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Neuroscience

माउस मस्तिष्क में एक Synaptic प्रोटीन के विषम वितरण बढ़ाता इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग

Published: January 29, 2019 doi: 10.3791/58940

Summary

यहां, हम एक synaptic एक मार्कर इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला का उपयोग प्रोटीन के सापेक्ष प्रोटीन के वितरण का निर्धारण करने के लिए एक मात्रात्मक दृष्टिकोण का वर्णन, फोकल माइक्रोस्कोपी, और कंप्यूटर आधारित विश्लेषण ।

Abstract

उपस्थिति, अनुपस्थिति, या विशिष्ट synaptic प्रोटीन का स्तर गंभीर रूप से synaptic संचरण को प्रभावित कर सकते हैं । एक प्रोटीन के समारोह elucidating के अलावा, यह भी इसके वितरण का निर्धारण करने के लिए महत्वपूर्ण है । यहां, हम एक इम्यूनोफ्लोरेसेंस काम प्रोटोकॉल का वर्णन, फोकल माइक्रोस्कोपी, और कंप्यूटर आधारित विश्लेषण synaptic प्रोटीन प्रस्तावक के वितरण का निर्धारण (TPRGL या SVAP30 भी कहा जाता है) । हम synaptic पुटिका प्रोटीन synaptophysin की है कि प्रस्तावक के वितरण की तुलना, जिससे एक मात्रात्मक तरीके synaptic बुलबुले की बहुतायत के सापेक्ष में प्रस्तावना के वितरण का निर्धारण । विशेष रूप से, इस विधि संभवतः विभिंन एंटीबॉडी या सूक्ष्मदर्शी या विभिंन अध्ययनों के पार का उपयोग कर प्रोटीन के वितरण की तुलना के लिए अनुमति देने के लिए लागू किया जा सकता है । हमारी विधि immunofluorescent दाग के अंतर्निहित परिवर्तनशीलता एक अनुपात के बजाय निरपेक्ष प्रतिदीप्ति स्तर उपज से दरकिनार । इसके अतिरिक्त, हम वर्णन विधि शोधकर्ता को विभिंन स्तरों पर एक प्रोटीन के वितरण का विश्लेषण करने में सक्षम बनाता है: पूरे मस्तिष्क स्लाइस से मस्तिष्क क्षेत्रों में एक मस्तिष्क क्षेत्र में विभिंन उपक्षेत्रों के लिए, हिप्पोकैम्पस या संवेदी के विभिंन परतों के रूप में cortices । प्रस्तावक एक हड्डीवाला-विशिष्ट प्रोटीन है कि synaptic बुलबुले के साथ जुड़ा हुआ है । इस विधि के साथ, हम बताते है कि प्रस्तावक विषम मस्तिष्क क्षेत्रों में वितरित की है, ventral pallidum, septal नाभिक, और प्रमस्तिष्कखंड में उच्च स्तर के साथ, और भी एक मस्तिष्क क्षेत्रों के भीतर, जैसे हिप्पोकैम्पस के विभिंन परतों के रूप में ।

Introduction

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न्यूरॉन्स के बीच संचार synapses नामक विशेष संपर्क साइटों पर होता है. Synapses विभिंन प्रोटीन है कि synaptic संचरण आर्केस्ट्रा के असंख्य होते हैं । उन प्रोटीन से कुछ तंत्रिका तंत्र भर में एक विषम वितरण दिखाने के लिए और हर synapse1में मौजूद नहीं हैं । ऐसे प्रोटीन के लिए एक उदाहरण Munc13 है, जो synaptic बुलबुले की भड़काने की प्रक्रिया में शामिल है । वहां Munc13 के विभिंन isoforms, जो विषम मस्तिष्क2भर में वितरित कर रहे हैं, और उपस्थिति या विशिष्ट isoforms की अनुपस्थिति अल्पकालिक synaptic प्लास्टिक और synaptic पुटिका गतिशीलता 3 को प्रभावित कर सकते हैं, 4 , 5. इसलिए, यह महत्वपूर्ण महत्व का है करने के लिए मस्तिष्क क्षेत्रों में विभिंन synaptic प्रोटीन की उपस्थिति की पहचान कर सकता है ।

synaptic प्रोटीन के ठहराव के लिए पसंद के तरीके-अब तक मास स्पेक्ट्रोमेट्री और पश्चिमी सोख्ता, immunohistochemistry6,7,8,9के बजाय कर रहे हैं । कुछ मामलों में, दोनों मात्रा और विशिष्ट प्रोटीन (यानी, विल्हेम एट अल के स्थानीयकरण का आकलन करने के लिए एक दूसरे के पूरक करने के लिए कई तरीकों का उपयोग किया जाता है । 10). विधि हम यहां का वर्णन स्थानीयकरण और किसी भी जैव रासायनिक विधि का उपयोग करने की आवश्यकता के बिना ब्याज की प्रोटीन की ठहराव के लिए अनुमति देता है, बस immunofluorescent दाग को रोजगार । यहां एक और लाभ यह है कि ठहराव बहुत छोटे क्षेत्रों पर किया जा सकता है और, इसलिए, अधिक विशिष्ट, अंय तरीकों से हासिल की तुलना में उन । हालांकि, एक को ध्यान में रखना है कि एक विश्वसनीय संदर्भ प्रोटीन के लिए ब्याज की प्रोटीन के वितरण का आकलन करने की जरूरत है ।

