Summary
Burada, bir sinaptik protein ayirt boyama kullanarak işaret protein, confocal mikroskobu ve bilgisayar tabanlı analiz göre dağılımını belirlemek için nicel bir yaklaşım açıklar.
Abstract
Ciddi varlığı, yokluğu veya belirli sinaptik proteinlerin seviyeleri sinaptik iletimi etkisi altına alabiliyor. Işlev bir protein elucidating ek olarak, ayrıca dağılımı belirlemek için önemlidir. Burada, biz istihdam ayirt, confocal mikroskobu ve sinaptik protein (TPRGL veya SVAP30 olarak da adlandırılır) taşıyıcı dağılımını belirlemek için analiz bilgisayar tabanlı bir protokol tanımlamak. Biz taşıyıcı dağıtım sinaptik vezikül protein synaptophysin olan için böylece sinaptik veziküller bolluk göre nicel bir şekilde hareket ettirmek dağıtımını belirleme karşılaştırın. Özellikle, bu yöntem dağıtım farklı antikorlar veya mikroskoplar kullanarak proteinlerin veya farklı çalışmalar arasında karşılaştırılması için izin vermek için potansiyel olarak uygulanabilir. Bizim Yöntem immünfloresan stainings doğasında değişkenliği mutlak floresans düzeyleri yerine bir oranı verimli kaçınmanızı sağlar. Ek olarak, farklı düzeylerde bir proteinin dağıtım analiz etmek araştırmacı tarif yöntemi sağlar: beyin bölgeleri için farklı katmanları oluşur veya duyusal gibi bir beyin alanına farklı milletlere dilimlere tüm beyin üzerinden cortices. Taşıyıcı sinaptik veziküller ile ilişkili bir omurgalılar özgü proteindir. Bu yöntemle, gösterdiğimiz taşıyıcı heterogeneously yüksek seviyelerde ventral yarayan, septal çekirdekleri ve amigdala ve hipokampus farklı katmanları gibi tek beyin bölgeleri içinde beyin bölgeleri arasında dağıtılır.
Introduction
Sinir hücreleri arasındaki iletişimi sinapslarda denilen özel kişi sitelerinde olur. Sinapsların sayısız sinaptik iletimi yönetmek farklı protein içerir. Bazı bu proteinlerin sinir sistemi boyunca heterojen bir dağılımını göstermek ve her synapse1' mevcut değildir. Bir tür bir protein için sinaptik veziküller astar sürece dahil Munc13 örnektir. Heterogeneously beyin2dağıtılır, Munc13, ve farklı izoformlarının vardır ve belirli izoformlarının olup kısa vadeli sinaptik plastisite ve sinaptik vezikül dynamics3, üzerinde etkili olabileceği 4 , 5. bu nedenle, beyin bölgeleri arasında farklı sinaptik proteinlerin varlığı tespit edebilmek için hayati önem taşıyor.
Seçim yöntemleri için miktar sinaptik proteinler - defa - kütle spektrometresi ve Western blot yerine, immünhistokimya6,7,8,9vardır. Bazı durumlarda, miktar ve spesifik proteinlerin (yani, Wilhelm ve ark. lokalizasyonu değerlendirmek için birbirlerini tamamlayıcı için çeşitli yöntemler kullanılır 10). miktar ilgi sadece immünfloresan stainings istihdam biyokimyasal herhangi bir yöntem kullanarak gerek kalmadan proteinlerin ve yerelleştirme için biz tarif işte yöntem sağlar. Başka bir avantaj burada miktar çok daha küçük bir alana yapılabilir ve bu nedenle, daha belirgin, bu daha başka yöntemlerle elde var. Ancak, bir güvenilir referans protein faiz protein dağılımı değerlendirmek gerektiğini dikkate almak zorunda.
Floresan immünhistokimya tarafından boyama yerelleştirme proteinlerin beyin bölgeleri arasında yanı sıra farklı nöronal bölmeleri içinde düzenli olarak tanımlamak için bize izin verir. Farklı bölmeleri tanımlamak için belirli işaretleri kullanılır. Genellikle, synapsin ve synaptophysin11 karşı antikor Fagot karşı antikor presynaptic terminal12etkin bölgenin etiket iken sinaptik veziküller, etiketlemek için kullanılabilir. Veziküler glutamat taşıyıcılar (vGluT) veya veziküler GABA ışınlama (vGAT), gibi veziküler taşıyıcılar13 eksitatör ve inhibitör14 presynaptic terminalleri, sırasıyla etiketlemek için kullanılır. Postsinaptik tarafında, Homer protein karşı antikor postsinaptik terminalleri ve postsinaptik yoğunluğu protein 95 (PSD95)15,16,17 veya gephyrin18 karşı antikor işaretlemek için istihdam edilebilir , 19 , 20 eksitatör veya inhibitör postsinaptik terminalleri, sırasıyla etiketleyebilirsiniz. Faiz ve işaretleri yukarıda açıklanan olanlar gibi bir protein karşı antikor kullanarak, bir tür protein lokalizasyonu belirleyebilirsiniz. Bugüne kadar birçok çalışma bu nitel şekilde21' yaptık. Ancak, güvenilir bir şekilde belirli bir sinaptik protein fark dağılımını belirlemek için biri sadece varlığını veya yokluğunu aynı zamanda onun göreli yoğunlaşmasını belirlemeniz gerekir değil. Sinapsların yoğunluğu ve boyutları heterojen sinaptik marker ve faiz protein arasındaki oran kurmak önemli hale getirir. Aksi takdirde, sinaps zengini bölgeleri hipokampüs piramit katmanları ve beyincik moleküler tabakası gibi yüksek yoğunluklu sinaptik proteinlerin, sinapslarda daha yüksek yoğunluk nedeniyle sadece ama bu proteinin güçlü bir varlığı nedeniyle değil gösterecektir Her synapse (Örneğin, Wallrafen ve Dresbach1). Öte yandan, nöronal soma (Örneğin, TGN3822) proteinler genelde güçlü bir varlık hipokampal piramit hücre katmanı veya hipokampal veya serebellar granül hücre katmanı nöronal hücre gövdeleri yüksek konsantrasyon nedeniyle gösterir Bu alanlarda. Bu nedenle, homojen olmayan bu dağıtım yapıları, bu durumda synapses, faiz kendisi protein dağıtımını yanlış bir tahmin için yol açabilir. Ayrıca, bir içsel değişkenlik immunohistokimyasal stainings örnekleri arasında yoğunluklarda boyama olduğunu. Burada açıklanan protokol bu dikkate alır ve immunohistokimyasal yöntemleri ortaya çıkan diğer uyarılar yanı sıra böyle önyargıları önler.
