Summary
هنا، يمكننا وصف نهج كمي لتحديد توزيع البروتين متشابك بالنسبة للبروتين علامة استخدام الفلورة تلطيخ والفحص المجهري [كنفوكل]، والتحليل القائم على الحاسوب.
Abstract
وجود أو عدم وجود، أو مستويات معينة من البروتينات متشابك يمكن التأثير على شدة انتقال متشابك. بالإضافة إلى توضيح وظيفة البروتين، من الضروري أيضا تحديد توزيعها. هنا، يمكننا وصف بروتوكول استخدام الفلورة والفحص المجهري [كنفوكل]، والتحليل القائم على الحاسوب لتحديد توزيع البروتين متشابك المحرك (تسمى أيضا تبرجل أو SVAP30). نحن مقارنة توزيع المحرك لأن سينابتوفيسين البروتين حويصلة متشابك، وبالتالي تحديد توزيع المحرك بطريقة كمية مقارنة بوفرة حويصلات متشابك. جدير بالذكر أن يحتمل أن يكون تنفيذ هذا الأسلوب للسماح للمقارنة بين توزيع البروتينات باستخدام الأجسام المضادة المختلفة أو المجاهر أو عبر دراسات مختلفة. لدينا طريقة تلتف تقلب الملازمة لمن ستينينجس إيمونوفلوريسسينت بالغلة بنسبة بدلاً من المستويات المطلقة الأسفار. بالإضافة إلى ذلك، يتيح الأسلوب يصف لنا الباحث لتحليل توزيع البروتين على مستويات مختلفة: من شرائح المخ كله لمناطق الدماغ لمختلف المناطق دون الإقليمية في مجال المخ واحد، مثل طبقات مختلفة من قرن آمون أو حسية كورتيسيس. المحرك هو بروتين فقاريات محددة مقترنة حويصلات متشابك. مع هذا الأسلوب، ونظهر أن المحرك هو موزعة بين مناطق الدماغ، مع مستويات عالية في المكورة البطني ونواة الحاجز في اللوزة، وأيضا داخل مناطق الدماغ واحدة، مثل طبقات مختلفة من الحصين.
Introduction
يحدث الاتصال بين الخلايا العصبية في مواقع اتصال متخصصة تسمى نقاط الاشتباك العصبي. الاشتباكات العصبية تحتوي على عدد ضخم بروتينات المختلفة التي تنسق انتقال متشابك. بعض من تلك البروتينات تظهر توزيعاً غير متجانسة في جميع أنحاء النظام العصبي وليست موجودة في كل المشبك1. مثال واحد لهذا بروتين هو Munc13، الذي يشارك في عملية فتيلة من حويصلات متشابك. وهناك isoforms مختلفة من Munc13، التي توزع في جميع أنحاء الدماغ2تقوم، ويمكن أن تؤثر على وجود أو عدم وجود isoforms محددة قصيرة الأجل اللدونة متشابك وحويصله متشابك ديناميات3، 4 , 5-لذلك، أنها ذات أهمية حيوية ليتمكن من تحديد وجود البروتينات متشابك المختلفة عبر مناطق الدماغ.
أساليب اختيار للتحديد الكمي للبروتينات متشابك-حتى الآن-هي الكتلي والغربية النشاف، بدلاً من إيمونوهيستوتشيميستري6،7،،من89. وفي بعض الحالات، يتم استخدام عدة أساليب يكمل كل منهما الآخر لتقييم الكمية وإضفاء الطابع المحلي على البروتينات المحددة (أي، فيلهلم et al. 10)-الأسلوب يصف لنا هنا يسمح للتعريب والتحديد الكمي للبروتينات للفائدة دون الحاجة إلى استخدام أي أسلوب البيوكيميائية، ببساطة استخدام ستينينجس إيمونوفلوريسسينت. هنا ميزة أخرى هي أنه يمكن أن يتم التحديد الكمي على مناطق أصغر بكثير، ولذلك أكثر تحديداً، من تلك التي تحققت بأساليب أخرى. ومع ذلك، يتعين على المرء أن يأخذ في الاعتبار ضرورة بروتين مرجع موثوق بها لتقييم توزيع بروتين الفائدة.
صبغة الفلورسنت ب immunohistochemistry يسمح لنا بتحديد إضفاء الطابع المحلي على البروتينات بصورة روتينية عبر مناطق الدماغ وكذلك داخل الأقسام العصبية المختلفة. للتعرف على الأقسام المختلفة، يتم استخدام علامات محددة. عادة، يمكن استخدام أجسام مضادة ضد سينابسين وسينابتوفيسين11 لتسمية حويصلات متشابك، بينما الأجسام المضادة ضد عزف تسمية منطقة نشطة من المحطة الطرفية presynaptic12. الناقلين حويصلية، مثل الناقلين غلوتامات حويصلية (فجلة) أو الناقل غابا حويصلية (فجأت)، تستخدم لتسمية ضادات13 و المثبطة14 محطات presynaptic، على التوالي. من ناحية بوستسينابتيك، يمكن أن تستخدم الأجسام المضادة ضد بروتين هوميروس بمناسبة بوستسينابتيك المحطات الطرفية، والأجسام المضادة ضد الكثافة بوستسينابتيك البروتين 95 (PSD95)15،،من1617 أو جيفيرين18 , 19 , ويمكن تسمية 20 محطات بوستسينابتيك ضادات أو المثبطة، على التوالي. باستخدام الأجسام المضادة ضد بروتين الفائدة وعلامات مثل تلك المذكورة أعلاه، واحد تحدد إضفاء الطابع المحلي على هذا البروتين. العديد من الدراسات لتاريخ فعلنا ذلك في طريقة نوعية21. بيد لتحديد توزيع التفاضلية بروتين متشابك محددة موثوق بها، واحدة يجب أن لا فقط تحديد وجودها أو غياب لكن تركيزه النسبي أيضا. عدم تجانس أحجام وكثافة الاشتباكات العصبية يجعل من المهم إثبات نسبة بين علامة متشابك والبروتين من الفائدة. وبخلاف ذلك، سوف تظهر المناطق الغنية بالمشبك مثل الطبقات غير الهرمية قرن آمون والطبقة الجزيئية المخيخ بكثافة عالية من البروتينات متشابك، فقط بسبب كثافة أعلى من نقاط الاشتباك العصبي ولكن ليس بسبب وجود قوي لهذا البروتين في كل المشبك (مثلاً، والرافين ودريسباتش1). من ناحية أخرى، البروتينات في سوما العصبية (مثلاً، TGN3822) سوف تظهر عادة حضور قوي في الخلية الهرمي هيبوكامبال طبقة أو طبقة الخلايا الحبيبية هيبوكامبال أو الدماغ بسبب التركيز العالي للهيئات الخلايا العصبية وفي تلك المناطق. ولذلك، هذا التوزيع غير المتجانس للهياكل، وفي هذه الحالة synapses، يمكن أن يؤدي إلى إجراء تقدير كاذبة لتوزيع البروتين الاهتمام نفسه. وعلاوة على ذلك، يوجد التغيرات جوهرية في تلطيخ كثافات عبر العينات في ستينينجس المناعي. البروتوكول هو موضح هنا يأخذ هذا في الاعتبار، ويتجنب هذه الانحيازات، فضلا عن غيرها من المحاذير التي تنشأ من أساليب المناعي.
