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Neuroscience

Cuantificar la distribución heterogénea de una proteína sináptica en el cerebro de ratón mediante inmunofluorescencia

Published: January 29, 2019 doi: 10.3791/58940

Summary

Aquí, describimos un enfoque cuantitativo para determinar la distribución de una proteína sináptica en relación con un marcador proteico utilizando tinción de inmunofluorescencia, microscopia confocal y análisis basados en computadoras.

Abstract

La presencia, ausencia o niveles de proteínas sinápticas específicas pueden influir seriamente en transmisión sináptica. Además de dilucidar la función de una proteína, es vital para determinar su distribución. Aquí, describimos un protocolo de empleo de la inmunofluorescencia, microscopia confocal y análisis computarizado para determinar la distribución de la proteína sináptica Mover (también llamado TPRGL o SVAP30). Comparamos la distribución del motor a la de la vesícula sináptica proteína sinaptofisina, determinando la distribución del motor en términos cuantitativos en relación con la abundancia de vesículas sinápticas. En particular, este método podría aplicarse potencialmente para permitir la comparación de la distribución de proteínas con diversos anticuerpos o microscopios o a través de diferentes estudios. Nuestro método evita la variabilidad inherente de los stainings inmunofluorescentes cediendo una relación en lugar de los niveles de fluorescencia absoluta. Además, el método que se describe permite al investigador analizar la distribución de una proteína en diferentes niveles: desde rebanadas de todo el cerebro a regiones del cerebro a diversas subregiones de zona de un cerebro, como las diferentes capas del hipocampo o sensorial cortezas. Es una proteína específica de vertebrados que se asocia con vesículas sinápticas. Con este método, se muestra que Mover es heterogénea en las áreas del cerebro, con altos niveles en el pallidum ventral, el núcleo septal y la amígdala y también en áreas individuales del cerebro, como las diferentes capas del hipocampo.

Introduction

Comunicación entre las neuronas sucede en sitios especializados de contacto denominados sinapsis. Las sinapsis contienen un gran número de proteínas diferentes que orquestar la transmisión sináptica. Algunas de estas proteínas muestran una distribución heterogénea en todo el sistema nervioso y no están presentes en cada sinapsis1. Un ejemplo de tal proteína es Munc13, que participa en el proceso de cebado de vesículas sinápticas. Existen diferentes isoformas de Munc13, que están distribuidos heterogéneamente en el cerebro2, y la presencia o ausencia de isoformas específicas puede influir en la plasticidad sináptica a corto plazo y vesícula sináptica dinámica3, 4 , 5. por lo tanto, es de vital importancia para poder identificar la presencia de diferentes proteínas sinápticas entre áreas del cerebro.

Los métodos de elección para la cuantificación de proteínas sinápticas - hasta ahora - son la espectrometría de masas y de Western Blot, en lugar de inmunohistoquímica6,7,8,9. En algunos casos, se utilizan varios métodos que se complementan entre sí para evaluar la cantidad y la localización de proteínas específicas (es decir, Wilhelm et al. 10). el método se describe aquí permite la localización y cuantificación de proteínas de interés sin la necesidad de utilizar cualquier método bioquímico, simplemente empleando los stainings inmunofluorescentes. Otra ventaja aquí es que la cuantificación puede realizarse sobre áreas mucho más pequeñas y, por lo tanto, más específicos, que el logrado por otros métodos. Sin embargo, hay que tener en cuenta que una proteína de referencia confiable es necesario para evaluar la distribución de la proteína de interés.

