Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Идентификация посредников Т-клеточных рецепторов сигналов через скрининг химического ингибитор библиотек

Published: January 22, 2019 doi: 10.3791/58946
Automatic Translation
*1, *2,3, *1, 1, 1,4
1Department of Microbiology and Immunology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 2Singapore Immunology Network, A*STAR, 3Curiox Biosystems, 4Department of Immunobiology, Rega Institute for Medical Research, Katholieke Universiteit (KU) Leuven
* These authors contributed equally

Summary

Этот документ использует на основе потока цитометрии пробирного экране библиотеки химических ингибиторов для идентификации ингибиторы и их целевых показателей, которые влияют на Т-клеточный рецептор сигнализации. Методы, описанные здесь также могут быть расширены для фильмов высокой пропускной способности.

Abstract

Т-клеточных рецепторов (TCR) сигнальный путь состоит из множества посредников, которые передают сигналы после активации TCR. Различные стратегии были предложены и осуществлены для идентификации новых посредников TCR сигнализации, которые способствовали бы улучшению понимания процессов Т-клеток, включая активацию и тимуса выбор. Мы описываем скрининг assay, который позволяет идентифицировать молекул, которые влияют TCR сигналов, основанный на активации развивающихся тимоцитов. TCR сильные сигналы вызывают развивающихся тимоцитов активировать механизм апоптоза в процесс, известный как негативный выбор. Путем применения ингибитора киназы те с целями, которые влияют на сигнализацию TCR способны переопределить процесс негативного отбора. Метод, подробно изложены в настоящем документе может использоваться для идентификации ингибиторы канонических киназ с установленными ролями в TCR сигнальных путей, а также ингибиторы новых киназ еще должен быть создан в сигнальных путей TCR. Стратегия отбора здесь может применяться к экранам более высокую пропускную способность для идентификации Роман druggable целей в TCR сигнализации.

Introduction

Т-клетки являются линии лимфоцитов, которые играют ключевую роль в поддержании адаптивного иммунитета. Они выражают TCR, что позволяет им признавать их лиганды, комплексы, состоящие из сложных молекул гистосовместимости (MHC) с привязанного пептид, которые встречаются на поверхности антиген представляющих клеток (БТР). Срабатывание сигнализации путь через взаимодействие TCR/MHC TCR имеет решающее значение для активации Т-клеток и развитию1.

В развитие Т-клеток кость-костного мозга производные гемопоэтических стволовых клеток (СКК) перенести тимуса, где они подвергаются дифференциации и пройти через этапы Т-клеточной линии прогрессии2. Двухместный позитивные (DP) тимоцитов, выражая CD4 и CD8 coreceptors, взаимодействовать с self пептида/MHC на БТРах. Тимоцитов с умеренным сродством для их самостоятельной пептида/MHC лигандов Зрелые стать сингл позитивные (SP) CD4 и CD8 тимоцитов, процесс называют как позитивного выбора. И наоборот тимоцитов, которые получают чрезмерной стимуляции TCR через self пептида/MHCs проходят apoptosis через негативный выбор3,4. Этот процесс апоптоза стимуляции индуцированного, caspase зависимая может быть передразнил в пробирке , стимулируя тимоцитов, например с бисером антителами anti-CD3/285. Зрелых Т-клеток, которые прошли процесс отбора активируются non-self пептида/MHC лигандов с БТР на периферии. Self пептида/MHCs по-прежнему актуальны для периферической Т-клеток, в контексте тоник, сигнализации для выживания и гомеостатических распространения, дифференциация вспомогательные Т-клеток и повышение Т-клеток ответов на non-self пептида/MHCs через coagonism6,,78,9. Высокоспецифичные связывающие TCR с пептида/MHC лигандом активирует несколько ниже по течению сигнальные пути, которые включают много сигнальных молекул, формирование комплекса TCR сигнализации сети10. TCR сигнальных путей были изучены на протяжении нескольких десятилетий, и тем не менее открытие новых посредников пути показывает никаких признаков ослабления11,12. Модуляция TCR сигнальных путей имеет клиническое значение и может включать потенцирования Т-клеточный ответ для иммунотерапевтических приложений или ингибирование Т-клеточный ответ для управления аутоиммунитета13. Стратегии для модуляции Т-клеток ответов главным образом зависят от нарушения киназу или фосфатазы деятельности14,,1516.

Мы описываем приложения на основе потока цитометрии анализа для проверки малых химических соединений для их способность модулировать TCR сигнализации и Т-клеток активации17. Assay петли на явлении тимоцитов, активизируя путь апоптоза при воздействии сильные сигналы TCR. Assay достаточно чувствительным для выявления изменений в стимуляции силой; инкубации тимоцитов, выражая трансгенных TCR с пептида/MHC тетрамера с увеличением сродство привело к соответствующему увеличению caspase активации используется как мера реакции apoptotic5. Для экрана мы использовали библиотеку ингибитора киназы и оценивать их способность модулировать тимоцитов ответ на сильные сигналы TCR.

Были описаны несколько потока цитометрии основанные или флуоресценции репортер стратегии для высокопроизводительного скрининга ассортимент периферийных активации фенотипы в различных подмножеств Т-клеток. Такие стратегии включают в себя использование генетических флуоресцентные репортеров для оценки сроков и масштабов Т-клеток активации18, использование дегрануляции как индикация19,активность цитотоксических Т-клеток20и анализ фосфорилирование различных белков, участвующих в сотовых сигнализации21.

Assay скрининга, представленные здесь возможность успешно идентифицировать соединений, которые тормозят канонические молекул TCR, сигнальный путь, а также потенциал, Роман соединений с тормозящее действие на TCR сигнализации. Например мы определили ингибиторов GSK3β и Hsp90 как новых соединений, влияющих на Т-клеточные ответы17. Assay возможность различать ингибиторов, которые мешают трансдукции сигнала, вследствие сокращения в ответе apoptotic, TCR-независимые эффекты ингибиторов на сотовой токсичности. В дополнение к индукции апоптоза мы также измерить CD69 upregulation и TCR Даунрегуляция как маркеры активации. Как TCR сигнализации есть сложных сетей использование нескольких показаний может увеличить шансы обнаружения молекул с конкретными последствиями на один путь. Здесь мы также внедрить использование центрифугирования независимый протокол как альтернатива высокой пропускной способностью для первоначального протокола во время окрашивания клеток в рамках подготовки анализа гранулярных потока. Assay, описанные в этой статье использует небольшую библиотеку составных ингибиторов протеинкиназы, но, в принципе, он может использоваться для более высокой пропускной способности скрининга. Библиотека выбора также может включать различные ингибиторы или других молекул.

Protocol

В этом исследовании были использованы 6 - до 8-недельных мужские и женские мышей C57Bl/6. Мышей были разведены в объекте животных в национальном университете Сингапура (Сингапур). Национальный университет Сингапура институционального ухода за животными и использования Комитет (IACUC) одобрил все экспериментов на животных.