في مؤخرا دراسة، وقد استخدمت هذا الأسلوب لوصف التعبير التفاضلية من المحرك (تسمى أيضا تبرجل23 أو24من SVAP30) عبر مناطق مختلفة من الدماغ 161. المحرك هو بروتين متشابك فقاريات محددة يمكن العثور في الرابطة إلى حويصلات متشابك ويؤثر العصبي الإفراج عن25،،من2627. نحن تتعلق بالتعبير المحرك لوفرة حويصلات متشابك، تلطيخ سينابتوفيسين كعلامة مرجعية حويصلة متشابك. وجدنا مستويات عالية للمحرك خاصة في نواة الحاجز، المكورة البطني وفي اللوزة. ضمن قرن آمون، وجدنا توزيعاً غير متجانسة من المحرك، مع مستويات عالية في الطبقات المرتبطة بعملية حسابية داخل هيبوكامبال، ومستويات منخفضة في طبقات الإدخال والإخراج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
هذا البروتوكول لا تنطوي على إجراء التجارب على الحيوانات الحية. التجارب التي تنطوي على يوثانيزينج من الحيوانات للحصول على عينات المخ بموافقة السلطات المحلية حماية الحيوانات (غوتنغن تيرشوتزكوميشن der Universitätsmedizin) تحت رقم الموافقة تي 10/30.
ملاحظة: لهذا البروتوكول، استخدمت 3 الفئران الذكور البالغين في C57BL/6.
1. إعداد نموذج
- إعداد مثبت و 0.1 متر العازلة الفوسفات (PB) (انظر الجدول 1).
- إصلاح الحيوان نضح ترانسكارديال كما هو موضح في سبر et al. 28-أولاً تغسل الدم مع 0.9% محلول كلوريد الصوديوم، ثم نتخلل مع 30 مل من 4% بارافورمالدهيد (منهاج عمل بيجين).
- فتح الجمجمة مع المقص وعزل الدماغ باستخدام ملعقة ذات حواف حادة لتجنب إتلاف الأنسجة بدقة.
- ملء أنبوب رد 50 مل مع مثبت و postfix الدماغ في 4% منهاج عمل بيجين في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
- إزالة مثبت وغسل الدماغ في 50 مل م 0.1 pb على شاكر مدة 30 دقيقة.
- بعد الغسيل، احتضان الدماغ في أنبوب 50 مل رد فعل في السكروز 30% في الجريدة الرسمية 0.1 م لح 48 أو حتى أنه يغرق في الأنبوب في 4 درجات مئوية عن كريوبروتيكشن.
- تقليم المخ كريوبروتيكتيد بشفرة حادة ووضعه في كريومولد، وتضمين ذلك مع قطع الأمثل درجة الحرارة (OCT) مجمع. تجنب الفقاعات. توجيه الدماغ وتجميد كريومولد في الثلاجة-80 درجة مئوية.
- جبل الأنسجة المجمدة لتمزيقها. حجته الأنسجة إلى درجة حرارة كريوميكروتومي لمدة 15 دقيقة على الأقل قبل تمزيقها.
- قسم الدماغ إلى 25 ميكرومتر سميكة شرائح الاكليلية. لمسة OCT بعناية مع ربط زجاج دون لمس أنسجة المخ. جمع 3 شرائح متجاورة كل بئر في 24 لوحة جيدا وتخزينها في الجريدة الرسمية 0.1 متر عند 4 درجة مئوية حتى تلطيخ.
ملاحظة: البروتوكول يمكن أن يكون مؤقتاً هنا لمدة تصل إلى أسبوعين. أوقات أطول في التخزين يمكن أن تتداخل مع نوعية الأنسجة وبالتالي التأثير على نتائج هذه التجربة.
2-الفلورة
- إعداد الحلول بما في ذلك حظر المخزن المؤقت، جسم المخزن المؤقت، غسل المخزن المؤقت 1، والغسيل العازلة 2 (انظر الجدول 1).
- شطف شرائح مرة بالجريدة الرسمية لإزالة الزائدة OCT.
- إزالة الحل مع ماصة بلاستيكية دون مص شرائح المخ. إضافة 250 ميليلتر من PB الطازجة مع ماصة 1000 ميليلتر.
