Summary
Här beskriver vi en kvantitativ metod att bestämma fördelningen av ett synaptic protein i förhållande till en markör protein med hjälp av immunofluorescens färgning, konfokalmikroskopi och datorbaserad analys.
Abstract
Den närvaro, frånvaro eller nivåer av specifika synaptic proteiner kan allvarligt påverka synaptisk transmission. Förutom att belysa funktionen av ett protein, är det viktigt att även kartlägga dess utbredning. Här beskriver vi ett protokoll som sysselsätter immunofluorescens, konfokalmikroskopi och datorbaserad analys för att bestämma fördelningen av proteinet synaptiskt Mover (även kallad TPRGL eller SVAP30). Vi jämför fördelningen av Mover som den synaptiska vesikelproteinet protein synaptophysin, därmed att bestämma fördelningen av Mover på ett kvantitativt sätt i förhållande till överflödet av synaptiska vesikler. Särskilt, skulle denna metod potentiellt kunna genomföras för att möjliggöra jämförelse av fördelningen av proteiner med olika antikroppar eller Mikroskop eller mellan olika studier. Vår metod kringgår det inneboende variabilitet av Immunofluorescerande infärgning av ger förhållandet snarare än absoluta fluorescens nivåer. Dessutom, den metod som vi beskriver gör det möjligt för forskaren att analysera fördelningen av ett protein på olika nivåer: från hela hjärnan skivor till hjärnan till olika delområden i en hjärna området, såsom de olika lagren av hippocampus eller sensoriska cortices. Mover är ett ryggradsdjur-specifika protein som associeras med synaptic blåsor. Med den här metoden visar vi att Mover fördelas ojämnt över hjärnområden, med höga nivåer i den ventrala pallidum, septal atomkärnor och amygdala, och även inom enda hjärnan, såsom hippocampus olika lager.
Introduction
Kommunikationen mellan nervceller händer på specialiserade kontakt webbplatser kallas synapser. Synapser innehåller en myriad av olika proteiner som orkestrera synaptisk transmission. Några av dessa proteiner visar en heterogen fördelning i hela nervsystemet och är inte närvarande i varje synaps1. Ett exempel för ett sådant protein är Munc13, som är involverat i processen priming av synaptiska vesikler. Det finns olika isoformer av Munc13, som är heterogent fördelat i hela hjärnan2, och närvaron eller frånvaron av särskilda isoformer kan påverka kortsiktiga synaptisk plasticitet och synaptiskt vesikelprotein dynamics3, 4 , 5. det är därför av avgörande betydelse för att kunna identifiera förekomsten av olika synaptic proteiner över hjärnområden.
Metoderna av val för kvantifiering av synaptic proteiner - hittills - är masspektrometri och Western blotting, i stället för immunohistokemi6,7,8,9. I vissa fall metoderna flera kompletterar varandra för att bedöma både kvantiteten och lokalisering av specifika proteiner (dvs, det Wilhelm o.a. 10). den metod som vi beskriver här tillåter för lokalisering och kvantifiering av proteiner av intresse utan att behöva använda någon biokemisk metod, helt enkelt anställa Immunofluorescerande infärgning. En annan fördel här är att kvantifiering kan göras över områden mycket mindre och därför mer specifika, än de som uppnås med andra metoder. Dock måste man beakta att en tillförlitlig referens protein behövs för att bedöma fördelningen av proteinet av intresse.
Fluorescerande färgning av immunohistokemi tillåter oss att rutinmässigt identifiera lokaliseringen av proteiner i hjärnområden samt inom olika neuronala fack. För att identifiera de olika fack, används specifika markörer. Antikroppar mot synapsin och synaptophysin11 kan vanligtvis användas att märka synaptic vesicles, medan antikroppar mot fagott etikett den aktiva zonen av en presynaptiska terminal12. Vesikulär transportörer, såsom vesikulär glutamat transportörer (vGluT) eller vesikulär GABA transportör (vGAT), används för att märka excitatoriska13 och hämmande14 presynaptiska terminaler, respektive. På postsynaptiska sida, kan antikroppar mot Homer proteinet användas för att markera postsynaptiska terminaler och antikroppar mot postsynaptiska densitet protein 95 (PSD95)15,16,17 eller gephyrin18 , 19 , 20 kan märka retande eller hämmande postsynaptiska terminaler, respektive. Med hjälp av antikroppar mot ett protein av intresse och markörer såsom de som beskrivs ovan, kan man bestämma localizationen av sådant protein. Många studier hittills har gjort i en kvalitativ sätt21. Dock för att tillförlitligt avgöra differentiell fördelningen av ett specifikt synaptic protein, måste man inte bara bestämma dess närvaro eller frånvaro men också dess relativa koncentration. Heterogenitet i storlekar och täthet av synapser gör det viktigt att fastställa en kvot mellan den synaptiska markören och proteinet av intresse. Annars, synaps-rika regioner såsom icke-pyramidal lager av hippocampus och det molekylära lagret av lillhjärnan visar en hög täthet av synaptic proteiner, endast på grund av den högre tätheten av synapser men inte på grund av en stark närvaro av det proteinet i varje synaps (t.ex., Wallrafen och Dresbach1). Å andra Visa proteiner i de neuronala soma (t.ex., TGN3822) vanligtvis stark närvaro i hippocampus pyramidal cellager eller Hippocampus eller cerebellär granule cellager på grund av den höga koncentrationen av neuronala cellen organ i dessa områden. Därför denna icke-homogen fördelning av strukturer, i detta fall synapser, kan leda till en falsk uppskattning av fördelningen av proteinet av intresse själv. Dessutom finns det en inneboende variabilitet i färgning stödnivåer över prover i immunhistokemiska färgningar. Protokollet beskrivs här tar hänsyn till detta och undviker sådana fördomar, liksom andra varningar som uppstår från immunohistokemiska metoder.
