Summary
Здесь мы описываем количественный подход к определению распределение синаптических белков относительно белка маркер, с помощью окрашивания иммунофлюоресценции, confocal микроскопии и анализа на основе компьютера.
Abstract
Наличие, отсутствие или уровня конкретных синаптических белков может сильно влияние синаптической передачи. В дополнение к разъяснению функцию белка, жизненно важно также определить его распространения. Здесь мы описываем протокол, используя иммунофлюоресценции, конфокальная микроскопия и компьютерного анализа для определения распределения синаптических белков двигателем (также называется TPRGL или SVAP30). Мы сравниваем распределение Mover, синаптических пузырьков synaptophysin белка, таким образом определяя распределение движенца в количественном выражении по отношению к обилие синаптических пузырьков. В частности этот метод может быть реализован потенциально для сравнения распределения белков, с использованием различных антител или Микроскопы или через различные исследования. Наш метод обходит присущих изменчивости immunofluorescent stainings, уступая соотношение, вместо того, чтобы абсолютное флуоресценции уровнях. Кроме того, мы описываем метод позволяет исследователю проанализировать распределение белка на разных уровнях: от весь мозг срезы мозга районы для различных субрегионов в области один мозг, например различные слои гиппокампа или сенсорными коре. Мувер является белок позвоночных животных конкретных, связанный с синаптических пузырьков. С помощью этого метода мы показываем, что двигателем гетерогенно распределяется между областях мозга, с высоким уровнем в вентральной pallidum, межжелудочковой перегородки ядер и миндалины, а также в пределах одного мозга областях, таких как различные слои гиппокампа.
Introduction
Связь между нейронами происходит на специализированных сайтах контакта, называется синапсы. Синапсы содержат множество различных белков, которые оркестровать синаптической передачи. Некоторые из этих белков показывают гетерогенных распределение всей нервной системы и не присутствуют в каждом синапсе1. Одним из примеров такого белок является Munc13, который участвует в процессе грунтования синаптических пузырьков. Существуют разные изоформы Munc13, которые распространяются гетерогенно во всем мозг2, и наличие или отсутствие конкретных изоформ могут влиять на краткосрочные синаптической пластичности и синаптических пузырьков динамики3, 4 , 5. Таким образом, он имеет жизненно важное значение, чтобы иметь возможность определить наличие различных синаптических белков различных областях мозга.
Методы выбора для квантификации синаптических белков - пока -, масс-спектрометрия и западной blotting, вместо иммуногистохимия6,,78,9. В некоторых случаях несколько методов используются для дополнения друг друга, чтобы оценить количество и локализации специфических белков (то есть, Вильгельм и др. 10). метод, мы опишем здесь позволяет для локализации и количественной оценки протеинов интереса без необходимости использования любого биохимического метода, просто используя immunofluorescent stainings. Еще одним преимуществом здесь является количественная оценка может быть сделано над районами гораздо меньше, и, таким образом, более конкретные, чем достичь другими методами. Однако надо принимать во внимание, что белок надежные ссылки необходимы для оценки распределения протеина интереса.
Флуоресцентный окрашивание по иммуногистохимия позволяет нам регулярно выявить Локализация белков различных областях мозга, а также в рамках различных нейрональных отсеков. Для идентификации различных отсеках, используются конкретные маркеры. Как правило антитела против синапсины и synaptophysin11 может использоваться для обозначения синаптических пузырьков, в то время как антитела против Фагот ярлык активную зону пресинаптической терминал12. Везикулярный транспортер, например глютамат Везикулярный транспортер (vGluT) или Везикулярный транспортер ГАМК (vGAT), используются для обозначения возбуждающим13 и тормозящий14 Пресинаптический терминалы, соответственно. На стороне постсинаптических антитела против белков Гомер может использоваться для Марк постсинаптических терминалы и антител против постсинаптических плотность белка 95 (PSD95)15,,1617 или gephyrin18 , 19 , 20 может маркировать возбуждающим или тормозной постсинаптический терминалы, соответственно. С помощью антител против протеина интереса и маркеры например, описанным выше, можно определить локализацию таких белков. Многие исследования на сегодняшний день это сделали в качественным образом21. Однако достоверно определить дифференцированного распределения конкретных синаптических белков, нужно не только определить свое присутствие или отсутствие, но также его относительной концентрации. Неоднородности размеров и плотности синапсы делает его важным установить соотношение между синаптических маркер и протеина интереса. В противном случае СИНАПС богатые регионы, как-пирамидальной слои гиппокампа и молекулярный слой мозжечка покажет высокой плотности синаптических белков, только благодаря более высокой плотности синапсов но не сильное присутствие этого белка в каждый синапс (например, Wallrafen и Dresbach-1). С другой стороны белки в нейрональных Сома (например, TGN3822) обычно покажет сильное присутствие в гиппокампе пирамидальной клетке слоя или слоя клеток гиппокампа или мозжечковая гранул из-за высокой концентрации нейрональных клеток органов в этих областях. Таким образом эта неоднородность распределения структур, в этом случае синапсов, может привести к ложной оценки распределения протеина интереса сам. Кроме того существует внутренняя изменчивость в пятнать интенсивностей различных образцов в stainings иммуногистохимии. Протокол, описанные здесь принимает это во внимание и избегает такого предубеждения, а также другие предостережения, которые возникают от иммуногистохимических методов.
В наши последние исследования, мы использовали этот метод для описания дифференциального выражение движителя (также называемый TPRGL23 или24SVAP30) через 16 различных мозга области1. Мувер является позвоночных конкретных синаптических белок, который можно найти в ассоциации для синаптических пузырьков и влияет нейромедиатора релиз25,,2627. Мы связаны Mover выражение обилие синаптических пузырьков, путем пятнать для synaptophysin как маркер ссылки синаптических пузырьков. Мы нашли высокие уровни движителя особенно в межпредсердной перегородки ядер и брюшной pallidum, миндалины. В гиппокампе мы нашли гетерогенных распределение Mover, с высоким уровнем в слои, связанные с внутри гиппокампа вычисления и низкий уровень в слои ввода и вывода.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Этот протокол не предусматривает эксперименты на живых животных. Эксперименты с euthanizing животных для получения образцов мозга были утверждены властями местной защиты животных (Tierschutzkommission der этот Гёттинген) под номером официального утверждения T 10/30.
Примечание: Для этого протокола, были использованы 3 взрослых самцов мышей C57BL/6.
1. Пробоподготовка
- Подготовьте фиксатором и 0,1 М фосфатного буфера (PB; см. таблицу 1).
- Исправить животное, transcardial перфузии, как описано в Гейдж и др. 28. сначала промыть крови с 0,9% раствор NaCl, затем perfuse с 30 мл параформальдегида 4% (PFA).
- Откройте черепа с ножницами и тщательно изолировать с помощью ложки с тупыми краями, чтобы избежать повреждения ткани мозга.
- Заполнить 50 мл трубки реакции с фиксатором и постфиксная мозга в 4% PFA при 4 ° C на ночь.
- Снимите фиксатор и мыть мозга в 50 мл 0,1 М PB на шейкер для 30 мин.
- После мытья, Инкубируйте мозга в 50 мл трубки реакции в 30% сахарозы в 0,1 М PB для 48 ч или до тех пор, пока он тонет в трубе при 4 ° C для криозащиты.
- Trim cryoprotected мозга с острым лезвием, поместите его в cryomold и вставлять его с оптимального раскроя температуры (OCT) соединения. Избегайте пузырей. Ориент мозга и заморозить cryomold в морозилке-80 ° С.
- Смонтируйте замороженные ткани для разрезания. Сбалансировать ткани до температуры cryomicrotome для по крайней мере 15 минут перед секционирование.
- Раздел мозга в 25 мкм толщиной корональные срезы. Нажмите OCT тщательно с крюком стекла без касатьться ткани мозга. Сбор 3 прилегающих фрагментов в скважину в 24 хорошо пластины и хранить их в 0,1 М PB на 4 ° C до окрашивания.
Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь до двух недель. Время хранения может вмешиваться с качеством ткани и таким образом повлиять на результат эксперимента.
2. иммунофлуоресценции
- Подготовка решений включая блокирующий буфер, буфер антитела, мытье буфер 1 и Отмывающий буфер 2 (см. таблицу 1).
- Промывайте ломтики с PB для удаления избыточных OCT.
- Удаление решения с пластиковая Пипетка без сосание в срезах головного мозга. 250 мкл свежие PB с 1000 мкл пипетки.
Предупреждение: Фрагменты, не следует высохнуть, так что удалить и добавить жидкости от скважины.
- Удаление решения с пластиковая Пипетка без сосание в срезах головного мозга. 250 мкл свежие PB с 1000 мкл пипетки.
- Удаление PB с Пластиковые пипетки и 250 мкл блокировки буфера в колодец с 1000 мкл пипетки. Инкубируйте 3 ч при комнатной температуре (RT) на шейкер.