تنبيه: شرائح يجب أن لا تجف، حتى إزالة وإضافة سوائل ببئر.
- إزالة الحل مع ماصة بلاستيكية دون مص شرائح المخ. إضافة 250 ميليلتر من PB الطازجة مع ماصة 1000 ميليلتر.
- إزالة الجريدة الرسمية مع ماصة بلاستيكية وإضافة 250 ميليلتر من المخزن المؤقت حظر كل جيدا مع ماصة 1000 ميليلتر. احتضانها ح 3 في درجة حرارة الغرفة (RT) على شاكر.
- خلال فترة حضانة المرض، يؤدي إلى تمييع الأجسام المضادة الأولية في المخزن المؤقت لجسم في أنبوب رد فعل. استخدام 250 ميليلتر جسم العازلة لكل بئر وإضافة المقدار المناسب من جسم (انظر الجدول 2) التي بيبيتينج أنها مباشرة إلى الحل باستخدام ماصة 2 ميليلتر من. مزيج الحل بلطف بيبيتينج صعودا وهبوطاً عدة مرات. دوامة قريبا بعد ذلك لضمان خلط السليم.
ملاحظة: لتحديد الأسفار الخلفية، ستينينجس ينبغي أيضا إجراء دون إضافة جسم الأولية. لذلك، واحتضان الشريحة في جسم الحل دون الأجسام المضادة الأولية وفقا للبروتوكول. - بعد فترة الحضانة، إزالة المخزن المؤقت حظر مع ماصة بلاستيكية وإضافة 250 ميليلتر من جسم محلول يحتوي على الأجسام المضادة الأساسي للبئر الواحد. احتضان الشرائح مع جسم الأولية بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية على شاكر.
- وفي اليوم التالي يغسل الشرائح مع الغسيل المخزن المؤقت 1 3 x ل 10 دقيقة في RT على شاكر.
- إزالة المتوسطة مع ماصة بلاستيكية وإضافة 300 ميليلتر للغسيل المخزن المؤقت 1 كل بئر. احتضان في الرايت 10 دقيقة كرر 3 مرات.
- خلال خطوات الغسيل، تضعف الأجسام المضادة الثانوية إلى جانب فلوروفوري في جسم المخزن المؤقت في أنبوب رد فعل. استخدام 250 ميليلتر جسم العازلة لكل بئر وإضافة المقدار المناسب من جسم (انظر الجدول 2) التي بيبيتينج أنها مباشرة إلى الحل باستخدام ماصة 2 ميليلتر من. مزيج الحل بلطف بيبيتينج صعودا وهبوطاً عدة مرات. دوامة قريبا بعد ذلك لضمان خلط السليم.
تنبيه: نظراً لأن الأجسام المضادة التي تكون حساسة للضوء، جميع الخطوات من هذه النقطة تحتاج إلى القيام بها في الظلام. - بعد خطوات الغسيل، إزالة الغسيل المخزن المؤقت مع ماصة بلاستيكية وإضافة 250 ميليلتر من جسم محلول يحتوي على الأجسام المضادة الثانوية كل بئر. احتضان الشرائح مع الجسم المضاد الثانوي لمدة 90 دقيقة في RT في الظلام.
- تغسل الشرائح مع الغسيل المخزن المؤقت 2 3 x لمدة 10 دقائق في الرايت
- وخلال خطوات الغسيل، تمييع 4, 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI) في الجريدة الرسمية م 0.1 في تركيز 1:2000.
- إزالة المخزن المؤقت الغسيل 2 مع ماصة بلاستيكية وإضافة 250 ميليلتر لحل DAPI كل بئر. احتضان لمدة 5 دقائق في RT على شاكر.
- إزالة الحل DAPI مع ماصة بلاستيكية وإضافة 500 ميليلتر من PB 0.1 متر الواحد جيدا مع ماصة 1000 ميليلتر.
- تحميل الشرائح على شرائح المجهر.
- ضع شريحة مجهر تحت ستيريوسكوبي. بفرشاة الجميلة، إضافة ثلاث قطرات منفصلة من 0.1 م PB على الشريحة. ضع شريحة واحدة كل قطره ماء على شريحة المجهر.
- استخدم الفرشاة الجميلة لتسطيح وتوجيه الشرائح على شريحة المجهر.
- عندما يتم وضع كل الشرائح بشكل صحيح، إزالة الزائدة PB مع أنسجة وجاف الشريحة بعناية.
تحذير: تجنب تجفيف شرائح المخ تماما. - إضافة 80 ميليلتر لتضمين المتوسطة على الشريحة. بدقة أقل ساترة على الشريحة، ثم تضمين شرائح المخ.
- اترك الشرائح لتجف في غطاء الدخان ح 1-2 (غطاء لهم لتجنب التعرض للضوء) وتخزينها في مربع شريحة مجهر عند 4 درجة مئوية.
ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا.
3-تصوير
- بعد تضمين الوسيطة في حالة تصلب تماما، مكان الشريحة المجهر تحت المجهر [كنفوكل].
ملاحظة: ينبغي أن تسفر عن الفحص المجهري ابيفلوريسسينسي جنبا إلى جنب مع برامج deconvolution مماثلة من جودة الصورة. - ضبط إعدادات الليزر بزيادة أو تقليل كثافة الليزر لكل قناة حيث أنه يتم تعريض قليلة بكسل لضمان توزيع الحد الأقصى من قيم رمادية.
- الحصول على أنسجة الظاهري من شريحة الدماغ كله لقنوات مختلفة.
- في برامج التصوير (انظر الجدول للمواد)، حدد الخيار البلاط ويدويًا تحديد شريحة الدماغ مع بلاط منطقة الإعداد.
- توزيع نقاط الدعم في جميع أنحاء منطقة بلاط وضبط التركيز لنقاط الدعم المختلفة عن طريق الضغط على التحقق من بلاط المناطق/مواقف...