Bizim son çalışma, 16 farklı beyin alanları1arasında bu yöntem biz (TPRGL23 veya SVAP3024da denir) taşıyıcı fark ifade tanımlamak için kullanılan. Taşıyıcı Derneği sinaptik veziküller bulunabilir ve nörotransmitter yayın25,26,27etkiler, omurgalılar özgü sinaptik proteindir. Biz taşıyıcı ifade sinaptik veziküller, bereket için synaptophysin bir sinaptik vezikül başvuru işaretçisi olarak için boyama ile ilgili. Özellikle septum nükleuslar, ventral yarayan ve amigdala Mover yüksek düzeyde bulduk. Hippocampus içinde taşıyıcı, türdeş olmayan bir dağıtım içi hipokampal hesaplama ve giriş ve çıkış katmanları düşük düzeyleri ile ilgili katmanlarında yüksek seviyelerde bulduk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu iletişim kuralı canlı hayvanlar üzerinde deneyler anlamına gelmez. Hayvanların beyin örneklerini almak için ötenazi ile ilgili deneyler onay numarası altında T 10/30 (Tierschutzkommission der Universitätsmedizin Göttingen) yerel hayvan koruma yetkilileri tarafından kabul edildi.
Not: Bu iletişim kuralı için 3 Yetişkin erkek C57BL/6 fareler kullanıldı.
1. numune hazırlama
- Sabitleştirici ve 0.1 M fosfat tampon (PB; bkz: Tablo 1) hazırlayın.
- Hayvan transcardial perfüzyon tarafından Gage ve ark. içinde açıklandığı gibi tamir 28. 0,9 kanla önce yıkayın % NaCl-çözüm, sonra %4 paraformaldehyde (PFA) ile 30 mL sıvı.
- Kafatası makasla açın ve dikkatle doku zarar görmesini önlemek için künt kenarları olan bir kaşık kullanarak beyin yalıtır.
- 50 mL tepki tüp sabitleştirici ile doldurun ve % 4 beyinde postfix PFA gecede 4 ° C'de.
- Sabitleştirici kaldırmak ve 50 mL 0.1 M PB bir shaker 30 dk için üzerinde beyin yıkama.
- Yıkandıktan sonra 0.1 M PB 48 h ya da cryoprotection için 4 ° C'de tüp içinde batmadan kadar % 30 sükroz 50 mL tepki tüpte beyinde kuluçkaya.
- Cryoprotected beyin keskin bir bıçak ile kesme, bir cryomold içinde yer ve en iyi kesim ısı ile (OCT) bileşik embed. Bubbles kaçınmak. Beyin yönlendirmek ve cryomold-80 ° C dondurucuda dondurma.
- Kesit için dondurulmuş doku bağlayın. Cryomicrotome sıcaklık en az 15 dakika için doku kesit daha önce equilibrate.
- Beyin 25 µm kalınlığında koronal dilimler halinde bölüm. OKT'yi dikkatle bir cam kanca ile beyin dokusu dokunmadan dokun. İyi bir 24 iyi plaka başına 3 bitişik dilim toplamak ve onları boyama kadar 0.1 M PB 4 ° C'de depolayın.
Not: Protokol burada iki haftaya kadar duraklatılmış. Uzun depolama süreleri doku kalitesi ile müdahale ve böylece denemenin sonucu etkiler.
2. ayirt
- Engelleme tampon, antikor arabellek, arabellek 1 ve çamaşır tampon (bkz. Tablo 1) 2 yıkama dahil olmak üzere çözümleri hazırlayın.
- Dilimleri bir kez aşırı OCT kaldırmak için PB ile yıkayın.
- Bir plastik pipet ile çözüm beyin dilimler halinde emme olmadan kaldırın. 1000 µL pipet ile taze PB 250 µL ekleyin.
Dikkat: Dilimleri gerektiğini kurumasına, yani kaldırmak ve sıvıları iyi şey ekleyin.
- Bir plastik pipet ile çözüm beyin dilimler halinde emme olmadan kaldırın. 1000 µL pipet ile taze PB 250 µL ekleyin.
- PB plastik pipet ile kaldırın ve engelleme arabelleği iyi 1000 µL pipet ile başına 250 µL ekleyin. Shaker üzerinde (RT) Oda sıcaklığında 3 h için kuluçkaya.
- Kuluçka süresi sırasında birincil antikor antikor arabellekte bir tepki tüp sulandırmak. İyi 250 µL antikor arabellek kullanıp antikor uygun miktarda ekleyebilirsiniz (bkz. Tablo 2) tarafından doğrudan 2 µL pipet kullanarak çözüm pipetting. Çözüm yavaşça yukarı ve aşağı birkaç kez pipetting tarafından karıştırın. Girdap kısa bir süre sonra uygun karıştırma sağlamak için.
Not: arka plan floresans belirlemek için stainings da birincil antikor eklemeden yapılmalıdır. Bunun için dilim olmadan protokolüne göre birincil antikor antikor çözümde kuluçkaya. - Kuluçka süresi sonra plastik pipet ile engelleme tampon kaldırın ve antikor çözüm iyi başına birincil antikorlar içeren 250 µL ekleyin. Gecede 4 ° C'de bir shaker üzerinde birincil antikor dilimlerle kuluçkaya.
- Ertesi gün, dilimleri tampon 1 3 yıkama ile yıkayın x 10 dk RT bir shaker üzerinde az için.
- Bir plastik pipet ile orta kaldırın ve, arabellek 1 şey yıkama 300 µL ekleyin. RT 10 dk. tekrar 3 kez için kuluçkaya.
- Çamaşır adımları sırasında fluorophore birleştiğinde ikincil antikor antikor arabellekte bir tepki tüp sulandırmak. İyi 250 µL antikor arabellek kullanıp antikor uygun miktarda ekleyebilirsiniz (bkz. Tablo 2) tarafından doğrudan 2 µL pipet kullanarak çözüm pipetting. Çözüm yavaşça yukarı ve aşağı birkaç kez pipetting tarafından karıştırın. Girdap kısa bir süre sonra uygun karıştırma sağlamak için.
Dikkat: antikorlar ışığa duyarlı olduğundan, bu andan itibaren tüm adımları karanlıkta gerçekleştirilmesi gerekir. - Sonra çamaşır adımları, çamaşır tampon plastik pipet ile ve antikor çözüm iyi başına ikincil antikorlar içeren 250 µL Ekle Kaldır. Karanlıkta RT, 90 dk için ikincil antikor dilimlerle kuluçkaya.
- Dilimleri tampon 2 3 yıkama ile yıkayın x 10 dk RT. az için
- Çamaşır adımları sırasında 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 0.1 M PB 1:2000 bir konsantrasyon içinde sulandırmak.
- Bir plastik pipet ile çamaşır tampon 2 kaldırın ve DAPI çözüm iyi başına 250 µL ekleyin. RT shaker üzerinde 5 min için kuluçkaya.
- Bir plastik pipet DAPI çözümle kaldırın ve 0.1 M PB iyi 1000 µL pipet ile başına 500 µL ekleyin.
- Dilimleri mikroskop slaytlarda bağlayın.
- Stereoscope altından bir mikroskop slayt yerleştirin. İyi bir fırça ile üç ayrı damla 0.1 M PB bir slayda ekleyin. Bir dilim başına damla mikroskop slayt üzerine yerleştirin.
- İnce fırça dümdüz ve mikroskop slaytta dilimleri yönlendirmek için kullanın.
- Bütün dilimleri doğru yerleştirilmiş durumda, bir doku ile aşırı PB kaldırmak ve slayt dikkatle kuru.
Dikkat: Beyin dilimleri tamamen kurutma önlemek. - Orta bir slayda katıştırma 80 µL ekleyin. Dikkatli bir şekilde coverslip bir slayda, böylece beyin dilimleri katıştırma indirin.
- Slaytlar için 1-2 h duman başlıklı kuru bırakın (ışığa maruz önlemek için kapak) ve 4 ° C'de bir mikroskop slayt kutusunda saklamak
Not: Protokol burada duraklatılmış.
3. görüntüleme
- Gömme orta tamamen sertleştirilmiş sonra mikroskop slayt confocal mikroskop altında yerleştirin.
Not: benzer görüntü kalitesi Epifluorescence mikroskopi deconvolution yazılımı ile kombine verim. - Lazer ayarlarını artıyor veya kaç piksel gri değerlerden en büyük dağıtım sağlamak için pozlanmış böylece her kanal için lazer şiddeti azalıyor.
- Tüm beyin dilimin farklı kanallar için sanal dokular elde etmek.
- Düşsel bilgisayar yazılımı içinde (bkz. Tablo reçetesi) fayans seçeneğini belirleyin ve el ile Döşeme bölge Kurile beyin dilim betimlemek.
- Destek puan kiremit bölgesi boyunca dağıtır ve Doğrulamak döşeme bölgeler/pozisyonlar... basarak farklı destek noktaları için odak ayarlamak
- İstediğiniz çözünürlük ve dosya boyutu ortaya çıkan görüntü göre Satın alma modu ayarlarını ve tarama başlatın.
