Summary
Her, beskriver vi en kvantitativ tilgang til fastlæggelse af fordelingen af en synaptic protein i forhold til en markør protein ved hjælp af immunofluorescens farvning, Konfokal mikroskopi og computer-baseret analyse.
Abstract
Tilstedeværelse, fravær eller niveauer af specifikke synaptic proteiner kan alvorligt påvirke synaptisk transmission. Ud over belyse funktion af et protein, er det vigtigt at også bestemme dens udbredelse. Her, beskriver vi en protokol ansættelse immunofluorescens, Konfokal mikroskopi og computer-baseret analyse til at fastlægge fordelingen af synaptic protein Mover (også kaldet TPRGL eller SVAP30). Vi sammenligner distribution af Mover til af synaptic vesikel protein synaptophysin, derved bestemme fordelingen af Mover i en kvantitativ måde i forhold til overfloden af synaptiske vesikler. Især kunne denne metode potentielt blive gennemført for at give mulighed for sammenligning af fordelingen af proteiner ved hjælp af forskellige antistoffer eller mikroskoper eller på tværs af forskellige undersøgelser. Vores metode omgår de iboende variation af immunfluorescent stainings ved fremstilling af et forhold i stedet for absolutte fluorescens niveauer. Derudover metoden vi beskrive gør det muligt for forskeren at analysere fordelingen af et protein på forskellige niveauer: fra hele hjernen skiver til hjerneregioner til forskellige underregioner i en hjerne område, som de forskellige lag af hippocampus eller sensoriske cortex. Mover er en hvirveldyr-specifikke proteiner, der er knyttet til synaptiske vesikler. Med denne metode viser vi, at Mover er uensartet fordelt på tværs af områder i hjernen, med høje niveauer i den ventrale pallidum, septal atomkerner og amygdala, og også inden for enkelt hjernen områder, som de forskellige lag af hippocampus.
Introduction
Kommunikationen mellem neuroner sker på specialiserede kontakt websteder kaldes synapser. Synapser indeholder et utal af forskellige proteiner, der dirigerer synaptisk transmission. Nogle af disse proteiner Vis en heterogen fordeling i hele nervesystemet og er ikke til stede i hver synapse1. Et eksempel på sådan et protein er Munc13, der er involveret i priming processen med synaptiske vesikler. Der er forskellige isoformer af Munc13, som er uensartet fordelt i hele hjernen2, og tilstedeværelse eller fravær af specifikke isoformer kan påvirke kortsigtede synaptisk plasticitet og synaptic vesikel dynamics3, 4 , 5. det er derfor af afgørende betydning at kunne identificere tilstedeværelsen af forskellige synaptic proteiner på tværs af områder i hjernen.
Metoderne til valg af kvantificering af synaptic proteiner - indtil videre - er massespektrometri og Western blotting, snarere end Immunhistokemi6,7,8,9. I nogle tilfælde er flere metoder brugt til at supplere hinanden for at vurdere både antallet og lokaliseringen af specifikke proteiner (dvs., Wilhelm et al. 10). den metode, vi beskriver her giver mulighed for lokalisering og kvantificering af proteiner af interesse uden at bruge nogen biokemiske metode, blot beskæftiger immunfluorescent stainings. En anden fordel her er at kvantificeringen kan ske over områder meget mindre, og derfor mere konkret, end dem, der gennemføres af andre metoder. Dog skal man tage i betragtning at en pålidelig reference protein er nødvendig for at vurdere fordelingen af protein af interesse.
Fluorescerende farvning af Immunhistokemi tillader os at rutinemæssigt identificere lokalisering af proteiner i hele hjernen områder samt inden for forskellige neuronal rum. For at identificere de forskellige rum, anvendes specifik markører. Typisk, antistoffer mod synapsin og synaptophysin11 kan bruges til at mærke synaptiske vesikler, mens antistoffer mod Fagot mærke den aktive zone af en præsynaptiske terminal12. Vesikulær transportvirksomheder, såsom vesikulære glutamat transportører (vGluT) eller vesikulær GABA transporter (vGAT), der bruges til at mærke excitatoriske13 og hæmmende14 præsynaptiske terminaler, henholdsvis. På den postsynaptiske side, kan antistoffer mod Homer protein være ansat til at markere postsynaptiske terminaler og antistoffer mod postsynaptiske tæthed protein 95 (PSD95)15,16,17 eller gephyrin18 , 19 , 20 kan mærke excitatoriske eller hæmmende postsynaptiske terminaler, henholdsvis. Ved hjælp af antistoffer mod et protein af interesse og markører som dem, der er beskrevet ovenfor, kan man bestemme lokalisering af sådant protein. Mange undersøgelser til dato har gjort dette i en kvalitativ måde21. Dog Bestem pålideligt differential fordelingen af en bestemt synaptic protein, skal man ikke kun bestemme dets tilstedeværelse eller fravær men også dets relative koncentration. Heterogenitet af størrelser og tæthed af synapser gør det vigtigt at etablere et forhold mellem den synaptiske markør og protein af interesse. Ellers vil synapse-rige regioner som de ikke-pyramideformede lag af hippocampus og den molekylære lag af lillehjernen vise en høj tæthed af synaptic proteiner, kun på grund af den højere tæthed af synapser, men ikke på grund af en stærk tilstedeværelse af dette protein i hver synapse (fx, Wallrafen og Dresbach1). På den anden side vil proteiner i de neuronale soma (fx, TGN3822) normalt vise stærke tilstedeværelse i hippocampus pyramideformet cellelag eller hippocampus eller cerebellare granulet cellelag på grund af den høje koncentration af neuronal celle organer i disse områder. Derfor, denne ikke-homogen fordeling af strukturer, i dette tilfælde synapser, kan føre til en falsk estimering af fordeling af protein af interesse, selv. Desuden er der en iboende variabilitet i farvning intensiteter over prøver i immunhistokemisk stainings. Protokollen beskrevet her tager dette i betragtning og undgår sådanne afvigelser, samt andre forbehold, der opstår fra immunhistokemiske metoder.
I vores seneste undersøgelse, vi har brugt denne metode til at beskrive det differentierede udtryk af Mover (også kaldet TPRGL23 eller SVAP3024) på tværs af 16 forskellige hjernen områder1. Mover er en hvirveldyr-specifikke synaptic protein, der findes i tilknytning til synaptiske vesikler og påvirker neurotransmitter frigivelse25,26,27. Vi har relateret Mover udtryk til overflod af synaptiske vesikler, ved farvning for synaptophysin som synaptic vesikel reference markør. Vi fandt høje niveauer af Mover navnlig de septal kerner, de ventrale pallidum og amygdala. I hippocampus fandt vi en heterogen fordeling af Mover, med høje niveauer i lag forbundet med intra-hippocampus beregning, og lave niveauer i input- og output lag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokol indebærer ikke eksperimenter på levende dyr. Eksperimenter, der involverer euthanizing af dyr til at få hjernen prøver blev godkendt af de lokale dyrebeskyttelse myndigheder (Tierschutzkommission der Universitätsmedizin Göttingen) under godkendelsesnummer T 10/30.
Bemærk: Til denne protokol, 3 voksne mandlige C57BL/6 mus blev brugt.
1. Prøvetilberedning
- Forberede fiksativ og 0,1 M fosfat buffer (PB, se tabel 1).
- Fix dyret ved transcardial perfusion, som beskrevet i Gage et al. 28. først vaske ud blod med 0,9% NaCl-opløsning, derefter perfuse med 30 mL 4% PARAFORMALDEHYD (PFA).
- Åbne kraniet med en saks og forsigtigt isolere hjernen ved hjælp af en ske med stumpe kanter til at undgå at beskadige vævet.
- Fyld en 50 mL reaktion tube med fiksativ og postfix hjernen i 4% PFA ved 4 ° C natten over.
- Fjerne fiksativ og vaske hjernen i 50 mL af 0,1 M PB på en shaker i 30 min.
- Efter vask, Ruger hjerne i en 50 mL reaktion rør i 30% saccharose i 0,1 M PB i 48 timer, eller indtil det synker i røret ved 4 ° C for cryoprotection.
- Trim cryoprotected hjernen med en skarp kniv, placere den i en cryomold, og Integrer det med optimal opskæring temperatur (OCT) sammensatte. Undgå boblerne. Orientere hjernen og fryse cryomold i-80 ° C fryser.
- Montere de frosne væv til skæring. Reagensglasset væv til cryomicrotome temperatur i mindst 15 min. før skæring.
- Afsnit hjernen i 25 µm tykt koronale skiver. Touch OLT omhyggeligt med en glas krog uden at røre hjernevævet. Samle 3 tilstødende udsnit pr. brønd i en 24 godt plade og gemme dem i 0,1 M PB ved 4 ° C indtil farvning.
Bemærk: Protokollen kan stå i pause her i op til to uger. Længere opbevaring gange kan forstyrre væv kvalitet og dermed påvirke resultatet af eksperimentet.
2. immunfluorescens
- Forberede løsninger herunder blokerende buffer, antistof buffer, vask buffer 1, og vask buffer 2 (Se tabel 1).
- Skyl skiver én gang med PB til at fjerne overskydende OCT.
- Fjerne løsningen med en plastik pipette uden sutter i hjernen skiver. Tilsæt 250 µL af frisk PB med 1000 µL pipette.
Forsigtig: Skiver må ikke tørre ud, så fjern og tilføje væsker godt af godt.