- قم بضبط الإعدادات في اكتساب وضع وفقا لحجم الملف والقرار المطلوب للصورة الناتجة وبدء المسح الضوئي.
- عند الانتهاء من المسح الضوئي، استخدم الدالة Stitching لمعالجة الأنسجة الظاهري. تصدير الملف .tif باستخدام الدالة تصدير الصورة.
4-جهاز الكمبيوتر على أساس تحليل
- تحميل جميع قنوات واحد لصورة واحدة في فيجي29 بواسطة النقر فوق الملف | فتح.
- باستخدام أداة التحديد اليدوي ، ترسم واحد نصف الكرة الأرضية في DAPI-القناة. إنشاء قناع التحديد بالنقر فوق تحرير | اختيار | إنشاء قناع.
- تحديد كثافة fluorescence يعني لقنوات فردية (المحرك وسينابتوفيسين) بواسطة النقر فوق تحليل | قياس.
ملاحظة: تأكد من تحديد قنوات مختلفة لتحديد قيم الكثافة fluorescence يعني لكل قناة. - نسخ كثافة fluorescence يعني لقنوات واحد في جدول بيانات.
- تحديد كثافة fluorescence يعني لقنوات فردية في مجال يحظى بالاهتمام بتحديد المنطقة أيضا باستخدام أداة التحديد اليدوي . استخدام أطلس الدماغ ماوس كمرجع.
- كرر الخطوات من 4، 1-4، 5 لكل من نصفي الكرة الأرضية وجميع مجالات الاهتمام.
ملاحظة: تحديد القيم الخاصة بنصف الكرة الغربي كل على حدة من أجل مقارنة القيم الموجودة في مجال يحظى باهتمام لأن في نصف الكرة الغربي في وقت لاحق (راجع الخطوة 5، 2).
5-بيانات التعامل
- وفي حالة الأسفار خلفية عالية (انظر المناقشة)، قد تكون هناك حاجة طرح خلفية. لذلك، تحديد كثافة fluorescence يعني الشريحة معالجتها دون جسم الأولية ضد البروتين الإشارة (هنا: سينابتوفيسين) وطرح هذه القيمة من كافة القيم التي تم الحصول عليها لمناطق الدماغ ونصفي الكرة الأرضية.
- عندما تم تحديد كثافات fluorescence يعني لقنوات واحد لكل نصف الكرة الأرضية، وكل مجال من مجالات الاهتمام (انظر الجدول 3)، حساب نسبة انتقال إلى سينابتوفيسين بقسمة القيمة للمحرك بالقيمة (سينابتوفيسين اللون الأصفر في الجدول 3). تنفيذ هذا الإجراء لكل نصف الكرة الأرضية، وكل مجال اهتمام كل على حدة.
- تقسيم نسبة الحصول عليها لمنطقة واحدة للاهتمام بنسبة الحصول على نصف الكرة الأرضية المقابل (أورانج في الجدول 3) لتحديد النسبة مجال اهتمام لنصف الكرة الغربي.
- لتحديد المحرك الوفرة النسبية، ترجمة نسبة الحصول على 5.2 إلى نسبة مئوية عن طريق تحديد انحرافه عن 1 (الأحمر في الجدول 3). ولذلك سيعطي أي بنسبة 1.25 وفرة نسبية في محرك من 25 في المائة فوق متوسط، ونسبة 0.75 سوف يسفر عن وفرة محرك نسبي من 25% أقل من المتوسط.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يمكن أن ينظر إليها الممثل تلطيخ الأنماط علامات مختلفة في الشكل 1. يختلف النمط توزيع البروتين. وترد أمثلة على خمسة مستويات rostro والذيلية في الأعمدة من (أ)-(ﻫ). تلطيخ DAPI الممثل هو مبين في الصف الأول: DAPI تتمسك بالحمض النووي للخلية، وهكذا هي الملون الأنوية. هذه النتائج في نمط الشروريه. المناطق ذات كثافة عالية خلية أكثر إشراقا من المناطق ذات الخلية منخفضة الكثافة. يمكن أن تعتبر مثالاً لبروتين موزعة بين في الصف الثاني. المحرك تلطيخ يكشف توزيع تفاضلية في جميع أنحاء الدماغ، مع المناطق الساخنة مشرقة وباهتة. في الصف الثالث، يظهر مثال عن سينابتوفيسين علامة مرجعية أكثر البلوتينيوم الموزعة. تراكب من البروتينات هما (الصف الرابع) يبين توزيع التفاضلية المحرك (أحمر) بالمقارنة مع سينابتوفيسين البروتين ماركر (الأخضر).
ويبين الشكل 2 التحديد الكمي هو موضح في الخطوة 4 من البروتوكول. يظهر هي قيم الكثافة يعني الأسفار لقنوات مختلفة عبر نصفي الكرة الأرضية (المحرك، الشكل 2أ؛ سينابتوفيسين، الشكل 2ب) والمجالات التي تهم (المحرك، الشكل 2ج؛ سينابتوفيسين، الشكل 2د). لتحديد وفرة المحرك بالنسبة لعدد الحويصلات متشابك، تؤخذ القيم fluorescence المحرك بنسبة سينابتوفيسين fluorescence القيم. هذه النسب للمجالات التي تهم مبينة في الشكل 2ه، وتوفر بالفعل إشارة إلى التوزيع غير المتجانس للمحرك، ومع المناطق مع ارتفاع وانخفاض مستويات المحرك بالنسبة إلى حويصلات متشابك. لتعويض التغيرات التقنية الكامنة بالإضافة إلى ذلك، مقارنة بجميع أنحاء نصف الكرة الغربي (غير معروضة) النسبة في منطقة واحدة للاهتمام (الشكل 2ه) وترجمتها إلى نسبة مئوية. هذا يعطي وفرة (الشكل 2و) المحرك النسبي في قياس كم المحرك موجود في منطقة واحدة للاهتمام بالنسبة إلى متوسط.