- Во время инкубации разбавляют первичных антител в буфере антитела в пробирке реакция. Использовать буфер для 250 мкл антител на хорошо и добавить соответствующее количество антител (см. таблицу 2), закупорить непосредственно в раствор с помощью пипетки 2 мкл. Mix решение, мягко закупорить вверх и вниз несколько раз. Вихрь вскоре после этого, для обеспечения надлежащего перемешивания.
Примечание: Для определения фона флуоресценции, stainings также должны выполняться без добавления основного антитела. Для этого Инкубируйте среза в раствор антител без первичного антитела согласно протоколу. - После инкубации время Удалите блокирующий буфер с Пластиковые пипетки и 250 мкл антител раствора, содержащего первичных антител в колодец. Инкубируйте ломтики с основное антитело на ночь при 4 ° C на шейкер.
- Следующий день, вымойте ломтики отмывающим буфером 1 3 x 10 мин на RT на шейкер.
- Удаление среды с Пластиковые пипетки и 300 мкл отмывающего буфера 1 за хорошо. Инкубируйте на RT для 10 минут повторите 3 раза.
- Во время стирки шаги развести Флюорофор сочетании вторичные антитела в буфере антитела в пробирке реакция. Использовать буфер для 250 мкл антител на хорошо и добавить соответствующее количество антител (см. таблицу 2), закупорить непосредственно в раствор с помощью пипетки 2 мкл. Mix решение, мягко закупорить вверх и вниз несколько раз. Вихрь вскоре после этого, для обеспечения надлежащего перемешивания.
Предупреждение: Ведь светочувствительные, антитела все шаги от этой точки зрения должны быть выполнены в темноте. - После стирки шаги, удалить буфер с пластиковых дозаторов для стирки и 250 мкл раствор антител, содержащие вторичные антитела в колодец. Инкубируйте ломтики с вторичное антитело 90 мин на RT в темноте.
- Вымойте ломтики отмывающим буфером 2 3 x 10 мин на RT.
- Во время стирки шаги разбавляют 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) в 0,1 М PB в концентрации 1: 2000.
- Отмывающий буфер 2 с пластиковая Пипетка Удалить и 250 мкл раствора DAPI на хорошо. Инкубируйте 5 мин на RT на шейкер.
- Удаление решения DAPI с Пластиковые пипетки и 500 мкл 0,1 М PB в колодец с 1000 мкл пипетки.
- Смонтируйте ломтики на скольжениях микроскопа.
- Место микроскопа под стереоскоп. С тонкой кистью добавьте три отдельные капли 0,1 М PB на слайд. Поместите один срез на каплю на слайд микроскопа.
- Используйте тонкой кистью для выравнивания и ориентировать ломтики на микроскопа.
- Когда все фрагменты расположены правильно, удалите избыток PB салфеткой и тщательно высушите слайд.
Предостережение: Избегайте сушки срезы мозга полностью. - 80 мкл встраивания среднего на слайд. Осторожно опустите coverslip на слайд, тем самым встраивание срезы мозга.
- Оставьте слайды для просушки в вытяжной шкаф для 1-2 ч (покрыть их, чтобы избежать воздействия света) и хранить их в коробке слайд микроскопа при 4 ° C.
Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь.
3. томография
- После внедрения среды полностью закаленные, место микроскопа под конфокального микроскопа.
Примечание: В сочетании с программным обеспечением деконволюция микроскопия помощью эпифлуоресцентного должна принести аналогичные качества изображения. - Настройте параметры лазера путем увеличения или уменьшения интенсивности лазера для каждого канала, так что несколько пикселей переэкспонированных для обеспечения максимального распределения серого значений.
- Приобрести виртуальные тканей весь мозг фрагмента для различных каналов.
- В программе обработки изображений (см. Таблицу материалы), выберите параметр плитки и вручную определить срез мозга с Установки плитки региона.
- Распространять опорных точек во всем регионе плитки и отрегулировать фокус на различных опорных точек, нажав Проверить плитка регионов/позиций...
- Настройки в Режиме приобретения желаемого резолюции и файла размер результирующего изображения и начать сканирование.
- Когда проверка завершается, используйте функцию колющие для обработки виртуального ткани. Экспортируйте в формате .tif с функцией Экспорта изображения.
4. компьютер-анализ
- Загрузить все отдельные каналы для одного изображения в Фиджи29 , нажав файл | Открытые.
- С помощью инструмента Freehand выделения разграничить одного полушария в DAPI-канале. Создание маски выделения, нажав Edit | Выбор | Создание маски.
- Определить интенсивность средняя флуоресценции для одного канала (Mover и synaptophysin), нажав анализ | Мера.
Примечание: Не забудьте выбрать различные каналы для определения значений интенсивности среднее флуоресценции для каждого канала. - Скопируйте интенсивность средняя флуоресценции для отдельные каналы в электронную таблицу.
- Определите интенсивность средняя флуоресценции один каналов в области, представляющей интерес для разграничения области также инструментом Freehand выделение . Атлас мозга мыши используйте как Справка.
- Повторите шаги 4.1-4.5 для всех полушариях и во всех областях, представляющих интерес.
Примечание: Определить значения для каждого полушария отдельно для того, чтобы позже сравнить значения в области, представляющей интерес, в Западном полушарии (см. шаг 5.2).
5. Данные обработки
- В случае, если фон флуоресценции высокой (см. обсуждение), вычитание фона могут быть необходимы. Для этого, определить интенсивность средняя флуоресценции для фрагмента, обрабатываются без первичного антитела против белков ссылка (здесь: synaptophysin) и вычесть это значение из всех значений, полученных для мозга и полушарий.
- Когда были определены среднее флуоресценции интенсивности для отдельные каналы для каждого полушария и каждая область интересов (см. таблицу 3), рассчитать коэффициент движенца к synaptophysin путем деления значения для движенца значение для synaptophysin ( желтый цвет в таблице 3). Выполните это действие для каждого полушария и каждая область интересов отдельно.
- Разделите коэффициент для одной области интереса соотношение, полученные для соответствующего полушария (оранжевый в таблице 3) для определения коэффициента области, представляющие интерес для нашего полушария.
- Чтобы определить относительное изобилие Mover, перевод соотношение, полученные в 5.2 в процентах путем определения ее отклонение от 1 (красная в таблице 3). Поэтому коэффициент 1,25 даст относительное изобилие Mover 25% выше среднего, и отношение 0,75 даст относительное изобилие Mover 25% ниже среднего.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Представитель окрашивания моделей различных маркеров можно увидеть на рисунке 1. Шаблон варьируется в зависимости от распределения белка. Примеры из пяти уровней rostro хвостового приводятся в колонках (A)-(E). Представитель DAPI пятнать показано в первой строке: DAPI придерживается ДНК клетки и таким образом окрашенных ядер. Это приводит к пунктата шаблон. Регионы с высоким клетки плотностью ярче, чем в регионах с низкой сотовый плотности. Пример для гетерогенно распределенное белки можно увидеть во втором ряду. Движенец пятнать показывает дифференцированного распределения по всему мозгу, с яркими очагах и dimmer областях. В третьей строке показан пример для synaptophysin более равномерно распределенных ссылок маркера. Наложение двух белков (в четвертой строке) показывает дифференцированного распределения движителя (красный) по сравнению с synaptophysin белка маркера (зеленый).
Рисунок 2 показывает количественной оценки, описанные в шаге 4 протокола. Приведены значения интенсивности среднее флуоресценции для различных каналов через полушарий (Mover, Рисунок 2A; synaptophysin, Рисунок 2B) и во всех областях, представляющих интерес (Mover, Рисунок 2C; synaptophysin, Рисунок 2D). Чтобы определить изобилие Mover относительно числа синаптических пузырьков, соотношение берется Mover флуоресценции значений значениям synaptophysin флуоресценции. Эти показатели в областях, представляющих интерес показаны на рисунке 2Eи уже указывать гетерогенные распределения Mover, районы с высокой и низкой Mover уровнях относительно синаптических пузырьков. Дополнительно компенсировать присущие технических изменчивости, соотношение в одной области интереса (Рисунок 2E) по сравнению с показателем в полушарии (не показан) и переведен на определенный процент. Это относительное Mover изобилия (Рисунок 2F) дает меру сколько движителя присутствует в одной области родства интерес в среднем.
Как упоминалось выше, одним из основных преимуществ этой методики является возможность определить обилием протеина интереса через очень небольших площадях, даже субрегионов и слои областей, представляющих интерес. Одним из примеров этого приложения показан на рисунке 3, где относительное изобилие двигателем был определен для различных слоев в рубриках гиппокампа. Количественная оценка в разных слоях, показано на рисунке 3D, Рисунок 3Fи Рисунок 3H соответствует слои, показано на рис. 3C, Рисунок 3Eи Рисунок 3G, с соответствующими цветами. В гиппокампе гетерогенно распространяется Mover, с высоким уровнем двигателем относительно синаптических пузырьков в слои, связанные с внутри гиппокампа вычисления (например, превращение слоя зубчатой извилине [ГД], слой radiatum, Lucidum oriens Cornu Ammonis 3 [CA3] и слой radiatum и oriens Cornu Ammonis 1 [СА1]) и низкого уровня в слои ввода и вывода (внутренние и внешние молекулярный слой ГД, пирамидальной клетке слои CA3 и СА1 и в слое stratum lacunosum-moleculare о СА1).