I vår senaste studie, vi har använt denna metod för att beskriva differentiell uttrycket av Mover (även kallad TPRGL23 eller SVAP3024) över 16 olika hjärnan områden1. Mover är ett ryggradsdjur-specifika synaptic protein som finns i föreningen till synaptic blåsor och påverkar signalsubstansen pressmeddelande25,26,27. Vi har släkt Mover uttrycket att överflödet av synaptiska vesikler, genom färgning för synaptophysin som synaptiskt vesikelprotein referens markör. Vi hittade höga halter av Mover särskilt i septal atomkärnor, den ventrala pallidum och amygdala. Inom hippocampus hittade vi en heterogen fördelning av Mover, med höga nivåer i samband med intra-Hippocampus uträkningen, och låga nivåer i in- och utdata lager lager.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta protokoll innebär inte experiment på levande djur. Experiment med euthanizing av djur för att erhålla hjärnan prover godkändes av de lokala djurskydd myndigheterna (Tierschutzkommission der Universitätsmedizin Göttingen) under godkännandenummer T 10/30.
Obs: För detta protokoll, 3 vuxna manliga C57BL/6 möss användes.
1. provberedning
- Förbereda fixativ och 0,1 M fosfatbuffert (PB, se tabell 1).
- Fixa djuret av transcardial perfusion som beskrivs i Gage et al. 28. Tvätta först ut blodet med 0,9% NaCl-lösning, sedan BEGJUTA med 30 mL 4% PARAFORMALDEHYD (PFA).
- Öppna skallen med sax och noggrant isolera hjärnan med hjälp av en sked med slöa kanter för att undvika att skada vävnaden.
- Fyll en 50 mL reaktionsröret med fixativ och postfix hjärnan i 4% PFA vid 4 ° C över natten.
- Ta bort fixeringsvätskan och tvätta hjärnan i 50 mL 0,1 M PB på en shaker i 30 min.
- Efter tvätt, inkubera hjärnan i en 50 mL reaktionsröret i 30% sackaros i 0,1 M PB i 48 h eller tills det sjunker i röret vid 4 ° C för cryoprotection.
- Trimma cryoprotected hjärnan med ett vasst blad, placera den i en cryomold och bädda in den med optimal skärtemperatur (ULT) förening. Undvik bubblor. Orient hjärnan och frysa cryomold i-80 ° C frysen.
- Montera den fryst vävnaden för snittning. Temperera vävnaden som den cryomicrotome temperaturen för minst 15 min innan snittning.
- Avsnitt hjärnan i 25 µm tjocka koronalt skivor. Tryck ULT noggrant med en glas-krok utan att vidröra hjärnvävnaden. Samla 3 intilliggande skivor per brunn i en 24 väl platta och lagra dem i 0,1 M PB vid 4 ° C fram till färgning.
Obs: Protokollet kan pausas här i upp till två veckor. Längre lagringstid kan störa vävnad kvalitet och därmed påverka resultatet av experimentet.
2. immunofluorescens
- Bered lösningar inklusive blockerande buffert, antikropp buffert, tvättning buffert 1 samt tvätt buffert 2 (se tabell 1).
- Skölj skivor en gång med PB ta bort överflödig OCT.
- Ta bort lösningen med en plast pipett utan suger i hjärnan skivor. Tillsätt 250 µL av färska PB med 1000 µL pipett.
FÖRSIKTIGHET: Skivor bör inte torka ut, så ta bort och lägga till vätskor väl av väl.
- Ta bort lösningen med en plast pipett utan suger i hjärnan skivor. Tillsätt 250 µL av färska PB med 1000 µL pipett.
