS onların ek polimerizasyon reaksiyonu başlatır gibi hemen jel dökme önce ekleyin.
  4. Jel kaset (3 mL) kalan bölümünün yarısını jel çözüm çözme peptid ile doldurun.
    Not: Bir çok katmanlı çözme jel yaklaşım peptid ve bağlayıcı her jel için gerekli miktarını azaltır. Peptid çözme jel katman boyutunu gerektiği gibi moleküler ağırlık daha büyük bir dizi karşılamak için ayarlanabilir.
  5. İsopropanol (~ 500 µL) ince bir tabaka polyacrylamide düzey bir jel üretmek ve kabarcıklar önlemek için jel tepesine pipette. Artık polyacrylamide çözüm polimerizasyon reaksiyonu ilerlemesini izlemek için kullanın. Ne zaman tüp içinde polyacrylamide tamamen katılaşmış, tam (~ 40 dk) tepkidir.
    Not: Floresan peptid ışığa duyarlı olduğunu. Photobleaching jel hazırlık, Elektroforez, çamaşır ve geliştirme sırasında önlemek için alüminyum folyo ile kaplı jelleri tutun.
  6. İsopropanol katman dökün ve jel gibi adım 3.1 deiyonize su ile çözme peptid üst durulayın.
  7. Adım 4'e jelleri hemen, kullanmaya devam ederseniz, aksi takdirde, 1 fosfat tamponlu tuz (PBS) jeller kurumasını önlemek için plastik bir kutu içinde 4 ° C'de x 100 ml hazırlanmış jelleri bırakın. Photobleaching önlemek için alüminyum folyo kutusunda sarın. Jelleri PBS içinde 3 hafta kadar önce kullanım için saklanır.

4. yığın jel hazırlanması

  1. Bir % 5 yığın jel çözüm Tablo 1göre hazırlayın. TEMED ve APS onların ek polimerizasyon reaksiyonu başlatır gibi hemen jel dökme önce ekleyin.
  2. Jel kaset (~ 2 mL) boş kalan kısmı yığın jel çözüm ile doldurun.
  3. Hızlı bir şekilde bir 1.5 mm jel tarak hava kabarcığı yok wells altında sıkışıp kalır emin yığın jel katmanına yerleştirin. Artık polyacrylamide çözüm polimerizasyon reaksiyonu ilerlemesini izlemek için kullanın. Ne zaman tüp içinde polyacrylamide tamamen katılaşmış, tam (~ 10 dk) tepkidir.
  4. Yavaşça tarak ve kaseti jel kaset arkasından çıkarın.

5. Elektroforez için biyolojik örnek hazırlanması

  1. Klimalı hücre medya, hücre lysates, doku homogenates ve MMP standartları başka bir yerde sigara azaltarak koşulları2altında açıklandığı şekilde hazırlayın. Örnekleri ısı değil.
  2. Örneğin, aşağıdaki gibi şartına hücre medya hazırlayın:
    1. Plaka 40.000 hücreleri/cm2 hücrelerin % 10 fetal Sığır serum (FBS) Kültür medya bir 6-şey plaka. Hücrelere oksijen odası (%5 CO2 37 ° C'de) için 24 saat kuluçkaya ve % 70-80 izdiham ulaşmak izin.
      Not: hücreleri istenilen confluency 24 saat sonra ulaşılmış, ek bir 24 saat boyunca % 10 FBS kültür medyada büyümeye izin.
    2. PBS iki kez hücrelerle yıkama ve 2 mL serum serbest Kültür medya ekleyin. Oksijen odası (%5 CO2 37 ° C'de) hücrelerde için ek bir 24 saat kuluçkaya.
    3. Serolojik pipet kullanarak, klimalı ortam her kuyudan toplamak. Herhangi bir hücre artıkları kaldırmak 3 dakika için 1200 rpm'de medya santrifüj kapasitesi. Süpernatant al ve kullanarak 15 mL, 10 kDa molekül ağırlığı kesme santrifüj filtre ünitesi konsantre ol. 4000 x g sallanan bir kova Open End 15 dakika veya 15 dakika içinde bir sabit açılı rotor 5000 x g filtre daxilində santrifüj kapasitesi.
      Not: Bu adım isteğe bağlıdır ancak peptid zymography jeller proteolitik bantlarında şiddetini artırabilir.
    4. Konsantre filtrate taze 1,5 mL santrifüj tüpü aktarın. Aliquot ve mağaza örnekleri-80 ° c ilâ üç donma-çözülme döngüsü.
  3. Protein içeriği bir standart protein miktar tahlil kullanarak ölçmek (Örneğin BCA, Bradford tahlil, vb).

