Summary
典型的には、マウスネック注射モデルは、プリトゲン誘発傷の挙動を評価するために使用される。ただし、モデルはかゆみに関する情報のみを提供し、痛みはありません。ここでは、痛みとかゆみに関連する行動を同時に測定するために使用できるマウスに頬注射モデルを導入する。
Abstract
かゆみは、1941年にロスマンによって「傷をつける欲求を引き起こす不快な皮膚感覚」と定義されました。マウスモデルでは、スクラッチの試合は、通常、pruritogenによって誘発されるかゆみを評価するためにカウントされます。しかし、以前の報告では、アルジェシス物質はマウスネック注射モデルでも引っ掻き動作を誘発し、これは引っ掻き行動に使用される最も一般的なテストであることが示されています。この発見は、マウスのかゆみを研究することが困難になります。 対照的に、カプサイシン、一般的なアルゴゲンは、いくつかの首の注射実験で傷の行動を減少させた。したがって、傷の行動に対する痛みの影響は不明のままである。したがって、行動テストを用いてかゆみや痛みの感覚を同時に調査する方法を開発する必要があります。ここでは、痛みやかゆみに関連する行動を同時に測定するために使用できる頬注射モデルを紹介します。このモデルでは、pruritogenは引っ掻き動作を誘発し、アルジェクザルはワイピング行動を誘発する。このモデルを使用して、リソホスファチ酸(LPA)は、かゆみを有する胆嚢患者に見られるかゆみメディエーターであり、かゆみを排他的に誘発するが、痛みを誘発しないことが示される。しかし、マウスモデルでは、LPAはプルトゲンとアルゴゲンの両方であることが報告されている。マウス頬注射モデルにおけるLPAの効果に関する調査では、LPAは引っ掻き傷のみを誘発し、拭き取る動作は行わないことが示された。これは、LPAがマウスとヒトにおいて同様にプルリトゲンとして作用することを示し、かゆみ研究のための頬注射モデルの有用性を示す。
Introduction
かゆみはもともと皮膚表面から有害な物質を除去するために引っ掻く行動を誘発する感覚として特徴付けられた。しかし、かゆみは、アトピー性皮膚炎、神経原性病変、およびコレスタ症1などの多くの疾患によって引き起こされる不快な感覚のための治療の焦点となっている。これらの場合、かゆみは痛みに似た深刻な不快な感覚です。したがって、かゆみは重要な研究目標を表す。引っ掻き行動は、動物実験におけるかゆみの主要な指標であり、マウスの首2,3の皮膚にプルリトゲンを注入することによって引っ掻き行動を誘発することができる。しかし、以前の研究では、アルゴゲンであるカプサイシンも首の注射モデル4で引っ掻く行動を誘発し、このモデルではかゆみを痛みから区別することが困難であることを示しました。 対照的に、カプサイシンは、首の注射モデルで傷の行動を減少させ、傷の行動に対する痛みの影響が複雑であり、実験条件に依存することを示すことがわかった。 したがって、痛みとかゆみ関連の行動の同時測定は、プルトゲンとアルゴゲンの正確な分析を可能にします。スティーブン・G・シマダとロバート・H・ラモットは、注射部位を首から頬4に変更することで、痛みとかゆみに関連する行動の同時測定に成功した。頬注射モデルでは、カプサイシンは拭き取りを誘発したが、引っ掻く行動はしないが、ヒスタミンはプリトゲンであるが、引っ掻き行動のみを誘発した。したがって、このモデルはかゆみおよび痛みの独立した評価を可能にし、頬注射はかゆみの研究のための有用なモデルを作る。試験物質がプルトゲンおよび/またはアルゴゲンであるかどうかを判断しようとすると、このモデルは、ネックインジェクションモデルよりも多くの情報を提供します。本稿では、頬注射を行い、傷や拭き取りの発作を数える実用的な方法について説明し、リソホスファチ酸(LPA)によって誘発される傷の挙動を評価するためのこの方法の有用性を示す。
Protocol
動物の世話と使用に関するすべての手順は、国立自然科学研究所(16A074)の機関動物ケア・使用委員会によって承認され、国立研究所のガイドラインに従って実施されました。生理学
注:本・ スティーブン・島及び・ロバート・・・島・ロバート・ラモト・.ミラー、記録あたりのマウス数、マウスのひずみ、ケージのサイズ、および記録時間。
1. 頬インジェクションモデル
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実験準備
- ケージ
- 図 1に示すように、カメラの下に 4 つのケージを設定します。マウスがお互いを見ないように画面を設定します。各ケージに各マウスを入れ、マウスの脱出を防ぐためにアクリル蓋を設定します。温度、湿度、音が制御される環境で録音を行う必要があります。
注:ケージが十分に高い場合は、蓋なしで動作を記録することもできます。
- 図 1に示すように、カメラの下に 4 つのケージを設定します。マウスがお互いを見ないように画面を設定します。各ケージに各マウスを入れ、マウスの脱出を防ぐためにアクリル蓋を設定します。温度、湿度、音が制御される環境で録音を行う必要があります。
- 針と注射器
- 試験物質の注入には、0.5 mLの注射器に取り付けられた29Gまたは30Gの針を使用します。試験物質溶液が粘性が高い場合は、より大きな針が必要です。しかし、大きな針は、追加の物理的な副作用を提起いことに注意してください。
注:ポリエチレン管で注射器に接続された針を使用することができます。
- 試験物質の注入には、0.5 mLの注射器に取り付けられた29Gまたは30Gの針を使用します。試験物質溶液が粘性が高い場合は、より大きな針が必要です。しかし、大きな針は、追加の物理的な副作用を提起いことに注意してください。
- ビデオカメラ
- フレームレートが十分に高いビデオカメラ(30~60フレーム/秒)で、スクラッチの測定や拭き取り動作に比較的高い解像度を持つビデオカメラを使用します。
- ビデオ解析用ソフトウェア
- ビデオの再生と分析には、ビデオ編集ソフトウェアを使用します。正確な分析には、早送りモードとフレームバイフレーム再生モードが必要です。
- ケージ
図1:ビデオカメラとケージのセットアップ。アクリル蓋付きアクリルケージ4種、マウスの脱出を防止するために、伝染性かゆみを防ぐためのスクリーンが用いられる。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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インジェクションとレコーディング
- 実験の1日前に、毛のバリカンでマウスの頬に毛皮を剃ります(ムービー1)。シェービングの前に、マウスを拘束しないでください。
注:CD-1またはC57BL/6マウスは、主にこのモデル4、5で使用された。本稿では、雄6〜12週齢のC57BL/6Nマウスを用いた。化学物質に対する感度は、様々なマウス株3、6、7の間で異なる場合がある。 - シェービングの1日後、記録条件に順応するために1時間、記録ケージにマウスを移動します。局所アプリケーションを使用する場合は、この順応期間中に適用します。
注:本報告では、生理塩水中のジフェンヒドラミン塩酸塩の2%(w/v)の10μLを記録前に局所的に30分塗布した。 - ケージの上にビデオカメラをセットし、試験物質注入の前にビデオ録画を開始します。覚醒条件下で剃った頬に内皮内に試験物質の10μL溶液を注入する(ムービー2)。注射後、マウスを記録ケージに戻します。
注:この報告では、50 μg/10 μLヒスタミン、40 μg/10 μLカプサイシンまたは車両(生理食中7%のツエン80)を試験物質として使用した。 - ケージの蓋を閉め、30分間ビデオ録画を続けます。
注:合計記録時間は実験条件によって異なります。
- 実験の1日前に、毛のバリカンでマウスの頬に毛皮を剃ります(ムービー1)。シェービングの前に、マウスを拘束しないでください。
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行動分析
- スクラッチの試合とワイピングの動作をそれぞれカウントします。マウスは後ろ足を頬に向かって上げ、1秒または数秒かけて数回引っ掻き、足を下ろします。この一連のアクションは、1 つのスクラッチの試合としてカウントされます。他の領域のスクラッチはカウントしないでください。マウスは、拭き取り用に単一の前足を使用し、グルーミングには両方の前肢を使用します。これらのアクションは区別する必要があります。ワイピング動作のみが痛みに関連する動作としてカウントされます。
注:各アクションは、図 2、ムービー 3、ムービー 4、およびムービー 5に示されています。
- スクラッチの試合とワイピングの動作をそれぞれカウントします。マウスは後ろ足を頬に向かって上げ、1秒または数秒かけて数回引っ掻き、足を下ろします。この一連のアクションは、1 つのスクラッチの試合としてカウントされます。他の領域のスクラッチはカウントしないでください。マウスは、拭き取り用に単一の前足を使用し、グルーミングには両方の前肢を使用します。これらのアクションは区別する必要があります。ワイピング動作のみが痛みに関連する動作としてカウントされます。
図2:記録中の一般的なマウスのアクティビティ。パネルA-Cは、右前脚(A)で拭き取り動作を表すイラスト、右後肢(B)での引っ掻き動作(B)、両方の前肢(C)でのグルーミング挙動を表しています。マウスは後ろ足を頬に向かって上げ、1秒または数秒かけて数回引っ掻き、その脚を下に置きます。この一連のアクションは、1 つのスクラッチの試合としてカウントされます。他の領域のスクラッチはカウントしないでください。マウスは、拭き取り用に単一の前足を使用し、グルーミングには両方の前肢を使用します。これらのアクションは区別する必要があります。ワイピング動作のみが痛みに関連する動作としてカウントされます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
2. ネックインジェクションモデル
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インジェクションとレコーディング
- 実験の1日前に、約5%のイソファルネ吸入後に2〜3分間、マウスの首のうなぎに毛を剃ります。
- シェービングの1日後、記録条件に順応するために1時間、記録ケージにマウスを移動します。
- ケージの上にビデオカメラをセットし(図1)、試験物質注入前にビデオ録画を開始します。覚醒条件下で剃った首に内皮的に試験物質の10 μL溶液を注入します。注射後、マウスを記録ケージに戻します。
注:本稿では、50 μg/10 μLヒスタミン、10μg/10 μLまたは40μg/10 μLカプサイシン、または車両(生理食中の7%の12en 80)を試験物質として使用した。 - ケージの蓋を閉め、30分間ビデオ録画を続けます。
注:合計記録時間は実験条件によって異なります。
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行動分析
- スクラッチの試合の動作をカウントします。マウスは首に向かって後ろ足を上げ、1秒または数秒にわたって数回引っ掻き、その脚を下に置きます。この一連のアクションは、1 つのスクラッチの試合としてカウントされます。他の領域のスクラッチはカウントしないでください。
注:傷の作用は頬注射モデルのそれと似ていますが、傷の位置が首にシフトする点が異なります。
- スクラッチの試合の動作をカウントします。マウスは首に向かって後ろ足を上げ、1秒または数秒にわたって数回引っ掻き、その脚を下に置きます。この一連のアクションは、1 つのスクラッチの試合としてカウントされます。他の領域のスクラッチはカウントしないでください。
Representative Results
ネックインジェクションモデルでは、ヒスタミンが強い引っ掻き動作を誘発しました(図3)。車両(生理生理中の7%の12en 80)も引っ掻き動作を誘発した。以前の報告では、洗剤がケラチノサイト8からのヒスタミン産生によってかゆみを誘発することを示した。Tween 80は同様のメカニズムによってかゆみを誘発する可能性があるが、カプサイシンは以前の報告4に反して、車両誘発の引っ掻き動作を減少させる。マウスひずみの違いがこれらの異なる結果を説明する可能性があります。これらの知見は、傷の行動に対する痛みの影響が複雑であることを示している。したがって、痛みとかゆみ関連の行動の同時測定は、プルトゲンとアルゴゲンの正確な分析を可能にする可能性があります。頬注射モデルでは、カプサイシンは引っ掻き動作を誘発せず、痛み9、10、11(図4)に関連すると考えられるワイプ行動のみを誘発した。カプサイシン注射はまた、グルーミング動作を増加させた (データは示されていません).頬への注射に続いて、ヒスタミンは主に弱い拭き取り行動で引っ掻く行動を誘発した。抗ヒスタミン剤の適用は、ジフェンヒドラミン、スクラッチを阻害した。この結果は、ヒスタミン誘発引っ掻き作用がヒスタミン受容体に対するヒスタミンの作用によって引き起こされていることを示唆している。ここで、一例として、頬注射モデルにおけるLPAの効果を示す(図5)。LPAはかゆみを伴う胆管静的患者に見られるかゆみメディエーターである。しかし、マウスモデルでは、LPAは、プルリトゲンとアルゴゲン12、13、14、15の両方として報告された。したがって、頬注射モデルでLPAの効果を調べた結果、LPAが引っ掻き傷を誘発したが、拭き取り動作は示さなかった。これは、LPAがヒトにおけるその効果と同様のマウスにおいて、アルゴゲンではなく、プルリトゲンであることを示している。
図3:頸部注射モデルにおけるヒスタミンとカプサイシンの効果(A)車両の注入によって誘発される引っ掻き行動(生理食/開き正方形で7%の10)、ヒスタミン(1部当たり50μg/10 μL、充填された円)またはカプサイシン(サイトあたり10 μg/10 μL、オープントライアングル;40 μg/10 μL/サイトあたり、充填された三角形)を首に5分ごとに合計30分間評価した(B)パネルA.*P<0.01 aNOVAに続くパネルの30分間の傷の行動の定量分析補正。データは平均±SEM(n=6-8)として示される。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:頬注射モデルにおけるプルリトゲンとアルゴゲンの効果。ワイピング(A)およびスクラッチ(B)は、車両の注入によって誘発される挙動(生理食生理食生理食、開いた正方形で7%のトゥエン80)、ヒスタミン(1部当たり50μg/10 μL、充填された円)またはカプサイシン(サイト当たり40μg/10 μL、満たされた三角形)をマウスの右頬に入れた。合計30分間5分ごとに評価した。開界円として示された群を、ヒスタミン注射(1部当たり50μg/10 μL)前に30分の間に2%(w/v)ジフェンヒドラミン塩酸塩(DHHCL)の10μLで処理した。DHHClを生理理生理生理知に溶解させた。パネルAおよびBの30分の間のワイピング(C)および引っ掻き(D)の行動の定量的分析;n = 1群あたり8匹の動物。※P < 0.05, *P < 0.01 by ANOVA によるボンフェロニ補正が続きます。データは平均±SEMとして表示されます。
図5:LPAは傷を誘発するが、頬注射モデルでは拭き取り動作を誘発しない。マウスの右頬に車両(生理食べ物、開いた正方形)またはLPA(100nmol/10 μL、充填された円)を注射することによって誘発されるスクラッチ(A)およびワイピング(B)の挙動を、合計30分間5分毎に評価した。パネルAおよびBの30分の間にスクラッチ(C)およびワイピング(D)の動作;車両の場合は n = 17、LPA の場合は n = 20 です。※P < 0.05, ※P < 0.01 ウェルチのtテストによる。データは平均±SEMとして表示されます。この図はキタカら5から変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
ムービー1:マウスの頬を剃る方法を示すムービーはこちらをクリックしてこの動画を見てください。(右クリックしてダウンロードしてください。
ムービー2:マウスの頬に注射を示すムービーはこちらをクリックしてこの動画を見てください。(右クリックしてダウンロードしてください。
ムービー 3: 一般的なワイピング動作を示すムービー。この映画は25%の速度で上映されます。このビデオを見るにはここをクリックしてください。(右クリックしてダウンロードしてください。
ムービー 4: 典型的な傷の動作のムービー. このビデオを見るにはここをクリックしてください。(右クリックしてダウンロードしてください。
ムービー 5: 典型的なグルーミング動作のムービー。この映画は25%の速度で上映されます。このビデオを見るにはここをクリックしてください。(右クリックしてダウンロードしてください。
Discussion
この記事では、頬注射モデルが導入され、痛みやかゆみに関連する行動の分析に有用であることが示される。
以前の報告では、マウスネック注射モデル4において、アルジェシカル物質が引っ掻き動作を引き起こすことが示された。対照的に、カプサイシンは他の首の注射実験で傷の挙動を減少させた(図3)。したがって、傷の行動に対する痛みの影響は不明のままである。したがって、行動テストを通じて痛みやかゆみを同時に調査する方法を開発する必要があります。頬注射モデルを用いることで、痛みとかゆみの両方に対する物質の効果を評価することができる。
細胞内LPAがLPA誘発かゆみ5のメカニズムとしてTRPV1およびTRPA1を直接活性化すると以前に報告されている。したがって、LPA誘発性かゆみはヒスタミン独立である可能性がある。以前の研究はまた、頬注射モデルがヒスタミンに依存しないかゆみ16の評価に使用できることを示した。したがって、このモデルは、ヒスタミン依存性および-独立性のかゆみの両方に使用することができる。
この実験の重要なステップの1つは注射である。これは急性行動テストであるため、これらの行動に影響を与える可能性があるため、注射ステップでは麻酔を使用できません。したがって、正確な注射を行うためには、マウスをしっかりと保持する必要があります。動物のホールドが安全でない場合、特に強いアルゴゲンを注入する場合、マウスは、不正確な注入量と深さにつながる、結果を解釈するのが困難につながる、苦労することがあります。マウスを取り扱う場合は、親指と人差し指の間の皮膚を引っ張って、マウスの動きを抑制します。
もう 1 つの重要なステップは、動作分析です。スクラッチは非常に速いので、ビデオを注意深く見る必要があります。また、拭き取りはグルーミングと区別するのが難しい場合があります。したがって、最初の実験では、カプサイシンなどの陽性制御化学物質の使用が推奨される。記録と再生の条件は、両方の動作のカウントにも影響を与える可能性があります。動作を明確に観察することが困難な場合は、ケージの周りにミラーを使用して視野角を高めることができます4.
なお、頬注射モデルは、頸部注射モデルよりも試験された化学物質の定量精度が低下する可能性があることに留意すべきである。図3及び図4に示すように、同量のヒスタミンは頬モデルよりも首モデルにおいてより多くの引っ掻き動作を誘発し、首インジェクションモデルにおいてより小さな変動を示した。試験された物質が頬注射モデルで低いアルゲス効果を有するプルリトゲンであることが示されたら、ネック注射モデルは追加の定量分析のために推奨される。これらの限界がある場合でも、頬注射モデルは、特にかゆみ研究の分野で、試験物質の正確な評価に有用である。
Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
スティーブン・G・シマダ博士とロバート・H・ラモット博士(コネチカット州イェール大学医学部)に感謝しています(参考4)。また、マウスイラストを作成してくださった宮原健太郎さんにも感謝します。本研究は、文部科学省の科学研究助成金(第15H02501号、M.T.15H05928号、16K21691~H.K.)、上原記念財団(H.K.)の助成を受けました。イェール大学のラモット教授による頬注射法の導入に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Capsaicin | Sigma | M2028 | |
| Diphenhydramine hydrochloride | Wako | 044-19772 | |
| Histamine | Sigma | H7125 | |
| iMovie | Apple | ||
| Lysophosphatidic acid | Avanti Polar Lipids | 325465-93-8 | |
| Myjector | Terumo | ss-05M2913 | |
| Tween-80 | Sigma | P4780 | |
| Video camera | Panasonic | VX985M |
References
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