Fluorescente de tinción por inmunohistoquímica permite identificar rutinariamente la localización de proteínas entre las áreas del cerebro, así como dentro de diferentes compartimientos neuronales. Para identificar los diferentes compartimentos, se utilizan marcadores específicos. Por lo general, los anticuerpos contra la sinapsina y synaptophysin11 pueden utilizarse para etiqueta de vesículas sinápticas, mientras que la zona activa de un terminal presináptico12la etiqueta anticuerpos contra fagot. Transportadores vesiculares, como los transportadores vesiculares de glutamato (vGluT) o el transportador vesicular de GABA (vGAT), se utilizan para etiquetar excitatorios13 e inhibitorio14 terminales presinápticos, respectivamente. En el lado postsináptico, anticuerpos contra la proteína Homer pueden ser empleados para marcar las terminales postsinápticas y anticuerpos contra densidad postsynaptic proteínas 95 (PSD95)15,16,17 o gephyrin18 , 19 , 20 puede etiquetar terminales postsinápticos excitatorios o inhibitorios, respectivamente. Mediante el uso de anticuerpos contra una proteína de interés y marcadores tales como los descritos anteriormente, uno puede determinar la localización de dicha proteína. Muchos estudios hasta la fecha han hecho esto en una forma cualitativa21. Sin embargo, determinar confiablemente la distribución diferencial de una proteína sináptica específica, uno debe no sólo determinar su presencia o ausencia sino también su concentración relativa. La heterogeneidad de tamaños y densidad de las sinapsis, es importante establecer una relación entre el marcador sináptico y la proteína de interés. De lo contrario, muestra una alta densidad de proteínas sinápticas, solamente debido a la mayor densidad de sinapsis pero no debido a una fuerte presencia de esa proteína en regiones ricas en sinapsis como las capas no piramidal del hipocampo y la capa molecular del cerebelo cada sinapsis (por ejemplo, Wallrafen y Dresbach1). Por otro lado, las proteínas en el soma neuronal (p. ej., TGN3822) generalmente presentan fuerte presencia en la capa de células piramidales hipocampales o capa de células de hipocampo o cerebelosas del gránulo debido a la alta concentración de cuerpos celulares neuronales en esas áreas. Por lo tanto, esta distribución no homogénea de las estructuras, en este caso sinapsis, puede conducir a una falsa estimación de la distribución de la proteína del interés propio. Además, hay una variabilidad intrínseca en la tinción de intensidades a través de muestras en los stainings de immunohistochemical. El protocolo descrito aquí tiene esto en cuenta y evita tales sesgos, así como otras advertencias que surgen de métodos inmunohistoquímicos.

En nuestro reciente estudio, hemos utilizado este método para describir la expresión diferencial del motor (también denominado TPRGL23 SVAP3024) a través de 16 cerebro diferentes zonas1. Es una proteína sináptica específica de vertebrados que puede encontrarse en asociación a las vesículas sinápticas e influye neurotransmisor lanzamiento25,26,27. Hemos relacionado la expresión de Mover a la abundancia de vesículas sinápticas, de coloración para el synaptophysin como un marcador de referencia de la vesícula sináptica. Se encontraron altos niveles del motor particularmente en la amígdala, los núcleos septales y el pallidum ventral. En el hipocampo, encontramos una distribución heterogénea de Mover, con altos niveles en las capas asociadas con cómputo intra-hippocampal y bajos niveles en las capas de entrada y salida.

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Protocol

Este protocolo no implica experimentos en animales vivos. Experimentos con euthanizing animales para obtener muestras de cerebro fueron aprobados por las autoridades locales de protección animal (Tierschutzkommission der Universitätsmedizin Göttingen) bajo el número T 10/30.

Nota: Para este protocolo, se utilizaron ratones C57BL/6 de machos adultos 3.

1. preparación de la muestra

  1. Preparar fijador y tampón de fosfato de 0,1 M (PB; ver tabla 1).
  2. Fijar el animal por la perfusión de transcardial como se describe en Gage et al. 28. primero lavar la sangre con 0.9% de solución de NaCl, luego perfusión con 30 mL de paraformaldehído al 4% (PFA).
  3. Abrir el cráneo con las tijeras y aislar cuidadosamente el cerebro con una cuchara con cantos romos para evitar dañar el tejido.
  4. Llene un tubo de reacción de 50 mL con fijador y postfix el cerebro en el 4% PFA a 4 ° C durante la noche.
  5. Retirar el fijador y lavado el cerebro en 50 mL de 0.1 M de PB en un agitador durante 30 minutos.
  6. Después del lavado, incubar el cerebro en un tubo de reacción de 50 mL en 30% de sacarosa en PB 0.1m durante 48 h o hasta que se hunde en el tubo a 4 ° C para crioprotección.
  7. Recorte el cerebro de cryoprotected con una cuchilla afilada, colocar en una cryomold e incrustar con la temperatura de corte óptima (OCT) compuesto. Evitar las burbujas. Oriente el cerebro y congelar el cryomold en el congelador de-80 ° C.
  8. Montar el tejido congelado para seccionamiento. Equilibrar el tejido a la temperatura de cryomicrotome para por lo menos 15 min antes de seccionamiento.
  9. Sección del cerebro en 25 μm espesor rebanadas coronales. Toque el OCT cuidadosamente con un gancho de vidrio sin tocar el tejido cerebral. Recoger 3 rebanadas adyacentes por pozo en una placa bien 24 y almacenarlas en PB 0.1m a 4 ° C hasta la coloración.
    Nota: El protocolo puede hacer una pausa aquí durante dos semanas. Tiempo de almacenamiento puede interferir con la calidad del tejido y así influir en el resultado del experimento.