6. biyolojik Elektroforez peptid Zymography jeller örnekleri

  1. Geleneksel zymography örnek arabellek örneklerinde dağıtılması (62,5 mM Tris-HCl, pH 6.8, % 25 gliserol, % 4 SDS, %0.01 bromophenol mavi). Hücre ve doku örnekleri için ~ 30 µg iyi başına toplam protein tavsiye edilir ve 50-100 ng protein MMP standartları için.
  2. 1 400 mL ekleyin jel aparatı Tris-glisin SDS çalıştıran arabelleğe x. Örnek iyi başına 35 µL yükleyin. 1,5 saat ya da moleküler ağırlık standartları faiz proteaz (görünür bir portakal rengi olan) jel katman çözme peptid içinde olduğunu belirtecek kadar 120 V 4 ° C'de örnekleri çalıştırmak.
    Not: Çoğu MMPs ve onların türevleri 35-100 kDa aralığı içinde düşer. Moleküler Ağırlık standartlarını o ağırlıkları jel katman çözme peptid içinde olduğunu belirttiğinizde, Elektroforez durdurulabilir. Aynı prensip diğer sınıfların proteaz bilinen moleküler ağırlıkları ile uygulanabilir. Moleküler ağırlık daha büyük bir dizi üzerinde birden fazla proteaz algılama bir ilgi ise, çözme jel katman boyutunu ve peptid çözme jel katman boyutunu artırın.
  3. Elektroforez, jelleri Plastik kaset kaldırmak ve nazik ajitasyon %2.5 Triton X-100, 1 µM ZnCl2ve 5 mM CaCl2 50 mM'içeren renaturing tampon altında oda sıcaklığında jelleri 10 min için üç kez yıkamak Tris-HCl, pH 7.5.
  4. Transfer % 1'i içeren gelişmekte olan bir arabellek çözüm Triton X-100, 1 µM ZnCl2 jelleri ve 5 mM CaCl2 . 50 mM Tris-HCl, taze geliştirme ile pH 7.5 15 dk. eski yerine koymak için çözüm tampon ve jelleri 24 saat nazik ajitasyon altında 37 ° C'de kuluçkaya , jelleri tam çözümde örtülü emin olmak istedim.

7. görüntüleme peptid Zymography jelleri

  1. 24 saat sonra tarayıcı/Imager uygun uyarma ve emisyon filtreleri kullanarak bir floresan kullanarak görüntü jelleri jel. Örneğin, temsilcisi sonuçlarında gösterilen peptid jelleri floresein ile Birleşik ve 488 bir uyarma filtre kullanarak yansıma nm ve bir emisyon filtresi 521 nm. Senin fluorophore için uygun filtreler kullanarak proteolitik aktivite tespiti en üst düzeye çıkarır.
    Not: Görüntüleri de DNA jelleri etidyum bromür ile lekeli görüntüleme için sık kullanılan bir UV transilluminator ile donatılmış bir jel Imager ile alınabilir. UV transilluminator kullanarak jelleri görüntü (365 nm) ayarı ve bir emisyon filtre 590 nm.
  2. Başka bir yerde13açıklandığı gibi ImageJ kullanarak bant yoğunluklarını densitometric değerlendirme yapmak.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Burada açıklanan yöntemi kullanarak, iki floresan proteaz parçalanabilir peptidler polyacrylamide jeller dahil edilmiştir: GGPQG↓IWGQK(PEG)2C (metin ve resimler QGIW kısaltılır) ve GPLA↓CpMeOBzlWARK(PEG)2 C (metin ve resimler LACW kısaltılır). ↓ dekolte sitesi gösterir. QGIW olan bir kollajen-hücresel collagenases14algılamak için tasarlanmış sıra türetilmiş. LACW MMP-14 ve MMP-1115tespiti için optimize edilmiş bir dizisidir. Peptidler dabcyl (içki) ve N-hydroxysuccinimide (NHS) - ester - kullanarak floresein (fluorophore) ile etiketlenir Amin Kimya11. Yeterli floresans Şoklama ve standart arabellekleri çözünür yeni fluorogenic peptidler geliştirmek için zor olabilir. Bu nedenle, peptid dizileri C terminal sistein dahil etmek için piyasada bulunan floresan proteaz yüzeylerde üzerinden adapte kez yeni fluorogenic sensörleri geliştirmek için başarılı bir strateji. Peptid zymography karmaşık proteaz karışımlar ayrı yeteneğini göstermek için klimalı ortam iki farklı kanser hücre satırlarından toplanmıştır. HT1080 Fibrosarkom hücreleri ve MDA-MB-231 meme adenokarsinom hücreleri % 10 FBS medyada 24 saat sonra ek bir 24 saat boyunca serum-ücretsiz medya ile medya değiştirildi, kaplama. Klimalı medya örnekleri toplanmıştır ve 10 kDa molekül ağırlığı kesme santrifüj filtre cihazları kullanarak yoğunlaşmıştır. Protein içeriği medya standart µBCA tahlil kullanılarak ölçüldü. protein şartına ortamdan 30 µg electrophoresed. Pozitif kontrol kuyuları türü ile ben bakteriyel collagenase (100 µg) veya saf, MMP-9 harekete geçirmek (125 ng) de dahil edildi. Jelleri MMP bölünme jelleri (Şekil 2) içinde parçalanabilir yüzeylerde, izin vermek için arabellek gelişmekte olan 24 saat inkübe ve ardından yansıma. Floresan görüntüleme ortaya sadece tek bir bant QGIW jelleri (Şekil 2B14) içinde belirgin iken çok sayıda bantları LACW peptid jelleri (Şekil 2A14), içinde görünür olduğunu. Jelatin zymography (Şekil 2 g14) ile karşılaştırıldığında, LACW jeller peptid zymography proteaz biyolojik örnekler içinde mevcut daha geniş algılama yeteneğini gösteren daha fazla proteolitik bantları tespit edebildik geleneksel yöntemler kullanarak yerel yüzeylerde.

MMPs olarak görüntülenmeyecektir grup kimliğini doğrulamak için peptid zymography jeller ya 20 µM içeren geliştirme arabellekte inkübe GM6001, geniş spektrumlu bir MMP önleyici veya 10 µM E-64, genel cathepsin inhibitörü. LACW peptid tedavisinde jelleri ile GM6001 (Şekil 2B14) E-64 (Şekil 2C14) ile tedavi hiçbir discernable etkisi varken bantları, yoğunluğu azaldı. GM6001 ile QGIW peptid jelleri tedavisinde daha önce görüldü bantları (Şekil 2E14) tam ablasyon içinde sonuçlandı. Beklendiği gibi E-64 (Şekil 2F14) herhangi bir etkisi yoktu. Her iki peptid jelleri, inhibe GM6001 MMP-9 aktivite saf ama bakteriyel collagenase etkinlik, floresans görüntülenmeyecektir artış proteolitik aktivite MMPs içinde test edilmiş biyolojik mevcut tarafından sonuç oldu daha fazla doğrulama etkilemedi örnekleri.

Geçerli altın standart, jelatin zymography, peptid zymography duyarlılığını karşılaştırmak için bir duyarlılık analizi arıtılmış, aktif MMP-9 kullanılarak yapılmıştır. MMP-9 (1-250 ng) seri halinde dilutions LACW, QGIW ve jelatin zymography jelleri (Şekil 3A14) içinde electrophoresed. Geliştirme ve floresan görüntüleme, ardından Grup yoğunluklarını ImageJ ile sayısal ve araziler normalleştirilmiş grup yoğunluğunun yüksek sinyal (Şekil 3B % 50'si üretir EC50 değerleri toplama hesaplamak için oluşturulan 14). LACW peptid jelleri MMP-9, en küçük konsantrasyonlarının 17,28 EC50 değeri olan başardık QGIW ve jelatin zymograms 59.50 değerleri ile karşılaştırıldığında ng ng ve 31.85 ng, sırasıyla. Bu veriler peptid zymography kullanımı maç veya jelatin gibi yerel yüzeylerde duyarlılık sınırlarını aşan gösteriyor.