- Tarama tamamlandığında, dikiş fonksiyonu sanal doku işlemek için kullanın. Olarak Görüntü vermeişleviyle bir .tif dosyasına.
4. bilgisayar tabanlı analiz
- Dosya tıklayarak FIJI29 bir resim tüm tek kanallarda yüklemek | Açık.
- Serbest seçim aracı ile DAPI kanaldaki bir yarımküre betimlemek. Düzen tıklatarak seçimi maskesi oluşturun | Seçimi | Maskesi oluşturma.
- Analiz tıklatarak tek kanal (taşıyıcı ve synaptophysin) için Ortalama floresans yoğunluğunu belirlemek | Ölçü.
Not: her kanal için Ortalama floresans yoğunluk değerleri belirlemek için farklı kanallar seçtiğinizden emin olun. - Ortalama floresans yoğunluğu tek kanallar için bir elektronik tabloya kopyalayın.
- Tek kanal bir ilgi alanı içinde ortalama floresans yoğunluk alan serbest seçim aracıyla aynı zamanda operasyona tarafından belirler. Bir fare beyin atlas başvuru olarak kullanın.
- 4.1 4.5 tüm hemisferlerin ve ilgi tüm alanları için yineleyin.
Not: daha sonra bir yarımküre buna ilgi alanı değerleri karşılaştırmak için her hemisphere değerlerini ayrı ayrı belirlemek (bkz. Adım 5.2).
5. veri işleme
- Arka plan floresans yüksek olması durumunda ( konuyabakın), bir arka plan çıkarma gerekli olabilir. Bunun için olmadan birincil antikor referans protein karşı işlenen dilim için Ortalama floresans yoğunluğunu belirlemek (burada: synaptophysin) ve bu değer için belgili tanımlık beyin bölgeleri ve hemisferlerin elde edilen tüm değerler den çıkarın.
- Ne zaman ortalama floresans yoğunluklarda her Yarımküre ve ilgi her alan için tek kanalları için tespit (bkz. Tablo 3) değeri taşıyıcı için synaptophysin () için değer bölünerek synaptophysin için taşıyıcı oranını hesaplama sarı Tablo3). Bu eylem her Yarımküre ve ilgi her alan için ayrı olarak gerçekleştirin.
- İlgi bir alan için elde edilen oranı Yarımküre için ilgi alanı oranını belirlemek için karşılık gelen Yarımküre (turuncu Tablo3) için elde oranla bölün.
- Göreli yol verici bereket belirlemek için onun sapma 1 ( Tablo 3' te kırmızı) belirlenerek yüzde 5,2 elde oranı çevirmek. 1,25 oranında bu nedenle ortalamanın üzerinde % 25 göreli bir taşıyıcı bereket vereceğini ve 0.75 oranında bir göreli yol verici bereket ortalamanın altında % 25 verim.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Boyama desenleri farklı imleyici temsilcisi Şekil 1' de görülebilir. Desen protein dağıtım bağlı olarak değişir. Beş rostro kaudal düzeyi örnekleri(a)sütunlarda gösterilir-(E). Bir temsilci DAPI boyama ilk satırında gösterilir: DAPI bir hücre DNA'yı bağlıdır ve böylece çekirdeklerin lekeli. Bu punctate bir düzen içinde sonuçlanır. Yüksek hücre yoğunluklu bölgelerde düşük hücre yoğunlukları ile daha parlak bölgeleridir. Bir örnek bir heterogeneously dağıtılmış protein için ikinci satırda görülebilir. Boyama Mover parlak hotspot alanları ve dimmer alanları olan beyin boyunca farklı bir dağıtım ortaya koymaktadır. Üçüncü sıradaki daha homojen dağıtılmış başvuru işaretçisi synaptophysin için bir örnek verilmiştir. Bir bindirme iki proteinlerin (Dördüncü satır) gösterir Mover fark dağılımı (kırmızı) işaretçisi protein synaptophysin (yeşil) göre.
Şekil 2 Protokolü'nün 4 adımda açıklanan miktar gösterir. Hemisferlerin (taşıyıcı, Şekil 2A; synaptophysin, Şekil 2B) ve (taşıyıcı, Şekil 2C; ilgi alanları arasında ortalama floresans yoğunluk değerleri farklı kanallar için gösterilmiştir synaptophysin, resim 2D). Sinaptik veziküller sayısına oranla Mover bereket belirlemek için bir oranı synaptophysin floresan değerleri için taşıyıcı floresans değerleri alınır. Bu oranları ilgi alanları için Şekil 2Egösterilir ve zaten sürüp sürmediğini Mover türdeş olmayan dağılımı sağlamak, alanları ile olan yüksek ve düşük taşıyıcı göreli olarak sinaptik veziküller düzeyleri. Ayrıca doğal teknik değişkenliği için telafi etmek için bir alanda ilgi (Şekil 2E) oranı (gösterilmez) Yarımküre kıyasla ve yüzde tercüme. Ne kadar hareket ettirmek ölçüsü bu göreli Mover bereket (Şekil 2F) verir ortalama faiz göreceli bir alanda mevcuttur.
