Summary
Nous décrivons ici une approche quantitative pour déterminer la répartition d’une protéine synaptique par rapport à une protéine de marqueur à l’aide d’immunofluorescence souillant, microscopie confocale et analyse assistée par ordinateur.
Abstract
La présence, l’absence ou niveaux de protéines synaptiques spécifiques peuvent influencer considérablement la transmission synaptique. En plus d’élucider la fonction d’une protéine, il faut également déterminer sa diffusion. Nous décrivons ici un protocole utilisant l’immunofluorescence, microscopie confocale et l’analyse assistée par ordinateur pour déterminer la distribution de la protéine synaptique Mover (également appelé TPRGL ou SVAP30). On compare la distribution de Mover à celui de la vésicule synaptique protéine synaptophysine, déterminant ainsi la distribution de Mover de manière quantitative par rapport à l’abondance des vésicules synaptiques. Notamment, cette méthode pourrait potentiellement être mises en œuvre pour permettre une comparaison de la distribution des protéines à l’aide d’anticorps différents ou microscopes ou à travers différentes études. Notre méthode contourne la variabilité inhérente des salissures par immunofluorescence en cédant un rapport plutôt que des niveaux de fluorescence absolue. En outre, la méthode que nous décrivons permet au chercheur d’analyser la distribution d’une protéine à différents niveaux : des tranches de cerveau entier de régions du cerveau dans différentes sous-régions dans la zone d’un cerveau, telles que les différentes couches de l’hippocampe ou sensorielles cortex. Mover est une protéine spécifique vertébré associé de vésicules synaptiques. Avec cette méthode, nous montrons que le déménageur est hétérogène dans les zones du cerveau, avec des concentrations élevées dans le pallidum ventral, les noyaux septums et l’amygdale et aussi dans les zones du cerveau unique, telles que les différentes couches de l’hippocampe.
Introduction
Communication entre les neurones se passe à des sites de contact spécialisées appelées synapses. Synapses contiennent une multitude de différentes protéines qui orchestrent la transmission synaptique. Certaines de ces protéines présentent une distribution hétérogène dans le système nerveux et ne sont pas présents dans chaque synapse1. Un exemple d’une telle protéine est Munc13, qui est impliqué dans le processus d’amorçage de vésicules synaptiques. Il existe différentes isoformes de Munc13, qui sont hétérogène dans tout le cerveau2, et la présence ou l’absence des isoformes spécifiques peut influer sur la plasticité synaptique à court terme et la vésicule synaptique dynamique3, 4 , 5. par conséquent, il est d’une importance vitale pour pouvoir identifier la présence de différentes protéines synaptiques dans certaines zones du cerveau.
Les méthodes de choix pour la quantification des protéines synaptiques - jusqu'à présent - sont la spectrométrie de masse et de Western Blot, plutôt que d’immunohistochimie6,7,8,9. Dans certains cas, plusieurs méthodes sont utilisées pour se compléter mutuellement afin d’évaluer la quantité et la localisation des protéines spécifiques (p. ex., Wilhelm et al. 10). la méthode que nous décrivons ici permet la localisation et quantification des protéines d’intérêt sans avoir besoin d’utiliser toute méthode biochimique, employant simplement les salissures par immunofluorescence. Un autre avantage ici est que la quantification peut être faite sur des zones beaucoup plus petites et, donc, plus précise, que ceux réalisés par d’autres méthodes. Cependant, il faut prendre en considération qu’une protéine de référence fiable est nécessaire pour évaluer la distribution de la protéine d’intérêt.
Une coloration fluorescente par immunohistochimie permet d’identifier systématiquement la localisation des protéines dans certaines zones du cerveau ainsi que dans différents compartiments neuronales. Pour identifier les différents compartiments, marqueurs spécifiques sont utilisés. En général, anticorps contre synapsine et synaptophysine11 peuvent être utilisés pour étiqueter des vésicules synaptiques, tandis que les anticorps contre basson étiqueter la zone active d’un présynaptique borne12. Transporteurs vésiculaires, tels que les transporteurs de glutamate vésiculaire (vGluT) ou le transporteur vésiculaire de GABA (vGAT), sont utilisés pour étiqueter les excitateurs13 et inhibitrice14 terminaisons présynaptiques, respectivement. Côté postsynaptique, anticorps dirigés contre la protéine Homer peuvent être utilisées pour marquer les bornes postsynaptiques et anticorps contre densité postsynaptique protéine 95 (PSD95)15,16,17 ou gephyrin18 , 19 , 20 peut marquer les bornes postsynaptiques excitateurs ou inhibiteurs, respectivement. En utilisant des anticorps contre une protéine d’intérêt et de marqueurs tels que ceux décrits ci-dessus, on peut déterminer la localisation de cette protéine. De nombreuses études à ce jour l’ont fait dans une manière qualitative21. Toutefois, pour déterminer de manière fiable la distribution différentielle d’une protéine synaptique spécifique, il faut non seulement déterminer sa présence ou absence, mais aussi sa concentration relative. L’hétérogénéité de la taille et la densité des synapses rendent important d’établir un rapport entre le marqueur synaptique et la protéine d’intérêt. Dans le cas contraire, les régions riches en synapse tels que les couches non pyramidaux de l’hippocampe et la couche moléculaire du cervelet montrera une densité élevée de protéines synaptiques, uniquement en raison de la densité plus élevée des synapses mais pas en raison d’une forte présence de cette protéine dans chaque synapse (p. ex., Wallrafen et Dresbach1). En revanche, les protéines dans le soma neuronal (par exemple, TGN3822) affichera généralement forte présence dans la couche de cellules pyramidales hippocampe ou la couche de cellules hippocampiques ou cérébelleux granule en raison de la forte concentration de corps des cellules neuronales dans ces domaines. Par conséquent, cette répartition non homogène des structures, synapses dans ce cas, peut conduire à une fausse estimation de la distribution de la protéine d’intérêt elle-même. En outre, il y a une variabilité intrinsèque en intensités de coloration dans les trois échantillons de salissures immunohistochimiques. Le protocole décrit ici tienne compte de cela et évite ces préjugés, mais aussi autres avertissements résultant de méthodes immunohistochimiques.
Dans notre récente étude, nous avons utilisé cette méthode pour décrire l’expression différentielle de Mover (également appelée TPRGL23 SVAP3024) l’ensemble 16 cerveau différents domaines1. Mover est une protéine synaptique vertébré spécifiques qui se trouvent en association à des vésicules synaptiques et influence la neurotransmetteur dégagement25,26,27. Nous avons lié l’expression Mover à l’abondance des vésicules synaptiques, par coloration pour synaptophysine comme un repère de vésicules synaptiques. Nous avons trouvé des niveaux élevés de Mover en particulier dans les noyaux septums, le pallidum ventral et l’amygdale. Dans l’hippocampe, nous trouvons une répartition hétérogène des Mover, avec des niveaux élevés dans les couches associées calcul intra-hippocampique et faibles concentrations dans les couches d’entrée et de sortie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ce protocole n’implique pas d’expériences sur des animaux vivants. Expériences portant sur l’euthanasie des animaux pour prélever des échantillons de cerveau ont été approuvées par les autorités locales de protection animale (Tierschutzkommission der Universitätsmedizin Göttingen) sous le numéro T 10/30.
Remarque : Pour ce protocole, 3 souris C57BL/6 mâles adultes ont été utilisées.
1. préparation de l’échantillon
- Préparer le fixateur et tamponné au phosphate 0,1 M (PB ; voir tableau 1).
- Difficulté de l’animal par la perfusion de transcardial comme décrit en Gage et al. 28. tout d’abord laver le sang avec 0,9 % NaCl-solution, puis perfuse avec 30 mL de paraformaldéhyde à 4 % (PFA).
- Ouvrir le crâne avec des ciseaux et isoler soigneusement le cerveau à l’aide d’une cuillère angles pour éviter d’endommager le tissu.
- Remplir un tube de réaction de 50 mL de fixateur et postfix le cerveau chez 4 % PFA à 4 ° C durant la nuit.
- Enlever le fixateur et laver le cerveau dans 50 mL de 0.1 M PB sur un agitateur pendant 30 min.
- Après le lavage, incuber le cerveau dans un tube de réaction de 50 mL à 30 % de saccharose à 0,1 M PB pendant 48 h ou jusqu'à ce qu’elle s’enfonce dans le tube à 4 ° C pour la cryoprotection.
- Rogner le cerveau de cryoprotected avec une lame tranchante, placez-le dans un cryomold et incorporez-le avec la température de coupe optimale (OCT) composée. Éviter les bulles. Orientez le cerveau et geler le cryomold dans le congélateur à-80 ° C.
- Monter les tissus congelés pour la coupe. Equilibrer le tissu à la température de cryomicrotome pendant au moins 15 min avant la découpe.
- Section du cerveau en tranches épaisses coronale de 25 µm. Touchez l’OPO soigneusement avec un crochet de verre sans toucher le tissu cérébral. Collecter 3 tranches adjacentes par puits dans une plaque 24 puits et stockez-les en PB de 0,1 M à 4 ° C jusqu'à coloration.
Remarque : Le protocole peut être suspendu ici pendant deux semaines. Les périodes de conservation plus longues peuvent interférer avec la qualité du tissu et ainsi influencer le résultat de l’expérience.
2. immunofluorescence
- Préparer des solutions, y compris le tampon de blocage, le tampon de l’anticorps, lavage buffer 1 et laver 2 (voir tableau 1).
- Rincez les tranches une fois avec PB pour enlever l’excès OCT.
- Supprimer la solution avec une pipette en plastique sans sucer dans les tranches de cerveau. Ajouter 250 µL de PB fraîche avec une pipette de 1000 µL.
Attention : Tranches devraient s’assèchent pas, donc supprimer et ajouter des fluides bien par bien.
- Supprimer la solution avec une pipette en plastique sans sucer dans les tranches de cerveau. Ajouter 250 µL de PB fraîche avec une pipette de 1000 µL.
- Retirer le PB avec une pipette en plastique et ajouter 250 µL de tampon de blocage / puits avec une pipette de 1000 µL. Incuber pendant 3 h à température ambiante (RT) sur l’agitateur.
- Au cours de la période d’incubation, diluer l’anticorps primaires dans le tampon d’anticorps dans un tube à essais. Utiliser 250 µL de tampon d’anticorps / puits et ajouter la quantité appropriée d’anticorps (voir tableau 2) par pipetage il directement dans la solution à l’aide d’une pipette de 2 µL. Mélanger la solution de pipetage doucement et descendre plusieurs fois. Vortex sous peu par la suite pour assurer un bon mélange.
Remarque : Pour déterminer la fluorescence de fond, salissures doit également être effectuée sans ajouter de l’anticorps primaire. Pour cela, incuber la tranche dans la solution d’anticorps sans anticorps primaires selon le protocole. - Après la période d’incubation, retirer le tampon de blocage avec une pipette en plastique et ajouter 250 µL de solution d’anticorps contenant des anticorps primaires / puits. Incuber les tranches avec l’anticorps primaire pendant la nuit à 4 ° C dans un agitateur.
- Le lendemain, laver les tranches avec lavage tampon 1 3 x 10 min à ta sur un agitateur.
- Enlever le support avec une pipette en plastique et ajouter 300 µL de tampon 1 de lavage / puits. Incuber à RT pendant 10 min. Répétez 3 fois.
- Au cours des étapes de lavage, diluer l’anticorps secondaires couplés fluorophore dans le tampon d’anticorps dans un tube à essais. Utiliser 250 µL de tampon d’anticorps / puits et ajouter la quantité appropriée d’anticorps (voir tableau 2) par pipetage il directement dans la solution à l’aide d’une pipette de 2 µL. Mélanger la solution de pipetage doucement et descendre plusieurs fois. Vortex sous peu par la suite pour assurer un bon mélange.
Attention : Puisque les anticorps sont sensibles à la lumière, toutes les étapes de ce moment doivent être effectuées dans l’obscurité. - Après les étapes de lavage, enlever le lavage de la mémoire tampon avec une pipette en plastique et ajouter 250 µL de solution d’anticorps contenant des anticorps secondaires / puits. Incuber les tranches avec un anticorps secondaire pendant 90 min à ta dans l’obscurité.
- Laver les tranches avec lavage tampon 2 3 x pendant 10 min à température ambiante.
- Au cours des étapes de lavage, diluer 4′, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) à 0,1 M PB dans une concentration de 1 : 2000.
- Retirer le tampon de lavage 2 avec une pipette en plastique et ajouter 250 µL de solution DAPI / puits. Incuber 5 min à ta sur l’agitateur.
- Enlever la solution DAPI avec une pipette en plastique et ajouter 500 µL de PB de 0,1 M / puits avec une pipette de 1000 µL.
- Monter les tranches sur lames de microscope.
- Placez une lame de microscope sous le stéréoscope. Avec une brosse fine, ajouter trois gouttes distincts de 0,1 M PB sur le toboggan. Placer une tranche par goutte d’eau sur la lame de microscope.
- Utilisez la brosse fine à s’aplatir et à orienter les tranches sur la lame de microscope.
- Lorsque toutes les tranches sont correctement positionnés, enlever PB excédent avec un mouchoir et essuyer la lame soigneusement.
Attention : Éviter de sécher les tranches de cerveau complètement. - Ajouter 80 µL d’incorporation médium sur le toboggan. Déposez délicatement la lamelle sur le toboggan, intégrant ainsi les tranches de cerveau.
- Laissez les diapositives à sécher sous la hotte pendant 1-2 h (couvrir afin d’éviter l’exposition à la lumière) et stockez-les dans une boîte de glissière de microscope à 4 ° C.
Remarque : Le protocole peut être suspendu ici.
3. imagerie
- Après que le milieu d’enrobage est complètement trempé, placez la lame de microscope sous le microscope confocal.
NOTE : Microscopie à épifluorescence associée au logiciel de déconvolution devrait produire une qualité d’image similaire. - Ajustez les réglages du laser en augmentant ou en diminuant l’intensité du laser pour chaque canal afin que quelques pixels sont surexposés afin d’assurer une répartition maximale des valeurs de gris.
- Acquérir des tissus virtuels de la tranche de cerveau entier pour les différents canaux.
- Les logiciels d’imagerie (voir Table des matières), sélectionnez l’option de tuiles et de définir manuellement la tranche de cerveau avec la Tuile région d’installation.
- Distribuer des points d’appui dans toute la région de tuile et ajuster le focus pour les points d’appui différents en appuyant sur Vérifier carrelage régions/Positions...
- Ajuster les réglages en Mode d’Acquisition selon la taille désirée de résolution et de fichier de l’image qui en résulte et démarrer la recherche.
- Lorsque le scan est terminé, utilisez la fonction de couture pour traiter le tissu virtuel. Exporter le fichier comme un .tif avec la fonction Exporter Image.
4. computer-based Analysis
- Charger tous les canaux pour une seule image dans Fidji29 en cliquant sur fichier | Ouvert.
- Avec l’outil de sélection à main levée , délimiter un hémisphère dans le DAPI-canal. Créer un masque de la sélection en cliquant sur Edition | Sélection | Créer le masque.
- Déterminer l’intensité de la fluorescence de moyenne pour les canaux (Mover et synaptophysine) en cliquant sur Analyze | Mesure.
Remarque : Veillez à sélectionner les différents canaux pour déterminer les valeurs d’intensité de fluorescence moyenne pour chaque canal. - Copiez l’intensité de la fluorescence de moyenne pour les canaux dans une feuille de calcul.
- Déterminer l’intensité de la fluorescence de moyenne pour les canaux dans un domaine d’intérêt en délimitant la zone aussi avec l’outil de sélection à main levée . Utiliser un atlas de cerveau de souris comme référence.
- Répétez les étapes 4.1 à 4.5 pour tous les hémisphères et tous les domaines d’intérêt.
NOTE : Déterminer les valeurs pour chaque hémisphère séparément afin de pouvoir pour comparer plus tard les valeurs dans une zone d’intérêt que dans l’hémisphère (voir étape 5.2).
5. traitement
- Dans le cas où la fluorescence de fond est élevée (voir Discussion), une soustraction de fond peut-être s’avérer nécessaires. Pour cela, déterminer l’intensité de fluorescence moyenne pour la tranche traitée sans anticorps primaire contre la protéine de référence (ici : synaptophysine) et soustraire cette valeur de toutes les valeurs obtenues pour les régions du cerveau et des hémisphères.
- Lorsque les intensités de fluorescence moyenne pour les canaux pour chaque hémisphère et tous les domaines d’intérêt ont été déterminées (voir tableau 3), calculer le rapport de Mover à synaptophysine en divisant la valeur Mover de la valeur pour synaptophysine ( jaune dans le tableau 3). Effectuer cette opération pour chaque hémisphère et tous les domaines d’intérêt séparément.
- Diviser le ratio obtenu pour un domaine d’intérêt par le ratio obtenu pour l’hémisphère correspondant (orange dans le tableau 3) pour déterminer le rapport entre la zone d’intérêt dans l’hémisphère.
- Pour déterminer l’abondance relative des Mover, traduire le ratio obtenu en 5.2 en pourcentage en déterminant son écart par rapport à 1 (en rouge dans le tableau 3). Un ratio de 1,25 donnerait donc une abondance relative de Mover de 25 % au-dessus de la moyenne, et un ratio de 0,75, produirait une abondance relative de Mover de 25 % inférieure à moyenne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Représentant de modèles de différents marqueurs de coloration peut être vu dans la Figure 1. Le modèle varie en fonction de la répartition de la protéine. Exemples de cinq niveaux rostro-caudal sont indiqués dans les colonnes (A)-(E). Une souillure de DAPI représentatif est montrée dans la première rangée : DAPI adhère à l’ADN d’une cellule et donc les noyaux sont colorés. Il en résulte un motif ponctué. Les régions présentant une densité cellulaire élevée sont plus lumineux que les régions à faible densité. Un exemple d’une protéine de façon hétérogène distribué peut être vu dans la deuxième rangée. Le Mover coloration révèle une distribution différentielle dans tout le cerveau, avec des zones lumineuses hotspot et gradateur. Dans la troisième rangée, un exemple pour la synaptophysine de marqueur de référence plus homogènement distribués est montré. Une superposition de deux protéines (quatrième rangée) montre la distribution différentielle des Mover (rouge) par rapport à la synaptophysine de protéine marqueur (vert).
La figure 2 illustre la quantification décrite à l’étape 4 du protocole. Sont les valeurs d’intensité de fluorescence moyennes pour les différents canaux à travers les hémisphères (Mover, Figure 2A, synaptophysine, Figure 2B) et à travers les domaines d’intérêt (Mover, Figure 2C; synaptophysine, Figure 2D). Pour déterminer l’abondance Mover par rapport au nombre des vésicules synaptiques, un ratio provient des valeurs Mover fluorescence aux valeurs de fluorescence synaptophysine. Ces ratios pour les domaines d’intérêt sont indiqués dans la Figure 2Eet fournissent déjà une indication de la répartition hétérogène des Mover, avec zones avec haut et bas moteur niveaux par rapport à des vésicules synaptiques. Pour compenser la variabilité inhérente technique en outre, le rapport dans un domaine d’intérêt (Figure 2A) est comparé à celui dans l’hémisphère (non illustré) et traduit en pourcentage. Ce relatif Mover abondance (Figure 2F) qui donne une mesure de combien Mover est présent dans un domaine d’intérêt par rapport à la moyenne.
Comme mentionné ci-dessus, un des principaux avantages de cette technique est la capacité de déterminer l’abondance de la protéine d’intérêt à travers de très petites surfaces, voire sous-régions et couches de domaines d’intérêt. Un exemple de cette application est illustré à la Figure 3, où l’abondance relative des Mover a été déterminé pour les différentes couches dans les champs secondaires de l’hippocampe. La quantification dans les différentes couches, illustré à la Figure 3D Figure 3Fet Figure 3H correspond aux couches illustrés à la Figure 3C, Figure 3Eet Figure 3G, avec les couleurs correspondantes. Au sein de l’hippocampe, Mover est hétérogène, avec un taux élevé par rapport à des vésicules synaptiques en couches associées calcul intra-hippocampique (c'est-à-dire, la couche polymorphe du gyrus denté [DG], stratum radiatum, Mover Lucidum et oriens Cornu Ammonis 3 [CA3] et stratum radiatum et oriens Cornu Ammonis 1 [CA1]) et de faibles concentrations dans les couches d’entrée et de sortie (la couche moléculaire interne et externe de la DG, les couches de cellules pyramidales de la CA3 et CA1, ainsi que la strate lacunosum-moleculare de CA1).
Figure 1 : Images représentant immunofluorescence de DAPI (1er rang), Mover (seconde ligne), synaptophysine (3e rangée) et leur superposition (quatrième rangée, Mover dans synaptophysine rouge, en vert) les 5 niveaux rostro-caudal (A-E). Domaines d’intérêt sont ombrées en gris dans la rangée supérieure des panneaux. M1, le cortex moteur primaire ; CIO, îles de Calleja ; ACC, le cortex cingulaire antérieur ; SNu, noyaux septums ; VPa, pallidum ventral ; NuA, noyau accumbens ; CP, noyau caudé putamen ; S1, cortex somatosensoriel primaire ; HC, hippocampe ; Suis, amygdale ; MHa, habenula médiale ; PAG, grise périaqueducale ; SN, substantia nigra ; IDV, l’aire tegmentale ventrale ; MLC, couche moléculaire du cervelet ; GLC, couche granulaire du cervelet. Echelle = 500 µm. Ce chiffre a été modifié de Wallrafen et Dresbach1. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Quantification de la distribution de Mover à travers les 5 niveaux rostro-caudal. Signifie l’intensité de la fluorescence du signal Mover (A) et le signal de la synaptophysine (B) à différents niveaux. Veux dire intensité de la fluorescence de la signal Mover (C) et la synaptophysine (D) dans les 16 régions du cerveau définie manuellement. (E) Ratios de Mover et synaptophysine dans les régions du 16 cerveau d’intérêt. (F) Quantification de l’abondance relative des Mover, en comparant le ratio Mover/synaptophysine à la région respective au ratio de l’hémisphère correspondant. M1, le cortex moteur primaire ; CIO, îles de Calleja ; ACC, le cortex cingulaire antérieur ; SNu, noyaux septums ; VPa, pallidum ventral ; NuA, noyau accumbens ; CP, noyau caudé putamen ; S1, cortex somatosensoriel primaire ; HC, hippocampe ; Suis, amygdale ; MHa, habenula médiale ; PAG, grise périaqueducale ; SN, substantia nigra ; IDV, l’aire tegmentale ventrale ; MLC, couche moléculaire du cervelet. Points noirs représentent les points de données unique. Les barres montrent la moyenne ± erreur-type de la moyenne (SEM). Ce chiffre a été modifié de Wallrafen et Dresbach1. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Distribution de mover dans l’hippocampe de souris. Immunofluorescence salissures des tranches coronales de l’hippocampe de souris. Vue d’ensemble de l’hippocampe montrant le modèle d’expression Mover hétérogène (A) et la synaptophysine correspondante (B) la coloration. Les trois régions d’intérêt (DG, Figure 3C; Ca3, Figure 3E; Ca1, Figure 3G) sont délimitées avec des pointillés blancs. (D,F,H) Quantification en comparant le ratio dans les couches respectives pour le ratio de l’hémisphère correspondant. Les couleurs dans les graphiques à barres correspondent à l’ombrage respectif dans les groupes C, Eet G. Mover expression est élevée dans les niveaux associés aux calcul intra-hippocampique (c'est-à-dire, la couche polymorphe de DG, stratum radiatum, lucidum et oriens de CA3 et stratum radiatum et oriens de CA1) et faible dans l’entrée principale - et couches de sortie (le intérieure et extérieure couche moléculaire de DG, les couches de cellules pyramidales de la CA3 et CA1 et la strate lacunosum-moleculare de CA1). OML, couche moléculaire externe ; IML, couche moléculaire interne ; GrL, couche granulaire ; PmL, polymorphe couche/hile ; Oui, strate oriens ; Espion, strate pyramidale ; SLu, stratum lucidum ; SR, stratum radiatum ; SLM, strate lacunosum-moleculare. Echelle = 500 µm. points noirs représentent des données simples points. Les barres montrent la moyenne ± sem Ce chiffre a été modifié de Wallrafen et Dresbach1. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Tableau 1 : Les Solutions utilisées dans le présent protocole.
Tableau 2 : Anticorps utilisés dans le présent protocole.
Tableau 3 : Exemple de manipulation de données.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
La méthode présentée ici vise à quantifier la distribution d’une protéine d’intérêt par rapport à l’abondance d’une protéine marqueur avec une aire de répartition connue. Immunofluorescence souillant peut montrer une forte variabilité des intensités entre les différentes tranches de coloration. La méthode de quantification décrite ici contourne ce problème en déterminant la proportion de la protéine d’intérêt à la moyenne dans l’ensemble de l’hémisphère. Par conséquent, différentes intensités de coloration dans les tranches sont annulées et permettent une description quantitative.
Comme pour chaque protocole d’immunofluorescence, qualitative ou quantitative, plusieurs facteurs peuvent influencer le succès et ainsi confondre l’analyse. Par conséquent, devrait être une attention particulière aux étapes critiques du protocole. Tout d’abord, il faut une bonne fixation du tissu. Cette fixation est possible habituellement par une perfusion de transcardial réussie. La qualité de la perfusion peut être vérifiée en contrôlant le foie peu de temps après le lavage du sang. Un premier indicateur pour une perfusion réussie est le nettoyage du foie et des extrémités28. La présence de caillots de sang peut indiquer que la perfusion peut-être avoir été trop lente et doit être effectuée plus rapidement la prochaine fois. Certaines protéines nécessitent des protocoles différents de fixation, comme fixation chimique avec IFP peut causer l’épitope blocage30. Dans ce cas, fixation de gel ou de fixation avec un produit chimique différent, comme le méthanol, devrait considérer. En second lieu, après la découpe, il est essentiel de colorer les tranches de cerveau comme rapidement que possible, de préférence sur le même ou le prochain mot. Une conservation plus longue en PB peut conduire à une infection bactérienne et lors de l’ajout de NaN3 peut éviter cela dans une certaine mesure, la qualité du tissu se détériore généralement avec le temps de stockage. En troisième lieu, au cours de la procédure de marquage, c’est important d’effectuer les étapes de lavage puits par puits afin d’éviter le séchage des tranches. Lorsque les tranches se dessèchent, fluorescence de fond peut augmenter et ainsi entraîner un biais dans l’analyse. Quatrièmement, après application de l’anticorps secondaire, il est vital d’effectuer toutes les étapes suivantes dans l’obscurité. Les fluorophores sont sensibles à la lumière, et exposition à la lumière peut fausser gravement le signal de fluorescence.
L’optimisation de la procédure de coloration, y compris la sélection des anticorps primaires et secondaires adéquates concentration optimale d’anticorps et temps d’exposition, est une condition sine qua non pour obtenir le meilleur rapport signal sur bruit et d’effectuer un fiable analyse quantitative par immunofluorescence. Anticorps vérifiés en assommer de tissu devraient être le premier choix, quoique pas toujours disponible. Assurez-vous toujours d’effectuer des expériences de contrôle appropriés afin d’exclure la diaphonie entre les différents anticorps. On peut estimer la quantité de fluorescence de fond découlant de l’autofluorescence et liaison non spécifique de l’anticorps secondaire par imagerie les tranches dans lesquelles l’anticorps primaire ne s’appliquait pas. Il n’est pas trivial d’établir combien plus les intensités du signal doivent être par rapport à l’arrière-plan d’avoir un rapport signal-bruit acceptable. Cependant, basé sur des observations empiriques, les auteurs suggère visant pour avoir un signal au moins 2 fois plus fort que l’arrière-plan afin d’estimer de façon fiable la distribution des protéines. Dans le cas où la fluorescence de fond est élevée dans des conditions de contrôle (sans la présence de l’anticorps primaire), la fluorescence de fond moyenne devrait être déduite de l’expérience des images.
L’avantage majeur de notre approche est sa référence interne : l’intensité de l’immunofluorescence de la protéine cible (c'est-à-direMover) dans une région d’intérêt est comparée à un marqueur de référence (c'est-à-dire, synaptophysine) et à l’intensité globale de ces protéines à travers tout l’hémisphère. Ainsi, le calcul que nous effectuons, on peut conclure sans équivoque que l’abondance de la protéine cible est x fois plus haut/plus bas dans une certaine région d’intérêt que l’abondance de la protéine de référence par rapport à la distribution des protéines à travers le tout l’hémisphère à ce niveau par rapport au Bregma31. Ce qui permet la comparaison des résultats à l’aide d’anticorps différents, différents microscopes, ou même à travers différentes études. Cette uniformité entre les différents échantillons proviennent de la nature comparative de cette méthode : variabilité est compensée en prenant le rapport entre la fluorescence dans le domaine d’intérêt et celui de l’hémisphère. Par conséquent, différences en valeurs absolues résultant de différences techniques sont annulés. Un autre avantage majeur de cette technique est le fait que les domaines d’intérêt peuvent être aussi petits que vous le souhaitez, seulement limitée par la résolution du microscope. Quantification des niveaux de protéine avec des méthodes biochimiques, par exemple Western Blot ou spectrométrie de masse6,7,8,9, nécessite une dissection des tissus dans la zone d’intérêt. Cette dissection est difficile pour les régions du cerveau comme le cortex somatosensoriel primaire et devient pratiquement impossible lorsque visant des sous-régions, tels que les différentes couches du cortex ou l’hippocampe.
Un avertissement de l’approche est que les différents niveaux dans le cerveau ne peut pas directement être comparés entre eux. Hémisphères avec plusieurs régions riches dans la protéine d’intérêt auront une valeur différente de la moyenne celle hémisphères avec seulement quelques régions riches en protéines. Valeurs de 20 % au-dessus de la moyenne, par exemple, reflétera donc une différente valeur absolue de la protéine dans un niveau par rapport au Bregma par rapport à un autre. Il faut garder à l’esprit que cette méthode ne permet pas la détermination des niveaux de protéine absolue, seulement l’abondance relative par rapport au marqueur de référence interne et la moyenne dans l’ensemble de l’hémisphère.
Cette méthode peut être facilement adaptée pour déterminer la distribution de la protéine d’intérêt par rapport aux marqueurs pour différents compartiments neuronales, non seulement les sites présynaptiques. Il peut aussi être facilement adapté pour les tissus autres que le cerveau et - avec des anticorps appropriés - autres systèmes modèles de souris32,,33. Tandis que l’utilisation d’un microscope confocal est la méthode privilégiée des auteurs, une combinaison de logiciels de microscopie et de déconvolution épifluorescence doit produire la même qualité de données et ainsi améliorer la facilité d’utilisation du protocole. En outre, les salissures même peut être utilisé pour déterminer la distribution subcellulaire, avec par exemple la microscopie super-résolution.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions Irmgard Weiss excellente assistance technique. Les auteurs remercient Hermes Pofantis et du Andoniya Petkova. Les auteurs remercient également l’Institut européen des neurosciences pour l’utilisation de la LSM800 et l’assistance technique, notamment par le Dr Nils Halbsgut. Ce travail a été financé par l’université médicale centre de Göttingen. JSV reconnaît la prise en charge par le centre pour la microscopie nanométrique et physiologie moléculaire de la cerveau (CNMPB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL reaction tubes | Eppendorf | 30120094 | |
| 50 mL reaction tubes | Greiner Bio-One | 227261 | |
| multiwell 24 well | Fisher Scientific | 087721H | |
| plastic pipette (disposable) | Sarstedt | 861,176 | |
| 1000 mL pipette | Rainin | 17014382 | |
| 2 ml pipette | Eppendorf | 3123000012 | |
| Vortex Genius 3 | IKA | 3340001 | |
| Menzel microscope slides | Fisher Scientific | 10144633CF | |
| Stereoscope | Leica | ||
| LSM800 | Zeiss | Confocal microscope | |
| freezing microtome | Leica | ||
| PBS (10X) | Roche | 11666789001 | |
| PFA | Sigma | P6148-1kg | |
| NaCl | BioFroxx | 1394KG001 | |
| sucrose | neoFroxx | 1104KG001 | |
| Tissue Tek | Sakura | 4583 | OCT |
| Na2HPO4 | BioFroxx | 5155KG001 | |
| NaH2PO4 | Merck | 1,063,460,500 | |
| normal goat serum | Merck Millipore | S26-100ML | |
| normal donkey serum | Merck | S30-100ML | |
| Triton X-100 | Merck | 1,086,031,000 | |
| rabbit anti-Mover | Synaptic Systems | RRID: AB_10804285 | |
| guinea pig anti-Synaptophysin | Synaptic Systems | RRID: AB_1210382 | |
| donkey anti-rabbit AF647 | Jackson ImmunoResearch | RRID: AB_2492288 | |
| goat anti-mouse AF488 | Jackson ImmunoResearch | RRID: AB_2337438 | |
| Mowiol4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| ZEN2 blue software | Zeiss | Microscopy software | |
| FIJI | ImageJ | Analysis software | |
| Microsoft Excel | Microsoft |
References
- Wallrafen, R., Dresbach, T. The Presynaptic Protein Mover Is Differentially Expressed Across Brain Areas and Synapse Types. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 58 (2018).
- Augustin, I., Betz, A., Herrmann, C., Jo, T., Brose, N. Differential expression of two novel Munc13 proteins in rat brain. Biochemical Journal. 337, 363-371 (1999).
- Rosenmund, C., et al. Differential Control of Vesicle Priming and Short-Term Plasticity by Munc13 Isoforms. Neuron. 33, 411-424 (2002).
- Breustedt, J., et al. Munc13-2 differentially affects hippocampal synaptic transmission and plasticity. Cerebral cortex. 20, 1109-1120 (2010).
- Chen, Z., Cooper, B., Kalla, S., Varoqueaux, F., Young, S. M. The Munc13 Proteins Differentially Regulate Readily Releasable Pool Dynamics and Calcium-Dependent Recovery at a Central Synapse. The Journal of Neuroscience. 33, 8336-8351 (2013).
- Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A Defined Methodology for Reliable Quantification of Western Blot Data. Mol Biotechnol. , (2013).
- Charette, S. J., Lambert, H., Nadeau, P. J., Landry, J. Protein quantification by chemiluminescent Western blotting Elimination of the antibody factor by dilution series and calibration curve. Journal of Immunological Methods. 353, 148-150 (2010).
- Heidebrecht, F., Heidebrecht, A., Schulz, I., Behrens, S., Bader, A. Improved semiquantitative Western blot technique with increased quantification range. Journal of Immunological Methods. 345, 40-48 (2009).
- Toki, M. I., Cecchi, F., Hembrough, T., Syrigos, K. N., Rimm, D. L. Proof of the quantitative potential of immunofluorescence by mass spectrometry. Laboratory Investigation. 97, 329-334 (2017).
- Wilhelm, B. G., et al. Composition of isolated synaptic boutons reveals the amounts of vesicle trafficking proteins. Science. 344, 1023-1028 (2014).
- Navone, F., et al. Protein p38: An integral membrane protein specific for small vesicles of neurons and neuroendocrine cells. Journal of Cell Biology. 103, 2511-2527 (1986).
- Gundelfinger, E. D., Reissner, C., Garner, C. C. Role of Bassoon and Piccolo in Assembly and Molecular Organization of the Active Zone. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 7, (2016).
- Ziegler, D. R., Cullinan, W. E., Herman, J. P. Distribution of vesicular glutamate transporter mRNA in rat hypothalamus. Journal of Comparative Neurology. 448, 217-229 (2002).
- Chaudhry, F. A., et al. The vesicular GABA transporter, VGAT, localizes to synaptic vesicles in sets of glycinergic as well as GABAergic neurons. Journal of Neuroscience. 18, 9733-9750 (1998).
- Aoki, C., et al. Electron Microscopic Immunocytochemical SAP-97 at Postsynaptic, Presynaptic, and Nonsynaptic Sites of Adult and Neonatal Rat Visual Cortex. Synapse. 257, 239-257 (2001).
- Valtschanoff, J. G., et al. Expression of NR2 Receptor Subunit in Rat Somatic Sensory Cortex : Synaptic Distribution and Colocalization With NR1 and PSD-95. Journal of Comparative Neurology. 611, 599-611 (1999).
- Hunt, A., Schenker, L. J., Kennedy, B. PSD-95 Is Associated with the Postsynaptic Density and Not with the Presynaptic Membrane at Forebrain Synapses. Journal of Neuroscience. 76, 1380-1388 (1996).
- Luscher, B., Fuchs, T., Kilpatrick, C. L. GABA A Receptor Trafficking-Mediated Plasticity of Inhibitory Synapses. Neuron. 70, 385-409 (2011).
- Kirby, M. Understanding the molecular diversity of GABAergic synapses. 5, 1-12 (2011).
- Harris, K. M., Weinberg, R. J., Verrall, A. W. Ultrastructure of Synapses in the Mammalian Brain. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , 1-30 (2012).
- Heise, C., et al. Selective Localization of Shanks to VGLUT1-Positive Excitatory Synapses in the Mouse Hippocampus. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, (2016).
- Peters, P. J., Yuan, L. C., Biology, C., Branch, M. Localization of TGN38 to the trans-Golgi network: involvement of a cytoplasmic tyrosine-containing sequence. Journal of Cell Biology. 120, 1123-1135 (1993).
- Antonini, D., et al. Tprg, a gene predominantly expressed in skin, is a direct target of the transcription factor p63. Journal of Investigative Dermatology. 128, 1676-1685 (2008).
- Burre, J., et al. Synaptic vesicle proteins under conditions of rest and activation: Analysis by 2-D difference gel electrophoresis. Electrophoresis. 27, 3488-3496 (2006).
- Kremer, T., et al. Mover is a novel vertebrate-specific presynaptic protein with differential distribution at subsets of CNS synapses. FEBS Letters. 581, 4727-4733 (2007).
- Ahmed, S., et al. Mover Is a Homomeric Phospho-Protein Present on Synaptic Vesicles. PLoS ONE. 8, (2013).
- Körber, C., et al. Modulation of Presynaptic Release Probability by the Vertebrate-Specific Protein Mover. Neuron. 87, 521-533 (2015).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. , 1-9 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, (2012).
- Schneider Gasser, E. M., et al. Immunofluorescence in brain sections: simultaneous detection of presynaptic and postsynaptic proteins in identified neurons. Nature Protocols. 1, 1887-1897 (2006).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , ACADEMIC PRESS. (2001).
- Sun, Y., Ip, P., Chakrabartty, A. Simple Elimination of Background Fluorescence in Formalin-Fixed Human Brain Tissue for Immunofluorescence Microscopy. Journal of Visualized Experiments. , 1-6 (2017).
- Poole, A. R., Dingle, J. T., Mallia, A. K. The localization of retinol-binding protein in rat liver by immunofluorescence microscopy. Journal of Cell Science. 394, 379-394 (1975).