Figure 1
Şekil 1: floresan peptid zymography işleminin şematik. (A) jel çözme çok katmanlı polyacrylamide hazırlanması. Standart bir %10 jel çözüm çözme peptid zymography jel ilk katman oluşturmak için kullanılır. % 10 ikinci bir çözme jel yüzeyi, floresan peptid içeren katman ve bir azido-PEG3-maleimide bağlayıcı molekül sonra üzerinde ilk katmanı polimerli. Son üst kat % 5 yığın jel olan. (B) standart Elektroforez sigara azaltarak altında koşullar proteaz içeren örnekleri functionalized polyacrylamide jeller ayırmak için kullanılır. Jelleri SDS kaldırmak için ve proteinler renature için izin vermek için yıkanır. Jelleri sonra geliştirme arabelleği için artan floresans kaynaklanan fluorogenic peptidler ayırmak proteaz izin 37 ° C'de 24 saat inkübe. Proteaz aktivitesi ile karşılık gelen bu floresan sonra bir uyarma 488 nm ve emisyon 521 floresan jel Imager kullanma yakalanır nm (uyarlama izniyle Biotechniques ve gelecek bilim14). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: hücre salgılanan proteaz insan kanser hücre hatlarında tespiti. Collagenase enzim (100 µg), MMP-9 Analizi (125 ng) ve şartına hücre ortamdan HT1080 Fibrosarkom (30 µg) ve MDA-MB-231 adenokarsinom meme kanseri (30 µg) hücre hatları LACW ve QGIW peptid jelleri. Jelleri DMSO (araç denetimi) (A & D)ile tedavi, GM6001 (B & E) ile tedavi veya E-64 (C & F)ile tedavi. (G) jelatin zymogram HT1080 ve MDA-MB-231 hücre medya (uyarlama Biotechniques ve gelecek bilim14izinle) şartına. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: karşılaştırma MMP-9 hassasiyeti peptid ve jelatin Zymograms. (A) QGIW (üst), LACW (orta) ve jelatin (alt) zymography jeller MMP-9 seri dilutions için tabi tutuldu. (B) NORMALIZED grup yoğunluklarda MMP-9 konsantrasyon karşı çizilen ve dört parametre değişken yamaç eğriye uygun. EC50 değerleri yarım yüksek sinyal konsantrasyonu gösterir. Sonuçları n temsil edilen = 3, SD (uyarlama izniyle Biotechniques ve gelecek bilim14)demek. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Jel çözme
Hisse senedi konsantrasyonlu Son konsantrasyonlu 5 jelleri 10 jelleri
Akrilamid/Bis-Akrilamid (19:1) % 40 % 10 10 mL 20 mL
Tris-HCl pH 8.7 1 M 0.375 M 15 mL 30 mL
Sodyum Lauryl Sülfat (SDS) % 20 %0.10 200 ΜL 400 ΜL
Deiyonize H2O -- -- 14.4 mL 28,7 mL
TEMED -- -- 40 ΜL 80 ΜL
APS % 10 %0.10 400 ΜL 800 ΜL
Toplam hacim 40 mL 80 mL
Peptid çözme jel
Hisse senedi konsantrasyonlu Son konsantrasyonlu 5 jelleri 10 jelleri
Akrilamid/Bis-Akrilamid (19:1) % 40 % 10 5 mL 10 mL
Tris-HCl pH 8.7 1 M 0.375 M 7.5 mL 15 mL
Sodyum Lauryl Sülfat (SDS) % 20 %0.10 100 ΜL 200 ΜL
Deiyonize H2O -- -- 6.5 ΜL 13 mL
Floresan peptid 10 mM 75 ΜM 150 ΜL 300 ΜL
Azido-PEG3-Maleimide CrossLinker 75 mM 1.5 mM 400 ΜL 800 ΜL
TEMED -- -- 20 ΜL 40 uL
APS 10 %0.10 200 ΜL 400 ΜL
Toplam hacim 20 mL 40 mL
Yığın jel
Hisse senedi konsantrasyonlu Son konsantrasyonlu 5 jelleri 10 jelleri
Akrilamid/Bis-Akrilamid (19:1) % 40 % 5 2.5 mL 5 mL
Tris-HCl pH 6,9 1 M 0,125 M 2.5 mL 5 mL
Sodyum Lauryl Sülfat (SDS) % 20 %0.10 100 ΜL 200 ΜL
Deiyonize H2O -- -- 14.75 mL 29,5 mL
TEMED -- -- 50 ΜL 100 ΜL
APS % 10 %0.10 100 ΜL 200 ΜL
Toplam hacim 20 mL 40 mL