1. Подготовка тимоцитов подвеска

  1. Усыпить мышей в камере CO2 .
  2. Последующие действия в культуре ткани капюшоном избежать любого загрязнения клеточных культур. Безопасные мыши тушу рассечение Совету, с помощью булавки и спрей мышь с 70% этиловом спирте.
  3. С помощью ножниц, сделайте вертикальный разрез на вентральной стороне, начиная от живота к челюсти. Сделать дополнительные разрезы вдоль каждой из задних ног. Натяните кожу подвергать грудной клетки и контактный его.
  4. Вырежьте диафрагмы и обе стороны грудной клетки от заднего конца с ножницами. Поднять грудную клетку и контактный его вниз подвергать тимуса. Отдельной соединительной ткани придает тимуса и экстракт тимуса, используя пару Изогнутый пинцет.
  5. Место тимуса в колодец 6-ну пластины, содержащих 5 мл полного RPMI средств массовой информации.
    Примечание: Рекомендуется добавить 10% древесный уголь раздели плода бычьим сывороточным (ФБС) средства массовой информации для повышения жизнеспособности тимоцитов если долгое время ожидания ожидается между Анатомирование и стимуляции assay.
  6. Осторожно Маш тимуса, используя тупой конец шприца и передайте клетки через стрейнер ячейки 70 мкм. Кроме того для сбора тимоцитов в условиях здоровой, можно использовать две пары щипцов выжать тимуса и собирать тимоцитов что поток из тимуса эпителия.
  7. Перейти к ячейке подсчета, используя Горяева или любую автоматизированный подсчет инструмента.

2. титрование ингибитора киназы нетоксичных концентрации

Примечание: Этот раздел посвящен подготовке ингибиторы для использования на экранах активация Т-клеток. Ингибиторы, используемые при высоких концентрациях может привести к гибели клеток, который является индикации экранов активация Т-клеток. Серию разведений ингибиторов стремится определить окончательный концентрацию отдельных ингибиторов, которые не должны индуцировать апоптоз независимо от стимуляции TCR. Библиотека ингибитора киназы, используемые в данном исследовании был приобретен у внешних поставщиков. Список ингибиторов включен в Таблицу материалов.

  1. Подготовка пластин ингибитора киназы при более низких концентрациях
    1. Чтобы подготовить тарелку ингибиторов на 1 мм, добавьте 10 мкл ингибиторов 90 мкл диметилсульфоксида (ДМСО) для всех ингибиторов.
      Примечание: Ингибиторы из мелкомолекулярных библиотеки, используемые в данном исследовании приходят на складе концентрации 10 мм. Если ингибиторы в форме гранул, выполните рекомендуемые растворения от поставщиков. Если ингибиторы не предоставляются на 10 мм, вместо подготовить ингибитор пластины на альтернативных соответствующих концентрациях и подготовить отдельный серийных разведений ингибиторов с коэффициентом подходящей разрежения.
      Предупреждение: В случае токсичных ингибиторы, следуйте инструкциям производителя по безопасной обработки и удаления.
    2. Подготовить тарелку ингибиторов на 0,1 мм, добавьте 10 мкл ингибиторов от пластины 1 мм битор 90 мкл ДМСО.
    3. Подготовить тарелку ингибиторов на 0,01 мм, добавьте 10 мкл ингибиторов от пластины 0,1 мм битор 90 мкл ДМСО.
  2. Лечение тимоцитов с ингибиторы киназ
    1. Подготовьте тимоцитов подвеска в соответствии с разделом 1.
    2. Разбавьте тимоцитов в полной RPMI для получения тимоцитов подвеска 5 х 106 клеток/мл.
    3. Добавьте 200 мкл суспензии тимоцитов всех скважин 96-луночных плиты, используя многоканальные пипетки.
    4. Для каждой скважины мкл 2 ингибиторов от соответствующего хорошо из плиты, содержащие 1 мм битор (конечная концентрация ингибиторы-10 мкм).
    5. В том же пластины Подготовьте четыре скважины необработанных элементов управления, четыре скважины 5 мкм лечение дексаметазоном положительных элементов управления и четыре скважины автомобиля лечение негативный контроль, добавив 2 мкл ДМСО.
    6. Инкубировать тимоцитов в 37 ° C, 5% CO2 инкубатора для 17-20 h (или на ночь).
  3. Определение подходящих концентраций отдельных ингибиторы
    1. Спин пластине тимоцитов на 300 x g и 4 ° C, 5 мин Ресуспензируйте клетки в 250 мкл буфера мытья СУИМ.
    2. Запуск потока гранулярных анализ проб и анализ результатов с потоком cytometry анализ программы.
    3. Определите процент живых клеток, основанный на FSC-SSC стробирования. Шлюзовые стратегия показан на рисунке 1B.
    4. Рассчитайте в среднем доля живых клеток, основанные на элементах управления ДМСО лечение, которые нормализуются на 100%. Установка произвольной окна приемлемых клеточной смерти (e.g.,20%). Ингибиторов, которые привели к процент живых клеток ниже этого окна (т.е.., ниже 80% ДМСО лечить контроля) должны быть проверены снова при более низких концентрациях.
    5. Ингибиторов, которые не проходят критерии жизнеспособности в шаге 2.3.4 Повторите шаги от шагов 2.2.1 - 2.3.4, но используйте пластину ингибиторов на 0,1 мм для шага 2.2.4 вместо пластины, содержащие ингибиторы 1 мм. Конечная концентрация ингибиторов использованы здесь — 1 мкм.
    6. Ингибиторов, которые все еще производят высокий уровень гибели клеток в 1 мкм, испытание ингибиторов на 0,1 мкм. Повторите шаги 2.2.1 - 2.3.4, но используйте пластину ингибиторов на 0,01 мм на шаге 2.2.4. Конечная концентрация ингибиторов использованы здесь — 0,1 мкм.
  4. Подготовка запасов плиты ингибиторы киназ
    1. Ингибиторов, которые будут использоваться на 10 мкм добавьте 10 мкл 10 мм битор 10 мкл ДМСО.
    2. Ингибиторов для использования на 1 мкм добавьте 1 мкл 10 мм битор 19 мкл ДМСО.
    3. Ингибиторов, которые будут использоваться на 0,1 мкм добавьте 1 мкл 10 мм битор 199 мкл ДМСО (рис. 1 c).
      Примечание: Пластину подготовленных запасов ингибиторов является 500 x концентрации предполагаемой конечной концентрации при добавлении тимоцитов суспензий. Пластину запасов ингибиторы могут быть подготовлены в PCR полоски или 96-луночных пластины.
    4. Пластину штока ингибитора киназы могут быть применены к тимоцитов для скрининга в систему обычного центрифугирования зависимые (раздел 3; см. рис. 1A, методы 1 и 2), или в альтернативной системы центрифугирования независимые (раздел 4; см. Рисунок 1A, метод 3).