- Ta bort PB med en plast pipett och tillsätt 250 µL blockerande buffert per brunn med 1000 µL pipett. Inkubera under 3 h i rumstemperatur (RT) på shakern.
- Under inkubationstiden, späd de primära antikropparna i antikropp buffert i en reaktionsröret. Använd 250 µL antikropp buffert per brunn och Lägg till lämplig mängd antikroppar (se tabell 2) av pipett det direkt till lösningen med 2 µL pipett. Blanda lösningen genom pipettering försiktigt upp och ned flera gånger. Vortex strax efteråt för att säkerställa korrekt blandning.
Obs: För att avgöra den bakgrunden fluorescensen, infärgning bör också utföras utan att lägga den primär antikroppen. För att Inkubera segmentet i antikropp lösning utan primär antikroppar enligt protokollet. - Efter inkubationstiden, ta bort det blockerande buffert med plast pipett och tillsätt 250 µL av antikropp lösning innehållande primära antikroppar per brunn. Inkubera skivor med primär antikropp övernattning på 4 ° C på en shaker.
- Nästa dag, tvätta skivor med tvätt buffert 1 3 x 10 min vid RT på en shaker.
- Ta bort medlet med en plast pipett och tillsätt 300 µL av tvätt buffert 1 per brunn. Inkubera vid RT i 10 min. Upprepa 3 gånger.
- Under tvätt steg, späd fluorophore-kopplade sekundära antikropparna i antikropp buffert i en reaktionsröret. Använd 250 µL antikropp buffert per brunn och Lägg till lämplig mängd antikroppar (se tabell 2) av pipett det direkt till lösningen med 2 µL pipett. Blanda lösningen genom pipettering försiktigt upp och ned flera gånger. Vortex strax efteråt för att säkerställa korrekt blandning.
Varning: Eftersom antikropparna är ljuskänsliga, alla steg från och med nu måste utföras i mörkret. - Efter tvätt steg, ta bort tvätten buffert med plast pipett och tillsätt 250 µL av antikropp lösning innehållande sekundära antikroppar per brunn. Inkubera skivor med sekundär antikropp för 90 min på RT i mörkret.
- Tvätta skivor med tvätt buffert 2 3 x 10 min på RT.
- Under tvätt steg, späd 4′, 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI) i 0,1 M PB i en koncentration av 1: 2000.
- Ta bort tvätt bufferten 2 med en plast pipett och tillsätt 250 µL av DAPI lösning per brunn. Inkubera i 5 min på RT på shakern.
- Ta bort DAPI lösningen med en plast pipett och tillsätt 500 µL 0,1 M PB per brunn med 1000 µL pipett.
- Montera skivor på objektglas.
- Placera ett objektglas under stereoskop. Med en fin pensel, tillsätt tre separata droppar 0,1 M PB in i bilden. Placera en skiva per droppe på objektglas.
- Använd den fina borsten att platta och orientera skivor på objektglas.
- När alla skivor är rätt placerad, ta bort överflödig PB med en servett och torka bilden noggrant.
Undvik torkning hjärnan skivor helt. - Tillsätt 80 µL av inbäddning medium in i bilden. Sänk försiktigt ner täckglaset in i bilden, därmed inbäddning hjärnan skivor.
- Lämna bilderna ska torka i dragskåp för 1-2 h (täcka dem för att undvika ljus exponering) och lagra dem i ett Mikroskop bild rutan vid 4 ° C.
Obs: Protokollet kan pausas här.
3. imaging
- Efter inbäddning mediet är helt härdat, placera objektglas under mikroskopet confocal.
Obs: Epifluorescence mikroskopi kombineras med deconvolution programvara bör ge liknande bildkvalitet. - Justera inställningarna för laser genom att öka eller minska laser intensitet för varje kanal så att några pixlar är överexponerade för att säkerställa maximal utdelning av grå värden.
- Förvärva virtuella vävnader i hela hjärnan segmentet för de olika kanalerna.
- I avbildningsprogrammet (se Tabell för material), Välj alternativet plattor och manuellt avgränsa hjärnan segmentet med Kakel regionen Setup.
- Distribuera stödpunkter i hela regionen kakel och justera fokus för de olika stödpunkter genom att trycka på Verifiera kakel regioner/positioner...
- Justera inställningarna i Förvärv läge beroende på önskad upplösning och fil storleken på den resulterande bilden och starta skanningen.
- När genomsökningen är klar, Använd funktionen sy för att bearbeta den virtuella vävnaden. Exportera filen som en .tif med funktionen Bild exportera.
4. datorbaserad analys
- Läsa in alla enstaka kanaler för en bild i FIJI29 genom att klicka filen | Öppna.