Tablo 1: reaktif tablo zymography jeller floresan peptid hazırlığı. Konsantrasyonları ve birimler çok katmanlı peptid zymography jel hazırlanması için.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Geçerli zymographic teknikleri yerel yüzeylerde birleşme polyacrylamide jeller proteolizis tespiti için içine güveniyor. Bu teknikler yaygın kullanımı topladı sahip iken, onlar-ebilmek bulmak proteaz sayısında hala sınırlıdır. Burada, bir protokol hangi floresan, proteaz parçalanabilir peptidler jel çözme polyacrylamide dahil edilmiştir tanımlanmıştır. Kovalent kullanarak kaplin bir azido-PEG3-maleimide bağlayıcı molekül ayrılık ve proteaz daha çok tespiti ile yerel yüzeylerde Şu anda ulaşılabilir olduğunu daha sağlar. Floresan peptidler son derece ayarlanabilir doğası araştırmacılar onların proteaz ilgi hedefleyebilirsiniz yüzeylerde tasarım olanağı tanıyor. Çok sayıda peptid yüzeylerde çok çeşitli peptid kitaplıklarını kullanma proteaz için tespit edilmiştir ve ticari kaynakları özel peptidler imalat, giderek artan sayıda vardır. Yeterli floresans Şoklama ve standart arabellekleri çözünür yeni fluorogenic peptidler geliştirmek için zor olabilir. Bu nedenle, peptid dizileri ticari olarak adapte C-terminal sistein eklemek mevcut floresan proteaz yüzeylerde var. sık sık yeni fluorogenic sensörleri geliştirmek için başarılı bir strateji

Bu iletişim kuralı tamamlarken, floresan peptid jelleri işlerken bu önemli ölçüde tespit edilen floresan sinyali azaltabilir gibi ışık aşırı etkilenmemek için özen gösterilmelidir. Ayrıca, geçerli her jel kullanılan peptid 75 µM bölgedir. Bu peptid, peptid için tutmak azido-PEG3-maleimide çözüm çözüm en az 20 azı eklemeniz gerekir unutmayın aşırı tasarruf etmek için konsantrasyonları düşürmek için ayarlanabilir. Azido-PEG3-maleimide kiti 3 boyutlarda satın alınabilir (25, 100 ve 1000 mg). Yazarlar hazır çözüm sadece kısa bir süre-20 ° C'de, depolanmış olarak 25 mg kiti satın tavsiye Ayrıca, bir 25 mg kiti hazırlık 3 hafta içinde kullanılması gerekir 10 peptid jelleri hazırlamak yeterlidir.

Bir zymography sınırlamaları görüntülenmeyecektir proteaz bantları moleküler ağırlık önemli birbiri üzerine çakışması nedeniyle tam kimliğini yüksek beklentileri karşılayan zor olmasıdır. Gelecekte çalışmaları, kütle spektrometresi16,17gibi teknikleri kullanarak kendi kimliklerini belirlemek için ikincil analizi yapmak için önemli olacaktır. Başka bir zymography proteinlerin kısmi SDS ve Elektroforez tarafından denaturing takip onların aktif uyum için refolding kısıtlamasıdır. Bu işlemler proteolytically etkin olmayan proteinler, aktif işleme proteaz, etkin uyum içinde bir değişiklik neden olabilir. Örneğin, pro-MMP-2 inhibitör yanlısı etki alanı sağlam nedeniyle olmasına rağmen jelatin zymograms içinde tespit edilebilir bir ara etkin form için onun renaturation için. Enzim bağlı immunosorbent assay (ELISA) gibi ek yöntem veya Western engelliyor kimlik ve ilgi bir proteaz, toplam olup olmadığını belirlemek için kullanılabilir.

Bu makalenin geçerli zymographic teknikleri duyarlılığını arttırmak için floresan peptid yüzeylerde kullanımını gösterir. Arıtılmış MMP-9 kullanılarak, LACW, QGIW ve jelatin zymography jeller karşılaştırarak bir konsantrasyon gradyanı analizi yapılmıştır. Şu anda, jelatin zymography altın standart hangi tekniktir jelatinin (MMP-2 ve -9) biyolojik örnekleri algılanır. Üç yüzeylerde EC50 değerleri karşılaştırarak, LACW peptid jelleri en yüksek hassasiyet gösteren en düşük değerler vardı. Belirli proteaz tespiti için tasarlanmış farklı peptid dizileri kullanarak potansiyel olarak bu hassasiyetleri daha da artırabilir. Jelleri tedavisinde 4-aminophenylmercuric asetat (APMA) veya heparin gibi bir MMP aktive maddesi ile yukarıda açıklanan18olarak zayıf bir sinyal artırmak için kullanılabilir.

Biyolojik araştırmalar proteaz aktivitesinin ölçüm yanı sıra, proteaz parçalanabilir peptidler de sık sık crosslinking sentetik hydrogels doku mühendisliği ve ilaç teslim uygulamalar için kullanılır. Kontrollü bozulma Bu uygulamalar için önemlidir. Şu anda, Bu peptidler bozulması kinetik tek, saflaştırılmış enzimler kullanarak karakterizedir. Ancak, hangi enzimler hücre aslında üretmek ve bu peptidler bölünme için sorumludur belirleme belirlemek zor olmuştur. Hücre ve doku özgü enzim yayın ölçmek peptid zymography kullanımını büyük ölçüde bu peptid crosslinking dizilere rasyonel tasarımında yardımcı olacak.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Finansman Ohio Devlet Üniversitesi kolej Mühendisliği, Biyomedikal Mühendisliği Bölümü ve kapsamlı Kanser Merkezi - Arthur G. James Kanser Hastanesi ve Richard J. Solove Araştırma Enstitüsü tarafından sağlanmıştır.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mm Empty Gel Cassettes ThermoFisher Scientific NC2015
1.5 mm, 10 well Empty Gel Cassette Combs ThermoFisher Scientific NC3510
1x Phosphate Buffered Saline Fisher Scientific 10-010-049
20% SDS Solution Ambion AM9820
3x Zymography Sample Buffer Bio-Rad 1610764
40% (w/v) Acrylamide/Bis (19:1) Ambion AM9022
6 Well Tissue Culture Plates ThermoFisher Scientific 087721B
Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit (10 kDa MWCO) Sigma-Aldrich UFC201024
Ammounium Persulfate Sigma-Aldrich A3678
Azido-PEG3-Maleimide Kit Click Chemistry Tools AZ107
Calcium Chloride ThermoFisher Scientific BP510100
Dimethyl Sulfoxide Fisher Scientific BP231
Isopropanol Fisher Scientific A416P
Micro BCA Protein Assay Kit ThermoFisher Scientific 23235
N N N' N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) Sigma-Aldrich T9281
PowerPac Basic Power Supply Bio-Rad 1645050
Precision Plus Protein Dual Color Standard Bio-Rad 161-0374
PrecisionGlide Hypodermic Needles Fisher Scientific 14-826
Round Bottom Flask (100 mL) Fisher Scientific 50-873-144
Septum Rubber Stopper Fisher Scientific 50-872-546
Sterile Slip Tip Syringe (1 mL) Fisher Scientific 14-823-434
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100
Trizma hydrochlroide Sigma-Aldrich T5941
Typhoon 9410 Molecular Imager GE Amersham 8149-30-9410
Zinc Chloride Sigma-Aldrich 208086