وكما ذكر أعلاه، واحدة من أهم مزايا هذا الأسلوب هو القدرة على تحديد وفرة بروتين الاهتمام عبر مناطق صغيرة جداً وحتى المناطق دون الإقليمية وطبقات من المجالات ذات الاهتمام. ويرد مثال على هذا التطبيق في الشكل 3، حيث تقرر المحرك الوفرة النسبية للطبقات المختلفة في الفروع الحصين. يتوافق مع التقدير الكمي في طبقات مختلفة هو موضح في الشكل 3د، و الرقم 3و، و الرقم 3ح إلى طبقات هو موضح في الشكل 3جيم، الرقم 3ه، و الشكل 3ز، مع الألوان المطابقة. ضمن قرن آمون، المحرك تقوم توزع، مع ارتفاع مستويات المحرك بالنسبة إلى حويصلات متشابك في الطبقات المرتبطة بعملية حسابية داخل هيبوكامبال (أي، طبقة polymorph المغزلي المسنن [المدير العام]، رادياتوم الطبقة، لوسيدوم و oriens من أمونيس قرن 3 [CA3]، والطبقة رادياتوم وأورينس من أمونيس قرن 1 [CA1])، ومستويات منخفضة في الإدخال والإخراج طبقات (الطبقة الجزيئية الداخلي والخارجي للمديرية العامة، طبقات الخلايا الهرمية CA3 و CA1، الطبقة لاكونوسوم-موليكولاري من CA1).
الشكل 1 : صور الممثل الفلورة DAPI (الصف الأول)، المحرك (الصف الثاني)، سينابتوفيسين (الصف الثالث)، وتراكب (الصف الرابع، المحرك في سينابتوفيسين الأحمر والأخضر) على الصعيدين rostro والذيلية 5 (ألف-هاء)- المجالات ذات الاهتمام هي مظللة باللون الرمادي في الصف العلوي من الألواح. M1، والقشرة الحركية الأولية؛ اللجنة الأولمبية الدولية، جزر كاليخا؛ لجنة التنسيق الإدارية، اللحاء الأمامي cingulate؛ الوطني الصومالي، نواة الحاجز؛ جيش فيتنام الشعبي، المكورة البطني؛ نوا، نواة accumbens؛ حزب المحافظين، بوتامين كودات؛ S1، قشرة somatosensory الأولية؛ المفوض السامي، والحصين؛ وأنا، اللوزة؛ مليون هكتار، هابينولا الآنسي؛ باغ، بيرياكويدوكتال الرمادية؛ التعطيل، المادة الرمادية؛ صادر، منطقة تيجمينتال البطني؛ حركة تحرير الكونغو، طبقة الجزيئية المخيخ؛ الأخضر، الطبقة الحبيبية من المخيخ. شريط المقياس = 500 ميكرومتر. وقد تم تعديل هذا الرقم من والرافين ودريسباتش1. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : التحديد الكمي لتوزيع المحرك عبر 5 مستويات rostro-والذيلية. يعني كثافة fluorescence إشارة المحرك (A) وإشارة سينابتوفيسين (ب) على مختلف المستويات. يعني كثافة fluorescence إشارة المحرك (ج) وإشارة سينابتوفيسين (د) في 16 منطقة الدماغ مرسومة يدوياً. نسب المحرك (ﻫ) وسينابتوفيسين في المخ 16 مجالات الاهتمام. (و) التحديد الكمي للمحرك الوفرة النسبية، مقارنة نسبة انتقال/سينابتوفيسين في منطقة كل منهما بنسبة لنصف الكرة الغربي المقابلة. M1، والقشرة الحركية الأولية؛ اللجنة الأولمبية الدولية، جزر كاليخا؛ لجنة التنسيق الإدارية، اللحاء الأمامي cingulate؛ الوطني الصومالي، نواة الحاجز؛ جيش فيتنام الشعبي، المكورة البطني؛ نوا، نواة accumbens؛ حزب المحافظين، بوتامين caudate؛ S1، قشرة somatosensory الأولية؛ المفوض السامي، والحصين؛ وأنا، اللوزة؛ مليون هكتار، هابينولا الآنسي؛ باغ، بيرياكويدوكتال الرمادية؛ التعطيل، المادة الرمادية؛ صادر، منطقة تيجمينتال البطني؛ حركة تحرير الكونغو، طبقة الجزيئية المخيخ. نقاط سوداء تمثل نقطة بيانات مفردة. إظهار أشرطة الخطأ القياسي ± يعني يعني (SEM). وقد تم تعديل هذا الرقم من والرافين ودريسباتش1. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : توزيع المحرك في قرن آمون الماوس. ستاينينجس الفلورة من شرائح الاكليلية من الحصين الماوس. نظرة عامة على الحصين تبين نمط التعبير المحرك غير متجانسة (A) وسينابتوفيسين المقابلة تلطيخ (ب). المناطق الثلاث للفائدة (المديرية العامة، الشكل 3جيم؛ CA3، الرقم 3ه؛ CA1، الرقم 3ز) محددة بخطوط منقطة أبيض. (د،و،ح) مقارنة النسبة في طبقات كل منها بنسبة نصف الكرة الأرضية المقابل للقياس الكمي. الألوان في الرسوم البيانية بار تقابل كل منهما التظليل في لوحات Cو Eو G. التعبير المحرك ارتفاع في مستويات المقترن بحساب داخل هيبوكامبال (أي، طبقة polymorph المديرية العامة والطبقة رادياتوم، لوسيدوم و oriens CA3، والطبقة رادياتوم وأورينس من CA1)، ومنخفضة في الإدخال الرئيسي وإخراج الطبقات ( الطبقة الجزيئية الداخلي والخارجي للمديرية العامة، طبقات الخلايا الهرمية CA3 و CA1، والطبقة لاكونوسوم موليكولاري من CA1). أمل، طبقة الجزيئي الخارجي؛ IML، الطبقة الجزيئية الداخلية؛ قائمة مراجعة السلع، الطبقة الحبيبية؛ الرابطة الإسلامية الباكستانية، طبقة polymorph/نقير؛ هكذا، الطبقة oriens؛ تجسس، pyramidale الطبقة؛ SLu، لوسيدوم الطبقة؛ ريال، والطبقة رادياتوم؛ حركة تحرير السودان، الطبقة لاكونوسوم-موليكولاري. شريط المقياس = 500 ميكرومتر. النقاط السوداء تمثل واحد نقاط البيانات. إظهار أشرطة ± يعني sem. وقد تم تعديل هذا الرقم من والرافين ودريسباتش1. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الجدول 1: الحلول المستخدمة في هذا البروتوكول.