2. inmunofluorescencia

  1. Preparar soluciones incluyendo el amortiguador de bloqueo, almacenador intermediario del anticuerpo, lavado tampón 1 y el tampón de lavado 2 (ver tabla 1).
  2. Enjuague trozos de una vez con PB para quitar exceso OCT.
    1. Retirar la solución con una pipeta de plástico sin aspirar en las rebanadas de cerebro. Añadir 250 μl de PB fresco con una pipeta de 1000 μl.
      PRECAUCIÓN: Rebanadas deben no, así que quitar y añadir líquidos bien por bien.
  3. Retirar el PB con una pipeta de plástico y añadir 250 μl de solución amortiguadora de bloqueo por pozo con una pipeta de 1000 μl. Incubar durante 3 h a temperatura ambiente (RT) en el agitador.
  4. Durante el tiempo de incubación, diluir los anticuerpos primarios en tampón en un tubo de reacción de anticuerpos. Utilizar 250 μl de tampón de anticuerpo por bien y añadir la cantidad adecuada de anticuerpos (ver tabla 2) mediante Pipeteo directamente en la solución con una pipeta de 2 μl. Mezcle la solución mediante pipeteo suavemente arriba y abajo varias veces. Vórtice poco después para asegurar una mezcla adecuada.
    Nota: Para determinar la fluorescencia de fondo, los stainings debe también realizarse sin añadir el anticuerpo primario. Para ello, incubar la rebanada en la solución de anticuerpo sin anticuerpos primarios según el protocolo.
  5. Después del tiempo de incubación, retirar el amortiguador de bloqueo con una pipeta de plástico y añadir 250 μl de solución de anticuerpo que contiene anticuerpos primarios por pozo. Incuban rebanadas con anticuerpo primario durante la noche a 4 ° C en un agitador.
  6. Al día siguiente, lave las rebanadas con lavado tampón 1 3 x 10 min a temperatura ambiente en un agitador.
    1. Retirar el medio con una pipeta de plástico y añadir 300 μL de buffer 1 de lavado por pocillo. Incubar a temperatura ambiente por 10 minutos, repetir 3 veces.
  7. Durante los pasos de lavado, diluir los anticuerpos secundarios fluoróforo acoplado en tampón en un tubo de reacción de anticuerpos. Utilizar 250 μl de tampón de anticuerpo por bien y añadir la cantidad adecuada de anticuerpos (ver tabla 2) mediante Pipeteo directamente en la solución con una pipeta de 2 μl. Mezcle la solución mediante pipeteo suavemente arriba y abajo varias veces. Vórtice poco después para asegurar una mezcla adecuada.
    PRECAUCIÓN: Debido a que los anticuerpos son sensibles a la luz, todos los pasos desde este punto en necesitan a realizarse en la oscuridad.
  8. Tras los pasos de lavado, quitar el lavado tampón con una pipeta de plástico y añadir 250 μl de solución de anticuerpo que contiene anticuerpos secundarios por pozo. Incubar las rebanadas con el anticuerpo secundario durante 90 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.
  9. Lavar las rodajas con lavado Tampón 2 3 x 10 min a TA.
  10. Durante los pasos de lavado, diluir 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) en 0,1 M de PB en una concentración de 1: 2000.
  11. Eliminar el tampón de lavado 2 con una pipeta de plástico y añadir 250 μl de solución DAPI por pozo. Incubar por 5 min a temperatura ambiente en la coctelera.
  12. Retirar la solución DAPI con una pipeta de plástico y agregar 500 μl de 0,1 M de PB por pozo con una pipeta de 1000 μl.
  13. Monte cortes sobre portaobjetos.
    1. Colocar un portaobjetos bajo el estereoscopio. Con un pincel fino, añadir tres gotas separadas de 0,1 M de PB en la diapositiva. Coloque una rebanada por cada gota sobre el portaobjetos.
    2. Utilice el pincel fino para aplanar y orientar los cortes sobre el portaobjetos.
    3. Cuando todos los sectores estén posicionados correctamente, quite exceso PB con un pañuelo y secar el portaobjetos cuidadosamente.
      PRECAUCIÓN: Evitar que se sequen totalmente las rebanadas de cerebro.
    4. Añadir 80 μl de incrustación medio en la diapositiva. Baje cuidadosamente el cubreobjetos sobre el portaobjetos, así incorporar las rebanadas de cerebro.
    5. Dejo las diapositivas para secar en la campana para 1-2 h (cubierta para evitar la exposición a la luz) y guardarlos en una caja de portaobjetos de microscopio a 4 ° C.
      Nota: El protocolo se puede detener aquí.

3. la proyección de imagen

  1. Después de que el medio de inclusión es totalmente endurecido, coloque el portaobjetos en el microscopio confocal.
    Nota: Microscopía de epifluorescencia, combinado con el software de deconvolución debe producir calidad de imagen similar.
  2. Ajuste el laser aumentando o disminuyendo la intensidad del láser para cada canal de modo que algunos píxeles sobreexpuestas para una máxima distribución de valores de gris.
  3. Adquirir tejidos virtuales de la rebanada del cerebro entero para los distintos canales.
    1. En el software de proyección de imagen (véase Tabla de materiales), seleccione la opción de azulejos y delinear manualmente la rebanada del cerebro con la Configuración de región de azulejo.
    2. Distribuir puntos de apoyo en toda la región de azulejo y ajustar el enfoque para los puntos de apoyo diferentes presionando Verificar azulejo regiones/posiciones...
    3. Ajustar la configuración en el Modo de adquisición según el tamaño deseado de la resolución y el archivo de la imagen resultante y empezar la exploración.
  4. Una vez terminada la exploración, utilizar la función de costura para procesar el tejido virtual. Exporte el archivo como un .tif con la función de Exportación de la imagen.

4. análisis informático

  1. Cargar todos los canales solo para una imagen en FIJI29 haciendo clic en archivo | Abierto.
  2. Con la herramienta selección a mano alzada , delinear un hemisferio en el canal del DAPI. Crear una máscara de la selección haciendo clic en edición | Selección | Crear máscara.
  3. Determinar la intensidad de fluorescencia media de los canales individuales (Mover y sinaptofisina) haciendo clic en analizar | Medida.
    Nota: Asegúrese de seleccionar los canales diferentes para determinar los valores de intensidad de fluorescencia media para cada canal.
  4. Copie la intensidad de fluorescencia media de los canales individuales en una hoja de cálculo.
  5. Determinar la intensidad de fluorescencia media para los canales solo en un área de interés por delinear la zona también con la herramienta selección a mano alzada . Usar un atlas del cerebro de ratón como referencia.
  6. Repita los pasos 4.1-4.5 para los hemisferios y en todas las áreas de interés.
    Nota: Determinar los valores para cada hemisferio por separado para luego comparar los valores de un área de interés para que en el hemisferio (ver paso 5.2).