- Med Freehand markeringsverktyget, avgränsa ena hjärnhalvan i DAPI-kanalen. Skapa en mask av markeringen genom att klicka Redigera | Urval | Skapa mask.
- Bestämma medelvärdet fluorescensintensiteten för enstaka kanaler (Mover och synaptophysin) genom att klicka analysera | Mått.
Obs: Se till att välja olika kanaler att bestämma medelvärdet fluorescens intensitetsvärdena för varje kanal. - Kopiera genomsnittlig fluorescensintensiteten för enstaka kanaler i ett kalkylblad.
- Bestämma medelvärdet fluorescensintensiteten för enstaka kanaler i ett område av intresse av avgränsar området också med Freehand markeringsverktyget. Använda en mus hjärnan atlas som referens.
- Upprepa steg 4.1-4.5 för alla hjärnhalvorna och alla intresseområden.
Obs: Bestämma värdena för varje halvklotet separat för att senare jämföra värdena i ett område av intresse som i halvklotet (se steg 5.2).
5. datahantering
- Om bakgrunden fluorescensen är hög (se diskussion), en bakgrund subtraktion kan behövas. För att bestämma medelvärdet fluorescensintensiteten för det segmentet bearbetas utan primär antikropp mot jämförelseproteinet (här: synaptophysin) och subtrahera värdet från alla värden som erhållits för de områden i hjärnan och halvklot.
- När medelvärdet fluorescens stödnivåerna för enstaka kanaler för varje halvklotet och varje område av intresse har fastställts (se tabell 3), beräkna förhållandet mellan Mover synaptophysin genom att dividera värdet för Mover med värdet för synaptophysin ( gul i tabell 3). Utföra den här åtgärden för varje halvklotet och varje område av intresse separat.
- Dela upp förhållandet erhålls för ett område av intresse i förhållandet erhålls för den motsvarande halvklotet (orange i tabell 3) för att bestämma förhållandet mellan området av intresse till halvklotet.
- För att avgöra det relativa Mover överflödet, översätta förhållandet fås i 5.2 i procent genom att bestämma dess avvikelse från 1 (röd i tabell 3). En kvoten är 1,25 skulle därför ge en relativ Mover överflöd av 25% över genomsnittet och en kvot på 0,75 skulle ge en relativ Mover överflöd av 25% under genomsnittet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representant färgning mönster av olika markörer kan ses i figur 1. Mönstret varierar beroende på fördelningen av protein. Exempel på fem rostro-kaudala nivåer visas i kolumner (A)-(E). En representativ DAPI färgning visas i den första raden: DAPI följer DNA i en cell och därmed kärnor färgas. Detta resulterar i en punktuell mönster. Regioner med en hög cell densiteten är ljusare än regioner med låg cell tätheter. Ett exempel på ett ojämnt distribuerade protein kan ses i andra raden. Mover färgning avslöjar en differentierad fördelning i hela hjärnan, med ljusa hotspot områden och dimmer. I den tredje raden visas ett exempel för mer homogent fördelad referens markör synaptophysin. En överlagring av de två proteinerna (fjärde raden) visar differentiell fördelningen av Mover (rött) jämfört med den markör protein synaptophysin (grön).
Figur 2 visar en beräkning som beskrivs i steg 4 i protokollet. Visas är medelvärdet fluorescens intensitetsvärdena för de olika kanalerna mellan hemisfärerna (Mover, figur 2A; synaptophysin, bild 2B) och mellan områden av intresse (Mover, figur 2C; synaptophysin, figur 2D). För att avgöra Mover överflödet i förhållande till antalet synaptiska vesikler, tas ett förhållande av Mover fluorescens värden synaptophysin fluorescens värden. Dessa nyckeltal för områden av intresse visas i figur 2E, och redan ger en indikation om heterogen fördelning av Mover, med områden med höga och låga Mover nivåer i förhållande till synaptiska vesikler. För att dessutom kompensera för inneboende tekniska variationer, är förhållandet i ett område av intresse (figur 2E) jämfört med över halvklotet (visas inte) och översatt till en procentsats. Denna relativa Mover överflöd (figur 2F) ger ett mått på hur mycket Mover är närvarande i ett område av intresse i förhållande till genomsnittlig.