3. киназы ингибитора библиотека скрининг (обычных на основе центрифуги проба)

  1. Лечение тимоцитов с ингибиторы киназ
    1. Подготовьте тимоцитов подвеска в соответствии с разделом 1.
    2. Разбавьте тимоцитов в полной RPMI для получения тимоцитов подвеска 5 х 106 клеток/мл.
    3. Добавьте 200 мкл тимоцитов в каждой скважине 96-луночных плиты, используя многоканальные пипетки. Место пластину на льду.
    4. Добавьте 0,5 мкл ингибиторов на 96-луночных пластину из соответствующего скважин пластину штока ингибитора подготовлен в разделе 2.4.
    5. Подготовка восьми скважин необработанных элементов управления. Подготовка четырех скважин элементов транспортного средства лечение путем добавления 0,5 мкл ДМСО. Подготовка четырех скважин 5 мкм дексаметазон лечить контроля (рис. 2).
  2. Стимуляция с помощью анти CD3/CD28 бусины тимоцитов
    1. Возьмите 1 мл бисера и мыть бусины с 2 мл PBS. Отдельные шарики с помощью магнитного стенд и аспирационная решение. В 5 мл полной RPMI Ресуспензируйте бисер.
      Примечание: Отношение бисера клетки составляет 1 до 2,5. Отрегулируйте количество бисера принять, в зависимости от количество скважин для стимулирования и количество используемых тимоцитов.
    2. 50 мкл бисера для каждого образца, лечение ингибитором, четыре ДМСО лечение образцы и четверо из восьми необработанных образцов. 50 мкл полного RPMI, оставшиеся четыре необработанных скважин. На рисунке 2 показан общий вид пластины.
    3. Смешайте содержимое скважин с помощью многоканальных дозаторов.
    4. Инкубировать тимоцитов в 37 ° C, 5% CO2 инкубатора для 17-20 h (или на ночь).
  3. Окрашивание поверхностных антигенов
    1. Подготовка антитело пятная смеси, содержащих анти TCRβ, анти CD4, анти CD8 и антител анти CD69. Разбавьте антитела в буфере мыть СУИМ (PBS с 0,5% альбумина bovine сыворотки [BSA]) в соотношении 1: 200 (v/v).
      Примечание: Рассмотреть вопрос об оптимизации титры антител, используемый для окрашивания, вместо фиксированных антитела разведений, чтобы свести к минимуму различия в окрашивание через различные эксперименты и улучшить отношение сигнал шум.
    2. Спиновые пластину на 300 x g и 4 ° C, 5 мин.
    3. Проведите пластины для отмены решения.
    4. На данный момент, протокол может следовать обычным протокол центрифуги зависимые (переходите к шагу 3.3.5; см. рис. 1A, метод 1) или альтернативных центрифугирования независимый протокол (переходите к шагу 4.4.4; см. рис. 1A, метод 2).
    5. Ресуспензируйте клетки в 75 мкл окрашивание антитела смеси, подготовленную на этапе 3.3.1.
    6. Смешать образцов с помощью многоканальных дозаторов и инкубировать их на льду за 30 мин.
  4. Фиксация клеток
    1. Промыть лунки с 200 мкл буфера мытья СУИМ и спина пластину на 300 x g и 4 ° C, 5 мин.
    2. Проведите пластины для отмены решения.
    3. Добавить буфер фиксации/permeabilization (поставляется с комплектом активно caspase-3 апоптоза; же с 10 x буфер Пермь/мыть упомянутый в шаге 3.5.1 и антитела анти каспазы-3 шаге 3.5.2) в 200 мкл в колодец.
    4. Инкубируйте на льду за 30 мин.
  5. Внутриклеточные пятная для активно caspase 3
    1. Подготовка 1 x Пермь/мыть буфера путем разбавления 5 мл 10 x Пермь/мыть буфера в 45 мл ультрачистая вода.
    2. Подготовьте внутриклеточных активно caspase пятно, добавив 1,3 мл антитела анти каспазы-3 до 6,5 мл 1 x Пермь/мыть буфера. Отношение антител в Перми/мыть буфера составляет 1:5.
    3. Спина пластину на 300 x g и 4 ° C, для 5 минут Флик пластину для отмены решения. Вымойте тарелку с 200 мкл 1 x Пермь/мыть буфера.
    4. Повторите шаг 3.5.3.
    5. Спина пластину на 300 x g и 4 ° C, для 5 минут Флик пластину для отмены решения. 75 мкл внутриклеточных caspase пятно, подготовленную на этапе 3.5.2 для всех скважин.
    6. Смешать образцов с помощью многоканальных дозаторов и инкубировать на льду за 1 час.
    7. Вымойте образцы с 200 мкл 1 x Пермь/мыть буфера и спина пластину на 300 x g и 4 ° C, 5 мин.
    8. Проведите пластины для отмены решения. Вымойте тарелку с 200 мкл 1 x Пермь/мыть буфера. Спиновые пластину на 300 x g и 4 ° C, 5 мин.
    9. Проведите пластины для отмены решения и Ресуспензируйте образцы в 200 мкл буфера мытья СУИМ.
    10. Запуск потока гранулярных анализа проб и анализа результатов с программой анализа СУИМ.
    11. С помощью CD4 и CD8 сюжет, ворота на население DP тимоцитов с выражением положительный CD4 и CD8 (рис. 2, Нижняя половина). В рамках DP тимоцитов ворота определите процент клеток с активированной каспазы-3, используя кератоз образца в качестве отрицательного контроля и дексаметазона как позитивный элемент управления. Для анализа выражения CD69 в ворота тимоцитов DP используйте кератоз образец как отрицательный контроль и стимулировали образца как позитивный элемент управления.
      Примечание: Когда стробирования на DP тимоцитов, убедитесь, что население тимоцитов DP является правильно закрытом для отдельных образцов. Поверхности coreceptors помощью стимулируется клетки и исключение непредвиденных событий может произойти, если используется плотный DP ворота.

4. киназы ингибитора библиотека скрининг (центрифуги независимые проба)