5. manejo de datos

  1. En el caso de la fluorescencia de fondo es alta (ver discusión), puede necesitarse una sustracción de fondo. Para ello, determinar la intensidad de fluorescencia media para la rebanada procesada sin anticuerpo primario contra la proteína de referencia (aquí: sinaptofisina) y restar ese valor de todos los valores obtenidos para las regiones del cerebro y hemisferios.
  2. Cuando las intensidades de fluorescencia promedio de los canales individuales para cada hemisferio y cada área de interés se han determinado (ver tabla 3), calcular el cociente de Mover al synaptophysin dividiendo el valor para Mover el valor para el synaptophysin ( amarillo en la tabla 3). Realizar esta acción para cada área de interés y cada hemisferio por separado.
  3. Dividir el cociente obtenido para un área de interés por la relación obtenida para el hemisferio correspondiente (color naranja en la tabla 3) para determinar la relación entre el área de interés para el hemisferio.
  4. Para determinar la abundancia relativa de Mover, traducir la relación obtenida 5.2 en un porcentaje por determinar su desviación de 1 (en rojo en la tabla 3). Una proporción de 1.25 por lo tanto daría una abundancia relativa de la Mover de un 25% por encima de la media, y una proporción de 0,75 produciría una abundancia relativa de la Mover de un 25% por debajo de la media.

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Representative Results

Representante de patrones de diferentes marcadores de tinción puede verse en la figura 1. El patrón varía en función de la distribución de la proteína. Se muestran ejemplos de cinco niveles rostro caudal en columnas (A)-(E). Un representante de tinción DAPI se muestra en la primera fila: DAPI se adhiere al ADN de una célula y por lo tanto se tiñen los núcleos. Esto resulta en un patrón punteado. Regiones con una alta densidad celular son más brillantes que las regiones con densidades bajas de la célula. Un ejemplo de una proteína heterogéneamente distribuida puede verse en la segunda fila. El Mover la coloración revela una distribución diferencial a través del cerebro, con zonas brillantes hotspot y dimmer. En la tercera fila, se muestra un ejemplo para la sinaptofisina marcador de referencia más homogéneamente distribuidos. Una superposición de las dos proteínas (cuarta fila) muestra la distribución diferencial del motor (rojo) en comparación con el marcador la proteína sinaptofisina (verde).

La figura 2 muestra la cuantificación descrita en el paso 4 del protocolo. Se muestran los valores de intensidad de fluorescencia media para los diferentes canales a través de los hemisferios (Mover, figura 2A, sinaptofisina, figura 2B) y de las áreas de interés (Mover, figura 2C; sinaptofisina, figura 2D). Para determinar la abundancia de Mover en relación con el número de vesículas sinápticas, se toma una relación de los valores de fluorescencia de Mover a los valores de fluorescencia del synaptophysin. Estos ratios para las áreas de interés se muestran en la figura 2Ey proporcionan una indicación de la distribución heterogénea de Mover, con zonas de alta y baja motor niveles en relación con vesículas sinápticas. Además compensar la variabilidad técnica inherente, la relación en un área de interés (figura 2E) es comparada con en todo el hemisferio (no mostrado) y traducida en un porcentaje. Esta relativa Mover abundancia (figura 2F) da una medida de cuánto Mover es presente en un área de interés en relación a la media.

Como se mencionó anteriormente, una de las principales ventajas de esta técnica es la capacidad para determinar la abundancia de la proteína de interés a través de áreas muy pequeñas, incluso subregiones y las capas de áreas de interés. Un ejemplo de esta aplicación se muestra en la figura 3, donde se determinó la abundancia relativa de Mover las diferentes capas en los subcampos del hipocampo. La cuantificación de las diferentes capas que se muestra en la figura 3D,F, figura 3y figura 3H corresponde a las capas que se muestra en la figura 3C, figura 3Ey Figura 3G, con los colores correspondientes. En el hipocampo, Mover es heterogénea, con altos niveles de Mover en relación con vesículas sinápticas en capas asociadas con intra-hippocampal cómputo(es decir, la capa polimorfa de la convolución del cerebro dentada [DG], estrato radiatum, lucidum y oriens de Cornu Ammonis 3 [CA3] y estrato radiatum y oriens de Cornu Ammonis 1 [CA1]) y bajos niveles en las capas de entrada y salida (la capa molecular interna y externa de DG, las capas de células piramidales de CA3 y CA1 y las estrato lacunosum-moleculare de CA1).