Som nämnts ovan, är en av de stora fördelarna med denna teknik möjligheten att bestämma överflödet av proteinet av intresse över mycket små områden, även distrikt och lager av intresseområden. Ett exempel på detta program visas i figur 3, där det relativa Mover överflödet bestämdes för de olika lagren i delfält av hippocampus. Kvantifiering i olika lager visas i figur 3D, figur 3Foch figur 3H motsvarar de lager som visas i figur 3C, figur 3Eoch Figur 3G, med motsvarande färger. Inom hippocampus fördelas Mover ojämnt, med Mover hög i förhållande till synaptiska vesikler i lager som är associerad med intra-Hippocampus uträkning (dvs., det polymorph lagret av dentate gyrus [DG], stratum radiatum, lucidum och oriens av Cornu Ammonis 3 [CA3], och stratum radiatum samt oriens av Cornu Ammonis 1 [CA1]), och låga nivåer i in- och utdata lager (det inre och yttre molekylära lagret av GD, pyramidal cell lager av CA3 och CA1, och den Stratum lacunosum-moleculare av CA1).
Figur 1 : Representativa immunofluorescens bilder av DAPI (första raden), Mover (andra raden), synaptophysin (tredje raden), och deras overlay (fjärde raden, Mover i röd, synaptophysin i grönt) på 5 rostro-kaudala nivåer (A-E). Intresseområden är skuggade i grått i den övre raden av paneler. M1, primära motoriska cortex; IOK, öarna Calleja; ACC, främre cingulum; SNu, septal kärnor; VPa, ventrala pallidum; NuA, nucleus accumbens; CP, caudatus putamen; S1, primära somatosensoriska cortex; HC, hippocampus; Am, amygdala; MHa, mediala habenula; PAG, periaqueductal grå; SN, substantia nigra; VTA, ventral tegmental area; MLC, molekylära lagret av lillhjärnan; GLC, korniga lagret av lillhjärnan. Skalstapeln = 500 µm. Denna siffra har ändrats från Wallrafen och Dresbach1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Kvantifiering av Mover fördelningen över 5 rostro-kaudala nivåer. Menar fluorescensintensiteten hos Mover signalen (A) och synaptophysin signalen (B) på olika nivåer. Menar fluorescensintensiteten hos Mover signalen (C) och synaptophysin signalen (D) på de 16 manuellt avgränsade hjärnregioner. (E) nyckeltal av Mover och synaptophysin i 16 hjärnområden av intresse. (F) kvantifiering av det relativa Mover överflödet, jämföra Mover/synaptophysin baserat på den respektive regionen förhållandet av motsvarande halvklotet. M1, primära motoriska cortex; IOK, öarna Calleja; ACC, främre cingulum; SNu, septal kärnor; VPa, ventrala pallidum; NuA, nucleus accumbens; CP, caudatus putamen; S1, primära somatosensoriska cortex; HC, hippocampus; Am, amygdala; MHa, mediala habenula; PAG, periaqueductal grå; SN, substantia nigra; VTA, ventral tegmental area; MLC, molekylära lagret av lillhjärnan. Svarta prickar representerar enda datapunkter. Staplarna visar medelvärde ± standardavvikelsen för medelvärdet (SEM). Denna siffra har ändrats från Wallrafen och Dresbach1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Mover distribution i mus hippocampus. Immunofluorescens infärgning av koronalt skivor av mus hippocampus. Översikt av hippocampus visar heterogena Mover uttrycksmönstret (A) och den motsvarande Synaptophysin färgning (B). De tre regionerna av intresse (GD, figur 3C; CA3, figur 3E; CA1, figur 3G) är avgränsad med vita streckade linjer. (D,F,H) Rapporteringsgräns jämföra förhållandet i respektive lager för att förhållandet mellan den motsvarande halvklotet. Färgerna i stolpdiagram motsvarar respektive skuggningen i paneler C, Eoch G. Mover uttryck är hög i nivåer som är associerad med intra-Hippocampus uträkning (dvs, polymorph lagret av GD, stratum radiatum, lucidum och oriens CA3, och stratum radiatum samt oriens av CA1) och låg i den huvudsakliga input- och output lager (den inre och yttre molekylära lagret av GD, pyramidal cell lager av CA3 och CA1, och de stratum lacunosum-moleculare av CA1). OML, yttre molekylära lagret; IML, inre molekylära lagret; GrL, korniga lagret; PmL, polymorph lager/hilus; SÅ, stratum oriens; Spion, stratum pyramidale; SLu, stratum lucidum; SR, stratum radiatum; SLM, stratum lacunosum-moleculare. Skalstapeln = 500 µm. svarta prickar representerar enda datapunkter. Staplarna visar den genomsnittliga ± SEM. Denna siffra har ändrats från Wallrafen och Dresbach1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1: Lösningar som används i detta protokoll.
Tabell 2: Antikroppar används i detta protokoll.
Tabell 3: Exempel på datahantering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden presenteras här syftar till att kvantifiera distribution av ett protein av intresse i förhållande till överflödet av ett protein som markör med en känd fördelning. Immunofluorescens färgning kan visa en hög variabilitet av färgning stödnivåer mellan olika skivor. Metoden kvantifiering beskrivs här kringgår detta problem genom att bestämma förhållandet mellan proteinet av intresse för genomsnittet över halvklotet. Därför olika färgning intensiteter över segment ställs och möjliggöra en kvantitativ beskrivning.