immunohistochemistry की वजह से हम नियमित रूप से मस्तिष्क क्षेत्रों में प्रोटीन के स्थानीयकरण की पहचान करने की अनुमति देता है और साथ ही विभिन्न न्यूरॉन डिब्बों के भीतर. विभिन्न डिब्बों की पहचान करने के लिए, विशिष्ट मार्कर का उपयोग किया जाता है । आमतौर पर, synapsin और synaptophysin11 के खिलाफ एंटीबॉडी synaptic बुलबुले लेबल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जबकि एंटीबॉडी के खिलाफ एक presynaptic टर्मिनल12के सक्रिय क्षेत्र लेबल । Vesicular ट्रांसपोर्टरों, जैसे Vesicular ग्लूटामेट ट्रांसपोर्टर (vGluT) या Vesicular गाबा ट्रांसपोर्टर (vGAT), क्रमशः उत्तेजक13 और निरोधात्मक14 presynaptic टर्मिनलों लेबल करने के लिए उपयोग किया जाता है । postsynaptic ओर, होमर प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी postsynaptic टर्मिनलों को चिह्नित करने के लिए नियोजित किया जा सकता है, और postsynaptic घनत्व प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी ९५ (PSD95)15,16,17 या gephyrin18 , 19 , 20 उत्तेजक या निरोधात्मक postsynaptic टर्मिनलों, क्रमशः लेबल कर सकते हैं । ब्याज और मार्करों जैसे लोगों के ऊपर वर्णित के रूप में एक प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग करके, एक ऐसे प्रोटीन के स्थानीयकरण निर्धारित कर सकते हैं । तिथि करने के लिए कई अध्ययनों से यह एक गुणात्मक तरीके से21में किया है । हालांकि, मज़बूती से एक विशिष्ट synaptic प्रोटीन की विभेदक वितरण निर्धारित करने के लिए, एक ही अपनी उपस्थिति या अनुपस्थिति लेकिन यह भी अपने रिश्तेदार एकाग्रता का निर्धारण नहीं करना चाहिए । आकार और synapses के घनत्व के विविधता यह synaptic मार्कर और ब्याज की प्रोटीन के बीच एक अनुपात स्थापित करने के लिए महत्वपूर्ण बनाता है । अंयथा, synapse-हिप्पोकैम्पस की गैर-पिरामिडीय परतों और सेरिबैलम के आणविक परत जैसे समृद्ध क्षेत्रों synaptic प्रोटीन का एक उच्च घनत्व दिखाएगा, केवल synapses के उच्च घनत्व के कारण नहीं बल्कि उस प्रोटीन की एक मजबूत उपस्थिति के कारण प्रत्येक synapse (उदा., Wallrafen आणि Dresbach). दूसरी ओर, न्यूरॉनी सोमा (जैसे, TGN3822) में प्रोटीन आमतौर पर हिप्पोकैम्पस हवामहल सेल परत या हिप्पोकैम्पस या अनुमस्तिष्क granules कोशिका परत में मजबूत उपस्थिति दिखाने के लिए होगा कारण न्यूरॉन सेल निकायों की उच्च एकाग्रता के लिए उन क्षेत्रों में । इसलिए, संरचनाओं के इस गैर सजातीय वितरण, इस मामले synapses में, ब्याज खुद के प्रोटीन के वितरण का एक झूठा आकलन करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । इसके अलावा, वहां एक आंतरिक परिवर्तनशीलता में immunohistochemical दाग में नमूनों के पार तीव्रता धुंधला है । प्रोटोकॉल यहां वर्णित विचार में यह लेता है और ऐसे पूर्वाग्रहों से बचा जाता है, साथ ही अंय निरंतर कि immunohistochemical तरीकों से उठता है ।

हमारे हाल के अध्ययन में, हम इस विधि का इस्तेमाल किया है मूवर्स के अंतर अभिव्यक्ति का वर्णन (भी23 TPRGL या SVAP3024बुलाया) 16 विभिंन मस्तिष्क क्षेत्रों में1। मूवर्स एक हड्डीवाला-विशिष्ट synaptic प्रोटीन है कि synaptic बुलबुले के संबंध में पाया जा सकता है और प्रभाव न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज25,26,27. हम एक synaptic पुटिका संदर्भ मार्कर के रूप में synaptophysin के लिए दाग द्वारा synaptic बुलबुले की बहुतायत करने के लिए प्रस्तावना अभिव्यक्ति से संबंधित है । हम septal नाभिक, ventral pallidum, और प्रमस्तिष्कखंड में विशेष रूप से प्रस्तावक के उच्च स्तर पाया । हिप्पोकैम्पस के भीतर, हम मूवर्स के एक विषम वितरण, अंतर हिप्पोकैम्पस अभिकलन के साथ जुड़े परतों में उच्च स्तर के साथ पाया गया, और इनपुट में निंन स्तर और उत्पादन परतों ।

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Protocol

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इस प्रोटोकॉल रहते जानवरों पर प्रयोगों को शामिल नहीं करता है । मस्तिष्क के नमूनों को प्राप्त करने के लिए पशुओं के euthanizing शामिल प्रयोगों अनुमोदन संख्या टी 10/30 के तहत स्थानीय पशु संरक्षण अधिकारियों (Tierschutzkommission डेर Universitätsmedizin गौटिंगेन) द्वारा अनुमोदित किया गया ।

नोट: इस प्रोटोकॉल के लिए, 3 वयस्क पुरुष C57BL/6 चूहों का इस्तेमाल किया गया ।

1. नमूना तैयारी

  1. निर्धारण और ०.१ एम फॉस्फेट बफर तैयार (पंजाब; तालिका 1देखें) ।
  2. transcardial छिड़काव द्वारा पशु को ठीक करें जैसा कि पण एट अल में वर्णित है । 28. सबसे पहले ०.९% NaCl-सॉल्यूशन के साथ खून को धो लें, फिर 4% paraformaldehyde (पीएफए) के 30 मिलीलीटर के साथ perfuse ।
  3. कैंची के साथ खोपड़ी खोलें और ध्यान से कुंद किनारों के साथ एक चंमच का उपयोग मस्तिष्क को अलग ऊतक हानिकारक से बचने के लिए ।
  4. निर्धारण के साथ एक ५० मिलीलीटर रिएक्शन ट्यूब भरें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 4% पीएफए में मस्तिष्क रात भर पोस्टफिक्स ।
  5. निर्धारण निकालें और 30 मिनट के लिए एक शेखर पर ०.१ एम पंजाब के ५० मिलीलीटर में मस्तिष्क धो लो ।
  6. धोने के बाद, ४८ एच के लिए ०.१ एम पंजाब में 30% सुक्रोज में एक ५० मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूब में मस्तिष्क की मशीन या जब तक यह cryoprotection के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब में डूब ।
  7. एक तेज ब्लेड के साथ cryoprotected मस्तिष्क छांटो, यह एक cryomold में जगह है, और यह इष्टतम काटने तापमान (OCT) यौगिक के साथ एंबेड । बुलबुले से बचें । मस्तिष्क ओरिएंट और cryomold में फ्रीज-८० डिग्री सेल्सियस फ्रीजर ।
  8. अनुभाग के लिए जमे हुए ऊतक माउंट । Equilibrate के ऊतकों को cryomicrotome तापमान से कम से 15 मिनट पहले खोदी जाए ।
  9. धारा 25 µm मोटी राज्याभिषेक स्लाइस में मस्तिष्क । मस्तिष्क के ऊतकों को छूने के बिना एक गिलास हुक के साथ ध्यान से OCT स्पर्श करें । एक 24 अच्छी तरह से थाली में प्रति अच्छी तरह से 3 आसंन स्लाइसें ले लीजिए और उंहें 4 डिग्री सेल्सियस पर ०.१ मीटर पंजाब में धुंधला तक की दुकान ।
    नोट: प्रोटोकॉल यहां दो सप्ताह के लिए रोका जा सकता है । अब भंडारण बार ऊतक की गुणवत्ता के साथ हस्तक्षेप कर सकते है और इस तरह प्रयोग के परिणाम को प्रभावित करते हैं ।

2. इम्यूनोफ्लोरेसेंस

  1. ब्लॉकिंग बफ़र, एंटीबॉडी बफ़र, 1 बफ़र धुलाई, और 2 बफ़र ( तालिका 1देखें) को धोने सहित समाधान तैयार करें ।
  2. कुल्ला पंजाब के साथ एक बार स्लाइस अतिरिक्त OCT हटाने के लिए ।
    1. ब्रेन स्लाइस में चूसने के बिना एक प्लास्टिक पिपेट के साथ समाधान निकालें । एक १००० µ एल पिपेट के साथ ताजा पंजाब के २५० µ एल जोड़ें ।
      चेतावनी: स्लाइस बाहर शुष्क नहीं करना चाहिए, इसलिए निकालें और अच्छी तरह से अच्छी तरह से तरल पदार्थ जोड़ें ।
  3. एक प्लास्टिक पिपेट के साथ पंजाब निकालें और एक १००० µ एल पिपेट के साथ अच्छी तरह से प्रति बफ़र अवरुद्ध के २५० µ एल जोड़ें । कमरे के तापमान पर 3 ज के लिए मशीन (आरटी) पर शेखर ।
  4. मशीन समय के दौरान, एक प्रतिक्रिया ट्यूब में एंटीबॉडी बफर में प्राथमिक एंटीबॉडी पतला । अच्छी तरह से प्रति २५० µ एल एंटीबॉडी बफर का प्रयोग करें और एंटीबॉडी की उचित मात्रा में जोड़ें ( तालिका 2देखें) यह pipetting द्वारा सीधे समाधान में एक 2 µ l पिपेट का उपयोग कर । घोल को धीरे से ऊपर और नीचे कई बार pipetting । भंवर शीघ्र ही बाद में उचित मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए ।
    नोट: पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति निर्धारित करने के लिए, दाग भी प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ने के बिना किया जाना चाहिए । उसके लिए, प्रोटोकॉल के अनुसार प्राथमिक एंटीबॉडी के बिना एंटीबॉडी समाधान में टुकड़ा मशीन ।
  5. मशीन समय के बाद, एक प्लास्टिक पिपेट के साथ अवरुद्ध बफर निकालें और अच्छी तरह से प्रति प्राथमिक एंटीबॉडी युक्त एंटीबॉडी समाधान के २५० µ एल जोड़ें. एक शेखर पर 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ स्लाइसें ।
  6. अगले दिन, एक शेखर पर आर टी पर 10 मिनट के लिए 1 3, 0 3x धोने बफर के साथ स्लाइस धो लो ।
    1. एक प्लास्टिक पिपेट के साथ मध्यम निकालें और एक अच्छी तरह से प्रति वाशिंग बफर 1 के ३०० µ एल जोड़ें । 10 मिनट के लिए आरटी पर मशीन 3 बार दोहराएँ ।
  7. धोने के कदम के दौरान, एक प्रतिक्रिया ट्यूब में एंटीबॉडी बफर में fluorophore-युग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी पतला । अच्छी तरह से प्रति २५० µ एल एंटीबॉडी बफर का प्रयोग करें और एंटीबॉडी की उचित मात्रा में जोड़ें ( तालिका 2देखें) यह pipetting द्वारा सीधे समाधान में एक 2 µ l पिपेट का उपयोग कर । घोल को धीरे से ऊपर और नीचे कई बार pipetting । भंवर शीघ्र ही बाद में उचित मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए ।
    चेतावनी: क्योंकि एंटीबॉडी हल्के संवेदनशील होते हैं, जरूरत पड़ने पर इस बिंदु से सभी कदम अंधेरे में प्रदर्शन किया जाना है ।
  8. धोने के कदम के बाद, एक प्लास्टिक पिपेट के साथ धोने बफर निकालें और एंटीबॉडी के प्रति अच्छी तरह से माध्यमिक एंटीबॉडी युक्त समाधान के २५० µ एल जोड़ें । अंधेरे में आरटी पर ९० मिनट के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ स्लाइसें की मशीन ।
  9. आर टी पर 10 मिनट के लिए 2 3x बफर के साथ स्लाइस धो लें ।
  10. धोने के कदम के दौरान, पतला 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 1:2000 की एकाग्रता में ०.१ मीटर पंजाब में ।
  11. एक प्लास्टिक पिपेट के साथ धोने बफर 2 निकालें और अच्छी तरह से प्रति DAPI समाधान के २५० µ एल जोड़ें । शेखर पर आरटी में 5 मिनट के लिए मशीन ।
  12. एक प्लास्टिक पिपेट के साथ DAPI समाधान निकालें और ०.१ एम पंजाब के ५०० µ एल जोड़ने के प्रति अच्छी तरह से एक १००० µ एल पिपेट के साथ ।
  13. माइक्रोस्कोप स्लाइड पर स्लाइस माउंट ।
    1. stereoscope के तहत एक खुर्दबीन स्लाइड प्लेस । एक ठीक ब्रश के साथ, स्लाइड पर ०.१ मीटर पंजाब के तीन अलग बूंदें जोड़ें । माइक्रोस्कोप स्लाइड पर ड्रॉप प्रति एक टुकड़ा प्लेस ।
    2. समतल और माइक्रोस्कोप स्लाइड पर स्लाइस ओरिएंट के लिए ठीक ब्रश का उपयोग करें ।
    3. जब सभी स्लाइस सही ढंग से तैनात हैं, एक ऊतक के साथ अतिरिक्त पंजाब को हटा दें और स्लाइड को ध्यान से सुखाएं ।
      सावधानी: मस्तिष्क के स्लाइस को पूरी तरह सूखने से बचें ।
    4. एंबेडिंग मध्यम के ८० µ l को स्लाइड पर जोड़ें । ध्यान से स्लाइड पर coverslip कम है, जिससे मस्तिष्क स्लाइसें एंबेडिंग ।
    5. 1-2 घंटे के लिए धुएं डाकू में शुष्क करने के लिए स्लाइड छोड़ दो (प्रकाश जोखिम से बचने के लिए उन्हें कवर) और 4 डिग्री सेल्सियस पर एक खुर्दबीन स्लाइड बॉक्स में उन्हें स्टोर.
      नोट: प्रोटोकॉल यहां ठहराया जा सकता है ।

3. इमेजिंग

  1. के बाद embedding मध्यम पूरी तरह से कठोर है, फोकल माइक्रोस्कोप के तहत माइक्रोस्कोप स्लाइड जगह है ।
    नोट: Epifluorescence माइक्रोस्कोपी deconvolution सॉफ्टवेयर के साथ संयुक्त समान छवि गुणवत्ता उपज चाहिए ।
  2. बढ़ रही है या हर चैनल के लिए लेजर तीव्रता को कम करके लेजर सेटिंग्स को समायोजित करें ताकि कुछ पिक्सल ग्रे मूल्यों की अधिकतम वितरण सुनिश्चित करने के लिए उजागर कर रहे हैं ।
  3. विभिंन चैनलों के लिए पूरे मस्तिष्क टुकड़ा के आभासी ऊतकों मोल ।
    1. इमेजिंग सॉफ्टवेयर में ( सामग्री की तालिकादेखें), टाइल्स विकल्प का चयन करें और मैन्युअल टाइल क्षेत्र सेटअपके साथ मस्तिष्क टुकड़ा चित्रित.
    2. टाइल क्षेत्र में समर्थन बिंदुओं को वितरित करें और सत्यापित टाइल क्षेत्रों/स्थिति का उपयोग करके विभिन्न समर्थन बिंदुओं के लिए फ़ोकस समायोजित....
    3. वांछित संकल्प और परिणामी छवि का फ़ाइल आकार के अनुसार अधिग्रहण मोड में सेटिंग्स समायोजित करें और स्कैन शुरू करते हैं ।
  4. जब स्कैन समाप्त हो गया है, आभासी ऊतक प्रक्रिया करने के लिए सिलाई समारोह का उपयोग करें । फ़ाइल को फ़ंक्शन छवि निर्यातके साथ. tif के रूप में निर्यात करें ।

4. कंप्यूटर आधारित विश्लेषण

  1. फ़ाइलों पर क्लिक करके फिजी29 में एक छवि के लिए सभी एकल चैनल लोड । खुला
  2. मुक्तहस्त चयन उपकरण के साथ, DAPI-चैनल में एक गोलार्द्ध चित्रित । संपादित करें क्लिक करके चयन का मास्क बनाएं | चयन | मास्क बनाएं
  3. एक चैनल के लिए मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता का निर्धारण (प्रस्तावना और synaptophysin) पर क्लिक करके विश्लेषण । उपाय.
    नोट: प्रत्येक चैनल के लिए माध्य प्रतिदीप्ति तीव्रता मान निर्धारित करने के लिए विभिन्न चैनलों का चयन करना सुनिश्चित करें.
  4. एक स्प्रेडशीट में एक चैनल के लिए मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता की प्रतिलिपि बनाएं ।
  5. हित के एक क्षेत्र में एक चैनल के लिए मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता का निर्धारण भी मुक्तहस्त चयन उपकरण के साथ क्षेत्र delineating द्वारा । संदर्भ के रूप में एक माउस ब्रेन एटलस का प्रयोग करें ।
  6. सभी गोलार्द्धों और ब्याज के सभी क्षेत्रों के लिए चरण 4.1-4.5 दोहराएं ।
    नोट: प्रत्येक गोलार्द्ध के लिए मान अलग क्रम में करने के लिए कि गोलार्द्ध में एक ब्याज के क्षेत्र में मानों की तुलना करने के लिए (चरण ५.२ देखें) ।

5. डेटा हैंडलिंग

  1. मामले में पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति उच्च है ( चर्चादेखें), एक पृष्ठभूमि घटाव की जरूरत हो सकती है । उसके लिए, संदर्भ प्रोटीन के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी बिना संसाधित टुकड़ा के लिए मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता का निर्धारण (यहां: synaptophysin) और सभी मस्तिष्क क्षेत्रों और गोलार्द्धों के लिए प्राप्त मूल्यों से कि मूल्य घटाना ।
  2. जब हर गोलार्द्ध के लिए एक चैनल के लिए मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता और ब्याज के हर क्षेत्र निर्धारित किया गया है ( तालिका 3देखें), synaptophysin के लिए मूल्य से प्रस्तावक के लिए मूल्य विभाजन द्वारा synaptophysin के लिए प्रस्तावना के अनुपात की गणना ( 3 तालिकामें पीला) । हर गोलार्द्ध और ब्याज के हर क्षेत्र के लिए अलग से इस क्रिया को करते हैं ।
  3. गोलार्द्ध में रुचि के क्षेत्र के अनुपात का निर्धारण करने के लिए इसी गोलार्द्ध ( तालिका 3में नारंगी) के लिए प्राप्त अनुपात के आधार पर ब्याज के एक क्षेत्र के लिए प्राप्त अनुपात को विभाजित करें ।
  4. सापेक्ष प्रस्तावना बहुतायत निर्धारित करने के लिए, 1 से इसके विचलन का निर्धारण करके एक प्रतिशत में ५.२ में प्राप्त अनुपात का अनुवाद ( 3 तालिकामें लाल) । १.२५ का अनुपात इसलिए औसत से ऊपर 25% की एक रिश्तेदार पैरोकार बहुतायत देना होगा, और ०.७५ के अनुपात औसत से नीचे 25% की एक रिश्तेदार पैरोकार बहुतायत उपज होगी ।

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Representative Results

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प्रतिनिधि अलग मार्करों के धुंधला पैटर्न चित्रा 1में देखा जा सकता है । पैटर्न प्रोटीन के वितरण के आधार पर बदलता है । पाँच rostro-caudal स्तरों के उदाहरण स्तंभों (A)-(E) में दिखाए जाते हैं. एक प्रतिनिधि DAPI दाग पहली पंक्ति में दिखाया गया है: DAPI एक कोशिका के डीएनए का पालन करता है और इस तरह नाभिक दाग रहे हैं । यह एक कबरा पैटर्न में परिणाम है । उच्च कोशिका घनत्व वाले क्षेत्र कम सेल घनत्व वाले क्षेत्रों की तुलना में चमकीले होते हैं । एक विषम वितरित प्रोटीन के लिए एक उदाहरण दूसरी पंक्ति में देखा जा सकता है । पैरोकार धुंधला मस्तिष्क में एक अंतर वितरण से पता चलता है, उज्ज्वल hotspot क्षेत्रों और dimmer क्षेत्रों के साथ । तीसरी पंक्ति में, अधिक homogeneously वितरित संदर्भ मार्कर synaptophysin के लिए एक उदाहरण दिखाया गया है । दो प्रोटीन (चौथी पंक्ति) के एक ओवरले (लाल) मार्कर प्रोटीन synaptophysin (ग्रीन) की तुलना में प्रस्तावना के अंतर वितरण से पता चलता है ।

चित्रा 2 प्रोटोकॉल के चरण 4 में वर्णित ठहराव से पता चलता है । दिखाए गए गोलार्द्धों भर में विभिंन चैनलों के लिए मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता मान रहे है (प्रस्तावना, चित्रा 2A; synaptophysin, चित्रा 2) और ब्याज के क्षेत्रों (प्रस्तावना, 2सीके पार; synaptophysin, चित्रा 2डी) । प्रस्तावक बहुतायत synaptic बुलबुले की संख्या के सापेक्ष निर्धारित करने के लिए, एक अनुपात प्रतिदीप्ति मूल्यों synaptophysin करने के लिए प्रस्तावक प्रतिदीप्ति मूल्यों का लिया जाता है । ब्याज के क्षेत्रों के लिए ये अनुपात चित्रा 2में दिखाया गया है, और पहले से ही प्रस्तावना के विषम वितरण का एक संकेत, उच्च और कम पैरोकार synaptic बुलबुले के सापेक्ष स्तर के साथ क्षेत्रों के साथ प्रदान कर रहे हैं । इसके अतिरिक्त निहित तकनीकी परिवर्तनशीलता के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए, ब्याज के एक क्षेत्र में अनुपात (चित्रा 2) गोलार्द्ध भर में उस की तुलना में है (नहीं दिखाया गया है) और एक प्रतिशत में अनुवाद. इस रिश्तेदार प्रस्तावक बहुतायत (चित्रा 2एफ) कितना प्रस्तावक का एक उपाय देता है ब्याज की औसत के सापेक्ष एक क्षेत्र में मौजूद है ।

जैसा कि ऊपर उल्लेख किया है, इस तकनीक का प्रमुख लाभ में से एक को बहुत छोटे क्षेत्रों में ब्याज की प्रोटीन की बहुतायत निर्धारित करने की क्षमता है, यहां तक कि उपक्षेत्रों और ब्याज के क्षेत्रों की परतों । इस आवेदन का एक उदाहरण चित्रा 3में दिखाया गया है, जहां रिश्तेदार पैरोकार बहुतायत हिप्पोकैम्पस के उपक्षेत्रों में विभिंन परतों के लिए निर्धारित किया गया था । चित्रा 3डी, चित्रा 3 एफमें दिखाया अलग परतों में ठहराव, और चित्रा 3 एच चित्रा3सी, चित्रा 3में दिखाया परतों से मेल खाती है, और चित्रा 3जी, इसी रंग के साथ । हिप्पोकैम्पस के भीतर, प्रस्तावना विषम रूप से उच्च प्रस्तावक स्तर इंट्रा हिप्पोकैम्पस अभिकलन के साथ जुड़े परतों में synaptic बुलबुले के सापेक्ष के साथ, वितरित किया जाता है (यानी, dentate गाइरस के polymorph परत [डीजी], परत radiatum, lucidum और oriens के Cornu Ammonis 3 [CA3], और परत radiatum और oriens Cornu 1 के Ammonis [CA1]), और निम्न स्तरों में इनपुट-और आउटपुट परतों (डीजी की भीतरी और बाहरी आणविक परत, CA3 और CA1 के पिरामिडीय कोशिका परतों, और परत lacunosum-CA1 की आणविक).

Figure 1
चित्रा 1 : प्रतिनिधि इम्यूनोफ्लोरेसेंस DAPI की छवियां (पहली पंक्ति), प्रस्तावना (दूसरी पंक्ति), synaptophysin (तीसरी पंक्ति), और उनके ओवरले (चौथी पंक्ति, लाल रंग में प्रस्तावना, हरी में synaptophysin) 5 rostro-caudal स्तर पर (ए-ई) । ब्याज क्षेत्रों पैनलों की ऊपरी पंक्ति में भूरे रंग में छायांकित हैं । M1, प्राथमिक मोटर प्रांतस्था; आईओसी, Calleja के द्वीप; एसीसी, पूर्वकाल सिंगुलेट प्रांतस्था; SNu, septal नाभिक; VPa, ventral pallidum; नुआ, नाभिक accumbens; सीपी, caudate putamen; एस सी, प्राथमिक somatosensory प्रांतस्था; Hc, हिप्पोकैम्पस; Am, प्रमस्तिष्कखंड; एमएचए, औसत दर्जे का habenula; PAG, periaqueductal धूसर; SN, substantia नाइग्रा; VTA, ventral tegmental क्षेत्र; विधान पार्षद, सेरिबैलम की आणविक परत; GLC, सेरिबैलम की दानेदार परत । स्केल बार = ५०० µm । यह आंकड़ा Wallrafen और Dresbach1से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : ठहराव 5 rostro-caudal स्तरों भर में प्रस्तावना वितरण की । मूवर्स सिग्नल (A) और synaptophysin सिग्नल (B) के विभिंन स्तरों पर प्रतिदीप्ति तीव्रता का अर्थ है । मूवर्स सिग्नल के प्रतिदीप्ति तीव्रता मतलब (सी) और 16 मैन्युअल delineated मस्तिष्क क्षेत्रों में synaptophysin संकेत (डी). () ब्याज के 16 मस्तिष्क क्षेत्रों में मूवर्स और synaptophysin का अनुपात । () सापेक्षात्मक प्रस्तावकों की ठहराव, संबंधित क्षेत्र में मूवर्स/synaptophysin अनुपात की तुलना इसी गोलार्द्ध के अनुपात में की जाती है. M1, प्राथमिक मोटर प्रांतस्था; आईओसी, Calleja के द्वीप; एसीसी, पूर्वकाल सिंगुलेट प्रांतस्था; SNu, septal नाभिक; VPa, ventral pallidum; नुआ, नाभिक accumbens; सीपी, caudate putamen; एस सी, प्राथमिक somatosensory प्रांतस्था; Hc, हिप्पोकैम्पस; Am, प्रमस्तिष्कखंड; एमएचए, औसत दर्जे का habenula; PAG, periaqueductal धूसर; SN, substantia नाइग्रा; VTA, ventral tegmental क्षेत्र; विधान पार्षद, सेरिबैलम की आणविक परत । काले डॉट्स एकल डेटा बिंदुओं का प्रतिनिधित्व करते हैं । सलाखों मतलब (SEM) के अर्थ ± मानक त्रुटि दिखाते हैं । यह आंकड़ा Wallrafen और Dresbach1से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : माउस हिप्पोकैम्पस में मूवर्स वितरण । इम्यूनोफ्लोरेसेंस माउस हिप्पोकैम्पस के राज्याभिषेक स्लाइस के दाग । विषम प्रस्तावना अभिव्यक्ति पैटर्न (एक) और इसी Synaptophysin धुंधला (बी) दिखा हिप्पोकैम्पस का अवलोकन । ब्याज के तीन क्षेत्र (डीजी, चित्रा 3सी; CA3, चित्रा 3; CA1, चित्रा 3जी) सफेद बिंदीदार रेखाओं के साथ delineated हैं । (डी,एफ,एच) ठहराव संबंधित परतों में इसी गोलार्द्ध के अनुपात की तुलना में । पट्टी रेखांकन में रंग पैनलों में संबंधित छायाप्रभाव के अनुरूप सी, , और जी। प्रस्तावना अभिव्यक्ति अंतर हिप्पोकैम्पस अभिकलन के साथ जुड़े स्तरों में उच्च है (यानी, डीजी, परत radiatum, lucidum और oriens के CA3, और radiatum के oriens और परत CA1), और कम में मुख्य इनपुट-और उत्पादन परतों के polymorph लेयर ( डीजी की भीतरी और बाहरी आणविक परत, CA3 और CA1 की पिरामिडीय कोशिका परतें, और CA1 की परत lacunosum-आणविक). OML, बाहरी आणविक परत; IML, भीतरी आणविक परत; GrL, दानेदार परत; पीएमएल, polymorph लेयर/hilus; तो, परत oriens; जासूस, परत pyramidale; SLu, परत lucidum; SR, परत radiatum; SLM, परत lacunosum-आण्विक. स्केल बार = ५०० µm. ब्लैक डॉट्स एकल डेटा बिंदुओं का प्रतिनिधित्व करते हैं । सलाखों के मतलब ± SEM दिखाओ । यह आंकड़ा Wallrafen और Dresbach1से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Table 1
तालिका 1: समाधान इस प्रोटोकॉल में उपयोग किया जाता है ।

Table 2
तालिका 2: इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल एंटीबॉडी ।

Table 3
तालिका 3: डेटा हैंडलिंग का उदाहरण ।

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Discussion

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यहां प्रस्तुत विधि एक ज्ञात वितरण के साथ एक मार्कर प्रोटीन की बहुतायत के सापेक्ष ब्याज की एक प्रोटीन के वितरण को बढ़ाता है । इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला अलग स्लाइस के बीच धुंधला तीव्रता की एक उच्च परिवर्तनशीलता दिखा सकते हैं । यहां वर्णित ठहराव दृष्टिकोण इस समस्या को दरकिनार कर गोलार्द्ध में औसत से ब्याज के प्रोटीन का अनुपात निर्धारित करते हैं । इसलिए, स्लाइस भर में अलग धुंधला तीव्रता रद्द कर रहे है और एक मात्रात्मक विवरण के लिए अनुमति देते हैं ।

हर इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल, गुणात्मक या मात्रात्मक के साथ के रूप में, कई कारकों सफलता को प्रभावित कर सकते है और इस तरह विश्लेषण पाया । इसलिए, विशेष ध्यान प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण चरणों के लिए भुगतान किया जाना चाहिए । सबसे पहले, ऊतक के एक उचित निर्धारण की जरूरत है । यह निर्धारण आमतौर पर एक सफल transcardial छिड़काव द्वारा प्राप्त किया जा सकता है । छिड़काव की गुणवत्ता से रक्त को धोने के बाद शीघ्र ही लिवर की जाँच करके सत्यापित किया जा सकता है । एक सफल छिड़काव के लिए एक पहला संकेतक जिगर और उग्रवाद28के समाशोधन है । रक्त के थक्के की उपस्थिति संकेत कर सकते हैं कि छिड़काव बहुत धीमी हो गई है और तेजी से अगली बार किया जाना चाहिए हो सकता है । कुछ प्रोटीन अलग निर्धारण प्रोटोकॉल की आवश्यकता, पीएफए के साथ रासायनिक निर्धारण के रूप में epitope रुकावट30पैदा कर सकता है । इस मामले में, मेथनॉल के रूप में एक अलग रासायनिक के साथ स्थिर निर्धारण या निर्धारण, विचार किया जाना चाहिए । दूसरा, अनुभागीकरण के बाद, यह संभव के रूप में जल्दी के रूप में मस्तिष्क स्लाइसें दाग महत्वपूर्ण है, अधिमानतः एक ही या अगले कहते हैं । पंजाब में अब भंडारण जीवाणु संक्रमण के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, और जबकि3 नण जोड़ने कुछ हद तक इस को रोका जा सकता है, ऊतक की गुणवत्ता आमतौर पर भंडारण समय के साथ खराब हो जाती है । तीसरा, धुंधला प्रक्रिया के दौरान, यह अच्छी तरह से धोने चरणों का प्रदर्शन करने के लिए महत्वपूर्ण है-अच्छी तरह से स्लाइस के सूखने से बचने के लिए । जब स्लाइस बाहर सूखी, पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति वृद्धि और इस प्रकार विश्लेषण में एक पूर्वाग्रह पैदा कर सकता है । चौथा, माध्यमिक एंटीबॉडी के आवेदन के बाद, यह अंधेरे में सभी निम्न चरणों का पालन करने के लिए महत्वपूर्ण है. fluorophores प्रकाश के प्रति संवेदनशील हैं, और प्रकाश जोखिम गंभीर रूप से प्रतिदीप्ति संकेत विकृत कर सकते हैं ।

धुंधला प्रक्रिया का अनुकूलन, पर्याप्त प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी, इष्टतम एंटीबॉडी एकाग्रता, और प्रदर्शनी समय के चयन सहित, के लिए सबसे अच्छा संकेत करने के लिए शोर अनुपात को प्राप्त करने और एक विश्वसनीय बाहर ले जाने के लिए एक शर्त है मात्रात्मक इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण. बाहर ऊतक नॉकआउट में सत्यापित एंटीबॉडी पसंदीदा विकल्प होना चाहिए, हालांकि हमेशा उपलब्ध नहीं है । हमेशा अलग एंटीबॉडी के बीच crosstalk बाहर करने के लिए उचित नियंत्रण प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए सुनिश्चित करें. autofluorescence और द्वितीयक एंटीबॉडी की विशिष्ट बाइंडिंग से उत्पन्न होने वाली पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति की मात्रा को इमेजिंग द्वारा उन स्लाइसों का अनुमान लगाया जा सकता है जिनमें प्राथमिक एंटीबॉडी लागू नहीं किया गया था. यह तुच्छ नहीं है स्थापित करने के लिए कितना उच्च संकेत की तीव्रता की जरूरत है जब पृष्ठभूमि की तुलना करने के लिए एक स्वीकार्य संकेत करने के लिए शोर अनुपात है । हालांकि, अनुभवजंय टिप्पणियों के आधार पर, लेखकों एक संकेत करने के लिए लक्ष्य का सुझाव होगा कम से 2-पृष्ठभूमि की तुलना में मजबूत गुना करने के लिए मज़बूती से प्रोटीन वितरण का अनुमान है । मामले में पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति नियंत्रण की स्थिति में उच्च है (प्राथमिक एंटीबॉडी की उपस्थिति के बिना), औसत पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति प्रयोग छवियों से घटाया जाना चाहिए ।

हमारे दृष्टिकोण का प्रमुख लाभ अपने आंतरिक संदर्भ है: लक्ष्य प्रोटीन की इम्यूनोफ्लोरेसेंस तीव्रता (यानी, प्रस्तावक) ब्याज के क्षेत्र में एक संदर्भ मार्कर (यानी, synaptophysin) की तुलना में और समग्र तीव्रता के लिए है पूरे गोलार्द्ध में ये प्रोटीन. इस प्रकार, गणना हम प्रदर्शन से, एक स्पष्ट निष्कर्ष निकाल सकते है कि लक्ष्य प्रोटीन की प्रचुरता है एक्स गुना अधिक/ब्याज की एक निश्चित क्षेत्र में संदर्भ प्रोटीन के वितरण के सापेक्ष की बहुतायत से भर में प्रोटीन Bregma31के सापेक्ष इस स्तर पर संपूर्ण गोलार्द्ध । यह अलग एंटीबॉडी का उपयोग कर परिणामों की तुलना के लिए अनुमति देता है, विभिन्न सूक्ष्मदर्शी, या यहाँ तक कि विभिन्न अध्ययनों भर. विभिंन नमूनों में यह संगति इस विधि की तुलनात्मक प्रकृति से आती है: परिवर्तनशीलता के लिए ब्याज के क्षेत्र में प्रतिदीप्ति के बीच अनुपात को लेकर और गोलार्द्ध के द्वारा क्षतिपूर्ति की जाती है । इसलिए, तकनीकी मतभेदों से उत्पन्न निरपेक्ष मूल्यों में असमानताएँ प्राणविहीन हैं. इस तकनीक का एक अंय प्रमुख लाभ यह है कि ब्याज के क्षेत्रों के रूप में आप उंहें होना चाहता हूं के रूप में छोटे हो सकता है, केवल माइक्रोस्कोप के संकल्प से सीमित है । जैव रासायनिक तरीकों के साथ प्रोटीन के स्तर को बढ़ाता है, उदाहरण के लिए पश्चिमी दाग या मास स्पेक्ट्रोमेट्री6,7,8,9, ब्याज के क्षेत्र में ऊतक के एक विच्छेदन की आवश्यकता है । इस विच्छेदन मस्तिष्क के क्षेत्रों के लिए कठिन है, ऐसे प्राथमिक somatosensory प्रांतस्था के रूप में, और लगभग असंभव हो जाता है जब उपक्षेत्रों के लिए लक्ष्य, जैसे प्रांतस्था या हिप्पोकैम्पस के विभिंन परतों के रूप में ।

दृष्टिकोण का एक चेतावनी है कि मस्तिष्क में विभिंन स्तरों सीधे एक दूसरे के साथ तुलना नहीं की जा सकती है । कई ब्याज के प्रोटीन में समृद्ध क्षेत्रों के साथ गोलार्द्धों केवल कुछ प्रोटीन अमीर क्षेत्रों के साथ गोलार्द्धों की तुलना में एक अलग औसत मूल्य होगा । औसत से ऊपर 20% के मूल्यों, उदाहरण के लिए, इसलिए एक दूसरे से तुलना के रूप में Bregma के सापेक्ष एक स्तर में प्रोटीन की एक अलग निरपेक्ष मात्रा को प्रतिबिंबित करेगा । एक को ध्यान में रखने के रूप में अच्छी तरह से है कि इस विधि निरपेक्ष प्रोटीन के स्तर के निर्धारण की अनुमति नहीं है, केवल सापेक्ष बहुतायत आंतरिक संदर्भ मार्कर और गोलार्द्ध में औसत की तुलना में ।

इस विधि को आसानी से अलग ंयूरॉंस डिब्बों, न केवल presynaptic साइटों के लिए मार्करों के सापेक्ष ब्याज की प्रोटीन के वितरण का निर्धारण करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । यह भी आसानी से मस्तिष्क के अलावा अन्य ऊतकों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है और-उपयुक्त एंटीबॉडी के साथ-अन्य मॉडल सिस्टम चूहों से३२,३३. जबकि एक फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग ' लेखकों की पसंद की विधि है, epifluorescence माइक्रोस्कोपी और deconvolution सॉफ्टवेयर का एक संयोजन एक ही डेटा की गुणवत्ता उपज और इस तरह प्रोटोकॉल की प्रयोज्य का विस्तार करना चाहिए । इसके अतिरिक्त, एक ही दाग के लिए उपसेलुलर वितरण निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी के साथ उदाहरण के लिए ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए Irmgard Weiss धंयवाद । लेखक हेमीज़ Pofantis और Andoniya Petkova द्वारा समर्थन स्वीकार करते हैं । लेखक भी LSM800 और तकनीकी सहायता के उपयोग के लिए यूरोपीय तंत्रिका विज्ञान संस्थान, विशेष रूप से डॉ निल्स Halbsgut द्वारा धंयवाद । इस काम को यूनिवर्सिटी मेडिकल सेंटर गौटिंगेन ने वित्तपोषित किया था. जेएसवी मस्तिष्क (CNMPB) के नेनो माइक्रोस्कोपी और आणविक फिजियोलॉजी के लिए केंद्र द्वारा समर्थन स्वीकार करता है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL reaction tubes Eppendorf 30120094
50 mL reaction tubes Greiner Bio-One 227261
multiwell 24 well Fisher Scientific                                                                                                 087721H
plastic pipette (disposable) Sarstedt 861,176
1000 mL pipette Rainin  17014382
2 ml pipette Eppendorf 3123000012
Vortex Genius 3  IKA 3340001
Menzel microscope slides Fisher Scientific                                                                                           10144633CF
Stereoscope Leica
LSM800 Zeiss Confocal microscope
freezing microtome Leica
PBS (10X) Roche                                                                                        11666789001
PFA Sigma                                                                                             P6148-1kg
NaCl BioFroxx 1394KG001
sucrose neoFroxx 1104KG001
Tissue Tek Sakura  4583 OCT
Na2HPO4 BioFroxx 5155KG001
NaH2PO4 Merck 1,063,460,500
normal goat serum Merck Millipore S26-100ML
normal donkey serum Merck S30-100ML
Triton X-100 Merck 1,086,031,000
rabbit anti-Mover Synaptic Systems RRID: AB_10804285
guinea pig anti-Synaptophysin Synaptic Systems RRID: AB_1210382
donkey anti-rabbit AF647 Jackson ImmunoResearch RRID: AB_2492288
goat anti-mouse AF488 Jackson ImmunoResearch RRID: AB_2337438
Mowiol4-88 Calbiochem                                                                                                    475904
ZEN2 blue software Zeiss Microscopy software
FIJI ImageJ Analysis software
Microsoft Excel Microsoft

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References

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माउस मस्तिष्क में एक Synaptic प्रोटीन के विषम वितरण बढ़ाता इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग
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Wallrafen, R., Dresbach, T., Viotti, J. S. Quantifying the Heterogeneous Distribution of a Synaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence. J. Vis. Exp. (143), e58940, doi:10.3791/58940 (2019).More

Wallrafen, R., Dresbach, T., Viotti, J. S. Quantifying the Heterogeneous Distribution of a Synaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence. J. Vis. Exp. (143), e58940, doi:10.3791/58940 (2019).

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