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vandooren, J., Geurts, N., Martens, E., Vanden Steen, P. E., Opdenakker, G. Zymography methods for visualizing hydrolytic enzymes. Nature Methods. 10, (3), 211-220 (2013).
  2. Toth, M., Fridman, R. Assessment of Gelatinases (MMP-2 and MMP-9) by Gelatin Zymography. Methods in Molecular Medicine. 57, (2001).
  3. Heussen, C., Dowdle, E. B. Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates. Analytical Biochemistry. 102, (1), 196-202 (1980).
  4. Gogly, B., Groult, N., Hornebeck, W., Godeau, G., Pellat, B. Collagen zymography as a sensitive and specific technique for the determination of subpicogram levels of interstitial collagenase. Analytical Biochemistry. 255, (2), 211-216 (1998).
  5. Inanc, S., Keles, D., Oktay, G. An improved collagen zymography approach for evaluating the collagenases MMP-1, MMP-8, and MMP-13. BioTechniques. 63, (4), 174-180 (2017).
  6. Perera, H. K. I. Detection of Aspartic Proteinase Activities Using Gel Zymography. Zymography. 43-52 (2017).
  7. van Beurden, P. A. M. S. noek-, Vonden Hoff, J. W. Zymographic techniques for the analysis of matrix metalloproteinases and their inhibitors. BioTechniques. 38, (1), 73-83 (2005).
  8. Oliver, G. W., Stetler-Stevenson, W. G., Kleiner, D. E., Zymography, Zymography, Casein Zymography, and Reverse Zymography: Activity Assays for Proteases and their Inhibitors. Proteolytic Enzymes. Springer Lab Manual. Springer. Berlin, Heidelberg. 63-76 (1999).
  9. Deshmukh, A. A., Weist, J. L., Leight, J. L. Detection of proteolytic activity by covalent tethering of fluorogenic substrates in zymogram gels. BioTechniques. 64, (5), 203-210 (2018).
  10. Yasothornsrikul, S., Hook, V. Y. Detection of proteolytic activity by fluorescent zymogram in-gel assays. BioTechniques. 28, (6), 1172-1173 (2000).
  11. Leight, J. L., Alge, D. L., Maier, A. J., Anseth, K. S. Direct measurement of matrix metalloproteinase activity in 3D cellular microenvironments using a fluorogenic peptide substrate. Biomaterials. 34, (30), 7344-7352 (2013).
  12. Leight, J. L., Tokuda, E. Y., Jones, C. E., Lin, A. J., Anseth, K. S. Multifunctional bioscaffolds for 3D culture of melanoma cells reveal increased MMP activity and migration with BRAF kinase inhibition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, (17), 5366-5371 (2015).
  13. Ren, Z., Chen, J., Khalil, R. A. Zymography as a Research Tool in the Study of Matrix Metalloproteinase Inhibitors. Methods in Molecular Biology. 1626, Clifton, N.J. 79-102 (2017).
  14. Nagase, H., Fields, G. B. Human matrix metalloproteinase specificity studies using collagen sequence-based synthetic peptide. Biopolymers. 40, (4), 399-416 (1996).
  15. Mucha, A., et al. Membrane Type-1 Matrix Metalloprotease and Stromelysin-3 Cleave More Efficiently Synthetic Substrates Containing Unusual Amino Acids in Their P1′ Positions. Journal of Biological Chemistry. 273, (5), 2763-2768 (1998).
  16. Thimon, V., Belghazi, M., Labas, V., Dacheux, J. -L., Gatti, J. -L. One- and two-dimensional SDS-PAGE zymography with quenched fluorogenic substrates provides identification of biological fluid proteases by direct mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 375, (2), 382-384 (2008).
  17. Sun, X., Salih, E., Oppenheim, F. G., Helmerhorst, E. J. Activity-based mass spectrometric characterization of proteases and inhibitors in human saliva. Proteomics. Clinical Applications. 3, (7), 810-820 (2009).
  18. Yu, W., Woessner, J. F. Heparin-Enhanced Zymographic Detection of Matrilysin and Collagenases. Analytical Biochemistry. 293, (1), 38-42 (2001).
Floresan peptid Zymography tarafından proteaz aktivitesinin algılama
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Deshmukh, A. A., Weist, J. L., Leight, J. L. Detection of Protease Activity by Fluorescent Peptide Zymography. J. Vis. Exp. (143), e58938, doi:10.3791/58938 (2019).More

Deshmukh, A. A., Weist, J. L., Leight, J. L. Detection of Protease Activity by Fluorescent Peptide Zymography. J. Vis. Exp. (143), e58938, doi:10.3791/58938 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter