Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Identifikation af mediatorer af T-celle receptoren signalering via Screening af kemiske hæmmer biblioteker

Published: January 22, 2019 doi: 10.3791/58946
Automatic Translation
*1, *2,3, *1, 1, 1,4
1Department of Microbiology and Immunology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 2Singapore Immunology Network, A*STAR, 3Curiox Biosystems, 4Department of Immunobiology, Rega Institute for Medical Research, Katholieke Universiteit (KU) Leuven
* These authors contributed equally

Summary

Dette papir bruger en flow-flowcytometri-baserede assay til skærmen biblioteker af kemiske hæmmere for identifikation af hæmmere og deres mål, der har indflydelse på T-celle receptoren signalering. De metoder, der beskrives her kan også udvides til høj overførselshastighed screeninger.

Abstract

T-celle receptoren (TCR) signalering pathway består af et væld af mæglere, der overfører signaler ved aktivering af TCR. Forskellige strategier er blevet foreslået og gennemført for identifikation af nye mediatorer af TCR signalering, som ville forbedre forståelsen af T-celle processer, herunder aktivering og thymic udvalg. Vi beskriver en screening assay, der muliggør identifikation af molekyler, der har indflydelse på TCR signalering baseret på aktivering af udvikle thymocytter. Stærke TCR signaler forårsage udvikle thymocytter at aktivere apoptotiske maskiner i en proces kendt som negative valg. Gennem anvendelsen af kinase hæmmere er dem med mål, der påvirker TCR signalering tilsidesætte processen med negative valg. Metoden beskrevet i dette papir kan bruges til at identificere hæmmere af canonical kinaser med etablerede roller i TCR signaling veje og hæmmere af nye kinaser endnu at være etableret i TCR signaling veje. Screening strategi her kan anvendes på skærme med højere overførselshastighed for identifikation af roman druggable mål i TCR signalering.

Introduction

T-celler er en slægt af lymfocytter, spiller en central rolle i opretholdelsen af adaptive immunitet. De udtrykke TCR, som gør det muligt for dem at anerkende deres ligander, komplekser bestående af en større histocompatibility komplekse molekyle (MHC) med en bundne peptid, som findes på overfladen af antigen-præsentere celler (PMV'er). Udløsning af TCR signalering vej gennem TCR/MHC samspil er afgørende for T-celle aktivering og udvikling af1.

I T-celle udvikling overflytte knogle-marv-afledte hæmatopoietisk stamceller (HSCs) til thymus, hvor de gennemgår differentiering og gå gennem faser af T-celle lineage progression2. Dobbelt-positive (DP) thymocytter, udtrykker både CD4 og CD8 coreceptors, engagere sig self-peptid/MHC på de pansrede mandskabsvogne. Thymocytter med en moderat affinitet for deres self-peptid/MHC ligander modne til at blive single-positive (SP) CD4 eller CD8 thymocytter, en proces, der betegnes som positiv markering. Omvendt gennemgå thymocytter, der modtager overdreven TCR stimulering gennem self-peptid/MHCs apoptose via negative valg3,4. Denne proces af stimulation-induceret, caspase-afhængige apoptose kan være efterlignede in vitro- ved at stimulere thymocytter, for eksempel med anti-CD3/28 antistof-perler5. Modne T-celler, der passerer udvælgelsesprocessen er aktiveret af ikke-self-peptid/MHC ligander fra PMV'er i periferien. Self-peptid/MHCs er stadig relevante for perifert T-celler i forbindelse med tonic signalering for overlevelse og homeostatiske spredning, differentiering af hjælper T-celler og styrkelse af T-celle svar til ikke-self-peptid/MHCs gennem coagonism6,7,8,9. Høj-affinitet TCR binding til peptid/MHC ligand aktiverer flere downstream signaling veje, som involverer mange signaling molekyler danner en kompleks TCR signalering network10. Den TCR signaling veje er blevet studeret i flere årtier, og endnu opdagelsen af nye mediatorer af vejen viser ingen tegn på aftagende11,12. Graduering af TCR signaling veje har klinisk relevans og kan involvere forstærkende T-celle Svar nemlig immunterapeutisk applikationer eller hæmning af T-celle svar til kontrol af autoimmunitet13. Strategier for graduering af T-celle svar afhænge hovedsagelig af afbrydelse af kinase eller fosfatase aktivitet14,15,16.

Vi beskriver en anvendelse af en flow-flowcytometri-baserede assay for screening af små kemiske forbindelser for deres evne til at modulere TCR signalering og T-celle aktivering17. Analysen hængsler på fænomenet med thymocytter aktivering apoptose pathway når de udsættes for stærk TCR signaler. Analysen er tilstrækkeligt følsomme til at identificere ændringer i stimulation styrke; inkubere thymocytter udtrykker transgene TCR med peptid/MHC tetramers med stigende affinitet resulterede i en tilsvarende stigning i caspase aktivering-bruges som en målestok for den apoptotiske svar5. For skærmen, vi brugte et bibliotek af kinase hæmmere og vurderet deres evne til at modulere thymocyte svar på stærk TCR signaler.

Flere flow-flowcytometri-baserede eller fluorescens-reporter-baserede strategier er blevet beskrevet for high throughput screening af et sortiment af perifere aktivering fænotyper i forskellige T-celle subsets. Sådanne strategier omfatter brug af genetiske fluorescerende journalister at vurdere tidspunktet for og omfanget af T-celle aktivering18, brug af degranulering som en udlæsning af cytotoksiske T-celle aktivitet19,20, og analysen af de fosforylering af forskellige proteiner involveret i cellulær signalering21.

Screening analysen præsenteres her er købedygtig med held identificere stoffer, der hæmmer kanoniske molekyler af TCR signalering pathway, såvel som potentielle, nye forbindelser med hæmmende effekter på TCR signalering. For eksempel, identificeret vi hæmmere af GSK3β og Hsp90 som nye stoffer der påvirker T-celle svar17. Analysen er i stand til at skelne de hæmmere, der interfererer med signaltransduktion, på grund af en reduktion i apoptotiske svar fra TCR-uafhængig virkninger for hæmmere cellulære toksicitet. Ud over induktion af apoptose måle vi også CD69 Opregulering og TCR downregulation som markører for aktivering. Som TCR signalering netværk er kompleks, kan brug af flere udlæsninger øge chancerne for at opdage molekyler med specifikke virkninger på en enkelt vej. Her, har vi også indføre brugen af en centrifugering-uafhængig protokol som en høj overførselshastighed alternativ til den originale protokol under farvning af celler i forberedelse til flow cytometric analyse. Analysen er beskrevet i dette dokument bruger en lille sammensatte bibliotek af kinase hæmmere, men i princippet kan det bruges til højere throughput screening. Bibliotek valg kan også optage en række hæmmere eller andre molekyler.

Protocol

I denne undersøgelse, blev 6 til 8 uger gamle mandlige og kvindelige C57Bl/6 mus brugt. Musene blev avlet i Dyrefacilitet på National University of Singapore (Singapore). National University of Singapore institutionelle dyrs pleje og brug udvalg (IACUC) godkendt alle dyreforsøg.

1. forberedelse af Thymocyte Suspension

  1. Aflive mus i en CO2 sal.
  2. Udføre efterfølgende trin i en vævskultur hætte til at undgå enhver forurening af cellekulturer. Sikre mus slagtekroppen til dissektion bord, ved hjælp af stifter, og spray musen med 70% ethanol.
  3. Brug et par saks, lave et lodret snit på den ventrale side, startende fra underlivet mod kæben. Gør yderligere indsnit langs hver af bagbenene. Strække huden til at udsætte brystkassen og pin det ned.
  4. Skære mellemgulvet og begge sider af brystkassen fra den bageste ende med en saks. Løft brystkassen og pin det ned til eksponere thymus. Separat bindevævet knyttet til thymus og udtrække thymus ved hjælp af en buet pincet.
  5. Placer brissel i en brønd på en 6-godt plade der indeholder 5 mL af komplet RPMI medier.
    Bemærk: Overveje at tilføje 10% trækul-strippet føtal bovint serum (FBS) til medierne for at forbedre thymocyte levedygtighed, hvis en lang ventetid forventes mellem dissektion og stimulation assay.
  6. Forsigtigt mash thymus, brug den stumpe ende af en sprøjte, og passerer en 70 µM celle si cellerne. Alternativt, for at indsamle thymocytter i en sundere tilstand, overveje at bruge to par pincet klemme thymus og indsamle thymocytter denne strøm ud af thymic epitel.
  7. Gå videre til celle tælle, ved hjælp af en hemocytometer eller en automatiseret celle tælle instrument.

2. titrering af Kinase hæmmere for ugiftige koncentrationer

Bemærk: Dette afsnit fokuserer på at forberede hæmmere til brug i T-celle aktivering skærme. Hæmmere anvendes i høje koncentrationer kan forårsage celledød, som er en udlæsning af T-celle aktivering skærme. Serien af fortyndinger af hæmmere sigter mod at fastslå den endelige koncentration af de enkelte hæmmere, der ikke bør inducerer apoptose uafhængigt af TCR stimulation. Biblioteket i kinase hæmmere anvendes i denne undersøgelse blev købt fra en ekstern leverandør. Listen over hæmmere er inkluderet i Tabellen af materialer.

  1. Fremstilling af plader af kinase hæmmere ved lavere koncentrationer
    1. For at forberede en plade af hæmmere på 1 mM, tilføjes 10 µL af hæmmere 90 µL af dimethylsulfoxid (DMSO) for alle hæmmere.
      Bemærk: Hæmmere fra små-molekyle biblioteket anvendes i denne undersøgelse kommer i en bestand koncentration på 10 mM. Hvis hæmmere er i en pellet skema, Følg trinene anbefalede rekonstitution fra leverandørerne. Hvis hæmmere ikke leveres på 10 mM, forberede hæmmer pladerne på alternative relevante koncentrationer i stedet, og tilberedes separat serielle fortyndinger af hæmmere med en egnet fortyndingsfaktoren.
      Forsigtig: I tilfælde af giftige hæmmere, Følg producentens anvisninger om sikker håndtering og bortskaffelse.
    2. For at forberede en plade af hæmmere på 0,1 mM, tilføjes 10 µL af hæmmere fra pladen af 1 mM hæmmere 90 µL af DMSO.
    3. For at forberede en plade af hæmmere på 0,01 mM, tilføjes 10 µL af hæmmere fra pladen af 0,1 mM hæmmere 90 µL af DMSO.
  2. Behandling af thymocytter med kinase hæmmere
    1. Forberede en thymocyte suspension som punkt 1.
    2. Fortynd thymocytter i komplet RPMI til at opnå en thymocyte suspension af 5 x 106 celler/mL.
    3. Tilføje 200 µL af thymocyte suspension til alle huller i en 96-brønd pladen, ved hjælp af en multikanalpipette.
    4. Hver brønd, tilføje 2 µL af hæmmere fra de tilsvarende godt af pladen som indeholder 1 mM hæmmere (slutkoncentration af hæmmere er 10 µM).
    5. I den samme plade, forberede fire brønde af ubehandlet kontrol, fire brønde i 5 µM dexamethason-behandlede positive kontroller og fire brønde af køretøjet-behandlede negative kontroller, ved at tilføje 2 µL af DMSO.
    6. Inkuber thymocytter i et 37 ° C, 5% CO2 inkubator for 17-20 h (eller natten over).
  3. Bestemmelse af egnet koncentrationen af enkelte hæmmere
    1. Spin plade af thymocytter på 300 x g og 4 ° C i 5 min. Resuspend celler i 250 µL af FACS wash buffer.
    2. Kør en cytometric analyse af prøverne og analysere resultater med et flow flowcytometri analyse program.
    3. Bestemme procentdelen af levende celler baseret på FSC-SSC gating. Gating strategien er vist i figur 1B.
    4. Beregn et gennemsnit af procentdelen af levende celler baseret på DMSO-behandlede kontrolelementer, som er normaliseret på 100%. Angive en vilkårlig vindue af acceptable celledød (e.g.,20%). Hæmmere, der resulterede i en procentdel af levende celler under dette vindue (dvs.., under 80% af kontrolelementerne DMSO-behandlet) der skal testes igen ved lavere koncentrationer.
    5. For de hæmmere, der ikke gjorde pass levedygtighed kriterier i trin 2.3.4, Gentag trinene fra trin 2.2.1 - 2.3.4, men bruge plade af hæmmere på 0,1 mM til trin 2.2.4 i stedet for pladen indeholdende 1 mM-hæmmere. Den endelige koncentration af hæmmere anvendes her er 1 µM.
    6. For de hæmmere, der stadig producerer høje niveauer af celledød på 1 µM, teste hæmmere på 0,1 µM. Gentag trin 2.2.1 - 2.3.4, men bruge plade af hæmmere på 0,01 mM i skridt 2.2.4. Den endelige koncentration af hæmmere anvendes her er 0,1 µM.
  4. Forberedelse af en bestand plade af kinase hæmmere
    1. For hæmmere anvendes på 10 µM, tilføjes 10 µL af 10 mM hæmmere 10 µL af DMSO.
    2. Hæmmere anvendes på 1 µM, tilføje 1 µL af 10 mM-hæmmere til 19 µL af DMSO.
    3. Hæmmere anvendes på 0,1 µM, tilføje 1 µL af 10 mM-hæmmere til 199 µL af DMSO (figur 1 c).
      Bemærk: Den forberedte stock plade af hæmmere er 500 x koncentrationen af den tiltænkte endelige koncentration når føjet til thymocyte suspensioner. Stock pladen af hæmmere kan tilberedes i PCR strimler eller i 96-brønd plader.
    4. Stock pladen af kinase hæmmere kan anvendes til thymocytter for screening i en konventionel centrifugering-afhængige system (afsnit 3, se figur 1A, metode 1 og 2) eller i et alternativt centrifugering-uafhængige system (afsnit 4; Se Figur 1A, metode 3).

3. kinase Inhibitor bibliotek Screening (konventionelle Centrifuge-baseret analyse)

  1. Behandling af thymocytter med kinase hæmmere
    1. Forberede en thymocyte suspension som punkt 1.
    2. Fortynd thymocytter i komplet RPMI til at opnå en thymocyte suspension af 5 x 106 celler/mL.
    3. Tilføje 200 µL af thymocytter til hver brønd med en 96-brønd plade, ved hjælp af en multikanalpipette. Pladen anbringes på is.
    4. Tilsæt 0,5 µL af hæmmere til 96-brønd pladen fra de tilsvarende pladens huller, hæmmer stock forberedt i afsnit 2.4.
    5. Forbered otte wells af ubehandlet kontrol. Forberede fire brønde af køretøjet-behandlede kontrolelementer ved at tilføje 0,5 µL af DMSO. Forberede fire brønde i 5 µM dexamethason-behandlede kontrolelementer (figur 2).
  2. Stimulation af thymocytter ved hjælp af anti-CD3/CD28 perler
    1. 1 ml af perler og vaske perler med 2 mL PBS. Adskille perler ved hjælp af en magnetisk stå og Opsug løsningen. Resuspend perlerne i 5 mL af komplet RPMI.
      Bemærk: Forholdet mellem perler til celler er 1 til 2,5. Justere mængden af perler at tage, afhængigt af antallet af brønde til at stimulere og antallet af thymocytter anvendes.
    2. Tilføje 50 µL af perler til hver inhibitor-behandlede prøve, de fire DMSO-behandlede prøver, og fire af de otte ubehandlede prøver. Tilføje 50 µL af komplette RPMI til de resterende fire ubehandlede brønde. Figur 2 viser det generelle layout af pladen.
    3. Bland indholdet af brøndene ved hjælp af en multikanalpipette.
    4. Inkuber thymocytter i et 37 ° C, 5% CO2 inkubator for 17-20 h (eller natten over).
  3. Farvning af overflade antigener
    1. Forbered et antistof farvning blanding indeholdende anti-TCRβ, anti-CD4, anti-CD8 og anti-CD69 antistoffer. Fortynd antistoffer i FACS vaskebuffer (PBS suppleret med 0,5% bovint serumalbumin [BSA]) i forholdet 1:200 (v/v).
      Bemærk: Overveje at optimere antistof titers bruges til farvning, stedet for at bruge faste antistof fortyndinger, at minimere variationen i farvning på tværs af forskellige eksperimenter og at forbedre signal-støj-forhold.
    2. Spin plade på 300 x g og 4 ° C i 5 min.
    3. Svirp plade for at skille sig af med løsningen.
    4. På dette punkt i protokollen kan følge den konventionelle centrifuge-afhængige protokol (Fortsæt til trin 3.3.5, se figur 1A, metode 1) eller den alternative centrifugering-uafhængig protokol (Fortsæt til trin 4.4.4, se figur 1A, metode 2).
    5. Resuspend celler i 75 µL af farvning antistof blandingen forberedt i trin 3.3.1.
    6. Bland prøver ved hjælp af en multikanalpipette og dem der inkuberes i isbad i 30 min.
  4. Fiksering af celler
    1. Brøndene vaskes med 200 µL af FACS wash buffer og spin plade på 300 x g og 4 ° C i 5 min.
    2. Svirp plade for at skille sig af med løsningen.
    3. Tilføje fiksering/permeabilization buffer (leveres med aktive caspase-3 apoptose kit; samme med 10 x perm/vaskebuffer nævnt i trin 3.5.1 og anti-caspase-3 antistof i trin 3.5.2) på 200 µL pr. brønd.
    4. Der inkuberes i isbad i 30 min.
  5. Intracellulær farvning for aktive caspase 3
    1. Forberede 1 x perm/wash buffer ved fortynding af 5 mL 10 x perm/wash buffer i 45 mL i ultrarent vand.
    2. Forbered intracellulære aktive caspase pletten ved at tilføje 1,3 mL af anti-caspase-3 antistof til 6,5 mL 1 x perm/wash buffer. Forholdet mellem antistof til perm/wash buffer er 1:5.
    3. Spin plade på 300 x g og 4 ° C i 5 min. svirp plade til at skille sig af med løsningen. Vask pladen med 200 µL 1 x perm/wash buffer.
    4. Gentag trin 3.5.3.
    5. Spin plade på 300 x g og 4 ° C i 5 min. svirp plade til at skille sig af med løsningen. Tilføje 75 µL af intracellulære caspase pletten forberedt i trin 3.5.2 i alle pladens huller.
    6. Bland prøver ved hjælp af en multikanalpipette og inkuberes i isbad i 1 h.
    7. Vaske prøver med 200 µL 1 x perm/wash buffer og spin plade på 300 x g og 4 ° C i 5 min.
    8. Svirp plade for at skille sig af med løsningen. Vask pladen med 200 µL 1 x perm/wash buffer. Spin plade på 300 x g og 4 ° C i 5 min.
    9. Svirp plade for at kassere løsningen og resuspend prøverne i 200 µL af FACS wash buffer.
    10. Kør en cytometric analyse af prøverne og analysere resultater med en FACS analyse program.
    11. Bruger et CD4 og CD8 plot, gate på befolkningen i DP thymocytter med et positivt udtryk for både CD4 og CD8 (figur 2, nederste halvdel). Inden for DP thymocyte gate, bestemme procentdelen af celler med aktiveret caspase-3, med den unstimulated prøve som negativ kontrol og dexamethason som den positive kontrol. For analyse af udtryk for CD69 i DP thymocyte gate, brug den unstimulated prøve som den negative kontrol og stimuleret prøven som den positive kontrol.
      Bemærk: Når gating på DP thymocytter, kontrollere, at befolkningen i DP thymocytter er gated korrekt for individuelle prøver. Stimuleret celler nedregulere overflade coreceptors og utilsigtede udelukkelse af arrangementer kan forekomme, hvis en stram DP gate bruges.

4. kinase Inhibitor bibliotek Screening (Centrifuge-uafhængig analyse)

  1. Behandling af thymocytter med kinase hæmmere
    1. Forberede en thymocyte suspension som punkt 1.
    2. Fortynd thymocytter i komplet RPMI til at opnå en thymocyte suspension af 25 x 106 celler/mL.
    3. Tilføje 40 µL af thymocytter til hver brønd med en lille volumen plade, ved hjælp af en multikanalpipette. Pladen anbringes på is.
    4. Fortynd hæmmere fra stock plade, DMSO og dexamethason i komplet RPMI i forholdet fire dele af komplette RPMI til en del af inhibitor/DMSO/dexamethason (fortyndingsfaktoren 5).
      Bemærk: Som de mængder, der anvendes i denne små-volumen plade 5 x mindre end i den konventionelle metode, inhibitorer og kontrol reagenser er fortyndet femdoblet før du føjer dem til thymocytter i pladen.
    5. Tilføje 0,5 µL af hæmmere til 96-brønd plade fra de tilsvarende pladens huller, hæmmer forberedt i trin 4.1.4.
    6. Forbered otte wells af ubehandlet kontrol. Forberede fire brønde af køretøjet-behandlede kontrolelementer ved at tilføje 0,5 µL af DMSO forberedt i trin 4.1.4. Forberede fire brønde i 5 µM dexamethason-behandlede kontrol, ved hjælp af den fortyndede dexamethason forberedt i trin 4.1.4 (figur 2).
  2. Stimulation af thymocytter ved hjælp af anti-CD3/CD28 perler
    1. Sørg for, at perlerne er ensartet genopslemmes. 1 ml af perler og vaske dem med 2 mL PBS. Adskille perler ved hjælp af en magnetisk stå og Opsug løsningen. Resuspend perlerne i 1 mL af komplet RPMI.
      Bemærk: Forholdet mellem perler til celler er 1 til 2,5. Justere mængden af perler, afhængigt af antallet af brønde til at stimulere og antallet af thymocytter anvendes.
    2. Tilføje 10 µL af perle suspension til hver inhibitor-behandlede prøve, de fire DMSO-behandlede prøver, og fire af de otte ubehandlede prøver. Tilføje 10 µL af komplette RPMI til de resterende fire ubehandlede brønde. Figur 2 viser den generelle plade layout.
      NOTE: Den endelige mængden af brøndene er 50 µL, som ligger inden for den maksimale kapacitet af brøndene. Det er vigtigt at udvise forsigtighed og holde pladerne oprejst, at undgå cross-godt spild.
    3. For at blande, agitere pladen ved hjælp af en mikrotiterplade orbitalryster. Alternativt kan du blande indholdet af brøndene ved hjælp af en multikanalpipette.
    4. Inkuber thymocytter i et 37 ° C, 5% CO2 inkubator for 17-20 h (eller natten over) med en anti-fordampning låg.
  3. Opsætning af plade-skive
    Bemærk: Instruktioner for at konfigurere plade vaskemaskinen er leveret af producenten. Trinene er nævnt kort nedenfor. Omtrent er 150 mL af opløsning nødvendig for hvert priming trin.
    1. Prime vask system med 70% ethanol indeholdende 1% Tween 20.
    2. Prime vask system med deioniseret vand indeholdende 1% Tween 20.
    3. Prime vask system med FACS wash buffer.
  4. Farvning af overflade antigener
    1. Forbered et antistof farvning blanding indeholdende anti-TCRβ, anti-CD4, anti-CD8 og anti-CD69 antistoffer. Fortynd antistoffer i FACS wash buffer i forholdet 1: 100 (v/v).
    2. Vask plade 9 x, ved hjælp af 55 µL af FACS wash buffer pr. vask, ved hjælp af den automatiserede laminar flow vask system.
      Bemærk: For enden af vasker, vil der være 25 µL af residualvolumen i hver brønd.
    3. Resuspend celler i 25 µL af farvning antistof blandingen forberedt i trin 4.4.1.
    4. Hvis prøverne er overført fra en 96-brønd plade (fra trin 3.3.4), resuspend celler i 50 µL antistof blanding forberedt i trin 3.3.1, og overføre prøverne til små-volumen plade. Dette trin svarer til metode nummer 2, som afbilledet i figur 1A.
    5. At blande, agitere pladen med en mikrotiterplade orbitalryster eller blande prøver ved hjælp af en multikanalpipette, og der inkuberes i isbad i 30 min.
  5. Fiksering af celler
    1. Vask plade 9 x, ved hjælp af 55 µL af FACS wash buffer pr. vask, ved hjælp af den automatiserede laminar flow vask system.
    2. Tilføje fiksering/permeabilization buffer (leveres med aktive caspase-3 apoptose kit; samme med 10 x perm/vaskebuffer nævnt i trin 4.6.1 og anti-caspase-3 antistof i trin 4.6.2) i 50 µL pr. brønd.
    3. Der inkuberes i isbad i 30 min.
  6. Intracellulær farvning for aktive caspase 3
    1. Forberede 1 x perm/wash buffer ved fortynding af 25 mL 10 x perm/wash buffer i 225 mL i ultrarent vand.
    2. Forberede intracellulære aktive caspase pletten ved tilsætning af 1 mL af anti-caspase-3 antistof til 2 mL 1 x perm/wash buffer. Forholdet mellem antistof til perm/wash buffer er 1:2.
    3. Prime vask system med 1 x perm/wash buffer.
    4. Vaske plade 9 x med 1 x perm/vaskebuffer, på 55 µL for hver vask.
    5. Tilsæt 25 µL af intracellulære caspase pletten forberedt i trin 4.6.2 i alle pladens huller.
    6. At blande, agitere pladen med en mikrotiterplade orbitalryster eller blande prøver ved hjælp af en multikanalpipette, og der inkuberes i isbad i 1 h.
    7. Vaske plade 9 x med 1 x perm/vaskebuffer, på 55 µL for hver vask.
    8. Tilføj 25 µL af FACS vaskebuffer i alle pladens huller.
    9. Overføre prøverne til mikrotiter rør efter passende blanding via pipettering.
    10. Tilføje en anden 50 µL af FACS vaskebuffer Tom brønde og Gentag trin 4.6.9.
    11. Gentag trin 4.6.9 og 4.6.10 2 x indtil 200 µL af prøverne er indsamlet i mikrotiter-rør.
      Bemærk: Formålet med fremgangsmåden i trin 4.6.10 og 4.6.11 er at sikre en maksimal nyttiggørelse af celler fra små-volumen plade. Hvis celle numre er ikke en bekymring, efter trin 4.6.10, rør simpelthen top op mikrotiter til 200 µL med FACS wash buffer.
    12. Kør en cytometric analyse af prøverne og analysere resultater med en FACS analyse program, som pr trin 3.5.11. Caspase-3 aktivering og CD69 udtrykket analyseres i porten indeholdende CD4+CD8+DP thymocytter.

Representative Results

Tilgang til screening analysen er sammenfattet i figur 1A. Kinase-hæmmere blev først screenet for deres latente virkninger på thymocyte levedygtighed. Som positiv kontrol for apoptose, blev dexamethason brugt som en proapoptotic agent. Gating for den levende celle befolkning blev fastsat baseret på ubehandlet negative kontroller og dexamethason-behandlede positive kontroller (figur 1B). Hæmmere blev først testet på 10 µM på thymocytter, og procentdelen af levedygtige celler blev målt efter inkubation i 18 timer. Et 20% vindue for celledød blev valgt således, at forbindelser der induceret en større end 20% tab af celler i den levende celle gate, sammenlignet med DMSO-behandlede prøver, blev testet ved lavere koncentrationer (figur 1B). Repræsentative FACS parceller af inhibitor-behandlede stikprøver er vist at illustrere levedygtighed assay. LY294002 (2-(4-morpholinyl)-8-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one; CAS 154447-36-6), en PI3K hæmmer22, steg ikke kraftigt celledød på 10 µM, og hæmmer blev brugt på 10 µM til de efterfølgende assays. CAY10626 (N-[2-(dimethylamino)ethyl]-N-methyl-4-[[[4-[4-(4-morpholinyl)-7-(2,2,2-trifluoroethyl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-2-yl]phenyl]amino]carbonyl]amino]-benzamide; CAS 1202884-94-3), en dobbelt hæmmer af PI3Kα/mTOR23, induceret høje niveauer af celledød på 10 µM og på 1 µM, men ikke på 0,1 µM og 0,1 µM var fast besluttet på at være den passende koncentration til anvendelse i downstream assays. Staurosporine (2,3,10,11,12,13-hexahydro-10R-methoxy-9S-methyl-11R-methylamino-9S,13R-epoxy-1H,9H-diindolo[1,2,3-gh;3',2',1'-lm]pyrrolo[3,4-j][1,7]benzodiazonin-1-one; CAS 62996-74-1), en pan-protein kinase C hæmmer med en etableret evne til at inducere apoptose24, induceret betydelig celledød i alle koncentrationer testet, selv på 0,1 µM. Det blev brugt i efterfølgende assays på 0,1 µM som en supplerende positiv kontrol.

De endelige koncentrationen af hæmmere blev udvalgt på grundlag af de højeste koncentrationer, hvori de ikke forstærke celledød ved mere end 20% af prøverne DMSO-behandlede. Med den endelige koncentration af hæmmere bestemmes, blev en bestand plade af hæmmere udarbejdet sådan, at alle hæmmere var 500 gange koncentration når anvendt på cellerne. Figur 1 c viser plade layout af stock plade, med den endelige koncentration af hæmmere. I den alternative protokol af inkubere celler direkte i de små-volume plader for laminar flow vask assay, nødvendiggjorde brugen af små mængder en yderligere fortynding af hæmmere. For at sikre at DMSO indhold kulturer efter hæmmer desuden ikke ville være for høj for cellerne, hæmmere blev fortyndes yderligere i komplet RPMI, med en fortyndingsfaktor 5, sådan at de var på 100 gange den tilsigtede koncentration når de påføres den celler.

Hæmmere, fortyndet til ugiftige koncentrationer, blev anvendt i analysen for TCR-stimulering-induceret apoptose i thymocytter5,17. Stimulation blev udført ved hjælp af anti-CD3/CD28 perler til 18 h, og cellerne blev efterfølgende farvet for caspase-3 aktivering i CD4+ og CD8+ DP thymocyte befolkning (figur 2). En forøgelse af caspase-3 aktivering og CD69 udtryk, og også en TCR downregulation, blev observeret i både anti-CD3/CD28-stimuleret og DMSO-mock-behandlede anti-CD3/28-stimuleret prøverne, i forhold til de nonstimulated prøver. Dexamethason-behandlede prøverne viste en stigning i caspase-3 aktivering uafhængigt af CD69 Opregulering, som forventes af apoptose-inducerende effekt er uafhængig af TCR stimulation.

Figur 3A opsummerer resultaterne af biblioteket screening assay for udvalgte hæmmere. Både caspase-3 aktivering og CD69 kan bruges til at identificere potentielle hæmmere af interesse på grund af undertrykkelse af ytringsfriheden. Som forventet, dukkede hæmmere af canonical mediatorer af TCR signalering op som positive hits i skærme. Sådanne hæmmere, som udstillede varierende grader af hæmmende potens, inkluderet bredspektret hæmmere, der er målrettet mod flere kinaser og også mere specifikke hæmmere. Nogle hæmmere var i stand til at undertrykke både caspase-3 aktivering og CD69 Opregulering (figur 3B, øverste række, venstre paneler). En sådan inhibitor er bisindolylmaleimide II (3-(1H-Indol-3-yl)-4-[1-[2-(1-methyl-2-pyrrolidinyl)ethyl]-1H-indol-3-yl]-1H-pyrrole-2,5-dione; CAS 137592-45-1), som hæmmer alle protein kinase C isoformer, ud over protein kinase A og PDK125,26,27. En anden hæmmer i denne kategori er CAY10657 (3-[(aminocarbonyl)amino]-5-[4-(4-morpholinylmethyl)phenyl]-2-thiophenecarboxamide; CAS 494772-86-0), en foreslåede hæmmer af IKK228.

Der var forbindelser, der hæmmede CD69 Opregulering men ikke forringe caspase-3 aktivering (figur 3B, øverste række, højre paneler). CAY10626, en hæmmer af PI3Kα og mTOR23, og U-0126 (2,3-bis [amino [(2-aminophenyl) thio] methylen]-butanedinitrile; CAS 109511-58-2), en MEK hæmmer29, var nogle af de identificerede hæmmere. Resultaterne viser, at forskellige hæmmere målretter anderledes kinaser fra specifikke grene af TCR signalvejen, navnlig rettet mod sene kinaser, kan resultere i den selektive værdiforringelse af T-celle aktivering fænomener.

Der var også hæmmere, der ikke undertrykke både CD69 Opregulering og caspase-3 aktivering (figur 3B, nederste række, venstre paneler). Paclitaxel (βS-(benzoylamino) - αR - hydroxy-benzenepropanoic syre, (2aR,4S,4aS,6R,9S,11S,12S,12aR,12bS)-6,12b-bis(acetyloxy)-12-(benzoyloxy)-2a,3,4,4a,5,6,9,10,11,12,12a,12b-dodecahydro-4,11-dihydroxy-4a,8,13,13-tetramethyl-5-oxo-7 , 11-methano-1H-cyclodeca[3,4]benz[1,2-b]oxet-9-yl ester; CAS 33069-62-4), en disruptor mikrotubulus dynamics30og necrostatin-5 (2-[[3,4,5,6,7,8-hexahydro-3-(4-methoxyphenyl)-4-oxo[1]benzothieno[2,3-d]pyrimidin-2-yl]thio]-acetonitrile; CAS 337349-54-9), en hæmmer af RIP1 kinase31, er to hæmmere identificeret til at være i denne kategori. I sådanne tilfælde, hvor CD69 Opregulering og caspase-3 aktivering ikke var nedsat, dette kan på grund af hæmmere ikke er rettet mod en relevant kinase af TCR signalering pathway.

Som tidligere nævnt, blev staurosporine brugt i skærme, i en koncentration, der stadig induceret apoptose i thymocytter. Som forventet, staurosporine-behandlet prøven viste høje niveauer af caspase-3 aktivering (figur 3B, nederste række, højre kolonne). De lave niveauer af CD69 udtryk kan tilskrives en staurosporine-medieret hæmning af PKC, som bisindolylmaleimide II, en anden pan-PKC inhibitor, også undertrykt udtryk for CD69. Alternativt, staurosporine induceret apoptose i cellerne før de var i stand til at upregulate CD69 udtryk.

For at øge gennemløb og automatisering af protokollen, blev parallelle protokoller, der involverede anvendelse af en automatiseret plade vask system via laminar flow udarbejdet. To adskilte protokoller ved hjælp af automatiserede plade vask enheden blev trialed og i forhold til den konventionelle metode til dyrkning af celler i 96-brønd plader og farvning celler i en protokol, centrifugering-afhængige. Én metode involveret dyrkning af celler i 96-brønd plader, som standard procedure, og derefter overføre cellerne til plader kompatibel med automatiseret plade skive for farvning trin (figur 4, DA-vask prøver). Anden metoden involveret dyrkning af celler direkte i plade-skive-kompatible plader og fortsætter med farvning protokollen om den samme plade (figur 4, DA-kultur prøver). Centrifugering-uafhængig protokoller giver ikke mange iagttages forskelle i aktive caspase-3, CD69, eller TCRβ farvning på tværs af de forskellige stikprøver, der undersøges i forhold til de konventionelle centrifugering-afhængige protokol (figur 4). Forskelle i farvning intensiteten kan tilskrives ved hjælp af antistoffer på lidt forskellige koncentrationer under farvning trin.

Figure 1
Figur 1 : Thymocyte levedygtighed efter behandling med hæmmere. (A) eksperimentelle oversigt over de vigtigste trin i screening assay. Der er tre foreslåede metoder til stimulering og farvning af thymocytter bruges i aktivering analysen, nemlig (1) dyrkning af thymocytter i standard 96-brønd plader, efterfulgt af farvning ved hjælp af en konventionel centrifugering-baseret protokol, (2) dyrkning af thymocytter i standard 96-brønd plader, efterfulgt af farvning ved hjælp af en protokol, centrifugering-uafhængig vask, og (3) dyrkning af thymocytter i små-volumen plader, efterfulgt af farvning i de samme plader ved hjælp af en centrifugering-uafhængig vask protokol. (B) Gating strategier, der anvendes i levedygtighed assays. Den levende celle gate var afledt af den forward scatter (FSC) og side scatter (SSC) grunde, som tidligere beskrevet17. Hæmmere, der blev anset for at være alt for giftige på den testkoncentration blev udsat for yderligere levedygtighed assays på 10-fold lavere koncentrationer. Inhibitor-behandlede vareproever er vist. Bemærk den fælles kontrol (DMSO-behandlede [DMSO]) anvendes til den 1 µM og 0,1 µM prøver. (C) plade layout af fortyndede hæmmere. En skematisk fremstilling af plader af hæmmere fortyndet i DMSO til en koncentration af 500 x den tiltænkte endelige koncentration. Hver repræsenterer godt en unik hæmmer; grå brøndene er tomme. Koncentrationerne vist er den endelige koncentration når føjet til cellekulturer, nemlig 10 µM (mørk rød), 1 µM (fuchsia) og 0,1 µM (blå). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Plade layout af thymocyte aktivering assay. (Top) Kolonne 1 og 12 er reserveret til kontrol, mens kolonner 2 til 11 er inhibitor-behandlede prøver (beige). Den negative kontrol (nonstimulated [IF], grey) indtager wells A1 til D1, og den positive kontrol for celledød (dexamethason-behandlede [DEX]; lilla) indtager wells E1 til H1. Kolonne 2 til 12 indeholder thymocytter stimuleret med anti-CD3/CD28 perler. Den positive kontrol for thymocyte aktivering (stimuleret prøver [α-CD3/CD28]; grøn) indtager wells A12 D12, og køretøjet kontrol (stimuleret og DMSO-behandlede [α-CD3/CD28 + DMSO]; rød) indtager wells E12 til H12. (Nederst) Flow flowcytometri parceller af aktive caspase-3 (ActCasp3), CD69, og TCRβ farvning af thymocytter låge i dobbelt-positive (DP) gate. Repræsentative parceller på de forskellige kontrolelementer er vist. IF = nonstimulated; DEX = dexamethason-behandlede prøver; Α-CD3/CD28 + DMSO = prøver stimuleret med CD3/CD28-belagte perler og behandlet med DMSO; Α-CD3/CD28 = prøver stimuleret med CD3/CD28-belagte perler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Screening af inhibitor bibliotek på thymocyte aktivering. (A) opsummerede data for aktivering assay. Disse er resultatet af en repræsentativ eksperiment viser de normaliserede værdier af celler med aktiveret caspase-3 og CD69 udtryk for udvalgte hæmmere. Normalisering blev udført ved at sammenligne procentdelen af celler i den aktive-caspase-3-positive eller CD69-positive gate til værdien af kontrolelementet DMSO-behandlet, der er indstillet til en relativ værdi på 0 i grafen. (B) valgt FACS parceller. Flow flowcytometri parceller af hæmmere, der undertrykkes både caspase-3 aktivering og CD69 Opregulering (øverst til venstre), undertrykt kun CD69 Opregulering (øverst til højre), eller havde ingen effekt på caspase-3 aktivering og CD69 Opregulering (nederst til venstre). Parceller i eksemplet staurosporine-behandlet er vist at illustrere effekten af at bruge en inhibitor i giftige koncentrationer (nederst til højre). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : Sammenligning af forskellige assay protokoller. Flow flowcytometri parceller af aktive caspase-3 (ActCasp3), CD69, og TCRβ farvning af DP thymocytter efter de tre forskellige assay protokoller. Fire forskellige betingelser er testet, nemlig den negative kontrol (nonstimulated [IF]), den positive kontrol for celledød (dexamethason-behandlede [DEX]), køretøjet kontrol (stimuleret og DMSO-behandlede [α-CD3/CD28 + DMSO]), og en inhibitor-behandlede prøven (stimuleret og PIK-75-behandlede [α-CD3/CD28 + PIK-75]). Konventionelle = dyrkning af thymocytter i standard 96-brønd plader og farvning med en konventionel centrifugering-baseret protokol; DA-vask = dyrkning af thymocytter i standard 96-brønd plader og farvning, ved hjælp af et laminar flow vask protokol; DA-kultur = dyrkning af thymocytter i små-volumen plader og farvning i de samme plader ved hjælp af et laminar flow vask protokol.  Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Screening strategi foreslås her evalueres små-molekyle hæmmere evne til at undertrykke de apoptotiske virkninger i thymocytter efter stimulation, ud over mere konventionelle markører for T-celle aktivering-CD69 Opregulering og TCR downregulation . Yderligere markører kan også inkluderes aktiverer analyse af forskellige thymocyte delmængder32. Et interessant aspekt af den nuværende assay ligger i det faktum, at hæmmere, der hindrer TCR signalering også ville dæmpe induktion af apoptose, yderligere fremhæve sondringen af TCR-uafhængig virkninger hæmmere kan have på overtalelse celledød. Derudover tillader en flow-flowcytometri-baserede assay brug af flere udlæsninger som særskilte aktivering markører, som kunne rapportere virkningerne af hæmmere på separate enkelte grene af TCR signalering. I sagen forelagt her, var der hæmmere, der viste en differentieret hæmning af caspase-3 aktivering og CD69 Opregulering. Fordi nogle forbindelser kan påvirke husholdning funktioner såsom proteinsyntese eller vesikulær handel, er det ikke overraskende at observere følger opregulering af de novo syntetiseres markører (f.eks. CD69), men ikke på posttranslationelle ændringer (f.eks. proteolytiske aktivering af caspase-3).

Som analysen præsenteret her foranstaltninger apoptose som en udlæsning, er det bydende nødvendigt, at de latente giftige virkninger af hæmmere ikke overskygge resultaterne. For eksempel, i skærmbilledet, vi ikke fortyndes staurosporine ud over 1 nM, selv om den stadig er giftigt for celler ved denne koncentration. De repræsentative resultater er i overensstemmelse med staurosporine at være en promiskuøs kinase inhibitor og en inducer af apoptose33. Uden en tilstrækkelig fortynding af de stoffer testet for ugiftige koncentrationer, er det muligt at overse potentielle hits.

Screening strategi detaljeret her ville være vanskeligt at anvende til mennesker på grund af komplikationer forbundet med at opnå tilstrækkelig antal thymocytter for high throughput screening. Det er dog muligt at få menneskelige thymus prøver fra pediatric hjerte biopsier34,35 eller fostre36,37. Ikke desto mindre, som TCR signalering veje og aminosyresekvenser af signalering proteiner er stort set bevaret mellem mus og mennesker, thymocyte analysen giver en nyttig indledende screening strategi, og eventuelle resultater opnået med denne analyse ved hjælp af musen thymocytter kan, derefter, verificeres i primære humane lymfocytter.

En begrænsning af den konventionelle centrifugering-afhængige protokol vedrører udsigten til celletab, som kan tilskrives den omstændelig karakter af den proces, som indebærer skridt såsom celle permeabilization og centrifugering. Hver centrifugering og resuspension trin uundgåeligt resulterer i tab af celler. Mens sådanne tab ikke kan være afgørende for undersøgelser, hvor et begrænset antal prøver, kan det give problemer når de anvendes i højere-throughput screening, især som assay format skrider fra 96 - til 384 - til 1536-godt. En måde at omgå dette problem er ved hjælp af celle-gennemtrængelige fluorescerende caspase sensorer38 at muliggøre påvisning af caspase aktivering samtidig undgå komplikationer af celle permeabilization og flere vasker5. Alternativt kan du er ansætte en centrifugering-uafhængig metode til vask celler af laminar flow også muligt for at minimere celletab. Med en automatiseret plade vask station i forbindelse med en væg-mindre plade, vaskes celler af laminar flow uden brug af en centrifuge. Den eksponentielle fortynding af reagenser giver mulighed for en grundig og effektiv afskylning af celler i mindre end 3 min., hvilket svarer til en tilsvarende fortynding til to runder af centrifugal vask. Uden eksterne belastninger på grund af centrifugering, cellerne er mere holdbar og celle tab minimeres.

Vi har også undersøgt muligheden af at anvende automatiserede pladen vask station efter dyrkning thymocytter i 96-brønd U-bunden plader og også dyrkning af celler direkte i væggen-mindre plader kompatibel med automatiseret pladen vask station. Dyrkning af celler i væg-mindre plader aktiveret afskaffelse af alle centrifugering trin og minimeret celletab ved at eliminere behovet for en stikprøve overførsel på tværs af pladerne. Generelt, de tre forskellige protokoller er sammenlignelige i både stimulation effektivitet og farvning. Den automatiserede vask station giver fordelen ved automatisering, hastighed og effektivitet, hvilket gør det lettere for højere overførselshastighed analyse. Desuden, med øget automatisering, vask trin kan udføres hurtigere, og der er en større sammenhæng mellem eksperimenter eller eksperimentatorer. Vask station har imidlertid visse ulemper: store mængder af vask buffere er nødvendige for skive priming (150 mL per buffer ændring, hvoraf 50 mL bruges til vask); ekstra pleje er nødvendig, når håndtering pladen til at undgå enhver krydskontaminering af brønde på grund af begrænset opdeling mellem wells af små-volumen plade; resterende buffer på 25 µL i brøndene efter vask kræver anvendelsen af reagenser tilberedes på en højere end 1 x koncentration. For at løse problemer af residualvolumen og begrænset mængde kapacitet på pladen, kan tilbehør til at udvide inkubation volumen fra 70 µL til 150 µL tilføjes, at lette vedtagelsen af konventionelle protokoller. Mens automatiserede plade håndtering systemer er i øjeblikket tilgængelige, har de en betydelig fodaftryk i forhold til laminar vask system, som er en lille enhed af ~ 1 kubik fod (~0.028 m3). Desuden er integration af centrifugering i automatiserede plade håndteringssystemer udfordrende, begrænse deres brug i celle vask. Der er i øjeblikket ingen anden centrifuge-uafhængig celle vask instrumenter til rådighed, så vidt vi ved.

Screening strategien præsenteret her er købedygtig identificere små molekyler og deres påståede mål kinaser, der påvirker TCR signalering og T-celle aktivering. Biblioteket bruges her består hovedsageligt små-molekyle hæmmere af kinaser og var i stand til at generere en række potentielt interessant hits. Protokollen kan også anvendes let, hæmmer biblioteker af andre enzym klasser eller andre typer af små molekyler og biblioteker af andre stoffer (fx, forskellige makromolekyler). Protokollen kan også bruges til at screene andre celletyper, som perifert T-lymfocytter eller udødeliggjort celler, herunder dem, der udtrykker transgene TCRs eller transporterer reporter systemer. At identificere og karakterisere nye mediatorer af T-celle signalering kan forbedre vores viden om den signalvejen og også støtte i udviklingen af målrettede terapi i immune sygdomme13,14,15, 16. i alle, denne undersøgelse tilføjer til rækken af tilgængelige muligheder for påvisning af mæglere af T-celle signalering via high throughput screening assays.

Disclosures

Forfatteren Chyan Ying Ke er ansat af Curiox Biosystems, som producerer DA-cellen skive og DA-cellen plader anvendes i denne artikel.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Singapore Ministry of Healths nationale medicinske Forskningsråd, NMRC CBRG15may017 og Singapore Ministeriet for uddannelse, 2014-T2-1-136 (til N.R.J.G.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI HyClone SH30027FS
FBS HyClone SH3007103
L-Glutamine HyClone SH3003401
Sodium pyruvate HyClone SH3023901
Penicillin/Streptomycin HyClone SV30010
b-mercaptoethanol Sigma Aldrich 516732 
10X PBS Vivantis PB0344 – 1L
Kinase Screening Library (96-Well) Cayman Chemical 10505 Exact contents of the library may vary
DMSO Sigma Aldrich D2650
Dexamethasone Sigma Aldrich D4902 
anti-CD3/CD28 beads Thermo Fisher Scientific 11452D
FITC Active Caspase-3 Apoptosis Kit BD Pharmingen 550480 Contains Fixation/Permeabilisation buffer, 10X Perm/Wash buffer and anti-caspase 3 antibody
DA-Cell Washer CURIOX HT1000
96-well DA-Cell Plate CURIOX 96-DC-CL-05
Antibodies
CD3e BioLegend 100236
TCRb BD Biosciences 553174
CD4 BD Biosciences 740007
CD8 BD Biosciences 563786
CD69 eBioscience 25-0699-42
Inhibitors
TG003 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
PKC 412 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Doramapimod Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Paclitaxel Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Erlotinib Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Necrostatin-5 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
NVP-BEZ235 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Phthalazinone pyrazole Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AG-879 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
1-NA-PP1 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Torin 1 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Bisindolylmaleimide II Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
BIBF 1120 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
SMI-4a Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Bisindolylmaleimide XI (hydrochloride) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CAY10657 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AS-703026 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Chelerythrine chloride Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Tunicamycin Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
GSK 1059615 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Ruxolitinib Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Necrostatin-1 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
SB 505124 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
INK128 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Canertinib (hydrochloride) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
SB 431542 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
PD 173074 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Valproic Acid (sodium salt) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
PD 0325901 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
SB 203580 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
VX-702 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Emodin Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CHIR99021 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
BIO Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Imatinib (mesylate) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Sunitinib Malate Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Gefitinib Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
PP2 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
3-Methyladenine Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Bisindolylmaleimide I Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Bisindolylmaleimide IV Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Bisindolylmaleimide V Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
NSC 663284 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
D 4476 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
NU 7026 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
H-9 (hydrochloride) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Indirubin-3'-monoxime Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
KN-62 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
KN-93 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CGP 57380 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Iso-Olomoucine Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
(S)-Glycyl-H-1152 (hydrochloride) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Bisindolylmaleimide VIII (acetate) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
ST638 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
SU 6656 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
LY364947 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
SB 203580 (hydrochloride) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CAY10621 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
YM-201636 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
ZM 447439 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AS-041164 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
NVP-AEW541 (hydrochloride) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
PP242 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
ABT-869 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CAY10622 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
17β-hydroxy Wortmannin Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CAY10626 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
SU 6668 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CAY10572 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
N,N-Dimethylsphingosine Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
LY294002 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
U-0126 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Staurosporine Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
KN-92 (hydrochloride) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AS-605240 (potassium salt) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
O-1918 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Y-27632 (hydrochloride) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Leelamine Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
PD 98059 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
PD 169316 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
TGX-221 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
(S)-H-1152 (hydrochloride) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AS-605240 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
D-erythro-Sphingosine C-18 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
OSU03012 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
JNJ-10198409 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Leelamine (hydrochloride) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Arachidonic Acid Leelamide Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Lauric Acid Leelamide Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AS-252424 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CAY10505 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
PI-103 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
PIK-75 (hydrochloride) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Sphingosine Kinase Inhibitor 2 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Piceatannol Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
SC-1 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
(R)-Roscovitine Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
BAY-43-9006 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CAY10561 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AS-604850 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
PI3-Kinase α Inhibitor 2 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
ML-9 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Triciribine Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Erbstatin Analog Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Kenpaullone Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Olomoucine Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AG-494 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AG-825 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AG-1478 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
SB 216763 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
SB 415286 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AG-17 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
H-8 (hydrochloride) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
LFM-A13 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
SC-514 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Apigenin Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AG-18 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CAY10554 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
DRB Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
RG-13022 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
RG-14620 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AG-490 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AG-82 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AG-99 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AG-213 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AG-183 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Lavendustin C Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
ZM 336372 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
5-Iodotubercidin Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
SB 202190 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CAY10571 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Nilotinib Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
SP 600125 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
L-threo-Sphingosine C-18 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
H-89 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
HA-1077 (hydrochloride) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AG-370 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Wortmannin Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AG-1296 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
KT 5823 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Janex 1 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CAY10574 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CAY10575 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CAY10576 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
NH125 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
TWS119 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
NSC 210902 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CAY10577 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CAY10578 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
PD 184161 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CCT018159 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Myricetin Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gascoigne, N. R., Rybakin, V., Acuto, O., Brzostek, J. TCR Signal Strength and T Cell Development. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32, 327-348 (2016).
  2. Rothenberg, E. V., Moore, J. E., Yui, M. A. Launching the T-cell-lineage developmental programme. Nature Reviews Immunology. 8 (1), 9-21 (2008).
  3. Klein, L., Hinterberger, M., Wirnsberger, G., Kyewski, B. Antigen presentation in the thymus for positive selection and central tolerance induction. Nature Reviews Immunology. 9 (12), 833-844 (2009).
  4. Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of T cells. Annual Review of Immunology. 21, 139-176 (2003).
  5. Rybakin, V., Gascoigne, N. R. Negative selection assay based on stimulation of T cell receptor transgenic thymocytes with peptide-MHC tetramers. PLoS One. 7 (8), e43191 (2012).
  6. Krogsgaard, M., Juang, J., Davis, M. M. A role for "self" in T-cell activation. Seminars in Immunology. 19 (4), 236-244 (2007).
  7. Nakayama, T., Yamashita, M. The TCR-mediated signaling pathways that control the direction of helper T cell differentiation. Seminars in Immunology. 22 (5), 303-309 (2010).
  8. Hoerter, J. A., et al. Coreceptor affinity for MHC defines peptide specificity requirements for TCR interaction with coagonist peptide-MHC. The Journal of Experimental Medicine. 210 (9), 1807-1821 (2013).
  9. Zhao, X., et al. Nonstimulatory peptide-MHC enhances human T-cell antigen-specific responses by amplifying proximal TCR signaling. Nature Communications. 9 (1), 2716 (2018).
  10. Fu, G., et al. Fine-tuning T cell receptor signaling to control T cell development. Trends in Immunology. 35 (7), 311-318 (2014).
  11. Wang, D., et al. Tespa1 is involved in late thymocyte development through the regulation of TCR-mediated signaling. Nature Immunology. 13 (6), 560-568 (2012).
  12. Fu, G., et al. Themis sets the signal threshold for positive and negative selection in T-cell development. Nature. 504 (7480), 441-445 (2013).
  13. Rosenblum, M. D., Gratz, I. K., Paw, J. S., Abbas, A. K. Treating human autoimmunity: current practice and future prospects. Science Translational Medicine. 4 (125), (2012).
  14. Hebeisen, M., et al. SHP-1 phosphatase activity counteracts increased T cell receptor affinity. The Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1044-1056 (2013).
  15. Wang, R. E., et al. An immunosuppressive antibody-drug conjugate. Journal of the American Chemical Society. 137 (9), 3229-3232 (2015).
  16. Borroto, A., et al. First-in-class inhibitor of the T cell receptor for the treatment of autoimmune diseases. Science Translational Medicine. 8 (370), (2016).
  17. Chen, E. W., Brzostek, J., Gascoigne, N. R. J., Rybakin, V. Development of a screening strategy for new modulators of T cell receptor signaling and T cell activation. Scientific Reports. 8 (1), 10046 (2018).
  18. Fouda, A., Tahsini, M., Khodayarian, F., Al-Nafisah, F., Rafei, M. A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules. Journal of Visualized Experiments. (121), e55199 (2017).
  19. Zhao, Z., et al. A high-throughput phenotypic screen of cytotoxic T lymphocyte lytic granule exocytosis reveals candidate immunosuppressants. Journal of Biomolecular Screening. 20 (3), 359-371 (2015).
  20. Florian, A. E., et al. Flow cytometry enables a high-throughput homogeneous fluorescent antibody-binding assay for cytotoxic T cell lytic granule exocytosis. Journal of Biomolecular Screening. 18 (4), 420-429 (2013).
  21. Krutzik, P. O., Crane, J. M., Clutter, M. R., Nolan, G. P. High-content single-cell drug screening with phosphospecific flow cytometry. Nature Chemical Biology. 4 (2), 132-142 (2008).
  22. Vlahos, C. J., Matter, W. F., Hui, K. Y., Brown, R. F. A specific inhibitor of phosphatidylinositol 3-kinase, 2-(4-morpholinyl)-8-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one (LY294002). The Journal of Biological Chemistry. 269 (7), 5241-5248 (1994).
  23. Chen, Z., et al. Synthesis and SAR of novel 4-morpholinopyrrolopyrimidine derivatives as potent phosphatidylinositol 3-kinase inhibitors. Journal of Medicinal Chemistry. 53 (8), 3169-3182 (2010).
  24. Ruegg, U. T., Burgess, G. M. Staurosporine, K-252 and UCN-01: potent but nonspecific inhibitors of protein kinases. Trends in Pharmacological Sciences. 10 (6), 218-220 (1989).
  25. Davis, P. D., et al. Inhibitors of protein kinase C. 1. 2,3-Bisarylmaleimides. Journal of Medicinal Chemistry. 35 (1), 177-184 (1992).
  26. Komander, D., et al. Interactions of LY333531 and other bisindolyl maleimide inhibitors with PDK1. Structure (London, England: 1993). 12 (2), 215-226 (2004).
  27. Gassel, M., et al. The protein kinase C inhibitor bisindolyl maleimide 2 binds with reversed orientations to different conformations of protein kinase A. The Journal of Biological Chemistry. 279 (22), 23679-23690 (2004).
  28. Faull, A., Johnstone, C., Morley, A., et al. Novel compounds. , (2003).
  29. Favata, M. F., et al. Identification of a novel inhibitor of mitogen-activated protein kinase kinase. The Journal of Biological Chemistry. 273 (29), 18623-18632 (1998).
  30. Woods, C. M., Zhu, J., McQueney, P. A., Bollag, D., Lazarides, E. Taxol-induced mitotic block triggers rapid onset of a p53-independent apoptotic pathway. Molecular Medicine (Cambridge, MA). 1 (5), 506-526 (1995).
  31. Teng, X., et al. Structure-activity relationship study of novel necroptosis inhibitors. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 15 (22), 5039-5044 (2005).
  32. Saini, M., et al. Regulation of Zap70 expression during thymocyte development enables temporal separation of CD4 and CD8 repertoire selection at different signaling thresholds. Science Signaling. 3 (114), ra23 (2010).
  33. Chae, H. J., et al. Molecular mechanism of staurosporine-induced apoptosis in osteoblasts. Pharmacological Research. 42 (4), 373-381 (2000).
  34. Varas, A., et al. Analysis of the human neonatal thymus: evidence for a transient thymic involution. Journal of Immunology (Baltimore, MD:1950). 164 (12), 6260-6267 (2000).
  35. Verstichel, G., et al. The checkpoint for agonist selection precedes conventional selection in human thymus. Science Immunology. 2 (8), (2017).
  36. Yamaguchi, E., de Vries, J., Yssel, H. Differentiation of human single-positive fetal thymocytes in vitro into IL-4- and/or IFN-gamma-producing CD4+ and CD8+ T cells. International Immunology. 11 (4), 593-603 (1999).
  37. Farley, A. M., et al. Dynamics of thymus organogenesis and colonization in early human development. Development (Cambridge, UK). 140 (9), 2015-2026 (2013).
  38. Cali, J. J., et al. Bioluminescent assays for ADMET. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 4 (1), 103-120 (2008).

Tags

Immunologi og infektion spørgsmålet 143 Caspase-3 aktivering kinase hæmmere bibliotek screening TCR signalering T-celle aktivering thymocyte udvalg
Identifikation af mediatorer af T-celle receptoren signalering <em>via</em> Screening af kemiske hæmmer biblioteker
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, E. W., Ke, C. Y., Brzostek,… More

Chen, E. W., Ke, C. Y., Brzostek, J., Gascoigne, N. R. J., Rybakin, V. Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries. J. Vis. Exp. (143), e58946, doi:10.3791/58946 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter