Summary
Hier beschreiben wir einen quantitativen Ansatz zur Bestimmung der Verteilung der synaptischen Protein im Verhältnis zu einer Marker Protein mit Immunfluoreszenz-Färbung, konfokalen Mikroskopie und Computer-basierte Analyse.
Abstract
Die Anwesenheit, Abwesenheit oder Ebenen der spezifischen synaptischen Proteine können synaptische Übertragung stark beeinflussen. Neben der Erläuterung der Funktion eines Proteins, ist es wichtig, auch die Verteilung bestimmen. Hier beschreiben wir ein Protokoll mit Immunfluoreszenz, konfokale Mikroskopie und Computer-basierte Analyse zur Bestimmung der Verteilung der synaptischen Protein Mover (auch TPRGL oder SVAP30 genannt). Wir vergleichen die Verteilung der Mover mit derjenigen der synaptischen Vesikel Protein Synaptophysin, wodurch Bestimmung der Verteilung der Mover in einer quantitativen Weise im Verhältnis zu der Fülle der synaptischen Vesikel. Insbesondere könnte möglicherweise diese Methode implementiert werden, um Vergleich der Verteilung von Proteinen mit verschiedenen Antikörpern oder Mikroskope oder über verschiedene Studien zu ermöglichen. Unsere Methode umgeht die inhärente Variabilität der immunofluorescent Verfärbungen durch nachgeben ein Verhältnis eher als absolute Fluoreszenz Ebenen. Darüber hinaus ermöglicht die Methode, die wir beschreiben die Forscher die Verteilung eines Proteins auf verschiedenen Ebenen zu analysieren: aus ganzen Gehirnscheiben in Gehirnregionen zu verschiedenen Teilregionen in einem Hirnareal, wie die verschiedenen Schichten des Hippocampus oder sensorische Cortex. Mover ist ein Wirbeltier-spezifische Protein, das synaptischen Vesikel zugeordnet ist. Mit dieser Methode zeigen wir, dass Mover Hirnareale mit hohem in der ventralen Troponema, septal Kerne und die Amygdala, und auch innerhalb einzelner Hirnareale, wie die verschiedenen Schichten des Hippocampus heterogen verteilt ist.
Introduction
Kommunikation zwischen den Nervenzellen geschieht an speziellen Kontaktstellen, die Synapsen genannt. Synapsen enthalten eine Vielzahl von verschiedenen Proteinen, die synaptische Übertragung zu orchestrieren. Einige dieser Proteine zeigen eine heterogene Verteilung im gesamten Nervensystem und sind nicht in jeder Synapse-1. Ein Beispiel für solche ein Protein ist Munc13, die Grundierung der synaptischen Vesikel beteiligt ist. Es gibt verschiedene Isoformen von Munc13, die das Gehirn2heterogen verteilt sind, und das Vorhandensein oder Fehlen von bestimmten Isoformen beeinflussen kann kurzfristige synaptische Plastizität und synaptischen Vesikel Dynamik3, 4 , 5. Daher ist es von entscheidender Bedeutung für das Vorhandensein von verschiedenen synaptischen Proteine in Hirnregionen identifizieren zu können.
Die Methoden der Wahl für die Quantifizierung der synaptischen Proteine - bis jetzt - sind Massenspektrometrie und Western Blot, anstatt Immunohistochemistry6,7,8,9. In einigen Fällen sind verschiedene Methoden zur Bewertung der Menge und die Lokalisierung von bestimmten Proteinen (d.h., Wilhelm Et Al. ergänzen 10). die Methode wir hier beschreiben ermöglicht die Lokalisierung und Quantifizierung von Proteinen ohne die Notwendigkeit der Verwendung biochemische Methode, einfach nur immunofluorescent Färbungen. Ein weiterer Vorteil hier ist, dass die Quantifizierung, über Flächen, die viel kleiner möglich ist und daher genauer als die durch andere Methoden erreicht. Man muss jedoch berücksichtigen, dass eine verlässliche Referenz-Protein benötigt wird, um die Verteilung des Proteins des Interesses zu beurteilen.
Fluoreszierende Färbung von Immunohistochemistry ermöglicht es uns, die routinemäßig die Lokalisierung der Proteine über Hirnareale sowie in verschiedenen neuronalen Kompartimenten identifizieren. Um die verschiedenen Fächer zu identifizieren, werden spezifische Marker verwendet. Antikörper gegen Wirbeltiere und Synaptophysin11 ist in der Regel lässt sich die synaptischen Vesikel zu kennzeichnen, während Antikörper gegen Fagott die aktive Zone einer präsynaptischen terminal12beschriften. Vesikuläre Transporter, z. B. die vesikuläre Glutamat-Transporter (vGluT) oder vesikuläre GABA-Transporter (vGAT), werden verwendet, um exzitatorischen13 und hemmenden14 präsynaptischen Klemmen bzw. beschriften. Auf der postsynaptischen Seite können Antikörper gegen das Protein Homer eingesetzt werden anlässlich der postsynaptischen Terminals und Antikörper gegen postsynaptischen Dichte Protein 95 (PSD95)15,16,17 oder Gephyrin18 , 19 , 20 können erregenden oder hemmenden postsynaptischen Terminals bzw. beschriften. Mithilfe von Antikörpern gegen ein Protein des Interesses und Markierungen wie oben beschrieben, kann man feststellen, die Lokalisierung von solchen Protein. Viele Studien bisher haben dies in einer qualitativen Weise21durchgeführt. Jedoch muss um die differenzierte Verteilung der ein bestimmtes synaptischen Protein zuverlässig zu bestimmen, nicht nur seine Anwesenheit oder Abwesenheit, sondern auch die relative Konzentration festgestellt werden. Die Heterogenität der Größe und Dichte der Synapsen ist es wichtig, ein Verhältnis zwischen dem synaptischen Marker und das Protein des Interesses zu etablieren. Andernfalls werden Synapse-reiche Regionen wie die nicht-pyramidale Schichten des Hippocampus und der molekularen Schicht des Kleinhirns zeigen eine hohe Dichte an synaptischen Proteine, nur aufgrund der höheren Dichte der Synapsen aber nicht aufgrund einer starken Präsenz von diesem Protein in Jede Synapse (z.B. Wallrafen und Dresbach1). Auf der anderen Seite zeigen Proteine in die neuronale Soma (z.B., TGN3822) in der Regel starken Präsenz im Hippokampus pyramidale Zellschicht oder hippocampal oder zerebelläre Granulat Zellschicht aufgrund der hohen Konzentration von neuronalen Zellkörpern in diesen Bereichen. Daher diese nicht-homogene Verteilung der Strukturen, in diesem Fall Synapsen, kann auf eine falsche Einschätzung der Verteilung des Proteins des Interesses selbst führen. Darüber hinaus gibt es eine intrinsische Veränderlichkeit in der Färbung Intensitäten über Proben in immunhistochemischen Färbungen. Das hier beschriebene Protokoll berücksichtigt dies und vermeidet solche Vorurteile, wie auch andere Einschränkungen, die durch immunhistochemischen Methoden entstehen.
In unserer letzten studieren, haben wir diese Methode um zu beschreiben, die differentielle Expression der Mover (auch genannt TPRGL23 SVAP3024) über 16 verschiedene Gehirn Bereiche1verwendet. Mover ist ein Wirbeltier-spezifischen synaptischen Protein, finden Sie im Verein zu synaptischen Vesikel und beeinflusst die Neurotransmitter-Freisetzung25,26,27. Wir haben den Mover-Ausdruck auf die Fülle der synaptischen Vesikel verwandt, durch Färbung für Synaptophysin als synaptischen Vesikel Referenz Marker. Hohes Maß an Mover fanden wir vor allem in der septal Kerne, die ventrale Troponema und der Amygdala. Im Hippocampus fanden wir eine heterogene Verteilung der Mover, mit einem hohen in den Schichten Intra-hippocampal Berechnung und niedrigen Niveau in Eingang und Ausgang Schichten zugeordnet.
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Protocol
Dieses Protokoll beinhaltet keine Experimente an lebenden Tieren. Experimente mit von Tieren Gehirn Proben erhalten euthanizing stimmten mit den lokalen Tierschutz Behörden (Tierschutzkommission der Universitätsmedizin Göttingen) unter der Zulassungsnummer T 10/30.
Hinweis: Für dieses Protokoll wurden 3 Erwachsene männlichen C57BL/6 Mäusen verwendet.
1. die Probenvorbereitung
- Bereiten Sie Fixiermittel und 0,1 M Phosphatpuffer (PB; siehe Tabelle 1).
- Befestigen Sie das Tier durch Transcardial Perfusion, wie Gage Et Al. beschrieben 28. Waschen Sie zuerst das Blut mit 0,9 % NaCl-Lösung, dann mit 30 mL 4 % Paraformaldehyd (PFA) durchspülen.
- Den Schädel mit einer Schere öffnen und das Gehirn mit einem Löffel mit stumpfen Kanten zu beschädigen das Gewebe vorsichtig zu isolieren.
- Füllen Sie eine 50 mL Reaktionsgefäß mit Fixativ und postfix das Gehirn bei 4 % PFA bei 4 ° C über Nacht.
- Entfernen Sie das Fixiermittel zu und waschen Sie das Gehirn in 50 mL 0,1 M PB auf einem Boston-Shaker für 30 min.
- Nach dem Waschen inkubieren Sie das Gehirn in ein 50 mL Reaktionsgefäß in 30 % Saccharose in 0,1 M PB für 48 h oder bis es in der Röhre bei 4 ° C für Cryoprotection sinkt.
- Das Cryoprotected Gehirn mit einer scharfen Klinge trimmen, legen Sie sie in ein Cryomold und Binde sie mit optimalen Arbeitstemperatur (OCT) Verbindung. Vermeiden Sie Luftblasen. Richten Sie das Gehirn und frieren Sie die Cryomold in den-80 ° C Gefrierschrank ein.
- Montieren Sie das gefrorene Gewebe für schneiden. Equilibrate das Gewebe auf die Cryomicrotome Temperatur für mindestens 15 Minuten vor dem Schneiden.
- Abschnitt des Gehirns in 25 µm Dicke koronalen Scheiben. Berühren Sie das Office-Anpassungstool sorgfältig mit einem Glas Haken ohne das Hirngewebe zu berühren. 3 angrenzende Scheiben pro Bohrloch in einer 24-well-Platte zu sammeln und aufbewahren in 0,1 M PB bei 4 ° C bis Färbung.
Hinweis: Das Protokoll kann hier bis zu zwei Wochen lang angehalten werden. Längere Lagerzeiten können die Gewebe-Qualität beeinträchtigen und somit Einfluss auf den Ausgang des Experiments.
(2) Immunfluoreszenz
- Bereiten Sie Lösungen einschließlich der blockierenden Puffer, Antikörper Puffer, Wasch-Puffer 1 und waschen Puffer 2 (siehe Tabelle 1).
- Spülen Sie Scheiben einmal mit PB, überschüssige OCT zu entfernen.
- Entfernen Sie die Lösung mit einer Pipette aus Kunststoff, ohne in den Gehirnscheiben saugen. Fügen Sie 250 µL frische PB mit einer 1000 µL Pipette.
Achtung: Scheiben sollte nicht austrocknen, also entfernen und Hinzufügen von Flüssigkeiten gut durch Brunnen.
- Entfernen Sie die Lösung mit einer Pipette aus Kunststoff, ohne in den Gehirnscheiben saugen. Fügen Sie 250 µL frische PB mit einer 1000 µL Pipette.
- Entfernen Sie den PB mit einer Kunststoff-Pipette und 250 µL blocking-Puffer pro Bohrloch mit einer 1000 µL Pipette. 3 h bei Raumtemperatur (RT) auf den Shaker inkubieren.
- Während der Inkubationszeit verdünnen Sie die primären Antikörper Antikörper Puffer in einem Reaktionsgefäß. Verwenden Sie 250 µL Antikörper Puffer pro Bohrloch und fügen Sie die entsprechende Menge des Antikörpers (siehe Tabelle 2) durch direkt in die Lösung mit einer 2 µL Pipette pipettieren. Mischen Sie die Lösung, indem Sie sanft nach oben und unten mehrmals pipettieren. Vortex kurz danach um die richtige Mischung zu gewährleisten.
Hinweis: Um die Hintergrundfluoreszenz zu bestimmen, sollten Verfärbungen auch durchgeführt werden ohne Zugabe von den primären Antikörper. Dafür inkubieren Sie die Scheibe in Antikörperlösung ohne primäre Antikörper nach dem Protokoll. - Entfernen Sie nach der Inkubationszeit den blockierenden Puffer mit einer Pipette aus Kunststoff zu und fügen Sie 250 µL Antikörperlösung mit primären Antikörper pro Bohrloch. Inkubieren Sie Scheiben mit primären Antikörper über Nacht bei 4 ° C in einen Shaker geben.
- Am nächsten Tag waschen Sie die Scheiben mit Waschpuffer 1 3 X für 10 min bei RT in einen Shaker geben.
- Entfernen Sie das Medium mit einer Kunststoff-Pipette und fügen Sie 300 µL Waschpuffer 1 pro Bohrloch. 10 min. Wiederholen Sie 3-Mal bei RT inkubieren.
- Während die Waschschritte Verdünnen der Fluorophor-gekoppelten Sekundärantikörper in Antikörper-Puffer in einem Reaktionsgefäß. Verwenden Sie 250 µL Antikörper Puffer pro Bohrloch und fügen Sie die entsprechende Menge des Antikörpers (siehe Tabelle 2) durch direkt in die Lösung mit einer 2 µL Pipette pipettieren. Mischen Sie die Lösung, indem Sie sanft nach oben und unten mehrmals pipettieren. Vortex kurz danach um die richtige Mischung zu gewährleisten.
Achtung: Da die Antikörper lichtempfindlich sind, müssen alle Schritte von diesem Zeitpunkt an im Dunkeln durchgeführt werden. - Nach der Waschschritte, entfernen Sie das Waschen Puffer mit einer Pipette aus Kunststoff und fügen Sie 250 µL Antikörperlösung mit Sekundärantikörper pro Bohrloch. Inkubieren Sie die Scheiben mit Sekundärantikörper für 90 min bei RT in der Dunkelheit.
- Waschen Sie die Scheiben mit Waschpuffer 2 3 X für 10 min bei RT
- Während die Waschschritte verdünnen Sie 4 ', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) in 0,1 M PB in einer Konzentration von 1: 2000.
- Entfernen Sie waschen-Puffer 2 mit einer Pipette aus Kunststoff zu und fügen Sie 250 µL DAPI-Lösung pro Bohrloch. 5 min bei RT auf den Shaker inkubieren.
- Entfernen Sie die DAPI-Lösung mit einer Pipette aus Kunststoff und fügen Sie 500 µL 0.1 M PB pro Bohrloch mit einer 1000 µL Pipette.
- Montieren Sie Scheiben auf Objektträger.
- Legen Sie einen Objektträger unter das Stereoskop. Tropfen Sie mit einem feinen Pinsel drei separate 0,1 M PB auf der Folie. Legen Sie eine Scheibe pro Tropfen auf dem Objektträger.
- Verwenden Sie die feinen Pinsel zu glätten und die Scheiben auf den Objektträger zu orientieren.
- Wenn alle Scheiben richtig positioniert sind, überschüssige PB mit einem Tuch entfernen und die Folie vorsichtig abtrocknen.
Achtung: Vermeiden Sie die Gehirnscheiben vollständig trocknen. - Fügen Sie 80 µL Medium auf der Folie einbetten. Setzen Sie vorsichtig das Deckglas auf der Folie, dadurch die Gehirnscheiben einbetten.
- Die Folien in der Dunstabzugshaube für 1-2 Std. trocknen lassen (decken, um Lichteinfall zu vermeiden) und speichern sie in einer Mikroskop-Folie-Box bei 4 ° C.
Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden.
(3) Bildgebung
- Nachdem das einbettende Medium vollständig ausgehärtet ist, legen Sie Objektträger unter confocal Mikroskop.
Hinweis: Epifluoreszenz Mikroskopie in Kombination mit Dekonvolution Software sollten ähnliche Bildqualität liefern. - Einstellungen Sie die Laser-durch erhöhen oder verringern die Laserstärke für jeden Kanal, so dass einige Pixel überbelichtet sind, um maximale Verteilung der Grauwerte zu gewährleisten.
- Virtuelle Gewebe des gesamten Gehirns Slice für die verschiedenen Kanäle zu erwerben.
- In der imaging-Software (siehe Tabelle der Materialien), wählen Sie die Fliesen und die Gehirn-Scheibe mit der Fliese Region Setupmanuell abzugrenzen.
- Verteilen Sie Stützpunkte in der gesamten Region Fliese und stellen Sie den Fokus für die verschiedenen Stützpunkte durch drücken Bestätigen Fliese Regionen/Positionen...
- Passen Sie die Einstellungen im Akquisitionsmodus entsprechend die gewünschte Auflösung und Größe des resultierenden Bildes und starten Sie den Scanvorgang.
- Wenn der Scan abgeschlossen ist, verwenden Sie die Stitching -Funktion um das virtuelle Gewebe verarbeiten. Exportieren Sie die Datei als TIF mit der Funktion Bild exportieren.
(4) Computer-basierte Analyse
- Laden Sie alle einzelne Kanäle für ein Bild in Fidschi29 , indem Datei | Offene.
- Beschreiben Sie mit dem Freihand-Auswahl -Werkzeug eine Hemisphäre im DAPI-Kanal. Erstellen Sie eine Maske der Auswahl durch Klicken auf Bearbeiten | Auswahl | Maske erstellen.
- Bestimmen der mittleren Fluoreszenzintensität für die einzelnen Kanäle (Mover und Synaptophysin) indem Sie auf analysieren | Maßnahme.
Hinweis: Sollten Sie die verschiedenen Kanäle zur Bestimmung der mittleren Fluoreszenz Intensitätswerte für jeden Kanal auswählen. - Kopieren Sie die mittlere Fluoreszenzintensität für die einzelnen Kanäle in ein Arbeitsblatt.
- Bestimmen Sie die mittlere Fluoreszenzintensität für die einzelnen Kanäle auf einer Fläche von Interesse durch Abgrenzung der Gegend auch mit dem Freihand-Auswahl -Werkzeug. Verwenden Sie einen Maus-Gehirn-Atlas als Referenz.
- Wiederholen Sie die Schritte 4.1-4.5 für alle Hemisphären und alle Bereiche von Interesse.
Hinweis: Bestimmen die Werte für jede Hemisphäre separat, um später die Werte in einem Bereich von Interesse, dass in der Hemisphäre vergleichen (siehe Punkt 5.2).
5. Datenverarbeitung
- Für den Fall, dass die Hintergrundfluoreszenz hoch ist (siehe Diskussion), ein Hintergrundabzug kann erforderlich sein. Für das Bestimmen der mittleren Fluoreszenzintensität für den Slice verarbeitet ohne primären Antikörper gegen des Referenzproteins (hier: Synaptophysin) und subtrahieren Sie diesen Wert aus allen Werten für die Gehirnregionen und Hemisphären.
- Wenn die mittlere Fluoreszenz-Intensitäten für die einzelnen Kanäle für jede Hemisphäre und jedes Interessengebiet bestimmt wurden (siehe Tabelle 3), das Verhältnis von Mover zu Synaptophysin durch Dividieren den Wert für Mover durch den Wert für Synaptophysin (berechnen gelb in Tabelle 3). Führen Sie diese Aktion für jede Hemisphäre und jedes Interessengebiet getrennt.
- Teilen Sie das Verhältnis für ein Interessengebiet erhalten durch das Verhältnis für die entsprechenden Hemisphäre (Orange in Tabelle 3) erreicht wird, um das Verhältnis des Bereichs des Interesses an der Hemisphäre zu bestimmen.
- Um festzustellen, die relative Häufigkeit der Mover, übersetzen Sie das Verhältnis erwarb 5.2 in einen Prozentsatz durch die Bestimmung der Abweichung von 1 (rot in Tabelle 3). Ein Verhältnis von 1,25 würde daher eine relative Mover Fülle von 25 % über dem Durchschnitt, und ein Verhältnis von 0,75 würde ergeben eine relative Mover Fülle von 25 % unter dem Durchschnitt.
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Representative Results
Vertreter, die Muster der verschiedenen Markern Färbung ist in Abbildung 1ersichtlich. Das Muster ist abhängig von der Verteilung des Proteins. Beispiele für fünf Rostro-caudale Ebenen sind in Spalten (A)-(E). Eine repräsentative DAPI-Färbung zeigt sich in der ersten Reihe: DAPI hält sich an die DNA einer Zelle und somit Kerne gefärbt sind. Daraus resultiert eine punktförmige Muster. Regionen mit einer hohen Zelldichte sind heller als in Regionen mit niedrigen Zelldichten. In der zweiten Zeile ist ein Beispiel für ein heterogen verteilten Protein zu sehen. Die Mover Färbung zeigt eine differenzierte Verteilung im gesamten Gehirn, mit hellen Hotspot Bereiche und dimmer. In der dritten Zeile ist ein Beispiel für mehr homogen verteilten Referenz Marker Synaptophysin gezeigt. Eine Überlagerung der beiden Proteine (vierte Zeile) zeigt die unterschiedliche Verteilung der Mover (rot) im Vergleich zu den Marker Protein Synaptophysin (grün).
Abbildung 2 zeigt die Quantifizierung in Schritt 4 des Protokolls beschrieben. Dargestellt sind die mittlere Fluoreszenz Intensitätswerte für die verschiedenen Kanäle über die Halbkugeln (Mover, Abbildung 2A; Synaptophysin, Abbildung 2B) und in den Bereichen von Interesse (Mover, Abbildung 2C; Synaptophysin, Abbildung 2D). Um die Fülle der Mover im Verhältnis zur Anzahl der synaptischen Vesikel zu bestimmen, wird eine Verhältnis der Mover Fluoreszenz Werte in Synaptophysin Fluoreszenz Werte gebracht. Diese Verhältnisse für die Bereiche von Interesse sind in Abbildung 2Edargestellt und bieten bereits einen Hinweis auf die heterogene Verteilung der Mover, Gebiete mit hoher und niedriger Mover Ebenen relativ synaptischen Vesikel. Um zusätzlich die inhärente technische Variabilität auszugleichen, ist das Verhältnis in einem Bereich von Interesse (Abb. 2E) im Vergleich dazu in der Hemisphäre (nicht dargestellt) und übersetzt in einen Prozentsatz. Diese relative Mover Fülle (Abbildung 2F) gibt ein Maß dafür, wieviel Mover ist in einem Bereich von Interesse im Verhältnis zur durchschnittlichen vorhanden.
Wie bereits erwähnt, ist eines der großen Vorteile dieser Technik die Möglichkeit, die Fülle des Proteins des Interesses in sehr kleinen Bereichen, sogar Teilregionen und Schichten Bereiche von Interesse zu bestimmen. Ein Beispiel für diese Anwendung ist in Abbildung 3gezeigt wo die relative Häufigkeit der Mover für die verschiedenen Schichten in der Unterfelder des Hippocampus bestimmt war. Die Quantifizierung in den verschiedenen Schichten, dargestellt in Abbildung 3-D, Abbildung 3Fund Abbildung 3H entspricht die Schichten dargestellt in Abbildung 3C, Abbildung 3Eund Abbildung 3G, mit den entsprechenden Farben. Im Hippocampus Mover heterogen, im Vergleich zu synaptischen Vesikel in Schichten mit Intra-hippocampal Berechnung (d. h., die polymorphen Schicht der dentate Gyrus [DG], Stratum Radiatum, verbunden mit hoher Mover verteilt Lucidum Oriens von Cornu Ammonis 3 [CA3] und Stratum Radiatum und Oriens Cornu Ammonis 1 [CA1]), und niedrig in Input- und Output-Schichten (die inneren und äußeren molekulare Schicht der DG, die pyramidenförmige Zellschichten CA3 und CA1, und die Stratum Lacunosum-Moleculare der CA1).
Abbildung 1 : Repräsentative Immunfluoreszenz Bilder von DAPI (erste Reihe), Mover (zweite Zeile), Synaptophysin (dritte Zeile), und ihre überlagern (vierte Zeile, Mover in rot, Synaptophysin in grün) auf 5 Rostro-kaudalen Ebene (A-E). Bereiche von Interesse sind in der oberen Reihe der Platten grau schattiert. M1, primären motorischen Kortex; IoC, Inseln Calleja; ACC, anterioren cingulären Cortex; SNu, septal Kerne; VPa, ventrale Troponema; NuA, Nucleus Accumbens; CP, caudatus Putamen; S1, primären somatosensorischen Cortex; HC, Hippocampus; Bin, Amygdala; MHa, mediale Habenulae; PAG, periaquäduktales grau; SN, Substantia Nigra; VTA, ventrale Haubengebiet; MLC, molekulare Schicht des Kleinhirns; GLC, Körnerschicht des Kleinhirns. Maßstabsleiste = 500 µm. Diese Zahl wurde von Wallrafen und Dresbach1geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Quantifizierung der Mover Verteilung über 5 Ebenen Rostro-kaudalen. Meine Fluoreszenzintensität von der Mover (A) und Synaptophysin Signal (B) auf den verschiedenen Ebenen. Meine Fluoreszenzintensität von der Mover (C) und Synaptophysin-Signal (D) auf 16 manuell abgegrenzte Hirnregionen. (E) Verhältnisse der Mover und Synaptophysin in 16 Hirnareale von Interesse. (F) Quantifizierung der relativen Fülle Mover, Mover/Synaptophysin-Verhältnis bei der jeweiligen Region auf das Verhältnis der entsprechenden Hemisphäre zu vergleichen. M1, primären motorischen Kortex; IoC, Inseln Calleja; ACC, anterioren cingulären Cortex; SNu, septal Kerne; VPa, ventrale Troponema; NuA, Nucleus Accumbens; CP, caudatus Putamen; S1, primären somatosensorischen Cortex; HC, Hippocampus; Bin, Amygdala; MHa, mediale Habenulae; PAG, periaquäduktales grau; SN, Substantia Nigra; VTA, ventrale Haubengebiet; MLC, molekulare Schicht des Kleinhirns. Schwarze Punkte repräsentieren einzelne Datenpunkte. Balken zeigen den Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwertes (SEM). Diese Zahl wurde von Wallrafen und Dresbach1geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Mover-Verteilung in der Maus Hippocampus. Immunfluoreszenz-Färbungen der koronalen Scheiben des Hippocampus Maus. Übersicht des Hippocampus zeigt das heterogene Mover Expressionsmuster (A) und die entsprechenden Synaptophysin Färbung (B). Die drei Regionen von Interesse (DG, Abbildung 3C; CA3, Abbildung 3E; CA1, Abbildung 3G) sind durch weiße gepunktete Linien abgegrenzt. (D,F,H) Quantifizierung, Vergleich das Verhältnis in den jeweiligen Schichten auf das Verhältnis der entsprechenden Hemisphäre. Die Farben in die Balkendiagramme entsprechen den jeweiligen Schattierung in Platten, C, Eund G. Mover Ausdruck ist in Zusammenhang mit Intra-hippocampal Berechnung (d.h. die polymorphen Schicht der DG, Stratum Radiatum, Lucidum und Oriens CA3, und Stratum Radiatum und Oriens CA1) und niedrig in den wichtigsten Eingang und Ausgang Schichten (die Stufen hoch Innere und äußere molekulare Schicht der DG, die pyramidenförmige Zellschichten CA3 und CA1, und das Stratum Lacunosum-Moleculare der CA1). OML, molekulare Außenschicht; IML, innere molekulare Schicht; GrL, Körnerschicht; PmL, polymorphen Schicht/Hilus; Ja, Stratum Oriens; Spion, Stratum Pyramidale; SLu, Stratum Lucidum; SR, Stratum Radiatum; SLM, Stratum Lacunosum-Moleculare. Maßstabsleiste = 500 µm. schwarze Punkte repräsentieren einzelne Datenpunkte. Balken zeigen den Mittelwert ± SEM Diese Zahl wurde von Wallrafen und Dresbach1geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Tabelle 1: Lösungen in diesem Protokoll verwendeten.
Tabelle 2: In diesem Protokoll verwendeten Antikörper.
Tabelle 3: Beispiel für den Umgang mit Daten.
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Discussion
Hier präsentiert die Methode zielt darauf ab die Verteilung eines Proteins des Interesses im Verhältnis zu der Fülle von einem Marker Protein mit einer bekannten Verteilung zu quantifizieren. Immunfluoreszenz-Färbung zeigen eine hohe Variabilität der Färbung Intensitäten zwischen verschiedenen Scheiben. Die Quantifizierung der hier beschriebene Ansatz umgeht dieses Problem durch das Verhältnis des Proteins des Interesses an den Durchschnitt in der Hemisphäre zu bestimmen. Daher verschiedenen befleckenden Intensitäten über Scheiben sind zunichte gemacht und ermöglichen eine quantitative Beschreibung.
Wie mit jedem Immunfluoreszenz-Protokoll, qualitative oder quantitative, können mehrere Faktoren beeinflussen den Erfolg und damit verwirren die Analyse. Wichtige Schritte des Protokolls sollte daher besondere Aufmerksamkeit geschenkt werden. Erstens braucht man eine korrekte Fixierung des Gewebes. Diese Fixierung kann in der Regel durch eine erfolgreiche Transcardial Perfusion erreicht werden. Die Qualität der Durchblutung kann durch Überprüfung der Leberzellkrebs kurz nach dem Waschen das Blut überprüft werden. Ein erster Indikator für eine erfolgreiche Perfusion ist die Rodung von der Leber und der Extremitäten28. Das Vorhandensein von Blutgerinnseln kann zeigen, dass die Perfusion hätte zu langsam sein und das nächste Mal schneller durchgeführt werden sollte. Einige Proteine erfordern unterschiedliche Fixierung Protokolle, wie chemische Fixierung mit PFA Epitop Blockade30verursachen kann. In diesem Fall Freeze Fixierung oder Fixierung mit einer anderen Chemikalie, wie Methanol, zu berücksichtigen. Zweitens nach schneiden ist es wichtig, die Gehirnscheiben als schnell wie möglich, vorzugsweise auf demselben oder auf das nächste Wort zu beflecken. Längerer Lagerung in PB führen für bakterielle Infektionen und unter Zugabe von NaN3 kann dies zu einem gewissen Grad verhindern, die Gewebe-Qualität verschlechtert sich in der Regel mit Lagerzeit. Drittens: während das Färbeverfahren ist es wichtig, Waschschritte gut durch gut um zu vermeiden, Trocknen der Scheiben führen. Wenn die Scheiben trocknen, Hintergrundfluoreszenz erhöhen und dadurch eine Verzerrung in der Analyse. Viertens: nach Anwendung des sekundären Antikörpers ist es wichtig, alle folgenden Schritte im Dunkeln. Die Fluorophore sind lichtempfindlich und Belichtung kann das Fluoreszenzsignal stark verzerren.
Die Optimierung der Färbeverfahren, einschließlich der Auswahl der angemessenen primäre und sekundäre Antikörper, optimale Antikörperkonzentration und Expositionszeit, ist eine Voraussetzung, das beste Signal-Rausch-Verhältnis zu erreichen und eine zuverlässige Durchführung Immunfluoreszenz quantitative Analyse. Antikörper in k.o.-Gewebe überprüft sollte die bevorzugte Wahl, wenn auch nicht immer verfügbar sein. Immer darauf achten Sie, ordnungsgemäße Kontrolle Experimente um Übersprechen zwischen verschiedene Antikörper auszuschließen. Die Höhe der Hintergrundfluoreszenz aus Autofluoreszenz und unspezifische Bindung des sekundären Antikörpers abgeschätzt werden durch bildgebende die Scheiben in denen primäre Antikörper nicht angewendet wurde. Es ist nicht trivial, um festzulegen, wie viel höher die Intensität des Signals müssen im Vergleich zu den Hintergrund für ein akzeptables Signal-Rausch-Verhältnis haben. Jedoch würde basierend auf empirischen Beobachtungen, die Autoren vorschlagen, mit dem Ziel, nachdem ein Signal mindestens 2-fach stärker als Hintergrund, um die Proteinverteilung zuverlässig abschätzen zu können. Für den Fall, dass die Hintergrundfluoreszenz in Kontrolle Bedingungen (ohne die Anwesenheit des primären Antikörpers) hoch ist, sollte die durchschnittliche Hintergrundfluoreszenz von Experiment Bilder abgezogen werden.
Der große Vorteil unseres Ansatzes ist die interne Referenz: die Immunfluoreszenz-Intensität des Zielproteins (d.h., Mover) in einer Region von Interesse ist im Vergleich zu einer Referenz-Marker (d.h., Synaptophysin) und die Gesamtintensität des Diese Proteine in der gesamten Hemisphäre. So aus der Berechnung, die wir durchführen, kann man eindeutig feststellen, dass die Fülle des Zielproteins X Falten höher/niedriger in einer bestimmten Region des Interesses als die Fülle des Referenzproteins bezogen auf die Verteilung der Proteine über die gesamten Hemisphäre auf dieser Ebene relativ Bregma31. Dies ermöglicht den Vergleich der Ergebnisse mit verschiedenen Antikörpern, verschiedene Mikroskope oder sogar über verschiedene Studien. Diese Konsistenz über verschiedene Proben kommt aus der vergleichenden Natur dieser Methode: Variabilität wird kompensiert, indem man das Verhältnis zwischen der Fluoreszenz in den gewünschten Bereich und derjenigen der Hemisphäre. Daher sind Unterschiede in absoluten Werten aus technischen Unterschiede zunichte gemacht. Ein weiterer großer Vorteil dieser Technik ist die Tatsache, die die Bereiche von Interesse, so klein sein können, wie Sie nur durch die Auflösung des Mikroskops begrenzt werden, sollen. Quantifizierung der Protein-Ebene mit biochemischen Methoden, erfordert zum Beispiel Western Blot oder Massenspektrometrie6,7,8,9, eine Dissektion des Gewebes in den Bereich von Interesse. Diese Zerlegung ist schwer für Regionen des Gehirns, wie die primären somatosensorischen Cortex und wird praktisch unmöglich, wenn Teilbereiche, wie die verschiedenen Schichten der Rinde oder im Hippocampus anstreben.
Eine Einschränkung des Ansatzes ist, dass die verschiedenen Ebenen im Gehirn direkt mit einander verglichen werden können. Halbkugeln mit vielen Regionen, die reich an die Protein des Interesses haben einen anderen durchschnittlichen Wert als Halbkugeln mit nur wenigen Protein-reiche Regionen. Werte von 20 % über dem Durchschnitt, werden daher beispielsweise eine unterschiedliche absolute Menge des Proteins in einer Ebene im Vergleich zu Bregma im Vergleich zu eine zweite widerspiegeln. Man muss auch daran denken, die diese Methode der Bestimmung der absoluten Proteingehalte, nur die relative Häufigkeit im Vergleich zu der internen Referenz-Marker und dem Durchschnitt in der Hemisphäre nicht zulässt.
Diese Methode kann leicht an die Verteilung des Proteins des Interesses bezogen auf Marker für verschiedene neuronale Fächer, nicht nur präsynaptischen Websites zu bestimmen sein. Es kann auch für Gewebe als das Gehirn und - mit geeigneten Antikörper - andere Modellsysteme als Mäuse32,33leicht angepasst werden. Während die Verwendung eines konfokalen Mikroskops die Autoren Methode der Wahl ist, sollte eine Kombination aus Epifluoreszenz Mikroskopie und Dekonvolution Software liefern die gleichen Datenqualität und erweitern somit die Nutzbarkeit des Protokolls. Darüber hinaus können die gleichen Färbungen zur die subzelluläre Verteilung, zum Beispiel mit Höchstauflösung Mikroskopie herangezogen werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir danken Irmgard Weiss für ausgezeichnete technische Unterstützung. Die Autoren erkennen Unterstützung durch Hermes Pofantis und Andoniya Petkova. Die Autoren danken auch das European Neuroscience Institute für die Nutzung der LSM800 und technische Hilfe, vor allem von Dr. Nils Halbsgut. Diese Arbeit wurde von der University Medical Center Göttingen finanziert. JSV erkennt Unterstützung durch die Mitte für Nanoscale Mikroskopie und molekulare Physiologie des Gehirns (CNMPB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL reaction tubes | Eppendorf | 30120094 | |
| 50 mL reaction tubes | Greiner Bio-One | 227261 | |
| multiwell 24 well | Fisher Scientific | 087721H | |
| plastic pipette (disposable) | Sarstedt | 861,176 | |
| 1000 mL pipette | Rainin | 17014382 | |
| 2 ml pipette | Eppendorf | 3123000012 | |
| Vortex Genius 3 | IKA | 3340001 | |
| Menzel microscope slides | Fisher Scientific | 10144633CF | |
| Stereoscope | Leica | ||
| LSM800 | Zeiss | Confocal microscope | |
| freezing microtome | Leica | ||
| PBS (10X) | Roche | 11666789001 | |
| PFA | Sigma | P6148-1kg | |
| NaCl | BioFroxx | 1394KG001 | |
| sucrose | neoFroxx | 1104KG001 | |
| Tissue Tek | Sakura | 4583 | OCT |
| Na2HPO4 | BioFroxx | 5155KG001 | |
| NaH2PO4 | Merck | 1,063,460,500 | |
| normal goat serum | Merck Millipore | S26-100ML | |
| normal donkey serum | Merck | S30-100ML | |
| Triton X-100 | Merck | 1,086,031,000 | |
| rabbit anti-Mover | Synaptic Systems | RRID: AB_10804285 | |
| guinea pig anti-Synaptophysin | Synaptic Systems | RRID: AB_1210382 | |
| donkey anti-rabbit AF647 | Jackson ImmunoResearch | RRID: AB_2492288 | |
| goat anti-mouse AF488 | Jackson ImmunoResearch | RRID: AB_2337438 | |
| Mowiol4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| ZEN2 blue software | Zeiss | Microscopy software | |
| FIJI | ImageJ | Analysis software | |
| Microsoft Excel | Microsoft |
References
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