Yukarıda belirtildiği gibi bu teknik büyük avantajlarından biri çok küçük alanlarda, hatta milletlere ve ilgi alanları katmanları arasında faiz protein bolluk belirlemek için yeteneğidir. Bu uygulama örneklerinden biri nerede göreli Mover bereket hipokampüs alt alanları farklı katmanlarda için tespit edilmiştir Şekil 3' te gösterilmiştir. Şekil 3D, Şekil 3Fve Şekil 3H gösterilen farklı katmanlarda miktar Şekil 3C, Şekil 3Eve gösterilen katmanlara karşılık gelir Şekil 3G, ile ilgili renklere. Hippocampus içinde taşıyıcı heterogeneously, sinaptik veziküller katmanlarında içi hipokampal hesaplama (yani, dentat gyrus [DG], stratum radiatum, polimorf tabakası ile ilişkili göreli olarak yüksek taşıyıcı ile dağıtılır Lucidium oriens, Cornu Ammonis 3 [CA3] ve stratum radiatum ve Cornu Ammonis 1 [CA1] oriens) ve düşük giriş ve çıkış katmanları seviyelerinde (DG, CA1, CA3 ve piramidal hücre katmanları iç ve dış moleküler tabakası ve Stratum lacunosum-moleculare, CA1).
Resim 1 : DAPI temsilcisi ayirt görüntüleri (ilk sıra), taşıyıcı (ikinci sırada), synaptophysin (3. sıra) ve onların (Dördüncü satır, yeşil kırmızı, synaptophysin taşıyıcı) 5 rostro kaudal düzeyleri (A-E) yerleşimi. İlgi alanları gri panellerin üst satırda gölgelendirilir. M1, birincil motor korteks; IOC, Calleja Adaları; ACC, anterior singulat korteks; SNu, septal çekirdeği; VPa, ventral yarayan; NuA, nucleus accumbens; CP, kaudat putamen; S1, birincil somatosensor korteks; HC, hipokampus; Dilerim, amigdala; MHa, medial habenula; PAG, periaqueductal gri; SN, gözlemliyorum nigra; VTA, ventral tegmental alan; MLC, beyincik moleküler tabakası; GLC, beyincik granüler tabaka. Ölçek çubuğu 500 µm =. Bu rakam Wallrafen ve Dresbach1ile değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Miktar 5 rostro kaudal düzeyleri arasında Mover dağılımı. Floresan yoğunluğu Taşıyıcı sinyal(a)ve (B) farklı düzeylerde synaptophysin sinyal demek. Floresan yoğunluğu Taşıyıcı sinyal (C) ve (D) synaptophysin sinyal 16 el ile belirlendi beyin bölgeleri demek. Taşıyıcı (E) oranları ve faiz 16 beyin alanlarında synaptophysin. Karşılık gelen Yarımküre oranı ilgili bölge taşıyıcı/synaptophysin oranı karşılaştırma (F) miktar göreli Mover bereket. M1, birincil motor korteks; IOC, Calleja Adaları; ACC, anterior singulat korteks; SNu, septal çekirdeği; VPa, ventral yarayan; NuA, nucleus accumbens; CP, kaudat putamen; S1, birincil somatosensor korteks; HC, hipokampus; Dilerim, amigdala; MHa, medial habenula; PAG, periaqueductal gri; SN, gözlemliyorum nigra; VTA, ventral tegmental alan; MLC, beyincik moleküler tabakası. Siyah noktalar tek veri noktalarını temsil eder. Çubukları (SEM) ortalama ortalama ± standart hatasını gösterir. Bu rakam Wallrafen ve Dresbach1ile değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Farenin hipokampus mover dağılımı. Farenin hipokampus koronal dilim ayirt stainings. Türdeş olmayan taşıyıcı ifade deseni(a)ve (B) boyama ilgili Synaptophysin gösterilen hipokampus genel bakış. Üç bölgeye ilgi (DG, Şekil 3C; CA3, Şekil 3E; CA1, Şekil 3G) beyaz noktalı çizgiler ile belirlendi. (D,F,H) Karşılık gelen Yarımküre oranı ilgili katmanlarında oranı karşılaştırma miktar. Çubuk grafikler renk panelleri C, Eve Gilgili gölgelendirme karşılık gelir. İçi hipokampal hesaplama (yani, DG, stratum radiatum, Lucidium ve oriens CA3, ve stratum radiatum ve CA1 oriens polimorf tabakası) ve düşük ana giriş - ve çıkış katmanları (ile ilgili düzeyleri taşıyıcı ifade yüksektir DG, CA1, CA3 ve piramidal hücre katmanları iç ve dış moleküler tabakası ve stratum lacunosum-moleculare, CA1). OML, dış Moleküler tabaka; IML, iç Moleküler tabaka; GrL, granüler tabaka; PmL, polimorf katman/hilus; Yani, stratum oriens; Casus, stratum pyramidale; SLu, stratum Lucidium; SR, stratum radiatum; SLM, stratum lacunosum-moleculare. Ölçek çubuğu = 500 µm. siyah noktalar temsil tek veri puan. Çubuklarını göster ortalama ± SEM Bu rakam Wallrafen ve Dresbach1ile değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Tablo 1: Bu protokol için kullanılan çözümler.
Tablo 2: Bu protokol için kullanılan antikor.
Tablo 3: Veri işleme örneği.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yöntemi burada sunulan bir protein göreli bir işaretleyici protein bolluğu ilgi dağılımıyla bilinen bir dağıtım miktarının amaçlamaktadır. Ayirt boyama boyama yoğunluklarda farklı dilimleri arasında yüksek bir değişkenlik gösterebilir. Burada açıklanan miktar yaklaşım Yarımküre protein ortalama faiz oranını belirleyerek bu sorunu kaçınmanızı sağlar. Bu nedenle, farklı boyama şiddetlerde dilimleri arasında iptal edilir ve nicel açıklamasını sağlar.
Her ayirt protokolü ile nitel veya nicel, çeşitli faktörler başarı etkiler ve böylece Analizi yıkmak. Bu nedenle, protokol kritik adımlar için özel dikkat edilmeli. İlk olarak, uygun bir doku fiksasyonu gereklidir. Bu fiksasyon genellikle başarılı transcardial perfüzyon tarafından elde edilebilir. Perfüzyon kalitesini kısa bir süre kan yıkadıktan sonra karaciğer denetleyerek doğrulayabilirsiniz. Başarılı bir perfüzyon bir ilk karaciğer ve ekstremitelerde28takas göstergesidir. Kan pıhtıları varlığı perfüzyon çok yavaş olabilir ve bir dahaki sefere daha hızlı gerçekleştirilmesi gerektiğini belirtebilirsiniz. PFA ile kimyasal fiksasyonu epitope tıkanıklık30neden olabilir bazı proteinler farklı fiksasyon iletişim kuralları gerektirir. Bu durumda, donma fiksasyon veya fiksasyonu gibi metanol, farklı bir kimyasal ile düşünülmelidir. İkinci olarak, kesit sonra beyin dilimler olarak mümkün olduğunca hızlı bir şekilde, tercihen aynı veya sonraki say leke için çok önemlidir. PB uzun depolama süre ekleyerek NaN3 bu bir ölçüde engelleyebilir, doku kalitesi genellikle depolama zamanla bozulur ve bakteriyel enfeksiyona yol açabilir. Üçüncü olarak, boyama işlemi sırasında bu dilim kurutma önlemek için çamaşır adımları iyi şey gerçekleştirmek önemlidir. Ne zaman dilimleri kurumasına, arka plan floresans artırmak ve böylece bir önyargı analizde neden. Dördüncü olarak, ikincil antikor uygulamadan sonra karanlıkta tüm aşağıdaki adımları gerçekleştirmek için hayati önem taşımaktadır. Fluorophores ışığa duyarlı ve pozlama ışık ağır floresans sinyal deforme edebilirsiniz.
Optimizasyonu boyama yordam yeterli birincil ve ikincil antikorlar, en uygun antikor konsantrasyon ve Fuar zaman, seçim dahil olmak üzere, en iyi sinyal-gürültü oranı elde etmek ve bir güvenilir taşımak için bir ön koşul olduğunu nicel ayirt analizi. Doku dışarı knock doğrulanmadı antikorlar tercih edilen seçim de olsa her zaman kullanılabilir durumda olmalıdır. Her zaman uygun denetim farklı antikorlar arasında çapraz karışma dışlamak için deneyler yerine getirdiğinizden emin olun. Arka plan floresan autofluorescence ve ikincil antikor belirsiz bağlama kaynaklanan miktarı içinde değil birincil antikor uygulandığı dilimleri görüntüleme tarafından tahmin edilebilir. Ne kadar daha yüksek yoğunluklarda sinyal zaman kabul edilebilir bir sinyal / gürültü oranına sahip olması için arka plana göre olması gerekir kurmak için önemsiz değil. Ancak, ampirik gözlemlere dayanarak, yazarlar protein dağıtım güvenilir bir şekilde tahmin etmek için en az 2 kat arka plan daha güçlü bir sinyal olması için amaçlayan öneririz. Arka plan Floresan (olmadan birincil antikor varlığı) Denetim koşullarında yüksek olması durumunda, ortalama arka plan floresans deney görüntülerden düşülen.
Onun iç başvuru yaklaşımımız temel avantajlarından birisidir: ayirt yoğunluk ilgi bir bölgede hedef protein (yani, taşıyıcı) bir referans işaretleyici (Örneğin, synaptophysin) ve genel yoğunluğu göre Bu proteinler arasında tüm Yarımküre. Böylece, biz gerçekleştirmek hesaplamadan bir tümden hedef protein bolluğu olduğunu sonucuna varabiliriz x proteinler arasında dağılımı göreli başvuru protein bolluk daha ilgi belirli bir bölgede üst/alt kat Bregma31göre bu düzeydeki tüm Yarımküre. Bu sonuçları kullanarak farklı antikorlar, karşılaştırma için sağlar farklı mikroskoplar, ya da bile karşıdan karşıya farklı çalışmalar. Bu tutarlılık farklı örnekleri arasında bu yöntem karşılaştırmalı doğadan gelir: değişkenlik telafi için ilgi alanı içinde floresans ve bu yarıkürenin arasındaki oran alarak. Bu nedenle, mutlak değerlerdeki teknik farklılıklardan kaynaklanan farklılıkları geçersiz. Bu teknik bir diğer büyük avantajı ilgi alanları sadece mikroskop kararı ile sınırlı istediğiniz kadar küçük olabilir gerçektir. Protein düzeyleri biyokimyasal yöntemlerle miktarının, örneğin Western Blot veya kütle spektrometresi6,7,8,9, gerektirir dokusu bir diseksiyon ilgi alanı içine. Bu diseksiyon primer somatosensor korteks gibi beyin bölgelerinde zor ve Milletlere, korteks veya hipokampüs farklı katmanları gibi yönelik zaman neredeyse imkansız hale gelir.
Beyinde farklı düzeylerde doğrudan birbirleri ile karşılaştırıldığında olamaz ki yaklaşımının bir ihtar olduğunu. Birçok bölge faiz protein zengin ile hemisferlerin hemisferlerin sadece bazı protein açısından zengin bölgeleri ile daha farklı bir ortalama değer olacaktır. Değerleri % 20 ortalamanın, örneğin, bu nedenle protein Bregma göre bir düzey ikinci bir kıyasla farklı bir mutlak miktarı yansıtır. Bir de unutmayın bu yöntem mutlak protein düzeyleri, yalnızca iç başvuru işaretçisi ve ortalama Yarımküre göre göreli bereket belirlenmesi izin vermez vardır.
Bu yöntem faiz işaretleri farklı nöronal salonlar, sadece presynaptic siteleri için göre protein dağılımı belirlemek için kolayca adapte edilebilir. Ayrıca doku beyin dışında ve - uygun antikor - fareler32,33daha diğer model sistemleri ile için kolayca adapte edilebilir. Confocal mikroskop kullanımı yazarın yönteminin seçimi olmakla birlikte, epifluorescence mikroskobu ve deconvolution yazılım kombinasyonu aynı veri kalitesi verim ve böylece kullanılabilirlik iletişim kuralı'nı genişletin. Ayrıca, aynı stainings Süper çözünürlük mikroskobu ile örneğin hücre altı dağıtım belirlemek için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Irmgard Weiss mükemmel teknik destek için teşekkür ederiz. Yazarlar destek Hermes Pofantis ve Andoniya Petkova tarafından kabul. Yazarlar ayrıca Avrupa Nörolojik Bilimler Enstitüsü LSM800 ve teknik destek, özellikle Dr. Nils Halbsgut tarafından kullanımı için teşekkür ederiz. Bu eser Göttingen Üniversitesi Tıp Merkezi nde tarafından finanse edildi. JSV nano mikroskobu ve moleküler Fizyoloji beyin (CNMPB) desteği Merkezi tarafından kabul eder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL reaction tubes | Eppendorf | 30120094 | |
| 50 mL reaction tubes | Greiner Bio-One | 227261 | |
| multiwell 24 well | Fisher Scientific | 087721H | |
| plastic pipette (disposable) | Sarstedt | 861,176 | |
| 1000 mL pipette | Rainin | 17014382 | |
| 2 ml pipette | Eppendorf | 3123000012 | |
| Vortex Genius 3 | IKA | 3340001 | |
| Menzel microscope slides | Fisher Scientific | 10144633CF | |
| Stereoscope | Leica | ||
| LSM800 | Zeiss | Confocal microscope | |
| freezing microtome | Leica | ||
| PBS (10X) | Roche | 11666789001 | |
| PFA | Sigma | P6148-1kg | |
| NaCl | BioFroxx | 1394KG001 | |
| sucrose | neoFroxx | 1104KG001 | |
| Tissue Tek | Sakura | 4583 | OCT |
| Na2HPO4 | BioFroxx | 5155KG001 | |
| NaH2PO4 | Merck | 1,063,460,500 | |
| normal goat serum | Merck Millipore | S26-100ML | |
| normal donkey serum | Merck | S30-100ML | |
| Triton X-100 | Merck | 1,086,031,000 | |
| rabbit anti-Mover | Synaptic Systems | RRID: AB_10804285 | |
| guinea pig anti-Synaptophysin | Synaptic Systems | RRID: AB_1210382 | |
| donkey anti-rabbit AF647 | Jackson ImmunoResearch | RRID: AB_2492288 | |
| goat anti-mouse AF488 | Jackson ImmunoResearch | RRID: AB_2337438 | |
| Mowiol4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| ZEN2 blue software | Zeiss | Microscopy software | |
| FIJI | ImageJ | Analysis software | |
| Microsoft Excel | Microsoft |
References
- Wallrafen, R., Dresbach, T. The Presynaptic Protein Mover Is Differentially Expressed Across Brain Areas and Synapse Types. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 58 (2018).
- Augustin, I., Betz, A., Herrmann, C., Jo, T., Brose, N. Differential expression of two novel Munc13 proteins in rat brain. Biochemical Journal. 337, 363-371 (1999).
- Rosenmund, C., et al. Differential Control of Vesicle Priming and Short-Term Plasticity by Munc13 Isoforms. Neuron. 33, 411-424 (2002).
- Breustedt, J., et al. Munc13-2 differentially affects hippocampal synaptic transmission and plasticity. Cerebral cortex. 20, 1109-1120 (2010).