Figure 1
Figura 1 : Imágenes de inmunofluorescencia representante de DAPI (primera fila), Mover (segunda fila), sinaptofisina (tercera fila) y su recubrimiento (cuarta fila, motor en synaptophysin rojo, en verde) nivel 5 rostro caudal (A-E). Áreas de interés están sombreadas en gris en la fila superior de los paneles. M1, corteza primaria del motor; COI, Islas de Calleja; ACC, corteza cingulada anterior; SNu, núcleos septales; VPa, pallidum ventral; NuA, Núcleo accumbens; CP, caudado putamen; S1, Corteza somatosensorial primaria; HC, hipocampo; Mañana, amygdala; MHa, habénula medial; PAG, gris periacueductal; SN, el nigra del substantia; VTA, área tegmental ventral; MLC, capa molecular del cerebelo; GLC, capa granular del cerebelo. Barra de escala = 500 μm. Esta figura ha sido modificada desde Wallrafen y Dresbach1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Cuantificación de la distribución del motor a través de los 5 niveles de rostro caudal. Significa intensidad de fluorescencia de la señal de Mover (A) y la señal de synaptophysin (B) en los distintos niveles. Significa intensidad de fluorescencia de la señal de motor (C) y la señal de synaptophysin (D) en las 16 regiones de cerebro manualmente delineado. (E) relaciones de Mover y sinaptofisina en las áreas del 16 cerebro de interés. (F) la cuantificación de la abundancia relativa de Mover, comparando la relación motor/sinaptofisina en la región respectiva a la relación del hemisferio correspondiente. M1, corteza primaria del motor; COI, Islas de Calleja; ACC, corteza cingulada anterior; SNu, núcleos septales; VPa, pallidum ventral; NuA, Núcleo accumbens; CP, caudado putamen; S1, Corteza somatosensorial primaria; HC, hipocampo; Mañana, amygdala; MHa, habénula medial; PAG, gris periacueductal; SN, el nigra del substantia; VTA, área tegmental ventral; MLC, capa molecular del cerebelo. Los puntos negros representan los puntos individuales de datos. Las barras indican la media ± error estándar de la media (SEM). Esta figura ha sido modificada desde Wallrafen y Dresbach1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 : Distribución de mover en el hipocampo del ratón. Stainings de inmunofluorescencia de coronales rebanadas de hipocampo de ratón. Resumen del hipocampo que muestra el patrón heterogéneo de expresión de Mover (A) y el Synaptophysin correspondiente coloración (B). Las tres regiones de interés (DG, figura 3C; CA3, figura 3E; CA1, figura 3G) son delineados con blanco las líneas de puntos. (D,F,H) Cuantificación, comparando la proporción en las capas correspondientes a la relación del hemisferio correspondiente. Los colores de los gráficos de barras corresponden a lo respectivo sombreado en paneles C, Ey G. Mover expresión es alta en niveles asociados con intra-hippocampal cómputo (es decir, la capa polimorfa del DG, radiatum del estrato, lucidum y oriens de CA3 y radiatum estrato oriens de CA1) y baja en la principal entrada y salida de capas (el capa molecular interna y externa de la dirección general, las capas de células piramidales de CA3 y CA1 y el estrato lacunosum-moleculare de CA1). OML, capa molecular externa; IML, capa molecular interna; GrL, capa granular; PmL, polimorfo capa/hilus; ASÍ, estrato oriens; Espía, pyramidale del estrato; SLu, lucidum del estrato; SR, estrato radiatum; SLM, lacunosum-moleculare del estrato. Barra de escala = 500 μm. puntos negros representan solo los puntos de datos. Las barras indican la media ± SEM. Esta figura ha sido modificada desde Wallrafen y Dresbach1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Table 1
Tabla 1: Soluciones utilizadas en el presente Protocolo.

Table 2
Tabla 2: Anticuerpos utilizados en el presente Protocolo.

Table 3
Tabla 3: Ejemplo de manejo de datos.

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Discussion

El método había presentado aquí tiene como objetivo cuantificar la distribución de una proteína de interés en relación con la abundancia de una proteína del marcador con una distribución conocida. Tinción de inmunofluorescencia puede mostrar una alta variabilidad de la coloración de intensidades entre los diferentes sectores. El enfoque de cuantificación descrito aquí evita este problema mediante la determinación de la proporción de la proteína de interés para el medio a través del hemisferio. Por lo tanto, diferentes intensidades de coloración en rebanadas se cancelan hacia fuera y permiten una descripción cuantitativa.

Como con cada protocolo de la inmunofluorescencia, cualitativa o cuantitativa, varios factores pueden influir en el éxito y así confundir el análisis. Por lo tanto, debe prestarse atención especial a los pasos críticos del protocolo. En primer lugar, es necesaria una adecuada fijación del tejido. Esta fijación se logra generalmente por una perfusión de transcardial éxito. La calidad de la perfusión puede verificarse consultando el hígado poco después de lavar la sangre. Un primer indicador para una perfusión exitosa es la limpieza del hígado y las extremidades28. La presencia de coágulos de sangre puede indicar que la perfusión podría haber sido demasiado lenta y se debe realizar más rápido la próxima vez. Algunas proteínas requieren protocolos de fijación diferentes, como la fijación química con PFA puede causar epitopo bloqueo30. En este caso, se debe considerar congelar la fijación o fijación con una química diferente, tales como metanol. En segundo lugar, después de seccionar, es crítico para teñir las rebanadas de cerebro como rápidamente como sea posible, preferiblemente en el mismo o la palabra siguiente. Un almacenaje más largo en PB puede conducir a infección bacteriana y añadiendo la NaN3 puede evitar en cierta medida, la calidad del tejido generalmente se deteriora con el tiempo de almacenamiento. En tercer lugar, durante el procedimiento de tinción, es importante realizar pasos de lavado pozo por pozo para evitar el secado de las rodajas. Cuando sequen las rodajas, fluorescencia del fondo puede aumentar y causar así un sesgo en el análisis. En cuarto lugar, después de la aplicación del anticuerpo secundario, es vital para llevar a cabo los siguientes pasos en la oscuridad. Los fluoróforos son sensibles a la luz, y exposición a la luz puede distorsionar gravemente la señal de fluorescencia.

La optimización del procedimiento de tinción, incluyendo la selección de anticuerpos primarios y secundarios adecuados, concentración óptima del anticuerpo y tiempo de exposición, es un requisito previo para lograr la mejor relación señal a ruido y realizar una confiable Análisis de la inmunofluorescencia cuantitativas. Anticuerpos en knock out tejido deberían ser la opción preferida, aunque no siempre está disponible. Asegúrese siempre de realizar experimentos de control adecuados para excluir la interferencia entre diferentes anticuerpos. La cantidad de fluorescencia del fondo derivadas de la autofluorescencia y Unión inespecífica del anticuerpo secundario puede estimarse por proyección de imagen las rebanadas en la que el anticuerpo primario no se aplicó. No es trivial para establecer cuánto más las intensidades de la señal deben ser comparados con el fondo para tener una relación señal a ruido aceptable. Sin embargo, basado en observaciones empíricas, los autores sugieren con el objetivo de tener una señal de por lo menos 2 más a fondo con el fin de estimar confiablemente la distribución de la proteína. En el caso de la fluorescencia de fondo es alta en condiciones de control (sin la presencia del anticuerpo primario), la fluorescencia de fondo promedio debe restarse de las imágenes del experimento.

La gran ventaja de nuestro enfoque es su referencia interna: la intensidad de la inmunofluorescencia de la proteína diana (es decir, Mover) una región de interés es en comparación con un marcador de referencia (es decir, synaptophysin) y a la intensidad total de Estas proteínas a través de todo el hemisferio. Así, el cálculo se realiza, se puede inequívocamente concluir que la abundancia de la proteína Diana es x doble superior e inferior de una determinada zona de interés que la abundancia de la proteína de referencia en relación con la distribución de las proteínas a través de la todo el hemisferio en este nivel en relación a Bregma31. Esto permite la comparación de resultados utilizando diversos anticuerpos, microscopios diferentes, o incluso a través de diferentes estudios. Esta consistencia a través de diferentes muestras proviene de la naturaleza comparativa de este método: la variabilidad se compensa tomando la relación entre la fluorescencia en la zona de interés y del hemisferio. Por lo tanto, diferencias en valores absolutos derivados de diferencias técnicas son anuladas. Otra gran ventaja de esta técnica es el hecho de que las áreas de interés pueden ser tan pequeñas como se desee, sólo limitado por la resolución del microscopio. Cuantificación de niveles de proteína con métodos bioquímicos, por ejemplo Western Blot o espectrometría de masas6,7,8,9, requiere una disección de los tejidos en el área de interés. Esta disección es difícil para las regiones del cerebro, tales como la corteza somatosensorial primaria y se convierte en virtualmente imposible cuando con el objetivo de subregiones, como las diferentes capas de la corteza o el hipocampo.

Una advertencia del enfoque es que los diferentes niveles en el cerebro no se puede comparar directamente entre sí. Hemisferios con muchas regiones ricas en la proteína de interés tendrá un valor promedio distinto de hemisferios con sólo algunas regiones ricas en proteína. Por ejemplo, valores de 20% por encima de la media, por lo tanto, reflejará una diversa cantidad absoluta de proteínas en un nivel en relación a Bregma en comparación con el otro. Hay que tener en cuenta también que este método no permite la determinación de los niveles de proteína absoluta, solamente la abundancia relativa en comparación con el marcador de referencia interna y la media en todo el hemisferio.

Este método puede adaptarse fácilmente para determinar la distribución de la proteína de interés en relación con marcadores de diferentes compartimientos neuronales, no sólo los sitios presinápticos. También puede ser fácilmente adaptado para los tejidos excepto el cerebro y - con los anticuerpos adecuados - otros sistemas modelo de ratones32,33. Mientras que el uso de un microscopio confocal es método de elección de los autores, una combinación de software de microscopía y deconvolución de epifluorescencia debe ceder la misma calidad de datos y así ampliar la utilidad del protocolo. Además, el mismo stainings puede utilizarse para determinar la distribución subcelular, por ejemplo con la microscopía de superresolución.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Agradecemos a Irmgard Weiss excelente asistencia técnica. Los autores reconocen el apoyo de Hermes Pofantis y Andoniya Petkova. Los autores también agradecen el Instituto Europeo de Neurociencias para el uso de la LSM800 y asistencia técnica, especialmente por el Dr. Nils Halbsgut. Este trabajo fue financiado por la Universidad médica centro de Göttingen. JSV agradece apoyo por el centro de microscopía de la nanoescala y Fisiología Molecular del cerebro (CNMPB).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL reaction tubes Eppendorf 30120094
50 mL reaction tubes Greiner Bio-One 227261
multiwell 24 well Fisher Scientific                                                                                                 087721H
plastic pipette (disposable) Sarstedt 861,176
1000 mL pipette Rainin  17014382
2 ml pipette Eppendorf 3123000012
Vortex Genius 3  IKA 3340001
Menzel microscope slides Fisher Scientific                                                                                           10144633CF
Stereoscope Leica
LSM800 Zeiss Confocal microscope
freezing microtome Leica
PBS (10X) Roche                                                                                        11666789001
PFA Sigma                                                                                             P6148-1kg
NaCl BioFroxx 1394KG001
sucrose neoFroxx 1104KG001
Tissue Tek Sakura  4583 OCT
Na2HPO4 BioFroxx 5155KG001
NaH2PO4 Merck 1,063,460,500
normal goat serum Merck Millipore S26-100ML
normal donkey serum Merck S30-100ML
Triton X-100 Merck 1,086,031,000
rabbit anti-Mover Synaptic Systems RRID: AB_10804285
guinea pig anti-Synaptophysin Synaptic Systems RRID: AB_1210382
donkey anti-rabbit AF647 Jackson ImmunoResearch RRID: AB_2492288
goat anti-mouse AF488 Jackson ImmunoResearch RRID: AB_2337438
Mowiol4-88 Calbiochem                                                                                                    475904
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References

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Neurociencia número 143 inmunofluorescencia microscopía confocal cuantificación proteínas sinápticas ratón Mover distribución
Cuantificar la distribución heterogénea de una proteína sináptica en el cerebro de ratón mediante inmunofluorescencia
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Wallrafen, R., Dresbach, T., Viotti, J. S. Quantifying the Heterogeneous Distribution of a Synaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence. J. Vis. Exp. (143), e58940, doi:10.3791/58940 (2019).

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