- Fjerne løsningen med en plastik pipette uden sutter i hjernen skiver. Tilsæt 250 µL af frisk PB med 1000 µL pipette.
- Fjern PB med en plastik pipette og tilsæt 250 µL blokerende buffer pr. brønd med en 1000 µL pipette. Inkuber i 3 timer ved stuetemperatur (RT) på shaker.
- Under inkubationstiden, fortyndes de primære antistoffer i antistof buffer i en reaktion tube. Bruge 250 µL antistof buffer pr. brønd og tilføje den passende mængde antistof (Se tabel 2) når der afpipetteres det direkte i løsning ved hjælp af en 2 µL pipette. Bland opløsningen af forsigtigt pipettering op og ned flere gange. Vortex kort tid bagefter til at sikre korrekt blanding.
Bemærk: For at bestemme baggrunden fluorescens, stainings bør også udføres uden at tilføje det primære antistof. For at udruge skive i antistof løsning uden primære antistoffer efter protokol. - Efter inkubationstiden, fjerne den blokerende buffer med en plastik pipette og tilføje 250 µL antistof løsning indeholdende primære antistoffer pr. brønd. Inkuber skiver med primær antistof natten over ved 4 ° C på en shaker.
- Næste dag, vaske skiver med vask buffer 1 3 x til 10 min på RT på en shaker.
- Fjern medium med en plastik pipette og tilsæt 300 µL af vask buffer 1 pr. brønd. Der inkuberes ved RT i 10 min. Gentag 3 gange.
- Under vask trin fortyndes de fluorophore-koblet sekundære antistoffer i antistof buffer i en reaktion tube. Bruge 250 µL antistof buffer pr. brønd og tilføje den passende mængde antistof (Se tabel 2) når der afpipetteres det direkte i løsning ved hjælp af en 2 µL pipette. Bland opløsningen af forsigtigt pipettering op og ned flere gange. Vortex kort tid bagefter til at sikre korrekt blanding.
Forsigtig: Fordi antistofferne er lysfølsomt, alle trin fra dette punkt på skal udføres i mørke. - Efter vask trin, Fjern vask buffer med en plastik pipette og tilføje 250 µL antistof løsning indeholdende sekundære antistoffer pr. brønd. Inkuber skiver med sekundær antistof i 90 min. på RT i mørke.
- Vaske skiver med vask buffer 2 3 x til 10 min på RT.
- Under vask trin fortyndes 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) i 0,1 M PB i en koncentration på 1: 2000.
- Fjern vask buffer 2 med en plastik pipette og tilsæt 250 µL af DAPI løsning pr. brønd. Inkuber i 5 min på RT på shaker.
- Fjern DAPI løsning med en plastik pipette og tilsæt 500 µL af 0,1 M PB pr. brønd med en 1000 µL pipette.
- Montere skiver på objektglas.
- Placere et objektglas under Stereoskopet. Med en fin børste, tilføje tre separate dråber 0,1 M PB i diaset. Læg en skive pr drop i mikroskop diaset.
- Bruge den fine pensel til at flade og orientere skiver på objektglas.
- Når alle skiver er placeret korrekt, fjerne overskydende PB med en serviet og tørre diaset omhyggeligt.
Forsigtig: Undgå tørring hjernen skiver helt. - Tilsættes 80 µL af indlejring medium i diaset. Sænk forsigtigt coverslip i diaset, dermed integrering i hjernen skiver.
- Forlade dias til tørre i stinkskab for 1-2 h (dække dem for at undgå lys eksponering) og gemme dem i et mikroskop dias boks ved 4 ° C.
Bemærk: Protokollen kan pause her.
3. billedbehandling
- Efter den indlejring medium er helt hærdet, placere objektglas under Konfokal mikroskop.
Bemærk: Epifluorescensmikroskop mikroskopi kombineret med deconvolution software bør give lignende billedkvalitet. - Justere indstillingerne for laser ved at øge eller mindske laser intensiteten for hver kanal for at få pixel er overeksponeret for at sikre maksimal fordelingen af grå værdier.
- Erhverve virtuelle væv af hele hjernen skive for de forskellige kanaler.
- I imaging-software (Se Tabel af materialer), skal du vælge indstillingen fliser og manuelt afgrænse hjernen skive med Flise Region Setup.
- Distribuere support punkter i hele regionen flise og justere fokus for forskellige støtte point ved at trykke på Bekræft flise regioner/holdninger...
- Justere indstillingerne i Erhvervelse Mode ifølge den ønskede opløsning og filstørrelse af den resulterende billede og opståen skanne.
- Når scanningen er færdig, skal du bruge funktionen syning til at behandle den virtuelle væv. Eksportere filen som en .tif med funktionen Billede eksport.
4. edb-baseret analyse
- Indlæse alle enkelt kanaler for ét billede i FIJI29 ved at klikke på fil | Åben.
- Med værktøjet frihånd markering afgrænse en halvkugle i DAPI-kanal. Oprette en maske af markeringen ved at klikke på Edit | Udvalg | Opret maske.
- Bestemme den gennemsnitlige fluorescens intensitet for de enkelte kanaler (Mover og synaptophysin) ved at klikke på analyser | Foranstaltning.
Bemærk: Sørg for at vælge de forskellige kanaler til at bestemme de gennemsnitlige fluorescens intensitetsværdier for hver kanal. - Kopier den gennemsnitlige fluorescens intensitet for de enkelte kanaler ind i et regneark.
- Bestem den gennemsnitlige fluorescens intensitet for de enkelte kanaler i et område af interesse ved afgrænse området også med værktøjet frihånd markering . Bruge en mus hjernen atlas som reference.
- Gentag trin 4.1-4.5 for alle hjernehalvdele og alle områder af interesse.
Bemærk: Bestemme værdierne for hver halvkugle separat for at senere sammenligne værdierne i et område af interesse at der på halvkugle (Se trin 5.2).
5. data håndtering
- I tilfælde af baggrunden Fluorescens er høj (Se diskussion), en baggrund subtraktion er påkrævet. For at bestemme den gennemsnitlige fluorescens intensitet for skive behandlet uden primære antistof mod referenceproteinet (her: synaptophysin) og trække værdien fra alle værdier opnået for de områder af hjernen og halvkugler.
- Når de gennemsnitlige fluorescens intensiteter for de enkelt kanaler for hver halvkugle og alle områder af interesse er fastlagt (Se tabel 3), Beregn forholdet af Mover til synaptophysin ved at dividere værdien for Mover med værdien for synaptophysin ( gul i tabel 3). Udføre handlingen for hver halvkugle og hvert område af interesse separat.
- Dividere forholdet opnået for ét område af interesse ved forholdet opnået for den tilsvarende halvkugle (orange i tabel 3) for at bestemme forholdet mellem området af interesse for halvkugle.
- For at bestemme den relative Mover overflod, oversætte forholdet fremkomne i 5,2 procent ved at bestemme sin afvigelse fra 1 (rød i tabel 3). En ratio på 1,25 ville derfor give en relativ Mover overflod af 25% over gennemsnittet, og forholdet mellem 0,75 ville give en relativ Mover overflod af 25% under gennemsnittet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Repræsentant farvning mønstre af forskellige markører kan ses i figur 1. Mønsteret varierer afhængigt af distribution af protein. Eksempler på fem rostro-caudale niveauer er vist i kolonner (A)-(E). En repræsentativ DAPI farvning er vist i den første række: DAPI overholder DNA i en celle og dermed cellekerner farves. Dette resulterer i en punktformet mønster. Regioner med en høj celle tæthed er lysere end regioner med lav celle tætheder. Et eksempel for en uensartet fordelt protein kan ses i anden række. Mover farvning afslører en differentieret distribution i hele hjernen, med lyse hotspot og svagere områder. I den tredje række vist et eksempel for mere homogent fordelt reference markør synaptophysin. En overlejring af de to proteiner (fjerde række) viser en differentieret fordeling af Mover (rød) i forhold til markør protein synaptophysin (grøn).
Figur 2 viser kvantificering beskrevet i trin 4 i protokollen. Vist er de gennemsnitlige fluorescens intensitetsværdier for de forskellige kanaler på tværs af hjernehalvdele (Mover, figur 2A, synaptophysin, figur 2B) og områder af interesse (Mover, figur 2C; synaptophysin, figur 2D). For at bestemme Mover overflod i forhold til antallet af synaptiske vesikler, er forholdet taget af Mover fluorescens værdier til synaptophysin fluorescens værdier. Disse nøgletal for områderne af interesse er vist i figur 2E, og allerede giver en indikation af den heterogen fordeling af Mover, med områder med høj og lav Mover niveauer i forhold til synaptiske vesikler. Desuden kompensation for den iboende tekniske variabilitet, er forholdet på ét område af interesse (figur 2E) sammenlignes på tværs af den halvkugle (ikke vist) og oversat til en procentdel. Denne relative Mover overflod (figur 2F) giver et mål for hvor meget Mover er til stede i et område af interesse i forhold til gennemsnittet.