الجدول 2: الأجسام المضادة المستخدمة في هذا البروتوكول.
الجدول 3: مثال للتعامل مع البيانات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الطريقة المعروضة هنا يهدف إلى التحديد الكمي لتوزيع بروتين فائدة بالنسبة إلى الوفرة من البروتين علامة مع توزيع معروفة. يمكن إظهار تلطيخ الفلورة تقلب عالية لتلطيخ كثافة بين شرائح مختلفة. أن النهج الكمي الموصوفة هنا تلتف هذه المشكلة بتحديد نسبة بروتين الفائدة إلى المتوسط في جميع أنحاء نصف الكرة الغربي. ولذلك، ألغيت كثافات مختلفة المصبوغة عبر شرائح والسماح وصفاً كمياً.
كما هو الحال مع كل بروتوكول الفلورة، النوعية أو الكمية، عدة عوامل يمكن أن تؤثر على نجاح وارباك ذلك التحليل. ولذلك، ينبغي إيلاء اهتمام خاص للخطوات الحاسمة للبروتوكول. أولاً، هناك حاجة إلى تثبيت سليم للأنسجة. عادة ما يمكن أن تحققه هذا التثبيت نضح ترانسكارديال ناجحة. يمكن التحقق من جودة التروية بفحص الكبد قريبا بعد غسل الدم. مؤشر أولى التروية نجاح هو تطهير الكبد، والحدود القصوى28. يمكن أن تشير إلى وجود تجلط الدم أن التروية ربما كان بطيئا للغاية، وينبغي أن يقوم أسرع في المرة القادمة. بعض البروتينات تتطلب تثبيت مختلف البروتوكولات، كما يمكن أن يسبب التثبيت الكيميائي مع منهاج عمل بيجين حانمه انسداد30. وفي هذه الحالة، ينبغي النظر في تجميد التثبيت أو التثبيت مع مادة كيميائية مختلفة، مثل الميثانول،. وثانيا، من المهم بعد تمزيقها، وصمة عار شرائح المخ كما بسرعة قدر الإمكان، ويفضل أن يكون ذلك على نفسه أو قل القادم. تخزين أطول في الجريدة الرسمية يمكن أن تؤدي إلى العدوى البكتيرية، وحين أضاف نان3 يمكن أن يمنع هذا إلى حد ما، وتتدهور نوعية الأنسجة عادة مع وقت التخزين. ثالثا، أثناء إجراء المصبوغة، من المهم إجراء خطوات الغسيل-بئر لتجنب تجفيف الشرائح. عندما تجف الشرائح، يمكن زيادة الأسفار الخلفية ومما يسبب وجود تحيز في التحليل. رابعا، بعد تطبيق جسم الثانوية، أنها حيوية لتنفيذ كافة الخطوات التالية في الظلام. فلوروفوريس حساسة للضوء، والتعرض للضوء يمكن أن تشوه شدة الإشارة الأسفار.
الاستفادة المثلى الإجراء المصبوغة، بما في ذلك اختيار الأجسام المضادة الكافية للابتدائي والثانوي، وتركيز جسم المثلى، ووقت المعرض، شرط أساسي لتحقيق أفضل نسبة إشارة إلى الضجيج والقيام بعمليات موثوقة تحليل كمي الفلورة. ينبغي أن تكون الأجسام المضادة يتم التحقق في ضرب النسيج الخيار المفضل، أن كانت غير متوفرة دائماً. دائماً التأكد من إجراء تجارب التحكم المناسبة لاستبعاد الحديث المتبادل بين مختلف الأجسام المضادة. يمكن تقدير مبلغ fluorescence الخلفية الناشئة عن أوتوفلوريسسينسي وملزمة غير محدد من جسم الثانوية بالتصوير الشرائح الذي لم يطبق جسم الأولية. وليس تافها لتحديد كم أعلى كثافة الإشارة بحاجة إلى عند مقارنة بالخلفية لأن نسبة الإشارة إلى الضوضاء مقبولة. ومع ذلك، استناداً إلى الملاحظات التجريبية، سوف يقترح المؤلفون تهدف لوجود إشارة على الأقل 2-fold أقوى من الخلفية بغية تقدير موثوق بها توزيع البروتين. في حالة الأسفار خلفية عالية في ظروف التحكم (بدون وجود جسم الأولية)، ينبغي طرح fluorescence متوسط الخلفية من الصور التجربة.