Som med varje immunofluorescens protokoll, kvalitativa eller kvantitativa, flera faktorer kan påverka resultatet och därmed förvirra analysen. Därför bör särskild uppmärksamhet ägnas kritiska steg i protokollet. Först behövs en ordentlig fixering av vävnad. Denna fixering kan vanligtvis uppnås genom en framgångsrik transcardial perfusion. Kvaliteten på perfusion kan verifieras genom att kontrollera levern strax efter tvätt ut blodet. En första indikator för en framgångsrik perfusion är clearing av levern och extremiteter28. Förekomsten av blodproppar kan indikera att perfusionen kan ha varit för långsam och bör utföras snabbare nästa gång. Vissa proteiner kräver olika fixering protokoll, eftersom kemiska fixering med PFA kan orsaka epitop blockering30. I detta fall övervägas frysa fixering eller fixering med en olika kemiska, såsom metanol. För det andra, efter snittning är det viktigt att färga hjärnan skivor som snabbt som möjligt, helst på samma eller nästa säger. Längre lagring i PB kan leda till bakteriell infektion, och samtidigt lägga NaN3 kan förhindra detta i viss utsträckning, vävnad vanligtvis försämras med lagringstid. För det tredje, under förfarandet för färgning, det är viktigt att utföra tvätt steg väl-av-väl för att undvika uttorkning i skivor. När skivorna torka ut, kan bakgrunden fluorescens öka och därmed orsaka en slagsida i analysen. Fjärde, efter ansökan av sekundär antikropp är det viktigt att utföra alla följande steg i mörkret. Fluorophores är ljuskänsliga och ljusexponering kan allvarligt snedvrida fluorescens signalen.
Optimering av färgning förfarandet, inklusive valet av lämplig primära och sekundära antikroppar, optimal antikroppskoncentrationen och exposition tid, är en förutsättning att uppnå det bästa signal-brus-förhållandet och att genomföra en pålitlig kvantitativa immunofluorescens analys. Antikroppar som verifierad i knock-out vävnad bör vara det självklara valet, om än inte alltid tillgängliga. Se alltid till att utföra korrekt kontroll experiment för att utesluta överhörning mellan olika antikroppar. Mängden bakgrund fluorescens uppkommer autofluorescens och ospecifik bindning av sekundär antikropp kan uppskattas av imaging skivor där tillämpades den primär antikroppen. Det är inte trivialt att fastställa hur mycket högre stödnivåerna signalen måste vara jämfört med bakgrunden till har ett acceptabelt signal-brus-förhållande. Dock föreslår utifrån empiriska observationer, författarna siktar på att ha en signal som är minst 2-faldigt starkare än bakgrunden för att tillförlitligt beräkna protein fördelningen. Den bakgrund fluorescensen är hög i kontroll villkor (utan närvaro av primär antikropp), bör den genomsnittliga bakgrund fluorescensen subtraheras från experiment bilderna.
Den stora fördelen med vår metod är dess inre referens: immunofluorescens intensiteten i målproteinet (dvsMover) i en region av intresse är jämfört med en referens markör (dvs, synaptophysin) och till övergripande intensiteten av dessa proteiner över hela halvklotet. Således från beräkningen vi utför, kan man entydigt dra slutsatsen att överflödet av målproteinet är x gånger högre/lägre i en viss region av intresse än överflöd av proteinet i förhållande till fördelningen av proteinerna över den hela halvklotet på denna nivå i förhållande till Bregma31. Detta tillåter för jämförelse av resultaten med hjälp av olika antikroppar, olika Mikroskop, eller ens mellan olika studier. Denna enhetlighet över olika prover kommer från den jämförande naturen av denna metod: variabilitet kompenseras genom att ta förhållandet mellan fluorescensen i området av intresse och som av halvklotet. Därför är olikheter i absoluta värden som härrör från tekniska skillnader upphävs. En annan stor fördel med denna teknik är att områden av intresse kan vara så liten som du vill, endast begränsas av upplösningen av mikroskopet. Kvantifiera proteinnivåer med biokemiska metoder, kräver till exempel Western Blot eller masspektrometri6,7,8,9, en dissekering av vävnaden in i området av intresse. Detta dissektion är svårt för regioner av hjärnan, såsom den primära somatosensoriska cortexen, och blir nästan omöjligt när siktar på underregioner, såsom de olika lagren av hjärnbarken eller hippocampus.
En varning av metoden är att de olika nivåerna i hjärnan direkt inte kan jämföras med varandra. Halvklot med många regioner proteinrika sevärdheter har olika genomsnittliga värdet än halvklot med endast några proteinrika regioner. Värden på 20% över genomsnittet, kommer därför exempelvis återspeglar en olika absoluta mängden protein i en nivå i förhållande till Bregma jämfört med en andra. Man måste komma ihåg samt att denna metod inte tillåter bestämning av absoluta proteinnivåer, endast den relativa överflöd jämfört med intern referens markör och genomsnittet över halvklotet.
Denna metod kan lätt anpassas till bestämma fördelningen av proteinet av intresse i förhållande till markörer för olika neuronala fack, inte bara presynaptiska platser. Det kan också enkelt anpassas för vävnader än hjärnan och - med lämplig antikroppar - andra modellsystem än möss32,33. Medan användningen av confocal Mikroskop är författarnas metod för val, bör en kombination av epifluorescence mikroskopi och deconvolution programvara ge samma datakvalitet och därmed utöka användbarheten av protokollet. Dessutom kan den samma infärgning användas för att bestämma subcellulär fördelningen, till exempel med super-resolution mikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Irmgard Weiss för utmärkt tekniskt bistånd. Författarna erkänner stöd av Hermes Pofantis och Andoniya Petkova. Författarna vill även tacka Europeiska neurovetenskap Institutet för användning av LSM800 och tekniskt bistånd, särskilt genom Dr Nils Halbsgut. Detta arbete finansierades av vid University Medical Center Göttingen. JSV erkänner stöd av Center för nanoskala mikroskopi och molekylär fysiologi av hjärnan (CNMPB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL reaction tubes | Eppendorf | 30120094 | |
| 50 mL reaction tubes | Greiner Bio-One | 227261 | |
| multiwell 24 well | Fisher Scientific | 087721H | |
| plastic pipette (disposable) | Sarstedt | 861,176 | |
| 1000 mL pipette | Rainin | 17014382 | |
| 2 ml pipette | Eppendorf | 3123000012 | |
| Vortex Genius 3 | IKA | 3340001 | |
| Menzel microscope slides | Fisher Scientific | 10144633CF | |
| Stereoscope | Leica | ||
| LSM800 | Zeiss | Confocal microscope | |
| freezing microtome | Leica | ||
| PBS (10X) | Roche | 11666789001 | |
| PFA | Sigma | P6148-1kg | |
| NaCl | BioFroxx | 1394KG001 | |
| sucrose | neoFroxx | 1104KG001 | |
| Tissue Tek | Sakura | 4583 | OCT |
| Na2HPO4 | BioFroxx | 5155KG001 | |
| NaH2PO4 | Merck | 1,063,460,500 | |
| normal goat serum | Merck Millipore | S26-100ML | |
| normal donkey serum | Merck | S30-100ML | |
| Triton X-100 | Merck | 1,086,031,000 | |
| rabbit anti-Mover | Synaptic Systems | RRID: AB_10804285 | |
| guinea pig anti-Synaptophysin | Synaptic Systems | RRID: AB_1210382 | |
| donkey anti-rabbit AF647 | Jackson ImmunoResearch | RRID: AB_2492288 | |
| goat anti-mouse AF488 | Jackson ImmunoResearch | RRID: AB_2337438 | |
| Mowiol4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| ZEN2 blue software | Zeiss | Microscopy software | |
| FIJI | ImageJ | Analysis software | |
| Microsoft Excel | Microsoft |
References
- Wallrafen, R., Dresbach, T. The Presynaptic Protein Mover Is Differentially Expressed Across Brain Areas and Synapse Types. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 58 (2018).
- Augustin, I., Betz, A., Herrmann, C., Jo, T., Brose, N. Differential expression of two novel Munc13 proteins in rat brain. Biochemical Journal. 337, 363-371 (1999).
- Rosenmund, C., et al. Differential Control of Vesicle Priming and Short-Term Plasticity by Munc13 Isoforms. Neuron. 33, 411-424 (2002).
- Breustedt, J., et al. Munc13-2 differentially affects hippocampal synaptic transmission and plasticity. Cerebral cortex. 20, 1109-1120 (2010).
- Chen, Z., Cooper, B., Kalla, S., Varoqueaux, F., Young, S. M. The Munc13 Proteins Differentially Regulate Readily Releasable Pool Dynamics and Calcium-Dependent Recovery at a Central Synapse. The Journal of Neuroscience. 33, 8336-8351 (2013).
- Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A Defined Methodology for Reliable Quantification of Western Blot Data. Mol Biotechnol. , (2013).
- Charette, S. J., Lambert, H., Nadeau, P. J., Landry, J. Protein quantification by chemiluminescent Western blotting Elimination of the antibody factor by dilution series and calibration curve. Journal of Immunological Methods. 353, 148-150 (2010).