- Chen, Z., Cooper, B., Kalla, S., Varoqueaux, F., Young, S. M. The Munc13 Proteins Differentially Regulate Readily Releasable Pool Dynamics and Calcium-Dependent Recovery at a Central Synapse. The Journal of Neuroscience. 33, 8336-8351 (2013).
- Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A Defined Methodology for Reliable Quantification of Western Blot Data. Mol Biotechnol. , (2013).
- Charette, S. J., Lambert, H., Nadeau, P. J., Landry, J. Protein quantification by chemiluminescent Western blotting Elimination of the antibody factor by dilution series and calibration curve. Journal of Immunological Methods. 353, 148-150 (2010).
- Heidebrecht, F., Heidebrecht, A., Schulz, I., Behrens, S., Bader, A. Improved semiquantitative Western blot technique with increased quantification range. Journal of Immunological Methods. 345, 40-48 (2009).
- Toki, M. I., Cecchi, F., Hembrough, T., Syrigos, K. N., Rimm, D. L. Proof of the quantitative potential of immunofluorescence by mass spectrometry. Laboratory Investigation. 97, 329-334 (2017).
- Wilhelm, B. G., et al. Composition of isolated synaptic boutons reveals the amounts of vesicle trafficking proteins. Science. 344, 1023-1028 (2014).
- Navone, F., et al. Protein p38: An integral membrane protein specific for small vesicles of neurons and neuroendocrine cells. Journal of Cell Biology. 103, 2511-2527 (1986).
- Gundelfinger, E. D., Reissner, C., Garner, C. C. Role of Bassoon and Piccolo in Assembly and Molecular Organization of the Active Zone. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 7, (2016).
- Ziegler, D. R., Cullinan, W. E., Herman, J. P. Distribution of vesicular glutamate transporter mRNA in rat hypothalamus. Journal of Comparative Neurology. 448, 217-229 (2002).
- Chaudhry, F. A., et al. The vesicular GABA transporter, VGAT, localizes to synaptic vesicles in sets of glycinergic as well as GABAergic neurons. Journal of Neuroscience. 18, 9733-9750 (1998).
- Aoki, C., et al. Electron Microscopic Immunocytochemical SAP-97 at Postsynaptic, Presynaptic, and Nonsynaptic Sites of Adult and Neonatal Rat Visual Cortex. Synapse. 257, 239-257 (2001).
- Valtschanoff, J. G., et al. Expression of NR2 Receptor Subunit in Rat Somatic Sensory Cortex : Synaptic Distribution and Colocalization With NR1 and PSD-95. Journal of Comparative Neurology. 611, 599-611 (1999).
- Hunt, A., Schenker, L. J., Kennedy, B. PSD-95 Is Associated with the Postsynaptic Density and Not with the Presynaptic Membrane at Forebrain Synapses. Journal of Neuroscience. 76, 1380-1388 (1996).
- Luscher, B., Fuchs, T., Kilpatrick, C. L. GABA A Receptor Trafficking-Mediated Plasticity of Inhibitory Synapses. Neuron. 70, 385-409 (2011).
- Kirby, M. Understanding the molecular diversity of GABAergic synapses. 5, 1-12 (2011).
- Harris, K. M., Weinberg, R. J., Verrall, A. W. Ultrastructure of Synapses in the Mammalian Brain. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , 1-30 (2012).
- Heise, C., et al. Selective Localization of Shanks to VGLUT1-Positive Excitatory Synapses in the Mouse Hippocampus. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, (2016).
- Peters, P. J., Yuan, L. C., Biology, C., Branch, M. Localization of TGN38 to the trans-Golgi network: involvement of a cytoplasmic tyrosine-containing sequence. Journal of Cell Biology. 120, 1123-1135 (1993).
- Antonini, D., et al. Tprg, a gene predominantly expressed in skin, is a direct target of the transcription factor p63. Journal of Investigative Dermatology. 128, 1676-1685 (2008).
- Burre, J., et al. Synaptic vesicle proteins under conditions of rest and activation: Analysis by 2-D difference gel electrophoresis. Electrophoresis. 27, 3488-3496 (2006).
- Kremer, T., et al. Mover is a novel vertebrate-specific presynaptic protein with differential distribution at subsets of CNS synapses. FEBS Letters. 581, 4727-4733 (2007).
- Ahmed, S., et al. Mover Is a Homomeric Phospho-Protein Present on Synaptic Vesicles. PLoS ONE. 8, (2013).
- Körber, C., et al. Modulation of Presynaptic Release Probability by the Vertebrate-Specific Protein Mover. Neuron. 87, 521-533 (2015).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. , 1-9 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, (2012).
- Schneider Gasser, E. M., et al. Immunofluorescence in brain sections: simultaneous detection of presynaptic and postsynaptic proteins in identified neurons. Nature Protocols. 1, 1887-1897 (2006).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , ACADEMIC PRESS. (2001).
- Sun, Y., Ip, P., Chakrabartty, A. Simple Elimination of Background Fluorescence in Formalin-Fixed Human Brain Tissue for Immunofluorescence Microscopy. Journal of Visualized Experiments. , 1-6 (2017).
- Poole, A. R., Dingle, J. T., Mallia, A. K. The localization of retinol-binding protein in rat liver by immunofluorescence microscopy. Journal of Cell Science. 394, 379-394 (1975).