والميزة الرئيسية للنهج الذي نتبعه هو الإشارة الداخلية: هو مقارنة كثافة الفلورة البروتين المستهدفة (أيالمحرك) في منطقة الاهتمام علامة مرجعية (أي، سينابتوفيسين) وكثافة الشاملة هذه البروتينات عبر نصف الكرة بأكمله. وهكذا، من الحساب ونحن أداء، واحد يمكن دون لبس نستنتج أن وفرة البروتين المستهدف x إضعاف أعلى/أقل في منطقة معينة من الفائدة من وفرة البروتين مرجع بالنسبة إلى توزيع البروتينات عبر نصف الكرة بأكمله على هذا الصعيد بالنسبة بريجما31. وهذا ما يسمح لمقارنة النتائج باستخدام الأجسام المضادة المختلفة، مجاهر مختلفة، أو حتى عبر دراسات مختلفة. يأتي هذا الاتساق عبر عينات مختلفة من الطبيعة النسبية لهذا الأسلوب: هو تعويض تقلب بأخذ النسبة بين الأسفار في مجال الاهتمام وهذا النصف من الكرة الأرضية. ولذلك، هي إلغاء أوجه اختلاف في القيم المطلقة الناجمة عن الاختلافات التقنية. ميزة كبرى أخرى لهذا الأسلوب هو أن مجالات الاهتمام يمكن أن تكون صغيرة كما تريد أن يقتصر فقط بموجب قرار المجهر. قياس مستويات البروتين مع أساليب الكيمياء الحيوية، وعلى سبيل المثال "لطخة الغربية" أو الكتلي6،7،،من89، يتطلب تشريح الأنسجة في مجال الاهتمام. هذا التشريح الثابت لمناطق في الدماغ، مثل قشرة somatosensory الأولية، ويصبح من المستحيل تقريبا عندما تهدف للمناطق دون الإقليمية، مثل طبقات مختلفة من القشرة أو الحصين.
تحذير من هذا النهج أن مستويات مختلفة في الدماغ لا يمكن مقارنتها مباشرة مع بعضها البعض. نصفي الكرة الأرضية مع العديد من المناطق الغنية بروتين الفائدة سيكون قيمة متوسط مختلفة من نصفي الكرة الأرضية مع إلا عدد قليل من المناطق الغنية بالبروتين. على سبيل المثال، القيم 20% فوق المتوسط، ولذلك يعكس كمية مطلقة مختلفة من البروتين في مستوى واحد بالنسبة إلى بريجما مقارنة بثانية واحدة. يتعين على المرء أن نأخذ في الاعتبار، فضلا عن أن هذا الأسلوب لا يسمح بتحديد مستويات البروتين المطلق، فقط الوفرة النسبية مقارنة بالعلامة المرجعية الداخلية والمتوسط عبر نصف الكرة.
هذا الأسلوب يمكن تكييفها بسهولة لتحديد توزيع بروتين الفائدة بالنسبة إلى علامات للمقصورات العصبية مختلفة، ليس فقط من المواقع بريسينابتيك. كما يمكن تكييفها بسهولة للأنسجة عدا الدماغ-وبمناسبة الأجسام المضادة-نظم نموذجية أخرى من الفئران32،33. بينما استخدام مجهر [كنفوكل] هو أسلوب صاحبي الاختيار، ينبغي أن تسفر عن نوعية البيانات نفس مزيج من برامج الفحص المجهري و deconvolution ابيفلوريسسينسي وبالتالي توسيع إمكانية استخدام البروتوكول. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام ستينينجس نفسه لتحديد توزيع سوبسيلولار، على سبيل المثال مع مجهرية فائقة القرار.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ونحن نشكر ارمغارد فايس للمساعدة التقنية الممتازة. الكتاب نعترف بالدعم المقدم من شركة هرمس بوفانتيس وبيتكوفا أندونييا. كما يشكر المؤلفون المعهد الأوروبي لعلم الأعصاب للاستخدام LSM800 وتقديم المساعدة التقنية، لا سيما من جانب الدكتور نيلز هالبسجوت. تم تمويل هذا العمل من "غوتينغن المركز الطبي الجامعي". JSV يقر دعم المركز للفحص المجهري النانو والفيزيولوجيا الجزيئية للدماغ (كنمبب).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL reaction tubes | Eppendorf | 30120094 | |
| 50 mL reaction tubes | Greiner Bio-One | 227261 | |
| multiwell 24 well | Fisher Scientific | 087721H | |
| plastic pipette (disposable) | Sarstedt | 861,176 | |
| 1000 mL pipette | Rainin | 17014382 | |
| 2 ml pipette | Eppendorf | 3123000012 | |
| Vortex Genius 3 | IKA | 3340001 | |
| Menzel microscope slides | Fisher Scientific | 10144633CF | |
| Stereoscope | Leica | ||
| LSM800 | Zeiss | Confocal microscope | |
| freezing microtome | Leica | ||
| PBS (10X) | Roche | 11666789001 | |
| PFA | Sigma | P6148-1kg | |
| NaCl | BioFroxx | 1394KG001 | |
| sucrose | neoFroxx | 1104KG001 | |
| Tissue Tek | Sakura | 4583 | OCT |
| Na2HPO4 | BioFroxx | 5155KG001 | |
| NaH2PO4 | Merck | 1,063,460,500 | |
| normal goat serum | Merck Millipore | S26-100ML | |
| normal donkey serum | Merck | S30-100ML | |
| Triton X-100 | Merck | 1,086,031,000 | |
| rabbit anti-Mover | Synaptic Systems | RRID: AB_10804285 | |
| guinea pig anti-Synaptophysin | Synaptic Systems | RRID: AB_1210382 | |
| donkey anti-rabbit AF647 | Jackson ImmunoResearch | RRID: AB_2492288 | |
| goat anti-mouse AF488 | Jackson ImmunoResearch | RRID: AB_2337438 | |
| Mowiol4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| ZEN2 blue software | Zeiss | Microscopy software | |
| FIJI | ImageJ | Analysis software | |
| Microsoft Excel | Microsoft |
References
- Wallrafen, R., Dresbach, T. The Presynaptic Protein Mover Is Differentially Expressed Across Brain Areas and Synapse Types. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 58 (2018).
- Augustin, I., Betz, A., Herrmann, C., Jo, T., Brose, N. Differential expression of two novel Munc13 proteins in rat brain. Biochemical Journal. 337, 363-371 (1999).
- Rosenmund, C., et al. Differential Control of Vesicle Priming and Short-Term Plasticity by Munc13 Isoforms. Neuron. 33, 411-424 (2002).
- Breustedt, J., et al. Munc13-2 differentially affects hippocampal synaptic transmission and plasticity. Cerebral cortex. 20, 1109-1120 (2010).
- Chen, Z., Cooper, B., Kalla, S., Varoqueaux, F., Young, S. M. The Munc13 Proteins Differentially Regulate Readily Releasable Pool Dynamics and Calcium-Dependent Recovery at a Central Synapse. The Journal of Neuroscience. 33, 8336-8351 (2013).
- Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A Defined Methodology for Reliable Quantification of Western Blot Data. Mol Biotechnol. , (2013).
- Charette, S. J., Lambert, H., Nadeau, P. J., Landry, J. Protein quantification by chemiluminescent Western blotting Elimination of the antibody factor by dilution series and calibration curve. Journal of Immunological Methods. 353, 148-150 (2010).
- Heidebrecht, F., Heidebrecht, A., Schulz, I., Behrens, S., Bader, A. Improved semiquantitative Western blot technique with increased quantification range. Journal of Immunological Methods. 345, 40-48 (2009).
- Toki, M. I., Cecchi, F., Hembrough, T., Syrigos, K. N., Rimm, D. L. Proof of the quantitative potential of immunofluorescence by mass spectrometry. Laboratory Investigation. 97, 329-334 (2017).
- Wilhelm, B. G., et al. Composition of isolated synaptic boutons reveals the amounts of vesicle trafficking proteins. Science. 344, 1023-1028 (2014).
- Navone, F., et al. Protein p38: An integral membrane protein specific for small vesicles of neurons and neuroendocrine cells. Journal of Cell Biology. 103, 2511-2527 (1986).
- Gundelfinger, E. D., Reissner, C., Garner, C. C. Role of Bassoon and Piccolo in Assembly and Molecular Organization of the Active Zone. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 7, (2016).
- Ziegler, D. R., Cullinan, W. E., Herman, J. P. Distribution of vesicular glutamate transporter mRNA in rat hypothalamus. Journal of Comparative Neurology. 448, 217-229 (2002).
- Chaudhry, F. A., et al. The vesicular GABA transporter, VGAT, localizes to synaptic vesicles in sets of glycinergic as well as GABAergic neurons. Journal of Neuroscience. 18, 9733-9750 (1998).
- Aoki, C., et al. Electron Microscopic Immunocytochemical SAP-97 at Postsynaptic, Presynaptic, and Nonsynaptic Sites of Adult and Neonatal Rat Visual Cortex. Synapse. 257, 239-257 (2001).
- Valtschanoff, J. G., et al. Expression of NR2 Receptor Subunit in Rat Somatic Sensory Cortex : Synaptic Distribution and Colocalization With NR1 and PSD-95. Journal of Comparative Neurology. 611, 599-611 (1999).
- Hunt, A., Schenker, L. J., Kennedy, B. PSD-95 Is Associated with the Postsynaptic Density and Not with the Presynaptic Membrane at Forebrain Synapses. Journal of Neuroscience. 76, 1380-1388 (1996).
- Luscher, B., Fuchs, T., Kilpatrick, C. L. GABA A Receptor Trafficking-Mediated Plasticity of Inhibitory Synapses. Neuron. 70, 385-409 (2011).
- Kirby, M. Understanding the molecular diversity of GABAergic synapses. 5, 1-12 (2011).
- Harris, K. M., Weinberg, R. J., Verrall, A. W. Ultrastructure of Synapses in the Mammalian Brain. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , 1-30 (2012).
- Heise, C., et al. Selective Localization of Shanks to VGLUT1-Positive Excitatory Synapses in the Mouse Hippocampus. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, (2016).
- Peters, P. J., Yuan, L. C., Biology, C., Branch, M. Localization of TGN38 to the trans-Golgi network: involvement of a cytoplasmic tyrosine-containing sequence. Journal of Cell Biology. 120, 1123-1135 (1993).
- Antonini, D., et al. Tprg, a gene predominantly expressed in skin, is a direct target of the transcription factor p63. Journal of Investigative Dermatology. 128, 1676-1685 (2008).
- Burre, J., et al. Synaptic vesicle proteins under conditions of rest and activation: Analysis by 2-D difference gel electrophoresis. Electrophoresis. 27, 3488-3496 (2006).
- Kremer, T., et al. Mover is a novel vertebrate-specific presynaptic protein with differential distribution at subsets of CNS synapses. FEBS Letters. 581, 4727-4733 (2007).
- Ahmed, S., et al. Mover Is a Homomeric Phospho-Protein Present on Synaptic Vesicles. PLoS ONE. 8, (2013).
- Körber, C., et al. Modulation of Presynaptic Release Probability by the Vertebrate-Specific Protein Mover. Neuron. 87, 521-533 (2015).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. , 1-9 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, (2012).
- Schneider Gasser, E. M., et al. Immunofluorescence in brain sections: simultaneous detection of presynaptic and postsynaptic proteins in identified neurons. Nature Protocols. 1, 1887-1897 (2006).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , ACADEMIC PRESS. (2001).
- Sun, Y., Ip, P., Chakrabartty, A. Simple Elimination of Background Fluorescence in Formalin-Fixed Human Brain Tissue for Immunofluorescence Microscopy. Journal of Visualized Experiments. , 1-6 (2017).
- Poole, A. R., Dingle, J. T., Mallia, A. K. The localization of retinol-binding protein in rat liver by immunofluorescence microscopy. Journal of Cell Science. 394, 379-394 (1975).