Som tidligere nævnt, er en af de store fordele ved denne teknik muligheden for at bestemme overfloden af protein af interesse på tværs af meget små områder, selv underregioner og lag af interesseområder. Et eksempel på denne ansøgning er vist i figur 3, hvor den relative Mover overflod blev fastsat for de forskellige lag i underfelter af hippocampus. Kvantificering i de forskellige lag, vist i figur 3D, figur 3Fog figur 3H svarer til de lag, der er vist i figur 3C, figur 3Eog Figur 3G, med de tilsvarende farver. I hippocampus, er Mover uensartet fordelt, med høje Mover i forhold til synaptiske vesikler i lag forbundet med intra-hippocampus beregning (dvs, polymorph lag af dentate gyrus [GD], stratum radiatum, lucidum og oriens af Cornu Ammonis 3 [CA3], og stratum radiatum og oriens af Cornu Ammonis 1 [CA1]), og lave niveauer i input- og output lag (GD, de pyramideformede cellelag af CA3 og CA1, indre og ydre molekylære lag og den Stratum lacunosum-moleculare af CA1).
Figur 1 : Repræsentant immunofluorescens billeder af DAPI (første række), Mover (anden række), synaptophysin (tredje række), og deres overlay (fjerde række, Mover i røde, synaptophysin i grøn) på de 5 rostro-caudale niveauer (A-E). Områder af interesse er nedtonet i gråt i den øverste række af paneler. M1, primære motor cortex; IoC, øerne Calleja; ACC, forreste cingulate cortex; SNu, septal kerner; VPa, ventrale pallidum; NuA, nucleus accumbens; CP, spiegelske putamen; S1, primære somatosensoriske cortex; HC, hippocampus; Am, amygdala; MHa, mediale habenula; PAG, periaqueductal grå; SN, substantia nigra; VTA, ventrale tegmentale område; MLC, molekylære lag af lillehjernen; Rune, granulerende lag af lillehjernen. Skalalinjen = 500 µm. Dette tal er blevet ændret fra Wallrafen og Dresbach1. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Kvantificering af Mover distribution på tværs af de 5 rostro-caudale niveauer. Betyde fluorescens intensiteten af Mover signal (A) og synaptophysin signalet (B) på forskellige niveauer. Betyde fluorescens intensiteten af Mover signal (C) og synaptophysin signalet (D) på de 16 manuelt afgrænsede hjerneregioner. (E) nøgletal af Mover og synaptophysin i 16 hjernen områderne af interesse. (F) kvantificering af den relative Mover overflod, sammenligne Mover/synaptophysin ratio på de respektive region til forholdet mellem den tilsvarende halvkugle. M1, primære motor cortex; IoC, øerne Calleja; ACC, forreste cingulate cortex; SNu, septal kerner; VPa, ventrale pallidum; NuA, nucleus accumbens; CP, spiegelske putamen; S1, primære somatosensoriske cortex; HC, hippocampus; Am, amygdala; MHa, mediale habenula; PAG, periaqueductal grå; SN, substantia nigra; VTA, ventrale tegmentale område; MLC, molekylære lag af lillehjernen. Sorte prikker repræsenterer enkelt datapunkter. Viser gennemsnit ± standardafvigelsen af middelværdi (SEM). Dette tal er blevet ændret fra Wallrafen og Dresbach1. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Mover distribution i mus hippocampus. Immunfluorescens stainings af koronale skiver af musen hippocampus. Oversigt over hippocampus viser den heterogene Mover udtryk mønster (A) og den tilsvarende Synaptophysin farvning (B). De tre områder af interesse (GD, figur 3C; CA3, figur 3E; CA1, figur 3G) er afgrænset med hvide punkterede linjer. (D,F,H) Kvantificering sammenligne forholdet i de respektive lag til forholdet mellem den tilsvarende halvkugle. Farverne i bar grafer svarer til de respektive skygge i paneler C, Eog G. Mover udtryk er høj i niveauer forbundet med intra-hippocampus beregning (dvs, polymorph lag af GD, stratum radiatum, lucidum og oriens CA3, og stratum radiatum og oriens af CA1) og lav i de vigtigste input- og output lag (den indre og ydre molekylære lag af GD, de pyramideformede cellelag af CA3 og CA1, og stratum lacunosum-moleculare af CA1). OML, ydre molekylære lag; IML, inderste molekylære lag; GrL, granulerende lag; PmL, polymorph lag/hilus; SÅ, stratum oriens; Spion, stratum pyramidale; SLu, stratum lucidum; SR, stratum radiatum; SLM, stratum lacunosum-moleculare. Skalalinjen = 500 µm. sorte prikker repræsenterer enkelt datapunkter. Viser den gennemsnit ± SEM. Dette tal er blevet ændret fra Wallrafen og Dresbach1. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Tabel 1: Løsninger, der anvendes i denne protokol.
Tabel 2: Antistoffer bruges i denne protokol.
Tabel 3: Eksempel på datahåndtering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoden, der præsenteres her sigter mod at kvantificere distribution af et protein af interesse i forhold til overfloden af en markør protein med en kendt distribution. Immunfluorescens farvning kan vise en høj variation af farvning intensitet mellem forskellige skiver. Kvantificering fremgangsmåden her omgår dette problem ved at bestemme forholdet mellem protein af interesse for gennemsnitlige tværs over halvkugle. Derfor forskellige farvning intensiteter over skiver er aflyst og giver mulighed for en kvantitativ beskrivelse.
Som med alle immunofluorescens protokol, kvalitative eller kvantitative, flere faktorer kan påvirke succes og derved forvirre analysen. Særlig opmærksomhed bør derfor, lægges til kritiske trin i protokollen. Først, en ordentlig fiksering af væv er nødvendig. Denne fiksering kan normalt opnås ved en vellykket transcardial perfusion. Kvaliteten af perfusion kan bekræftes ved at kontrollere leveren kort efter vask ud af blodet. En første indikator for en vellykket perfusion er clearing af leveren og ekstremiteter28. Forekomst af blodpropper kan indikere at perfusion kunne have været alt for langsom og bør udføres hurtigere, næste gang. Nogle proteiner kræver forskellige fiksering protokoller, som kemisk fiksering med PFA kan forårsage epitop blokering30. I dette tilfælde bør fryse fiksation eller fiksering med et andet kemikalie, såsom methanol, overvejes. Efter skæring er det andet det kritisk at plette hjernen skiver som hurtigt som muligt, helst på den samme eller den næste sige. Længere opbevaring i PB kan føre til bakteriel infektion, og samtidig tilføjer NaN3 kan forhindre dette til en vis grad, væv normalt kvalitetsforringelser med fillagring tid. Tredje, under den farvning procedure, det er vigtigt at udføre vask trin godt-af-godt for at undgå udtørring af skiver. Når skiverne tørre ud, kan baggrunden fluorescens øge og dermed forårsage en skævhed i analysen. Fjerde, efter anvendelse af den sekundære antistof, det er vigtigt at udføre alle følgende trin i mørke. Fluorophores er lysfølsomme, og lys eksponering kan alvorligt fordreje fluorescens signal.
Optimering af farvning proceduren, herunder udvælgelsen af passende primære og sekundære antistoffer, optimal antistof koncentration og exposition tid, er en forudsætning, at opnå det bedste signal / støj-forhold og at foretage en pålidelig kvantitative immunofluorescens analyse. Antistoffer verificeret i knock out væv bør være det foretrukne valg, omend ikke altid tilgængelig. Sørg altid for at udføre korrekt kontrol eksperimenter for at udelukke krydstale mellem forskellige antistoffer. Størrelsen af baggrunden fluorescens som følge af autofluorescence og uspecifik bindingen af den sekundære antistof kan vurderes af imaging skiver som den primære antistof ikke blev anvendt. Det er ikke trivielt at fastslå hvor meget højere intensitet af signalet skal være i forhold til baggrunden for at have en acceptabel signal / støj-forhold. Men, baseret på empiriske observationer, forfatterne ville foreslå sigter mod at have et signal mindst 2-fold stærkere end baggrunden for at pålideligt skøn protein fordeling. Baggrund Fluorescens er høj i kontrol betingelser (uden tilstedeværelse af det primære antistof), skal de gennemsnitlige baggrundskoncentrationer fluorescens fratrækkes eksperiment billeder.
Den største fordel ved vores tilgang er dens intern reference: immunofluorescens intensiteten af target proteinet (dvs., Mover) i en region af interesse er i forhold til en reference markør (dvs, synaptophysin) og til den samlede intensitet disse proteiner på tværs af hele den halvkugle. Således fra beregningen vi udføre, man kan utvetydigt konkludere, at overflod af target proteinet er x fold højere/lavere i en bestemt region af interesse end overfloden af referenceproteinet i forhold til fordelingen af proteiner i hele den hele den halvkugle på dette niveau i forhold til Bregma31. Dette giver mulighed for sammenligning af resultater ved hjælp af forskellige antistoffer, forskellige mikroskoper, eller endda på tværs af forskellige undersøgelser. Denne sammenhæng på tværs af forskellige prøver kommer fra den sammenlignende karakter af denne metode: variation der kompenseres for ved at tage forholdet mellem fluorescens i området af interesse og halvkugle. Derfor er ulighederne i absolutte værdier som følge af tekniske forskelle annulleret. En anden stor fordel ved denne teknik er, at interesseområder kan være så lille som du ønsker dem til at være, kun begrænset af løsningen af mikroskopet. Kvantificere protein niveauer med biokemiske metoder, kræver for eksempel Western Blot eller massespektrometri6,7,8,9, en dissektion af vævet ind i området af interesse. Dette dissektion er svært for regioner af hjernen, som den primære somatosensoriske cortex, og bliver næsten umuligt, når der sigtes for delregioner, såsom de forskellige lag af cortex eller hippocampus.