- Heidebrecht, F., Heidebrecht, A., Schulz, I., Behrens, S., Bader, A. Improved semiquantitative Western blot technique with increased quantification range. Journal of Immunological Methods. 345, 40-48 (2009).
- Toki, M. I., Cecchi, F., Hembrough, T., Syrigos, K. N., Rimm, D. L. Proof of the quantitative potential of immunofluorescence by mass spectrometry. Laboratory Investigation. 97, 329-334 (2017).
- Wilhelm, B. G., et al. Composition of isolated synaptic boutons reveals the amounts of vesicle trafficking proteins. Science. 344, 1023-1028 (2014).
- Navone, F., et al. Protein p38: An integral membrane protein specific for small vesicles of neurons and neuroendocrine cells. Journal of Cell Biology. 103, 2511-2527 (1986).
- Gundelfinger, E. D., Reissner, C., Garner, C. C. Role of Bassoon and Piccolo in Assembly and Molecular Organization of the Active Zone. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 7, (2016).
- Ziegler, D. R., Cullinan, W. E., Herman, J. P. Distribution of vesicular glutamate transporter mRNA in rat hypothalamus. Journal of Comparative Neurology. 448, 217-229 (2002).
- Chaudhry, F. A., et al. The vesicular GABA transporter, VGAT, localizes to synaptic vesicles in sets of glycinergic as well as GABAergic neurons. Journal of Neuroscience. 18, 9733-9750 (1998).
- Aoki, C., et al. Electron Microscopic Immunocytochemical SAP-97 at Postsynaptic, Presynaptic, and Nonsynaptic Sites of Adult and Neonatal Rat Visual Cortex. Synapse. 257, 239-257 (2001).
- Valtschanoff, J. G., et al. Expression of NR2 Receptor Subunit in Rat Somatic Sensory Cortex : Synaptic Distribution and Colocalization With NR1 and PSD-95. Journal of Comparative Neurology. 611, 599-611 (1999).
- Hunt, A., Schenker, L. J., Kennedy, B. PSD-95 Is Associated with the Postsynaptic Density and Not with the Presynaptic Membrane at Forebrain Synapses. Journal of Neuroscience. 76, 1380-1388 (1996).
- Luscher, B., Fuchs, T., Kilpatrick, C. L. GABA A Receptor Trafficking-Mediated Plasticity of Inhibitory Synapses. Neuron. 70, 385-409 (2011).
- Kirby, M. Understanding the molecular diversity of GABAergic synapses. 5, 1-12 (2011).
- Harris, K. M., Weinberg, R. J., Verrall, A. W. Ultrastructure of Synapses in the Mammalian Brain. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , 1-30 (2012).
- Heise, C., et al. Selective Localization of Shanks to VGLUT1-Positive Excitatory Synapses in the Mouse Hippocampus. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, (2016).
- Peters, P. J., Yuan, L. C., Biology, C., Branch, M. Localization of TGN38 to the trans-Golgi network: involvement of a cytoplasmic tyrosine-containing sequence. Journal of Cell Biology. 120, 1123-1135 (1993).
- Antonini, D., et al. Tprg, a gene predominantly expressed in skin, is a direct target of the transcription factor p63. Journal of Investigative Dermatology. 128, 1676-1685 (2008).
- Burre, J., et al. Synaptic vesicle proteins under conditions of rest and activation: Analysis by 2-D difference gel electrophoresis. Electrophoresis. 27, 3488-3496 (2006).
- Kremer, T., et al. Mover is a novel vertebrate-specific presynaptic protein with differential distribution at subsets of CNS synapses. FEBS Letters. 581, 4727-4733 (2007).
- Ahmed, S., et al. Mover Is a Homomeric Phospho-Protein Present on Synaptic Vesicles. PLoS ONE. 8, (2013).
- Körber, C., et al. Modulation of Presynaptic Release Probability by the Vertebrate-Specific Protein Mover. Neuron. 87, 521-533 (2015).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. , 1-9 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, (2012).
- Schneider Gasser, E. M., et al. Immunofluorescence in brain sections: simultaneous detection of presynaptic and postsynaptic proteins in identified neurons. Nature Protocols. 1, 1887-1897 (2006).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , ACADEMIC PRESS. (2001).
- Sun, Y., Ip, P., Chakrabartty, A. Simple Elimination of Background Fluorescence in Formalin-Fixed Human Brain Tissue for Immunofluorescence Microscopy. Journal of Visualized Experiments. , 1-6 (2017).
- Poole, A. R., Dingle, J. T., Mallia, A. K. The localization of retinol-binding protein in rat liver by immunofluorescence microscopy. Journal of Cell Science. 394, 379-394 (1975).