  1. Лечение тимоцитов с ингибиторы киназ
    1. Подготовьте тимоцитов подвеска в соответствии с разделом 1.
    2. Разбавьте тимоцитов в полной RPMI для получения тимоцитов подвеска 25 х 106 клеток/мл.
    3. 40 мкл тимоцитов, в каждой скважине малообъемной плиты, используя многоканальные пипетки. Место пластину на льду.
    4. Разбавьте ингибиторов от запасов пластины, ДМСО и дексаметазона в полной RPMI в соотношении четырех частей полного RPMI одной части ингибитора/ДМСО/дексаметазон (коэффициент разрежения 5).
      Примечание: Как томах, используемых в этом малообъемной пластине 5 x меньше, чем в обычных методе, ингибиторы и управления реагенты разводят пятикратный перед их добавлением в тимоцитов в пластине.
    5. Добавьте 0.5 мкл ингибиторов к 96-луночных пластины из соответствующего скважин пластину ингибитор, подготовленную на этапе 4.1.4.
    6. Подготовка восьми скважин необработанных элементов управления. Подготовка четырех скважин элементов транспортного средства лечение путем добавления 0,5 мкл ДМСО, подготовленную на этапе 4.1.4. Подготовка четырех скважин 5 мкм лечение дексаметазоном элементов управления, с помощью разреженных дексаметазон, подготовленную на этапе 4.1.4 (рис. 2).
  2. Стимуляция с помощью анти CD3/CD28 бусины тимоцитов
    1. Убедитесь, что бисер равномерно высокомобильна. Возьмите 1 мл бисера и мыть их с 2 мл ФСБ. Отдельные шарики с помощью магнитного стенд и аспирационная решение. В 1 мл полной RPMI Ресуспензируйте бисер.
      Примечание: Отношение бисера клетки составляет 1 до 2,5. Отрегулируйте количество бусин, в зависимости от количество скважин для стимулирования и количество используемых тимоцитов.
    2. 10 мкл подвески из бисера, для каждого образца, лечение ингибитором, четыре ДМСО лечение образцы и четверо из восьми необработанных образцов. 10 мкл полного RPMI, оставшиеся четыре необработанных скважин. На рисунке 2 показана схема общего пластины.
      Примечание: Окончательный объем скважин составляет 50 мкл, который находится в пределах максимальное количество скважин. Важно проявлять осторожность и держать вертикально, чтобы жидкость не расплескивалась кросс ну пластины.
    3. Смешать, агитируйте пластину с помощью Гонав орбитальный шейкер. Кроме того Смешайте содержимое скважин с помощью многоканальных дозаторов.
    4. Инкубировать тимоцитов в 37 ° C, 5% CO2 инкубатора для 17-20 h (или ночь) с крышкой анти испарения.
  3. Установка пластины шайбы
    Примечание: Инструкции по настройке пластины шайба предоставляются изготовителем. Ниже вкратце упоминаются шаги. Примерно 150 мл раствора необходим для каждого шага грунтовки.
    1. Премьер системы мыть с 70% этиловом спирте, содержащей 1% 20 анимации.
    2. Премьер системы вымойте деионизированной водой, содержащей 1% 20 анимации.
    3. Премьер системы мыть с СУИМ мыть буфера.
  4. Окрашивание поверхностных антигенов
    1. Подготовка антитело пятная смеси, содержащих анти TCRβ, анти CD4, анти CD8 и антител анти CD69. Разбавьте антитела в буфере мыть СУИМ в соотношении 1: 100 (v/v).
    2. Вымойте тарелку 9 x, используя 55 мкл буфера мытья СУИМ в мыть, используя автоматизированные ламинарные промывки системы.
      Примечание: В конце стирок, будет 25 мкл остаточный объем в каждой скважине.
    3. Ресуспензируйте клетки в 25 мкл окрашивание антитела смеси, подготовленную на этапе 4.4.1.
    4. Если образцы передаются из 96-луночных плиты (от шага 3.3.4), Ресуспензируйте клетки в 50 мкл антител смеси, подготовленную на этапе 3.3.1 и передавать образцы для малообъемной пластины. Этот шаг соответствует метод номер 2, как показано на Рисунок 1A.
    5. Смешать, агитировать пластину с Гонав орбитальный шейкер или смешать образцов с помощью многоканальных дозаторов и инкубировать на льду за 30 мин.
  5. Фиксация клеток
    1. Вымойте тарелку 9 x, используя 55 мкл буфера мытья СУИМ в мыть, используя автоматизированные ламинарные промывки системы.
    2. Добавить буфер фиксации/permeabilization (поставляется с комплектом активно caspase-3 апоптоза; же с 10 x буфер Пермь/мыть упомянутый в шаге 4.6.1 и антитела анти каспазы-3 шаге 4.6.2) на 50 мкл в колодец.
    3. Инкубируйте на льду за 30 мин.
  6. Внутриклеточные пятная для активно caspase 3
    1. Подготовка 1 x Пермь/мыть буфера путем разбавления 25 мл 10 x Пермь/мыть буфера в 225 мл ультрачистая вода.
    2. Подготовьте внутриклеточных активно caspase пятно, добавив 1 мл антитела анти каспазы-3 по 2 мл 1 x Пермь/мыть буфера. Антитела к Пермь/мыть буфера составляет 1:2.
    3. Премьер системы мыть с 1 x Пермь/мыть буфера.
    4. Вымойте тарелка 9 x с 1 x Пермь/мыть буфера, в 55 мкл для каждой стирки.
    5. 25 мкл внутриклеточных caspase пятно, подготовленный на шаге 4.6.2 все скважины.
    6. Смешать, агитировать пластину с Гонав орбитальный шейкер или смешать образцов с помощью многоканальных дозаторов и инкубировать на льду за 1 ч.
    7. Вымойте тарелка 9 x с 1 x Пермь/мыть буфера, в 55 мкл для каждой стирки.
    8. Добавьте 25 мкл буфера мытья СУИМ все скважины.
    9. Передача образцов микротитровальных трубы после надлежащего перемешивания через закупорить.
    10. Еще 50 мкл буфера мытья СУИМ в пустой скважин и повторите шаг 4.6.9.
    11. Повторите шаги 4.6.9 и 4.6.10 2 x до 200 мкл образцы собраны в микротитровальных трубы.
      Примечание: Процедуры, описанные в шагах 4.6.10 и 4.6.11 предназначен для обеспечения максимального восстановления клеток от малообъемной пластины. Если число клеток являются не проблемой, после шага 4.6.10, просто пополнить микротитровальных трубы до 200 мкл с СУИМ мыть буфера.
    12. Запуск потока гранулярных анализ проб и анализ результатов с СУИМ анализ программы, в соответствии с шагом 3.5.11. Проанализированы активацию caspase-3 и CD69 выражение в ворота, содержащие CD4+CD8+DP тимоцитов.

Representative Results

Подход к assay скрининг приводится на рисунке 1A. Ингибиторы киназ впервые были экранированы для их скрытое влияние на жизнеспособность тимоцитов. Как позитивный элемент управления для apoptosis дексаметазон был использован как проапоптотических агента. Строб для живых клеток населения был определен на основе необработанных негативный контроль и лечение дексаметазоном позитивные элементы управления (рис. 1B). Ингибиторы были впервые опробованы в 10 мкм на тимоцитов, и доля жизнеспособных клеток была измерена после инкубации в течение 18 ч. 20% окно для клеточной смерти была выбрана таким образом, что соединений, индуцированной больше чем 20% потеря клеток в живых клеток ворота, по сравнению с образцами ДМСО лечение, были протестированы при более низких концентрациях (рис. 1B). Представитель СУИМ участки отобранных образцов, лечение ингибитором показаны продемонстрировать жизнеспособность assay. LY294002 (2-(4-morpholinyl)-8-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one; CAS 154447-36-6), PI3K ингибитор22, значительно не увеличить гибель клеток в 10 мкм и ингибитор использовался в 10 мкм для последующих анализов. CAY10626 (N-[2-(dimethylamino)ethyl]-N-methyl-4-[[[4-[4-(4-morpholinyl)-7-(2,2,2-trifluoroethyl)-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-2-yl]phenyl]amino]carbonyl]amino]-benzamide; CAS 1202884-94-3), двойной ингибитор PI3Kα/mTOR23, индуцированной высокого уровня гибели клеток в 10 мкм и на 1 мкм, но не на 0,1 мкм и 0,1 мкм преисполнена решимости быть подходящим концентрации для применения в нижнем течении анализов. Staurosporine (2,3,10,11,12,13-hexahydro-10R-methoxy-9S-methyl-11R-methylamino-9S,13R-epoxy-1H,9H-diindolo[1,2,3-gh;3',2',1'-lm]pyrrolo[3,4-j][1,7]benzodiazonin-1-one; CAS 62996-74-1), Пан белка ингибитора киназы C с установленным способность вызывать апоптоз24, индуцированной значительные клеточной гибели всех концентраций, испытания, даже на 0,1 мкм. Он был использован в последующих анализов на 0,1 мкм как дополнительный положительный элемент управления.

Окончательный концентрации ингибиторы были отобраны на основе самых высоких концентраций, которой они сделали не усиливают клеточную гибель более чем на 20% ДМСО лечение образцов. С окончательной концентрации определяется ингибиторы запасов плита ингибиторов был подготовлен таким образом, что все ингибиторы были 500 раз концентрации при применении к клеткам. Рисунок 1 c иллюстрирует пластины макет фондовых пластины, с окончательной концентрации ингибиторов. В альтернативный протокол инкубации клетки непосредственно в малообъемной пластины для ламинарного потока, мытье пробирного использование небольших объемах потребовало дальнейшего разбавления ингибиторов. Для того, чтобы содержание ДМСО культур после добавления ингибитора не будет слишком высокой для ячеек, ингибиторы были далее разбавлена в полной RPMI, коэффициент разрежения 5, таким образом, чтобы они были в 100 раз предполагаемой концентрации при применении к клетки.