Рисунок 1 : Представитель иммунофлюоресценции изображения DAPI (первая линия), тягач (вторая строка), synaptophysin (третья строка) и их наложение (четвертой строке, двигателем в красный, synaptophysin зеленым цветом) на уровне 5 rostro хвостового (A-E). Области интереса, закрашены серым в верхнем ряду панелей. M1, первичной моторной коры; МОК, острова Calleja; АКК, передней поясной коры; СНС, межжелудочковой перегородки ядер; VPa, вентральной pallidum; НУА, прилежащем ядре; CP, хвостатого Путамен; S1, первичной соматосенсорной коры; HC, гиппокампа; Ам, миндалина; Мга, медиальной habenula; Паг, periaqueductal серый; SN, substantia nigra; VTA, вентральной вентральная область; ДОК, молекулярный слой мозжечка; КЗС, зернистый слой мозжечка. Шкалы бар = 500 мкм. Этот рисунок был изменен с Wallrafen и Dresbach1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Количественная оценка Mover распределения по 5 уровней rostro хвостового. Означают интенсивности флуоресценции двигателем (A) и synaptophysin сигнал (B) на различных уровнях. Означают интенсивности флуоресценции двигателем (C) и synaptophysin сигнал (D) в 16 регионах вручную разграничены мозга. (E) коэффициенты Mover и synaptophysin в 16 мозга областях, представляющих интерес. (F) количественная оценка относительного изобилия Mover, сравнивая Mover/synaptophysin соотношение в соответствующем регионе отношение соответствующего полушария. M1, первичной моторной коры; МОК, острова Calleja; АКК, передней поясной коры; СНС, межжелудочковой перегородки ядер; VPa, вентральной pallidum; НУА, прилежащем ядре; CP, хвостатого Путамен; S1, первичной соматосенсорной коры; HC, гиппокампа; Ам, миндалина; Мга, медиальной habenula; Паг, periaqueductal серый; SN, substantia nigra; VTA, вентральной вентральная область; ДОК, молекулярный слой мозжечка. Черные точки представляют собой точки данных. Бары показывают среднее ± Среднеквадратичная ошибка среднего значения (SEM). Этот рисунок был изменен с Wallrafen и Dresbach1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Движенец распределение в гиппокампе мыши. Иммунофлюоресценции stainings корональные срезы мыши гиппокампа. Обзор гиппокампа, показаны гетерогенных Mover выражения (A) и соответствующие Synaptophysin окрашивание (B). Тремя регионами интереса (ГД, рис. 3C; CA3, Рисунок 3E; СА1, Рисунок 3G) определены с белыми пунктирными линиями. (D,F,H) Количественная оценка, сравнивая отношение в соответствующих слоях отношение соответствующего полушария. Цвета гистограммы соответствуют соответствующих затенение в панели, C, Eи G. Движенец выражение высоких уровней, связанных с интра гиппокампа вычисления (т.е., «превращение» слой ГД, radiatum пласта, lucidum и oriens CA3, и слой radiatum и oriens СА1) и температура в основные ввода и вывода слоев ( внутренний и внешний молекулярный слой ГД, пирамидальной клетке слои CA3 и СА1 и слое stratum lacunosum-moleculare о СА1). OML, наружный молекулярный слой; IML, внутренний молекулярный слой; Ост, зернистый слой; ПМЛ, превращение слоя/хилус; ТАК, пласт oriens; Шпион, pyramidale слой; SLu, stratum lucidum; SR, radiatum слой; ОДС, в слое stratum lacunosum-moleculare. Шкалы бар = 500 мкм. черные точки представляют данных точек. Столбцы показывают среднее ± SEM. Этот рисунок был изменен с Wallrafen и Dresbach1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Таблица 1: Решения, используемые в настоящем Протоколе.
Таблица 2: Антитела, используемые в настоящем Протоколе.
Таблица 3: Пример обработки данных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Метод здесь представлены направлена на количественной оценки распределения протеин интереса по отношению к обилие белка маркера с известным распределения. Иммунофлюоресценции пятнать может показать высокая изменчивость окраски интенсивности между различными секторами. Количественная оценка подход, описанный здесь обходит эту проблему, определяя отношение протеин интереса в среднем по всему полушарию. Таким образом различные интенсивности окрашивания через срезы отменяются и позволяют для количественного описания.
Как с каждый протокол иммунофлюоресценции, качественные или количественные, ряд факторов может влиять на успех и тем самым смешаем анализ. Таким образом особое внимание должно уделяться критических шагов протокола. Во-первых необходим надлежащий фиксации ткани. Обычно эта фиксация достигается путем успешного transcardial перфузии. Качество перфузии можно проверить путем проверки печени вскоре после стирки из крови. Первый индикатор для успешного перфузии является Очистка печени и конечностей28. Наличие сгустков крови может указывать, что перфузии, возможно, были слишком медленно и должно выполняться быстрее в следующий раз. Некоторые белки требуют фиксации различных протоколов, как химическая фиксация с PFA может вызвать epitope закупорки30. В этом случае замораживание фиксации или фиксации с различными химическими, таких, как метанол, должны рассматриваться. Во-вторых после разрезания, важно пятно срезы мозга как как можно скорее, предпочтительно на том же или следующий сказать. Больше хранения в PB может привести к бактериальной инфекции и при добавлении НАН3 может предотвратить это в некоторой степени, качество ткани обычно ухудшается с течением времени хранения. В-третьих в процессе окрашивания, важно выполнять Стиральная шаги скважины, чтобы избежать высыхания ломтиков. Когда кусочки высохнуть, фон флуоресценции можно увеличить и таким образом вызвать предвзятость в анализе. В-четвертых после применения вторичных антител, жизненно важно выполнять все следующие шаги в темноте. Флуорофоров чувствительны к свету, и освещенности можно серьезно исказить флуоресценции сигнала.
Оптимизации процедуры на окрашивание, включая выделение адекватных первичных и вторичных антител, оптимальное антитела концентрации и времени экспозиции, является необходимым условием для достижения лучшее соотношение сигнал шум и осуществлять надежный анализ количественных иммунофлюоресценции. Антитела, проверена в нокаут ткани должно быть предпочтительным выбором, хотя и не всегда доступны. Всегда убедитесь, что для надлежащего управления эксперименты для исключения перекрестных помех между различными антител. Количество флуоресцирования фон, вытекающих из аутофлюоресценция и неспецифическим привязки вторичные антитела может быть оценена путем визуализации фрагменты, в которых основное антитело не применялась. Это не тривиальная установить, насколько выше интенсивность сигнала нужно быть по сравнению с фон иметь приемлемого соотношения сигнал шум. Однако основываясь на эмпирических наблюдениях, авторы предлагаю стремится иметь по крайней мере 2 раза сильнее, чем фон сигнала для того чтобы достоверно оценить распределение белка. В случае, если фон флуоресценции в условиях управления (без наличия основного антитела), средняя фоновая флуоресценции следует вычесть из эксперимента изображений.
Основным преимуществом нашего подхода является его внутреннюю ссылку: интенсивность иммунофлюоресценции целевого белка (т.е., двигатель) в регионе интереса сравнивается ссылку маркера (например, synaptophysin) и общей интенсивности Эти белки через всего полушария. Таким образом, из расчета мы выполняем, один однозначно можно заключить, что обилие целевого белка является x раз выше/ниже в определенном регионе интереса чем обилие белка ссылка относительно распределения белков через все полушарие на этом уровне по отношению к Bregma31. Это позволяет для сравнения результатов с использованием различных антител, различные Микроскопы, или даже через различные исследования. Эта согласованность между различными образцы приходит от сравнительный характер этого метода: изменчивость компенсируется принимая отношение между флуоресценции в области интересов и полушария. Таким образом различия в абсолютных значениях, вытекающих из технических различий являются недействительными. Другое главное преимущество этой техники является тот факт, что области интереса может быть как малые, как вы хотите, чтобы ограничиваться только по решению микроскопа. Количественная оценка уровня белка с биохимическими методами, например западной помарке или масс-спектрометрии6,,78,9, требует рассечение тканей в области интересов. Этот рассечение трудно для областей мозга, таких как первичной соматосенсорной коры и становится практически невозможным для субрегионов, таких, как различные слои коры головного мозга и гиппокампе.
Ограничение подхода в том, что различные уровни в мозге нельзя напрямую сравнивать друг с другом. Полушарий со многими регионами богатые белком интерес будет иметь различные среднее значение чем полушариях с только несколько богатых белком регионами. Например, значения 20% выше среднего, поэтому будут отражать различные абсолютное количество белка в одном уровне по сравнению с второй по отношению к Bregma. Надо иметь в виду также, что этот метод не позволяет определение уровня абсолютной белка, только относительное изобилие, по сравнению с внутреннюю ссылку маркера и средний показатель по всему полушарию.
Этот метод может быть легко адаптирована для определения распределения протеина интереса по отношению к маркеры для различных нейрональных отсеков, не только Пресинаптический сайтов. Она также может быть легко адаптирована для тканей, за исключением мозга и - с подходящим антител - другие модель системы, чем мышей32,33. В то время как использование конфокального микроскопа является методом выбора авторов, сочетание эпифлуоресцентного микроскопии и деконволюция программного обеспечения следует дать такое же качество данных и таким образом расширить удобство использования протокола. Кроме того же stainings может использоваться для определения субцеллюлярные распределения, например с суперразрешением микроскопии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы благодарим Ирмгард Weiss за отличную техническую помощь. Авторы признают поддержка Гермес Pofantis и Andoniya Петкова. Авторы также поблагодарить Европейский институт неврологии для использования LSM800 и технической помощи, особенно д-р Нильс Halbsgut. Эта работа финансировалась медицинский центр Гёттингенский университет. ЗАО признает поддержка центром наноразмерных микроскопии и молекулярной физиологии мозга (CNMPB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL reaction tubes | Eppendorf | 30120094 | |
| 50 mL reaction tubes | Greiner Bio-One | 227261 | |
| multiwell 24 well | Fisher Scientific | 087721H | |
| plastic pipette (disposable) | Sarstedt | 861,176 | |
| 1000 mL pipette | Rainin | 17014382 | |
| 2 ml pipette | Eppendorf | 3123000012 | |
| Vortex Genius 3 | IKA | 3340001 | |
| Menzel microscope slides | Fisher Scientific | 10144633CF | |
| Stereoscope | Leica | ||
| LSM800 | Zeiss | Confocal microscope | |
| freezing microtome | Leica | ||
| PBS (10X) | Roche | 11666789001 | |
| PFA | Sigma | P6148-1kg | |
| NaCl | BioFroxx | 1394KG001 | |
| sucrose | neoFroxx | 1104KG001 | |
| Tissue Tek | Sakura | 4583 | OCT |
| Na2HPO4 | BioFroxx | 5155KG001 | |
| NaH2PO4 | Merck | 1,063,460,500 | |
| normal goat serum | Merck Millipore | S26-100ML | |
| normal donkey serum | Merck | S30-100ML | |
| Triton X-100 | Merck | 1,086,031,000 | |
| rabbit anti-Mover | Synaptic Systems | RRID: AB_10804285 | |
| guinea pig anti-Synaptophysin | Synaptic Systems | RRID: AB_1210382 | |
| donkey anti-rabbit AF647 | Jackson ImmunoResearch | RRID: AB_2492288 | |
| goat anti-mouse AF488 | Jackson ImmunoResearch | RRID: AB_2337438 | |
| Mowiol4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| ZEN2 blue software | Zeiss | Microscopy software | |
| FIJI | ImageJ | Analysis software | |
| Microsoft Excel | Microsoft |
References
- Wallrafen, R., Dresbach, T. The Presynaptic Protein Mover Is Differentially Expressed Across Brain Areas and Synapse Types. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 58 (2018).
- Augustin, I., Betz, A., Herrmann, C., Jo, T., Brose, N. Differential expression of two novel Munc13 proteins in rat brain. Biochemical Journal. 337, 363-371 (1999).
- Rosenmund, C., et al. Differential Control of Vesicle Priming and Short-Term Plasticity by Munc13 Isoforms. Neuron. 33, 411-424 (2002).
- Breustedt, J., et al. Munc13-2 differentially affects hippocampal synaptic transmission and plasticity. Cerebral cortex. 20, 1109-1120 (2010).
- Chen, Z., Cooper, B., Kalla, S., Varoqueaux, F., Young, S. M. The Munc13 Proteins Differentially Regulate Readily Releasable Pool Dynamics and Calcium-Dependent Recovery at a Central Synapse. The Journal of Neuroscience. 33, 8336-8351 (2013).
- Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A Defined Methodology for Reliable Quantification of Western Blot Data. Mol Biotechnol. , (2013).
- Charette, S. J., Lambert, H., Nadeau, P. J., Landry, J. Protein quantification by chemiluminescent Western blotting Elimination of the antibody factor by dilution series and calibration curve. Journal of Immunological Methods. 353, 148-150 (2010).
- Heidebrecht, F., Heidebrecht, A., Schulz, I., Behrens, S., Bader, A. Improved semiquantitative Western blot technique with increased quantification range. Journal of Immunological Methods. 345, 40-48 (2009).
- Toki, M. I., Cecchi, F., Hembrough, T., Syrigos, K. N., Rimm, D. L. Proof of the quantitative potential of immunofluorescence by mass spectrometry. Laboratory Investigation. 97, 329-334 (2017).
- Wilhelm, B. G., et al. Composition of isolated synaptic boutons reveals the amounts of vesicle trafficking proteins. Science. 344, 1023-1028 (2014).
- Navone, F., et al. Protein p38: An integral membrane protein specific for small vesicles of neurons and neuroendocrine cells. Journal of Cell Biology. 103, 2511-2527 (1986).
- Gundelfinger, E. D., Reissner, C., Garner, C. C. Role of Bassoon and Piccolo in Assembly and Molecular Organization of the Active Zone. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 7, (2016).
- Ziegler, D. R., Cullinan, W. E., Herman, J. P. Distribution of vesicular glutamate transporter mRNA in rat hypothalamus. Journal of Comparative Neurology. 448, 217-229 (2002).
- Chaudhry, F. A., et al. The vesicular GABA transporter, VGAT, localizes to synaptic vesicles in sets of glycinergic as well as GABAergic neurons. Journal of Neuroscience. 18, 9733-9750 (1998).
- Aoki, C., et al. Electron Microscopic Immunocytochemical SAP-97 at Postsynaptic, Presynaptic, and Nonsynaptic Sites of Adult and Neonatal Rat Visual Cortex. Synapse. 257, 239-257 (2001).
- Valtschanoff, J. G., et al. Expression of NR2 Receptor Subunit in Rat Somatic Sensory Cortex : Synaptic Distribution and Colocalization With NR1 and PSD-95. Journal of Comparative Neurology. 611, 599-611 (1999).
- Hunt, A., Schenker, L. J., Kennedy, B. PSD-95 Is Associated with the Postsynaptic Density and Not with the Presynaptic Membrane at Forebrain Synapses. Journal of Neuroscience. 76, 1380-1388 (1996).
- Luscher, B., Fuchs, T., Kilpatrick, C. L. GABA A Receptor Trafficking-Mediated Plasticity of Inhibitory Synapses. Neuron. 70, 385-409 (2011).
- Kirby, M. Understanding the molecular diversity of GABAergic synapses. 5, 1-12 (2011).
- Harris, K. M., Weinberg, R. J., Verrall, A. W. Ultrastructure of Synapses in the Mammalian Brain. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , 1-30 (2012).
- Heise, C., et al. Selective Localization of Shanks to VGLUT1-Positive Excitatory Synapses in the Mouse Hippocampus. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, (2016).
- Peters, P. J., Yuan, L. C., Biology, C., Branch, M. Localization of TGN38 to the trans-Golgi network: involvement of a cytoplasmic tyrosine-containing sequence. Journal of Cell Biology. 120, 1123-1135 (1993).
- Antonini, D., et al. Tprg, a gene predominantly expressed in skin, is a direct target of the transcription factor p63. Journal of Investigative Dermatology. 128, 1676-1685 (2008).
- Burre, J., et al. Synaptic vesicle proteins under conditions of rest and activation: Analysis by 2-D difference gel electrophoresis. Electrophoresis. 27, 3488-3496 (2006).
- Kremer, T., et al. Mover is a novel vertebrate-specific presynaptic protein with differential distribution at subsets of CNS synapses. FEBS Letters. 581, 4727-4733 (2007).
- Ahmed, S., et al. Mover Is a Homomeric Phospho-Protein Present on Synaptic Vesicles. PLoS ONE. 8, (2013).
- Körber, C., et al. Modulation of Presynaptic Release Probability by the Vertebrate-Specific Protein Mover. Neuron. 87, 521-533 (2015).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. , 1-9 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, (2012).
- Schneider Gasser, E. M., et al. Immunofluorescence in brain sections: simultaneous detection of presynaptic and postsynaptic proteins in identified neurons. Nature Protocols. 1, 1887-1897 (2006).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , ACADEMIC PRESS. (2001).
- Sun, Y., Ip, P., Chakrabartty, A. Simple Elimination of Background Fluorescence in Formalin-Fixed Human Brain Tissue for Immunofluorescence Microscopy. Journal of Visualized Experiments. , 1-6 (2017).
- Poole, A. R., Dingle, J. T., Mallia, A. K. The localization of retinol-binding protein in rat liver by immunofluorescence microscopy. Journal of Cell Science. 394, 379-394 (1975).