En advarsel af metoden er, at de forskellige niveauer i hjernen ikke direkte kan sammenlignes med hinanden. Halvkugle med mange regioner rige på protein af interesse vil have en anden gennemsnitlige værdi end hjernehalvdele med kun få protein-rige regioner. Værdier på 20% over gennemsnittet, for eksempel vil derfor afspejle en forskellige absolutte mængde af protein i ét niveau i forhold til Bregma i forhold til en anden en. Man må huske så godt, at denne metode ikke tillade bestemmelse af absolutte protein niveauer, kun den relative forekomst i forhold til intern reference markør og gennemsnittet i hele halvkugle.
Denne metode kan være let tilpasses til at bestemme fordelingen af protein af interesse i forhold til markører for forskellige neuronal rum, ikke kun præsynaptiske websteder. Det kan også være let tilpasses til væv end hjernen og - med passende antistoffer - andre modelsystemer end mus32,33. Mens brugen af en Konfokal mikroskop er forfatternes metode valg, bør en kombination af epifluorescensmikroskop mikroskopi og deconvolution software give de samme datakvalitet og dermed udvide anvendeligheden af protokollen. Desuden kan de samme stainings bruges til at bestemme den subcellulært distribution, for eksempel med super-resolution mikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi takker Irmgard Weiss for fremragende teknisk bistand. Forfatterne anerkende støtte af Hermes Pofantis og Andoniya Petkova. Forfatterne også takke den europæiske Neuroscience Institute for brugen af LSM800 og teknisk bistand, især af Dr. Nils Halbsgut. Dette arbejde blev finansieret af University Medical Center Göttingen. JSV anerkender støtte af Center for nanoskala mikroskopi og molekylær fysiologi af hjernen (CNMPB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL reaction tubes | Eppendorf | 30120094 | |
| 50 mL reaction tubes | Greiner Bio-One | 227261 | |
| multiwell 24 well | Fisher Scientific | 087721H | |
| plastic pipette (disposable) | Sarstedt | 861,176 | |
| 1000 mL pipette | Rainin | 17014382 | |
| 2 ml pipette | Eppendorf | 3123000012 | |
| Vortex Genius 3 | IKA | 3340001 | |
| Menzel microscope slides | Fisher Scientific | 10144633CF | |
| Stereoscope | Leica | ||
| LSM800 | Zeiss | Confocal microscope | |
| freezing microtome | Leica | ||
| PBS (10X) | Roche | 11666789001 | |
| PFA | Sigma | P6148-1kg | |
| NaCl | BioFroxx | 1394KG001 | |
| sucrose | neoFroxx | 1104KG001 | |
| Tissue Tek | Sakura | 4583 | OCT |
| Na2HPO4 | BioFroxx | 5155KG001 | |
| NaH2PO4 | Merck | 1,063,460,500 | |
| normal goat serum | Merck Millipore | S26-100ML | |
| normal donkey serum | Merck | S30-100ML | |
| Triton X-100 | Merck | 1,086,031,000 | |
| rabbit anti-Mover | Synaptic Systems | RRID: AB_10804285 | |
| guinea pig anti-Synaptophysin | Synaptic Systems | RRID: AB_1210382 | |
| donkey anti-rabbit AF647 | Jackson ImmunoResearch | RRID: AB_2492288 | |
| goat anti-mouse AF488 | Jackson ImmunoResearch | RRID: AB_2337438 | |
| Mowiol4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| ZEN2 blue software | Zeiss | Microscopy software | |
| FIJI | ImageJ | Analysis software | |
| Microsoft Excel | Microsoft |
References
- Wallrafen, R., Dresbach, T. The Presynaptic Protein Mover Is Differentially Expressed Across Brain Areas and Synapse Types. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 58 (2018).
- Augustin, I., Betz, A., Herrmann, C., Jo, T., Brose, N. Differential expression of two novel Munc13 proteins in rat brain. Biochemical Journal. 337, 363-371 (1999).
- Rosenmund, C., et al. Differential Control of Vesicle Priming and Short-Term Plasticity by Munc13 Isoforms. Neuron. 33, 411-424 (2002).
- Breustedt, J., et al. Munc13-2 differentially affects hippocampal synaptic transmission and plasticity. Cerebral cortex. 20, 1109-1120 (2010).
- Chen, Z., Cooper, B., Kalla, S., Varoqueaux, F., Young, S. M. The Munc13 Proteins Differentially Regulate Readily Releasable Pool Dynamics and Calcium-Dependent Recovery at a Central Synapse. The Journal of Neuroscience. 33, 8336-8351 (2013).
- Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A Defined Methodology for Reliable Quantification of Western Blot Data. Mol Biotechnol. , (2013).
- Charette, S. J., Lambert, H., Nadeau, P. J., Landry, J. Protein quantification by chemiluminescent Western blotting Elimination of the antibody factor by dilution series and calibration curve. Journal of Immunological Methods. 353, 148-150 (2010).
- Heidebrecht, F., Heidebrecht, A., Schulz, I., Behrens, S., Bader, A. Improved semiquantitative Western blot technique with increased quantification range. Journal of Immunological Methods. 345, 40-48 (2009).
- Toki, M. I., Cecchi, F., Hembrough, T., Syrigos, K. N., Rimm, D. L. Proof of the quantitative potential of immunofluorescence by mass spectrometry. Laboratory Investigation. 97, 329-334 (2017).
- Wilhelm, B. G., et al. Composition of isolated synaptic boutons reveals the amounts of vesicle trafficking proteins. Science. 344, 1023-1028 (2014).
- Navone, F., et al. Protein p38: An integral membrane protein specific for small vesicles of neurons and neuroendocrine cells. Journal of Cell Biology. 103, 2511-2527 (1986).
- Gundelfinger, E. D., Reissner, C., Garner, C. C. Role of Bassoon and Piccolo in Assembly and Molecular Organization of the Active Zone. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 7, (2016).
- Ziegler, D. R., Cullinan, W. E., Herman, J. P. Distribution of vesicular glutamate transporter mRNA in rat hypothalamus. Journal of Comparative Neurology. 448, 217-229 (2002).
- Chaudhry, F. A., et al. The vesicular GABA transporter, VGAT, localizes to synaptic vesicles in sets of glycinergic as well as GABAergic neurons. Journal of Neuroscience. 18, 9733-9750 (1998).
- Aoki, C., et al. Electron Microscopic Immunocytochemical SAP-97 at Postsynaptic, Presynaptic, and Nonsynaptic Sites of Adult and Neonatal Rat Visual Cortex. Synapse. 257, 239-257 (2001).
- Valtschanoff, J. G., et al. Expression of NR2 Receptor Subunit in Rat Somatic Sensory Cortex : Synaptic Distribution and Colocalization With NR1 and PSD-95. Journal of Comparative Neurology. 611, 599-611 (1999).
- Hunt, A., Schenker, L. J., Kennedy, B. PSD-95 Is Associated with the Postsynaptic Density and Not with the Presynaptic Membrane at Forebrain Synapses. Journal of Neuroscience. 76, 1380-1388 (1996).
- Luscher, B., Fuchs, T., Kilpatrick, C. L. GABA A Receptor Trafficking-Mediated Plasticity of Inhibitory Synapses. Neuron. 70, 385-409 (2011).
- Kirby, M. Understanding the molecular diversity of GABAergic synapses. 5, 1-12 (2011).
- Harris, K. M., Weinberg, R. J., Verrall, A. W. Ultrastructure of Synapses in the Mammalian Brain. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , 1-30 (2012).
- Heise, C., et al. Selective Localization of Shanks to VGLUT1-Positive Excitatory Synapses in the Mouse Hippocampus. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, (2016).
- Peters, P. J., Yuan, L. C., Biology, C., Branch, M. Localization of TGN38 to the trans-Golgi network: involvement of a cytoplasmic tyrosine-containing sequence. Journal of Cell Biology. 120, 1123-1135 (1993).
- Antonini, D., et al. Tprg, a gene predominantly expressed in skin, is a direct target of the transcription factor p63. Journal of Investigative Dermatology. 128, 1676-1685 (2008).
- Burre, J., et al. Synaptic vesicle proteins under conditions of rest and activation: Analysis by 2-D difference gel electrophoresis. Electrophoresis. 27, 3488-3496 (2006).
- Kremer, T., et al. Mover is a novel vertebrate-specific presynaptic protein with differential distribution at subsets of CNS synapses. FEBS Letters. 581, 4727-4733 (2007).
- Ahmed, S., et al. Mover Is a Homomeric Phospho-Protein Present on Synaptic Vesicles. PLoS ONE. 8, (2013).
- Körber, C., et al. Modulation of Presynaptic Release Probability by the Vertebrate-Specific Protein Mover. Neuron. 87, 521-533 (2015).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. , 1-9 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, (2012).
- Schneider Gasser, E. M., et al. Immunofluorescence in brain sections: simultaneous detection of presynaptic and postsynaptic proteins in identified neurons. Nature Protocols. 1, 1887-1897 (2006).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , ACADEMIC PRESS. (2001).
- Sun, Y., Ip, P., Chakrabartty, A. Simple Elimination of Background Fluorescence in Formalin-Fixed Human Brain Tissue for Immunofluorescence Microscopy. Journal of Visualized Experiments. , 1-6 (2017).
- Poole, A. R., Dingle, J. T., Mallia, A. K. The localization of retinol-binding protein in rat liver by immunofluorescence microscopy. Journal of Cell Science. 394, 379-394 (1975).