Ингибиторы, разбавляют до нетоксичных концентрации, были использованы в assay для TCR-стимуляции индуцированного апоптоза в тимоцитов5,17. Стимуляции проводилась с помощью анти CD3/CD28 бусы для 18 h, и клетки были впоследствии витражи для активации каспазы-3 в CD4+ и CD8+ DP тимоцитов населения (рис. 2). Увеличение активацию caspase-3 и CD69 выражение, а также Даунрегуляция TCR, были замечены в анти CD3/CD28-стимулировали и ДМСО макет лечение анти CD3/28-стимулирует образцы, по сравнению с nonstimulated образцами. Дексаметазон лечение образцы показали увеличение каспазы-3 активации независимо от CD69 upregulation, который ожидается от эффекта индуцировать апоптоз, будучи независимым TCR стимуляции.

На рисунке 3A кратко излагаются результаты библиотеки, скрининг assay для выбранного ингибиторов. Активацию caspase-3 и CD69 может использоваться для выявления потенциальных ингибиторов интерес из-за подавления выражения. Как и ожидалось, ингибиторы канонических посредников TCR сигнализации показал вверх как положительные ответы на экранах. Таких ингибиторов, которые выставлены различной степени ингибирующее потенции, включали широкий спектр ингибиторов, которые предназначены несколько киназы и, Кроме того, более специфичные ингибиторы. Некоторые ингибиторы смогли подавить активацию caspase-3 и CD69 upregulation (рисунок 3B, верхняя строка, левой панели). Один из таких ингибиторов является bisindolylmaleimide II (3-(1H-Indol-3-yl)-4-[1-[2-(1-methyl-2-pyrrolidinyl)ethyl]-1H-indol-3-yl]-1H-pyrrole-2,5-dione; CAS 137592-45-1), которая подавляет все киназы C изоформ белка, помимо протеинкиназа A и PDK125,,2627. Еще один ингибитор в этой категории является CAY10657 (3-[(aminocarbonyl)amino]-5-[4-(4-morpholinylmethyl)phenyl]-2-thiophenecarboxamide; CAS 494772-86-0), предлагаемый ингибитор IKK228.

Там были соединений, которые мешают CD69 upregulation, но не повредить активацию caspase-3 (рисунок 3B, верхняя строка, правой панели). CAY10626, ингибитор PI3Kα и mTOR23и U-0126 (2,3-бис [амино [(2-aminophenyl) Тио] метиленовой]-butanedinitrile; CAS 109511-58-2), MEK ингибитор29, были некоторые из выявленных ингибиторов. Результаты показывают, что различные ингибиторы ориентации различных киназ из конкретных отраслей TCR сигнальный путь, особенно направленными на поздней стадии киназы, может привести к выборочной обесценения явлений активация Т-клеток.

Были также ингибиторов, которые не подавлять CD69 upregulation и активацию caspase-3 (рисунок 3B, нижней, левой панели). Паклитаксел (βS-(benzoylamino) - αR - гидрокси-benzenepropanoic кислота (2aR,4S,4aS,6R,9S,11S,12S,12aR,12bS)-6,12b-bis(acetyloxy)-12-(benzoyloxy)-2a,3,4,4a,5,6,9,10,11,12,12a,12b-dodecahydro-4,11-dihydroxy-4a,8,13,13-tetramethyl-5-oxo-7 , 11-methano-1H-cyclodeca[3,4]benz[1,2-b]oxet-9-yl эфира; CAS 33069-62-4), а disruptor микротрубочек динамика30, и necrostatin-5 (2-[[3,4,5,6,7,8-hexahydro-3-(4-methoxyphenyl)-4-oxo[1]benzothieno[2,3-d]pyrimidin-2-yl]thio]-acetonitrile; CAS 337349-54-9), ингибитора киназы RIP131, являются два ингибиторы, выявленных в этой категории. В таких случаях, где не были нарушением CD69 upregulation и активацию caspase-3 это может благодаря ингибиторы не ориентации соответствующих киназы сигнальный путь TCR.

Как упоминалось ранее, staurosporine был использован в экранах, в концентрации, которая по-прежнему индуцированного апоптоза в тимоцитов. Как и ожидалось, staurosporine лечение образца показали высокий уровень активацию caspase-3 (рис. 3Б, нижней, правой колонке). Низкий уровень CD69 выражение может объясняться staurosporine опосредованной ингибирование PKC, как bisindolylmaleimide II, другой Пан PKC ингибитор, также подавил выражение CD69. Кроме того staurosporine индуцированных апоптоз в клетках прежде чем они смогли upregulate выражение CD69.

Чтобы увеличить пропускную способность и автоматизации протокола, были подготовлены параллельных протоколов, которые связаны с использованием автоматизированной промывки системы через ламинарный поток пластины. Две отдельные протоколы, используя это устройство стиральных автоматических пластины были тестируется и по сравнению с традиционным методом культивирования клеток в 96-луночных пластины и окрашивания клеток в протоколе центрифугирования зависимых. Один метод был связан с культивирования клеток в 96-луночных пластины, согласно стандартной процедуре, и затем передачу клетки пластины совместимы с шайбой автоматизированной пластины для окрашивания шаги (рис. 4, DA-Стиральная образцов). Другой метод участие культивирования клеток непосредственно в пластины пластины шайба совместимых и продолжая окрашивание протокол о же пластины (рис. 4, DA-культура образцов). Центрифугирование независимые протоколы не дают много явного различия в активно caspase-3, CD69, или TCRβ, окрашивание через различных образцов, по сравнению с обычными центрифугирования зависимых протокол (рис. 4). Использование антител в слегка различных концентрациях во время окрашивания шаги может объясняться различия в интенсивности окрашивания.

Figure 1
Рисунок 1 : Тимоцитов жизнеспособности после лечения ингибиторами. (A) экспериментальный план основных шагов в assay скрининга. Существует три предложенных методов для стимуляции и окрашивание тимоцитов, используемых в assay активации, а именно: (1 культивирование тимоцитов в стандартных 96-луночных пластины, следуют окрашивание с помощью обычного центрифугирования-протокол, (2 культивирование тимоцитов в стандартных 96-луночных пластины, следуют окрашивание с помощью центрифугирования независимые Стиральная протокол и (3) культивирование тимоцитов в малообъемной пластины, следуют окрашивание же пластины Стиральная центрифугирования независимый протокол. (B) стробирование стратегии, используемые в жизнеспособности анализов. Живой клетки ворота был производным от вперед точечной (FSC) и боковой (SSC) точечные, как описано выше17. Ингибиторов, которые были сочтены слишком токсичных в опытах концентрации подлежат дальнейшей жизнеспособности анализов в 10 раз более низкой концентрации. Показываются репрезентативных выборок, лечение ингибитором. Обратите внимание на общий элемент управления (ДМСО лечение [ДМСО]) используется для 1 мкм и 0,1 мкм образцов. (C) плита макет разреженных ингибиторов. Схематическое представление плит ингибиторов, разводят в ДМСО к концентрации 500 x предполагаемой конечной концентрации. Каждый хорошо представляет один уникальный ингибитор; серый скважин являются пустыми. Концентрации показано являются конечной концентрации при добавлении культур клеток, а именно 10 мкм (темно-красный), 1 мкм (Фуксия) и 0,1 мкм (синий). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2 : Плита макет пробирного активация тимоцитов. (Вверху) Колонки 1 и 12 зарезервированы для элементов управления, в то время как столбцы, 2-11, лечение ингибитором образцы (бежевый). Отрицательный контроль (nonstimulated [NS]; серый) занимает скважин A1 по D1, а положительный контроль для смерти клетки (дексаметазон лечение [DEX]; фиолетовый) занимает скважин E1 до H1. 2-12 столбцах тимоцитов стимулируется с анти CD3/CD28 бисером. Положительный контроль для активации тимоцитов (стимулировали образцы [α-CD3/CD28]; зеленый) занимает скважин A12 D12 и управления транспортным средством (стимулировали и лечить ДМСО [α-CD3/CD28 + ДМСО]; красный) занимает скважин E12 H12. (Внизу) Поток цитометрии участки активные каспазы-3 (ActCasp3), CD69 и TCRβ окрашивание тимоцитов, закрытого в ворота двойной позитивные (DP). Представитель участки различных элементов управления отображаются. NS = nonstimulated; DEX = лечение дексаметазоном образцы; Α-CD3/CD28 + ДМСО = образцы стимулировали CD3/CD28-покрытая бисером и относились с ДМСО; Α-CD3/CD28 = образцы стимулировали CD3/CD28-покрытая бисером. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3 : Скрининг ингибиторов библиотеки на Активация тимоцитов. (A) сводные данные активации assay. Таковы результаты представитель эксперимента, показаны нормализованных значений ячеек с activated caspase-3 и CD69 выражение для выбранного ингибиторов. Нормализация было сделано путем сравнения процент клеток в активно каспазы-3-позитивных или CD69-положительные ворота к значению элемента управления ДМСО лечение, который устанавливается относительное значение 0 в графе. (B) выбран СУИМ участков. Участки потока цитометрии ингибиторов, которые подавлены активацию caspase-3 и CD69 upregulation (вверху слева), подавляются только CD69 upregulation (вверху справа), или не отразилось на активацию caspase-3 и CD69 upregulation (внизу слева). Участки staurosporine лечение образца показано проиллюстрировать последствия использования ингибитора в токсичных концентрациях (внизу справа). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4 : Сравнение различных пробирного протоколов. Поток цитометрии участки активные каспазы-3 (ActCasp3), CD69, и TCRβ окрашивание DP тимоцитов после трех различных анализа протоколов. Тестируются четыре различные условия, а именно отрицательный контроль (nonstimulated [NS]), положительный контроль для смерти клетки (дексаметазон лечение [DEX]), управления транспортным средством (стимулировали и лечить ДМСО [α-CD3/CD28 + ДМСО]) и ингибитор лечение Пример (стимулировали и пик-75-лечение [α-CD3/CD28 + пик-75]). Обычные = культивирования тимоцитов в стандартных 96-луночных пластины и пятнать с обычного центрифугирования-протокол; DA-промывание = культивирования тимоцитов в стандартных 96-луночных пластины и окрашивание с помощью ламинарного потока, мытье протокол; DA-культура = культивирования тимоцитов в малообъемной пластины и окрашивание же пластины ламинарного потока, мытье протокол.  Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Discussion

Стратегия отбора предлагаемых здесь оценивается способность малых молекул ингибиторов для подавления apoptotic в тимоцитов после стимуляции, помимо обычных маркеров upregulation активации CD69 Т-клеток и TCR Даунрегуляция . Дополнительные маркеры также могут быть включены для включения анализа различных тимоцитов подмножеств32. Интересным аспектом текущего анализа заключается в том, что ингибиторы, которые препятствуют TCR сигнализации бы также ослабить индукции апоптоза, далее подчеркивая различие TCR-независимые эффекты ингибиторов может иметь на вызывающие гибель клеток. Кроме того на основе потока цитометрии пробирного позволяет использовать несколько показаний как собственный активации маркеры, которые могут сообщить эффекты ингибиторов на отдельных отдельных отраслей TCR сигнализации. В случае, представленные здесь были ингибиторов, которые показали дифференциального ингибирование активацию caspase-3 и CD69 upregulation. Потому что некоторые соединения могут повлиять на хозяйственные функции, такие как синтез белка или везикулярного людьми, это не удивительно наблюдать эффекты на upregulation de novo синтезированных маркеров (например, CD69), но не на Посттрансляционная изменения (например, протеолитических активацию caspase-3).

Как assay представленные здесь меры апоптоз как индикация, крайне важно, что скрытые токсические эффекты ингибиторов не заслонять результаты. Например, на экране, мы сделали не разбавить staurosporine за 1 Нм, несмотря на его по-прежнему токсичны для клеток при этом концентрации. Представитель результаты согласуются с staurosporine, неразборчивый киназы ингибитора и индуктором апоптоз33. Без достаточной разбавления протестированы на нетоксичные концентрации соединений можно упустить потенциальных хитов.

Стратегия отбора, подробно здесь будет трудно применять к людям из-за осложнений, связанных с получением достаточного количества тимоцитов для высокопроизводительного скрининга. Однако можно получить образцы человеческого тимуса от педиатрической сердечной биопсий34,35 или36,плодов37. Тем не менее, как TCR сигнальные пути и аминокислотных последовательностей сигнализации белки основном сохраняются между мышей и людей пробирного тимоцитов обеспечивает полезный предварительный скрининг стратегию, и любые результаты, полученные с этот assay, с помощью мыши тимоцитов может затем, проверена в первичной лимфоцитах человека.

Одним из ограничений обычного центрифугирования зависимых протокола относится к Перспектива потери клеток, которые можно отнести к многоступенчатый характер процесса, который включает такие шаги, как клетки permeabilization и центрифугирования. Каждый центрифугирования и ресуспендирования шаг неизбежно приводит к гибели клеток. Хотя такие потери не могут быть критически важное значение для исследований с участием ограниченного числа проб, он может породить проблемы при применении скрининг более высокой пропускной способности, в частности, по ходу пробирного формат из 96 - до 384-1536-хорошо. Одним из способов обхода этой проблемы является использование клеток проницаемой флуоресцентные caspase датчики38 , включите обнаружение активацию caspase избегая осложнений клеток permeabilization и нескольких стирок5. Кроме того используя метод центрифугирования независимые обмыв ламинарные клетки также возможна для минимизации ячейка потерь. С автоматизированной пластиной промывочной станции в сочетании с табличкой стены менее клетки омываются ламинарного потока без использования центрифуг. Экспоненциальная разбавления реагентов позволяет для тщательной и эффективной промывки клеток в менее чем 3 мин, которая представляет собой эквивалент разбавления до двух раундов центробежные стирки. Без внешних напряжений вследствие центрифугирования клетки более жизнеспособны и клеток потери сведены к минимуму.

Мы также изучили возможность использования автоматизированных пластины, промывочная станция после культивирования тимоцитов в 96-Ну U-нижней пластины и, Кроме того, культивирование клеток прямо в стену менее пластины совместим с автоматизированной пластины, промывочная станция. Культивирования клеток в стене менее пластины включен ликвидации всех шагов центрифугирования и свести к минимуму потери клеток, устраняя необходимость передачи образца через пластины. Как правило три различные протоколы являются сопоставимыми в эффективность стимуляции и пятнать. Станция автоматической мойки обеспечивает преимущество автоматизации, скорость и эффективность, что делает его легче для анализа более высокой пропускной способности. Кроме того с большей автоматизации, Стиральная шаги может осуществляться быстрее, и есть большей согласованности между экспериментов или экспериментаторов. Однако, станция мойки имеет определенные недостатки: большими объемами отмывающего буфера требуются для грунтования шайбу (150 мл в буфер изменения, из которых 50 мл используется для стирки); осторожность необходима при обработке пластину избежать любого загрязнения скважин из-за ограниченного перегородки между скважинами малообъемной плиты; остаточные буфер 25 мкл в скважинах после стирки требует использования реагентов, подготовленных на более высоком чем 1 x концентрации. Для решения проблемы остаточного объема и ограниченный объем плиты, могут быть добавлены аксессуар расширить объем инкубации из 70 мкл до 150 мкл, содействия принятию обычных протоколов. Хотя в настоящее время имеются системы обработки автоматизированной пластины, они имеют значительный след, по сравнению с ламинарным мыть системы, которая представляет собой небольшое устройство ~ 1 кубический фут (~0.028 м3). Кроме того интеграция центрифугирования в автоматизированных систем обработки пластина сложной, ограничивая их использования в ячейке стиральная. Есть в настоящее время нет центрифуги независимые ячейки, мытья инструментов, насколько мы знаем.

Стратегия отбора, представленные здесь может определить малых молекул и их предполагаемой целевой киназы, которые влияют на TCR сигнализации и активация Т-клеток. Библиотека, используемая здесь состоит главным образом малых молекул ингибиторов киназ и был в состоянии генерировать ряд потенциально интересные ответы. Протокол можно также легко применять ингибитор библиотек из других классов ферментов или других типов малых молекул, а также библиотеки других соединений (например, различные макромолекул). Протокол может также использоваться для других типов клеток, например периферической Т-лимфоцитов или увековечен клеток, включая те, выражая transgenic TCRs или ношение репортер систем. Выявления и классификации новых посредников Т-клеточной сигнализации может улучшить наши знания о сигнальный путь, а также помощь в разработке целенаправленной терапии иммунных заболеваний13,14,15, 16. в целом, это исследование добавляет диапазон доступных вариантов Т-клеточных сигналов через высокопроизводительного скрининга анализов для выявления посредников.

Disclosures

Автор Chyan ин Ke является сотрудником Curiox Biosystems, который производит DA-клеточной шайбу и DA-клеточной пластин, используемых в этой статье.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана от грантов от министерства здравоохранения Сингапура Национальный медицинский исследовательский совет, NMRC CBRG15may017 и Сингапуре Министерство просвещения, 2014-T2-1-136 (N.R.J.G.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI HyClone SH30027FS
FBS HyClone SH3007103
L-Glutamine HyClone SH3003401
Sodium pyruvate HyClone SH3023901
Penicillin/Streptomycin HyClone SV30010
b-mercaptoethanol Sigma Aldrich 516732 
10X PBS Vivantis PB0344 – 1L
Kinase Screening Library (96-Well) Cayman Chemical 10505 Exact contents of the library may vary
DMSO Sigma Aldrich D2650
Dexamethasone Sigma Aldrich D4902 
anti-CD3/CD28 beads Thermo Fisher Scientific 11452D
FITC Active Caspase-3 Apoptosis Kit BD Pharmingen 550480 Contains Fixation/Permeabilisation buffer, 10X Perm/Wash buffer and anti-caspase 3 antibody
DA-Cell Washer CURIOX HT1000
96-well DA-Cell Plate CURIOX 96-DC-CL-05
Antibodies
CD3e BioLegend 100236
TCRb BD Biosciences 553174
CD4 BD Biosciences 740007
CD8 BD Biosciences 563786
CD69 eBioscience 25-0699-42
Inhibitors
TG003 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
PKC 412 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Doramapimod Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Paclitaxel Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Erlotinib Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Necrostatin-5 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
NVP-BEZ235 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Phthalazinone pyrazole Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AG-879 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
1-NA-PP1 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Torin 1 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Bisindolylmaleimide II Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
BIBF 1120 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
SMI-4a Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Bisindolylmaleimide XI (hydrochloride) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CAY10657 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AS-703026 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Chelerythrine chloride Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Tunicamycin Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
GSK 1059615 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Ruxolitinib Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Necrostatin-1 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
SB 505124 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
INK128 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Canertinib (hydrochloride) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
SB 431542 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
PD 173074 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Valproic Acid (sodium salt) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
PD 0325901 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
SB 203580 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
VX-702 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Emodin Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CHIR99021 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
BIO Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Imatinib (mesylate) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Sunitinib Malate Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Gefitinib Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
PP2 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
3-Methyladenine Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Bisindolylmaleimide I Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Bisindolylmaleimide IV Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Bisindolylmaleimide V Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
NSC 663284 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
D 4476 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
NU 7026 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
H-9 (hydrochloride) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Indirubin-3'-monoxime Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
KN-62 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
KN-93 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CGP 57380 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Iso-Olomoucine Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
(S)-Glycyl-H-1152 (hydrochloride) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Bisindolylmaleimide VIII (acetate) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
ST638 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
SU 6656 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
LY364947 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
SB 203580 (hydrochloride) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CAY10621 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
YM-201636 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
ZM 447439 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AS-041164 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
NVP-AEW541 (hydrochloride) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
PP242 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
ABT-869 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CAY10622 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
17β-hydroxy Wortmannin Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CAY10626 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
SU 6668 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CAY10572 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
N,N-Dimethylsphingosine Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
LY294002 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
U-0126 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Staurosporine Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
KN-92 (hydrochloride) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AS-605240 (potassium salt) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
O-1918 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Y-27632 (hydrochloride) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Leelamine Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
PD 98059 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
PD 169316 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
TGX-221 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
(S)-H-1152 (hydrochloride) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AS-605240 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
D-erythro-Sphingosine C-18 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
OSU03012 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
JNJ-10198409 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Leelamine (hydrochloride) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Arachidonic Acid Leelamide Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Lauric Acid Leelamide Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AS-252424 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CAY10505 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
PI-103 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
PIK-75 (hydrochloride) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Sphingosine Kinase Inhibitor 2 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Piceatannol Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
SC-1 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
(R)-Roscovitine Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
BAY-43-9006 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CAY10561 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AS-604850 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
PI3-Kinase α Inhibitor 2 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
ML-9 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Triciribine Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Erbstatin Analog Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Kenpaullone Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Olomoucine Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AG-494 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AG-825 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AG-1478 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
SB 216763 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
SB 415286 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AG-17 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
H-8 (hydrochloride) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
LFM-A13 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
SC-514 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Apigenin Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AG-18 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CAY10554 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
DRB Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
RG-13022 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
RG-14620 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AG-490 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AG-82 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AG-99 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AG-213 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AG-183 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Lavendustin C Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
ZM 336372 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
5-Iodotubercidin Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
SB 202190 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CAY10571 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Nilotinib Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
SP 600125 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
L-threo-Sphingosine C-18 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
H-89 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
HA-1077 (hydrochloride) Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AG-370 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Wortmannin Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
AG-1296 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
KT 5823 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Janex 1 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CAY10574 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CAY10575 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CAY10576 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
NH125 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
TWS119 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
NSC 210902 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CAY10577 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CAY10578 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
PD 184161 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
CCT018159 Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library
Myricetin Cayman Chemical - From the Kinase Screening Library

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gascoigne, N. R., Rybakin, V., Acuto, O., Brzostek, J. TCR Signal Strength and T Cell Development. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32, 327-348 (2016).
  2. Rothenberg, E. V., Moore, J. E., Yui, M. A. Launching the T-cell-lineage developmental programme. Nature Reviews Immunology. 8 (1), 9-21 (2008).
  3. Klein, L., Hinterberger, M., Wirnsberger, G., Kyewski, B. Antigen presentation in the thymus for positive selection and central tolerance induction. Nature Reviews Immunology. 9 (12), 833-844 (2009).
  4. Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of T cells. Annual Review of Immunology. 21, 139-176 (2003).
  5. Rybakin, V., Gascoigne, N. R. Negative selection assay based on stimulation of T cell receptor transgenic thymocytes with peptide-MHC tetramers. PLoS One. 7 (8), e43191 (2012).
  6. Krogsgaard, M., Juang, J., Davis, M. M. A role for "self" in T-cell activation. Seminars in Immunology. 19 (4), 236-244 (2007).
  7. Nakayama, T., Yamashita, M. The TCR-mediated signaling pathways that control the direction of helper T cell differentiation. Seminars in Immunology. 22 (5), 303-309 (2010).
  8. Hoerter, J. A., et al. Coreceptor affinity for MHC defines peptide specificity requirements for TCR interaction with coagonist peptide-MHC. The Journal of Experimental Medicine. 210 (9), 1807-1821 (2013).
  9. Zhao, X., et al. Nonstimulatory peptide-MHC enhances human T-cell antigen-specific responses by amplifying proximal TCR signaling. Nature Communications. 9 (1), 2716 (2018).
  10. Fu, G., et al. Fine-tuning T cell receptor signaling to control T cell development. Trends in Immunology. 35 (7), 311-318 (2014).
  11. Wang, D., et al. Tespa1 is involved in late thymocyte development through the regulation of TCR-mediated signaling. Nature Immunology. 13 (6), 560-568 (2012).
  12. Fu, G., et al. Themis sets the signal threshold for positive and negative selection in T-cell development. Nature. 504 (7480), 441-445 (2013).
  13. Rosenblum, M. D., Gratz, I. K., Paw, J. S., Abbas, A. K. Treating human autoimmunity: current practice and future prospects. Science Translational Medicine. 4 (125), (2012).
  14. Hebeisen, M., et al. SHP-1 phosphatase activity counteracts increased T cell receptor affinity. The Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1044-1056 (2013).
  15. Wang, R. E., et al. An immunosuppressive antibody-drug conjugate. Journal of the American Chemical Society. 137 (9), 3229-3232 (2015).
  16. Borroto, A., et al. First-in-class inhibitor of the T cell receptor for the treatment of autoimmune diseases. Science Translational Medicine. 8 (370), (2016).
  17. Chen, E. W., Brzostek, J., Gascoigne, N. R. J., Rybakin, V. Development of a screening strategy for new modulators of T cell receptor signaling and T cell activation. Scientific Reports. 8 (1), 10046 (2018).
  18. Fouda, A., Tahsini, M., Khodayarian, F., Al-Nafisah, F., Rafei, M. A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules. Journal of Visualized Experiments. (121), e55199 (2017).
  19. Zhao, Z., et al. A high-throughput phenotypic screen of cytotoxic T lymphocyte lytic granule exocytosis reveals candidate immunosuppressants. Journal of Biomolecular Screening. 20 (3), 359-371 (2015).
  20. Florian, A. E., et al. Flow cytometry enables a high-throughput homogeneous fluorescent antibody-binding assay for cytotoxic T cell lytic granule exocytosis. Journal of Biomolecular Screening. 18 (4), 420-429 (2013).
  21. Krutzik, P. O., Crane, J. M., Clutter, M. R., Nolan, G. P. High-content single-cell drug screening with phosphospecific flow cytometry. Nature Chemical Biology. 4 (2), 132-142 (2008).
  22. Vlahos, C. J., Matter, W. F., Hui, K. Y., Brown, R. F. A specific inhibitor of phosphatidylinositol 3-kinase, 2-(4-morpholinyl)-8-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one (LY294002). The Journal of Biological Chemistry. 269 (7), 5241-5248 (1994).
  23. Chen, Z., et al. Synthesis and SAR of novel 4-morpholinopyrrolopyrimidine derivatives as potent phosphatidylinositol 3-kinase inhibitors. Journal of Medicinal Chemistry. 53 (8), 3169-3182 (2010).
  24. Ruegg, U. T., Burgess, G. M. Staurosporine, K-252 and UCN-01: potent but nonspecific inhibitors of protein kinases. Trends in Pharmacological Sciences. 10 (6), 218-220 (1989).
  25. Davis, P. D., et al. Inhibitors of protein kinase C. 1. 2,3-Bisarylmaleimides. Journal of Medicinal Chemistry. 35 (1), 177-184 (1992).
  26. Komander, D., et al. Interactions of LY333531 and other bisindolyl maleimide inhibitors with PDK1. Structure (London, England: 1993). 12 (2), 215-226 (2004).
  27. Gassel, M., et al. The protein kinase C inhibitor bisindolyl maleimide 2 binds with reversed orientations to different conformations of protein kinase A. The Journal of Biological Chemistry. 279 (22), 23679-23690 (2004).
  28. Faull, A., Johnstone, C., Morley, A., et al. Novel compounds. , (2003).
  29. Favata, M. F., et al. Identification of a novel inhibitor of mitogen-activated protein kinase kinase. The Journal of Biological Chemistry. 273 (29), 18623-18632 (1998).
  30. Woods, C. M., Zhu, J., McQueney, P. A., Bollag, D., Lazarides, E. Taxol-induced mitotic block triggers rapid onset of a p53-independent apoptotic pathway. Molecular Medicine (Cambridge, MA). 1 (5), 506-526 (1995).
  31. Teng, X., et al. Structure-activity relationship study of novel necroptosis inhibitors. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 15 (22), 5039-5044 (2005).
  32. Saini, M., et al. Regulation of Zap70 expression during thymocyte development enables temporal separation of CD4 and CD8 repertoire selection at different signaling thresholds. Science Signaling. 3 (114), ra23 (2010).
  33. Chae, H. J., et al. Molecular mechanism of staurosporine-induced apoptosis in osteoblasts. Pharmacological Research. 42 (4), 373-381 (2000).
  34. Varas, A., et al. Analysis of the human neonatal thymus: evidence for a transient thymic involution. Journal of Immunology (Baltimore, MD:1950). 164 (12), 6260-6267 (2000).
  35. Verstichel, G., et al. The checkpoint for agonist selection precedes conventional selection in human thymus. Science Immunology. 2 (8), (2017).
  36. Yamaguchi, E., de Vries, J., Yssel, H. Differentiation of human single-positive fetal thymocytes in vitro into IL-4- and/or IFN-gamma-producing CD4+ and CD8+ T cells. International Immunology. 11 (4), 593-603 (1999).
  37. Farley, A. M., et al. Dynamics of thymus organogenesis and colonization in early human development. Development (Cambridge, UK). 140 (9), 2015-2026 (2013).
  38. Cali, J. J., et al. Bioluminescent assays for ADMET. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 4 (1), 103-120 (2008).

Tags

Иммунология и инфекции выпуск 143 активацию Caspase-3 ингибиторы киназ скрининг TCR сигнализации активация Т-клеток выбор тимоцитов Библиотека
Идентификация посредников Т-клеточных рецепторов сигналов <em>через</em> скрининг химического ингибитор библиотек
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chen, E. W., Ke, C. Y., Brzostek,… More

Chen, E. W., Ke, C. Y., Brzostek, J., Gascoigne, N. R. J., Rybakin, V. Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries. J. Vis. Exp. (143), e58946, doi:10.3791/58946 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter