Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Rensing og analyse av en monoklonale antistoff fra kinesisk hamster eggstokk celler ved hjelp av en automatisert Microbioreactor system

Published: May 1, 2019 doi: 10.3791/58947

Summary

En detaljert protokoll for rensing og påfølgende analyse av et monoklonale antistoff fra høstet cellekultur væske (HCCF) av automatiserte microbioreactors har blitt beskrevet. Bruk av analyser for å fastslå kritiske kvalitet attributter (CQAs) og maksimere begrenset sample volum å trekke ut viktig informasjon er også presentert.

Abstract

Monoklonale antistoffer (mAbs) er en av de mest populære og godt preget biologiske produkter produseres i dag. De fleste vanligvis produsert ved hjelp av kinesiske hamster eggstokk (CHO) celler, kultur og prosessforhold må optimaliseres for å maksimere antistoff titers og oppnå mål kvalitet profiler. Denne optimaliseringen bruker vanligvis automatiserte Mikroskala bioreaktorer (15 mL) til å skjermen flere prosessbetingelser parallelt. Optimaliserings kriteriene omfatter kultur ytelse og de kritiske kvalitets attributtene (CQAs) til det monoklonale antistoff (mAb)-produktet, som kan påvirke effekten og sikkerheten. Kultur resultatberegninger omfatter cellevekst og nærings forbruk, mens CQAs inkluderer mAb N-glykosylering og aggregering profiler, lade varianter, og molekylvekt. Denne detaljerte protokollen beskriver hvordan du renser og senere analyserer HCCF-prøver produsert av et automatisert microbioreactor system for å få verdifulle resultatberegninger og-utganger. Først en automatisert protein en rask protein flytende kromatografi (FPLC) metoden brukes til å rense mAb fra høstet cellekultur prøver. Når konsentrert, er glycan profilene analysert ved masse massespektrometri ved hjelp av en bestemt plattform (se tabell over materialer). Antistoff molekyl vekter og aggregering profiler bestemmes ved hjelp av størrelses ekskludering kromatografi-flere vinkel lysspredning (SEC-MALS), mens lade varianter analyseres ved hjelp av microchip kapillær sone elektroforese (mCZE). I tillegg til kultur ytelse beregningene tatt under bioreactor prosessen (dvs. kultur levedyktighet, celle telling, og felles metabolitter inkludert glutamin, glukose, melkesyre, og ammoniakk), brukt Media er analysert for å identifisere begrensende næringsstoffer til for å forbedre fôrings strategiene og den helhetlige prosess designen. Derfor er en detaljert protokoll for den absolutte kvantifisering av aminosyrer av flytende kromatografi-Mass massespektrometri (LC-MS) av brukte medier også beskrevet. Metodene som brukes i denne protokollen, utnytter plattformer med høy gjennomstrømming som er kompatible for et stort antall små volum prøver.

Introduction

Protein legemiddel er brukes til å behandle en voksende rekke medisinske tilstander inkludert vev transplantasjon komplikasjoner, autoimmune sykdommer, og kreft1. Siden 2004 har USA Food and Drug Administration (USFDA) dokumentert en økende andel av biologiske lisens søknader (BLAs) av alle godkjenninger regulert av Center for Drug evaluering og forskning (CDER), med BLAs regnskap for over 25% i 2014 og 20152.

Betenke denne ekspanderer marked, biofarmasøytisk fabrikanter er angripe med rask levere flere fabrikat med gjennomført kvalitet. Arbeidet med å øke produktet yield har fokusert på CHO Cell engineering og produksjon linje screening, men de viktigste forbedringene er på grunn av fremskritt i media/feed strategi optimalisering og cellekultur miljømessige kontroller1, 3 andre priser , 4 andre priser , 5 under produksjonsprosessen.

Siden mAbs produseres i et biologisk system, kan det være iboende protein variasjon. Antistoff sammensetning kan endres etter translationally, slik som glykosylering eller påvirket av degradering eller enzymatisk reaksjoner. Disse strukturelle variasjoner kan provosere farlige immunreaksjoner eller endre antistoff binding, som igjen kan redusere eller eliminere den tiltenkte terapeutiske funksjon5. Således er kritiske kvalitet attributter (CQAs) av monoklonale antistoffer-N-glycan profil, ladning variant distribusjon, og prosentandelen av antistoff i monomere form-regelmessig overvåkes og kontrolleres som en del av en Quality by design (QbD) tilnærming under produksjonsprosesser1,6. I et regulert produksjonsmiljø må terapeutiske proteiner oppfylle aksept kriteriene for å være lisensiert som et godkjent kommersielt legemiddel produkt7. Metodene som presenteres her vil vanligvis være en del av kvalitets karakterisering prosessen for et antistoff7,8, og eventuelle protein forsker vil bli kjent med deres bruk.

I tidligere arbeid9, programmet og drift av microbioreactors for høy gjennomstrømning screening av cellekultur forhold i oppstrøms bioprosessering har blitt beskrevet. Renset produktet innhentet fra varierende medie forhold er utsatt for N-glycan analyse ved hjelp av LC-MS. glykosylering mønstre av terapeutiske proteiner kan oppdages og karakteriseres ved hjelp av LC-MS teknikker10,11, og tilstedeværelsen av ulike glycan arter har vært knyttet til bioprosessen parametre som fôr strategi, pH og temperatur12. Effekten av de varierende medie forhold på produktkvalitet, indikert av prosentandelen av den resulterende IgG i monomere form, er også evaluert med størrelses ekskludering kromatografi-multi-vinkel lysspredning (SEC-MALS)13,14 , 15. lade variant profilen representerer en rekke modifikasjoner16 som kan påvirke funksjonen til et produkt. Microcapillary sone elektroforese (mCZE) er en teknikk som gir en betydelig raskere analyse tid sammenlignet med tradisjonelle (CEX) kromatografi og kapillær isoelectric fokusering (cIEF) metoder som brukes for å lade variant analyse17 ,18. Tilbrakte bioreactor Media ble analysert for å spore amino acid forbruk under protein produksjon som gjelder endringer i antistoff identifisere attributter19,20,21,22 , 23på.

Protein analyse tillater oss å identifisere kritiske prosessparametre (Annonseinnholdspartnere) basert på forholdet mellom prosess innganger og endringer i CQAs. Under bioprosessen utvikling, identifisere og måle Annonseinnholdspartnere fundamentalt demonstrerer prosesskontroll og sikrer at produktet ikke har endret seg, noe som er viktig i sterkt regulerte produksjonsmiljøer. I denne utredningen, analytiske teknikker for å måle noen av de biokjemiske egenskapene til proteinet mest relevante for produktet CQAs (N-glycan profil, lade varianter, og størrelse homogenitet) presenteres.

Protocol

1. rensing av antistoff

Merk: likevekts buffer for husets antistoff er 25 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7,5. Den eluering buffer som brukes er 0,1 M eddiksyre. Buffere og harpiks (protein A) er avhengig av det spesifikke antistoff renset. Kol onne volum tilsvarer Senge høyden av harpiks. Mengden av mobil fase som brukes bestemmes i form av Kol onne volum.

  1. Initialisere rense systemet
    1. Åpne programvaren som er knyttet til rensing systemet. Ved hjelp av manuelle instruksjoner likevekt du kolonnen med likevekts bufferen med en strømningshastighet på 2 mL/min for 40 min. stopp den manuelle kjøringen etter likevekts.
    2. I brøk samleren, plasser 15 mL koniske rør for å samle inn renset antistoff eluatet og 50 mL koniske rør for å samle gjennomstrømning under høy salt vask. Kontroller at brøk kollektoren tilbakestilles til startposisjonen ved å åpne og lukke brøk kollektoren før begynnelsen av kjøringen. Fraksjon samleren opprettholdes ved 7 ° c.
      Merk: brøk kollektoren kan tilbakestilles manuelt under brøk Collector -fanen i Innstillinger, for både 15 mL-og 50 ml-rør.
  2. Prøve injeksjon
    Merk: høstes celle kulturen væsken som brukes i følgende prosedyrer er innhentet fra kinesisk hamster eggstokk celler kultivert i automatisert mikro-bioreaktorer9.
    1. Tilsett 0,22 μm filtrert høste cellekultur væske til en tom 12 mL sprøyte hvis dyse enden er avkortet.
    2. Hold sprøyten med munnstykket vendt ned, sett sprøytestempelet til en liten del av stempelet er i. Pass på at væsken ikke lekker, snu sprøyten med munnstykket vendt opp og ta av lokket.
    3. Hvis du fremdeles holder sprøyten med munnstykket vendt opp, skyver du sylinderen for å fjerne eventuell luft til cellekultur væsken er på tuppen av munnstykket. Sett sprøytemunnstykket inn i den manuelle injeksjons porten på rense systemet og vri for å stramme.
    4. Skyv ned stempelet til alle prøvene er injisert og er synlig i den vedlagte 10 mL store volum prøve sløyfen.
    5. Åpne den lagrede metode filen. Lagre resultatfilen på ønsket sted, og angi filnavnet når du blir bedt om det. Hit Run etter at prøven har blitt injisert i den store volum prøven loop.
  3. Kjøre rensing metoden
    1. Velge det bevart metoden og falle i staver løpe når spørsmål av apparat programvare (steg 1.2.5).
      Merk: systemet er konfigurert til å kjøre følgende trinn. Brukeren trenger ikke gjøre noe mens instrumentet er i gang.
    2. Likevekt kolonnen med tre Kol onne volumer (CVs) for likevekts buffer med en strømningshastighet på 2 mL/min. Når kolonnen er equilibrated, vil systemet ved hjelp av den store volum prøve sløyfen sette inn prøven på kolonnen med en strømningshastighet på 1 mL/min.
    3. Et fall i UV-signal ved 280 NM indikerer at prøven er ferdig lastet. Vask kolonnen med likevekts buffer med en strømningshastighet på 2 mL/min til UV-signalet faller under 25 mAU.
    4. Bruk fire CVer på 25 mM Tris med 1 M NaCl ved pH 7,5 for å utføre en sekundær høy salt vask med en strømningshastighet på 2 mL/min. Systemet fraksjon samleren vil samle alle protein/DNA som kommer av kolonnen under salt vask i 50 mL rør.
    5. Påfør fem CVs av eluering buffer med en strømningshastighet på 1 mL/min for å eluere antistoff av kolonnen. Samle eluatet i 15 mL rør basert på UV-signal; Når UV 280-signalet er over 35 mAU, starter samlingen. -samlingen slutter når signalet synker under 50 mAU; Dette kalles peak cutting.
      Merk: peak cutting sikrer normalisering av eluering profiler og for å unngå eluering peak Tailing som kan inneholde protein aggregater24.
    6. Vask kolonnen med tre CVs av likevekts buffer. Kjøringen avsluttes etter vaske trinnet.
    7. Etter eluering umiddelbart nøytralisere renset protein ved hjelp av 1 M Tris base til en pH på ~ 5,5. Mål protein konsentrasjonen ved hjelp av en microvolume UV-Vis spektrofotometer ved 280 NM og 260 NM og oppbevares ved 4 ° c.
    8. Konsentrer renset antistoff ved hjelp av sentrifugal enheter (trinn 2). Deretter underlagt renset antistoff å glycan analyse ved hjelp av LC-MS og etter aggregering profil analysere ved hjelp av SEC-MALS (trinn 3 & 4).
      Merk: renset antistoff bør ikke fryses uten ytterligere buffer utveksling så hyppige fryse-tine sykluser kan forårsake aggregering og nedbør.

2. konsentrasjon av renset antistoff

Merk: Tris-acetate buffer er 0,1 M eddiksyre nøytralisert med 1 M Tris base til en pH på ~ 5,5.

  1. Sett inn 100 kDa-filtre i sentrifugerør.
  2. Vask filtrene med 500 μL av dobbelt destillert vann. Sentrifuger for 10 min ved 14 000 x g ved romtemperatur (RT). Gjenta dette trinnet to ganger. Kast Filtrer.
  3. Overfør de skylles filtrene til friske sentrifugerør og tilsett 500 μL av prøven til hvert filter. Sentrifuger for 10 min ved 14 000 x g.
  4. Vend filteret til et nytt sentrifugerør. Sentrifuger for 2 min ved 1 000 x g for å samle den konsentrerte prøven.
  5. Bestem prøve konsentrasjonene ved hjelp av en UV-Vis spektrofotometer. Blank spektrofotometer ved hjelp av en løsning av Tris-acetate buffer. Bruk et protein utryddelse koeffisient på 1,37 mL • (mg • cm)-1 ved 280 NM for en 1% (% m/v) IgG løsning.
  6. Bruk den konsentrerte prøven til å klargjøre 12,5 μL av 2 mg/mL arbeids løsning for glycan analyse og 30 μL av 3,5 mg/mL arbeids løsning for SEC-MALS.
    Merk: protokollen kan stanses midlertidig her. Prøvene bør oppbevares ved 4 ° c. Ved 2 mg/mL konsentrasjon bør disse prøvene være stabile i minst tre måneder ved 4 ° c, mens høyere konsentrasjoner kan utløse.

3. analyse av N-glykaner ved hjelp av masse spektroskopi

  1. N-Glycan merking og isolering
    1. Start med antistoff konsentrasjoner på 2 mg/mL i en passende buffer som nøytral natrium fosfat, citrate eller HEPES buffer. Forbered en intakt mAb-standard (for eksempel NIST mAb) ved 2 mg/mL for å behandle sammen med de eksperimentelle prøvene for å fungere som en positiv kontroll.
      Merk: Antistoffene skal være i en endelig buffer som ikke inneholder noen SDS og mindre enn 0,1 mM nucleophiles (som Tris, DTT, Glycine eller histidin). SDS i prøve bufferen må fjernes. Hvis nucleophiles er i bufferen, deretter fortynne dem ned eller utføre en buffer utveksling siden de vil forstyrre Kit. Den generelle protokollen er utstyrt med glycan Kit.
    2. Fortynne 7,5 μL av antistoffer med 15,3 μL av LC-MS-grade vann i 1 mL rør som følger med settet og deretter denaturere med 6 μL 5% løsning av et enzym vennlig og MS-vennlig overflateaktivt middel ved 90 ° c i 3 min.
    3. Avkjøl prøvene i 3 min til romtemperatur (RT). Legg deretter til 1,2 μL av PNGase F og ruge i 5 minutter ved 50 ° c.
    4. Etter avkjøling 3 min til RT, Merk den kløyvde N-glykaner ved å tilsette 12 μL av fluorescerende merkings reagens oppløst i vannfri dimethylformamide (DMF) og vent i 5 min. fortynne den merkede N-glycan blandingen med 358 μL av acetonitril (ACN).
    5. Plasser en hydrofile interaksjon kromatografi (HILIC) plate i et vakuum manifold med mellomlegg og avfallsskuff. Bruk en flerkanals pipette for et stort antall prøver.
    6. Tilstand brønnene med 200 μL av vann, der vakuum er justert slik at væsken vil ta 15-30 s å passere gjennom HILIC harpiks. Likevekt med 200 μL av 85% ACN før lasting av ACN-fortynnet merket glycan blanding (400 μL), påføring av vakuum etter at hver ny væske er tilsatt til brønnene. Vask harpiks med 600 μL av 1% maursyre syre (FA)/90% ACN to ganger.
    7. Skift ut avfallsbrettet med 600 μL oppsamlings rør. Eluere den merkede N-glykaner med SPE-eluering buffer (3 elutions på 30 μL hver) i oppsamlings rørene. Fortynne den sammenslåtte elutions med 310 μL av DMF/ACN prøve fortynningsmiddel. Pipetter prøvene i Auto sampler hetteglass for å være klar for fluorescens (FLR)-MS analyse.
      Merk: disse prøvene er stabile når de oppbevares ved-80 ° c i minst 1 måned. Oppbevar HILIC plate i originalemballasjen, tapet lukket og inne i en desikator for fremtidig bruk.
  2. LC-MS analyse av merket N-glykaner
    1. Analyser de merkede N-glycan eluering prøvene på et ultra Performance Liquid kromatografi (UPLC)-system koblet til en fluorescens detektor og quadrupole time-of-Flight (Q-ToF) masse spektrometer. Bruk en kolonne som er godkjent for kromatografiske separasjon av merket glykaner og varme til 60 ° c under separasjoner.
      Merk: kolonnen må spyles med 60% acetonitril og 40% H2O før bruk: 50 CVS før første gangs bruk eller 20 CVS Hvis kolonnen har blitt brukt før.
      1. Bruk 50 mM ammonium formiat (AmF) (laget med mobil fase konsentrat) og 100% LC-MS-grade ACN for de mobile fasene. Den AmF er følsom for pH endringer og kan brukes i 1 måned etter blanding. Angi den første strømningshastigheten til 0,4 mL/min, med LC-graderingen som gir økende AmF under eluering fasen.
      2. Sett FLR-detektoren for å måle ved EX 265/EM 425 NM med en samplingsfrekvens på 2 Hz. sett Q-ToF til MS1 positiv ion følsomhet modus, med en masse utvalg av 100-2000 Daltons (da), en skanning tid på 0,25 sekunder og kontinuum data oppkjøpet. Bruk leucine enkephalin (2 ng/μL i 50% ACN/0.1% FA) for intern masse referanse, i "ikke bruk korreksjon"-modus.
        Merk: intern masse referanse korreksjon vil bli brukt senere under databehandling.
      3. Re-suspendere dextran stigen sekvensielt i 22,5 μL av H2O, 25 ΜL av DMF og 52,5 ΜL av ACN. Forbered 10 μL alikvoter for lagring ved-80 ° c, da stigen ikke er stabil i mer enn 24 timer ved høyere temperaturer (romtemperatur, 4 ° c). Den dextran stigen forringer etter mer enn én fryse-tine syklus.
      4. Sett prøvene i Auto sampler satt til 10 ° c. Legg en hetteglass med dextran stigen sammen med prøvene, som oppbevaring tid informasjon av stigen vil bli brukt til oppgaver mens massen informasjonen brukes til å validere IDer. Bruk 10 μL injeksjoner for prøvene og 7,5 μL injeksjoner for stigen. Injiser prøvene i tre eksemplarer. Kjør den innlastede metoden.
  3. N-Glycan-identifikasjon for LC-MS-data
    1. Utfør databehandling med et program optimalisert for hydrofile interaksjon kromatografi fluorescens masse massespektrometri (HILIC-FLR-MS) data.
    2. Bruk interne masse referanse rettelser i programmet. Utpeke dextran stigen injeksjoner som "standard" i sample informasjon. I analyse-metodenangir du separasjon sammensatte oppbevaring ganger til de av stigen forbindelser som ble oppdaget under kjøringen.
    3. For å sikre at området% vil bli returnert for identifiserte glykaner, endre analysemetode: under kategorien behandler , klikk kvantifisering innstillinger -Kalibrer og sett "kalibreringskurven passer type" til "relativ respons (%)".

4. analyse av antistoff aggregering ved bruk av SEC-MALS

  1. Eksempel på tilberedning
    1. Overfør 3,5 mg/mL (trinn 2) fortynnet protein til et hetteglass med en 150 μL glass innsats. Bruk en gel lasting spissen for å Pipet inn i bunnen bjelle på innsatsen for å unngå innføring av bobler.
    2. Hette flasken med en septa hette og analyser umiddelbart. Oppbevares ved 4 ° c Hvis det analyseres senere.
  2. SEC-MALS konfigurasjon og likevekts
    Merk: analyser aggregering på SEC-MALS konfigurert med en Ultra High-Pressure Liquid kromatografi (UHPLC) med en MALS detektor og brytningsindeks detektor styrt av MALS-programvaren.
    1. Konfigurer en metode fil i UHPLC-programvaren for kontroll av UHPLC-systemet, og angi strømningshastigheten til 0,4 mL/min med en mobil fase av 1x fosfat bufret Saline (PBS) (fortynnet fra 10x), injeksjonsvolumet til 5 μL, Kol onne temperaturen til 25 ° c , og diode array detektor (DAD) for å overvåke 280 NM. Angi kjøretid til 20 min. likevekt systemet i minst 4 timer før noen prøveanalyse.
    2. Grensesnittet mellom UHPLC og multi Angle lysspredning-brytningsindeks (MALS-RI) detektorer krever bruk av analog utgang på DAD. Sett DAD demping til 1 000 mAU i DAD metode filen og AU/UV-innstillingen til 1 (UV instrument ≫ kanaler ≫ Channel 1).
    3. Slå på DAD lampen 30 min før begynnelsen analyse og sette bølgelengde til 280 NM. Samtidig tømmer du referansecellen brytningsindeks (RI) i 15 minutter eller til den opprinnelige planen er stabil, og deretter lukker du referansecellen.
    4. Konfigurer SEC-MALS programvare sekvens, sette samlingen tid til 12 min, injeksjonsvolumet til 5 μL, DN/DC til 0,185 mL/g, A280 utryddelse koeffisient Hvis tidligere eksperimentelt bestemt eller 1,37 mL * (mg * cm)-1, og konsentrasjonen av Eksempel. Klikk Kjør og vent til "venter på å injisere" dialogen skal vises på skjermen.
      Merk: A280 utryddelse koeffisient er spesifikk for protein av interesse og bør fastsettes eksperimentelt.
    5. Konfigurer en eksempel liste i UHPLC-programvaren i samme rekkefølge som i MALS-RI-programvaren og Send.
      Merk: det er viktig å kjøre en system egnethet sjekk før og etter en løpetur. Storfe serum albumin vanligvis brukes til å se etter peak utvide, et tegn på at SEC kolonnen kan trengeren gjøring eller utskifting. Den samme BSA standard injeksjon kan brukes til å spesifisere signal justering, peak utvide, og detektor normalisering.
  3. Samlet analyse med MALS-programvare
    1. Klikk på fanen merket prosedyrer. Angi minimumsnivået for despiking som kreves. ingen er vanligvis tilstrekkelig.
    2. Kontroller at opprinnelige planer er riktig tegnet, og Juster om nødvendig for LS1-, LS2-, LS3-, RI-og UV-kanaler. Angi det høyeste området av interesse.
    3. Se gjennom den molekylære masse fordelingen for å bekrefte at de kalte toppene inneholder partikler av samme størrelse.

5. gebyr variant analyse

  1. Eksempel på klargjøring og merking
    1. Start med 80 μL av en oppløsning på 3,5 mg/mL antistoff. Avsalte prøven ved hjelp av en 0,5 mL Avsaltingsspisser overlegne sammenlignet-kolonne (7k MWCO). Klargjør kolonnen ved først å feste den nederste proppen, deretter løsne topp proppen og plassere den i en 1,7 mL mikro-sentrifuge slange. Sentrifuger den avsaltingsspisser overlegne sammenlignet kolonnen i 1 min ved 1 500 x g.
      Merk: Merk utsiden av kolonnen med en prikk slik at den kan plasseres i den opprinnelige retningen for de neste trinnene.
    2. Overfør kolonnen til et nytt mikro-sentrifugerør. Tilsett 80 μL av utvannet protein til toppen av kolonnen. Juster kolonnen til den opprinnelige retningen. Sentrifuger for 2 min ved 1 500 x g. Fjern prøven fra sentrifuger, kast den avsaltingsspisser overlegne sammenlignet kolonnen og bland prøven godt.
      Merk: Avsaltingsspisser overlegne sammenlignet er bare nødvendig hvis utvalget matrise inneholder primære aminer, hjelpestoffer som vil forurolige prøven elektroforese, eller andre inkompatible stoffer.
    3. Fortynne prøven til en endelig konsentrasjon på 2 mg/mL i et volum på 25 μL og tilsett 5 μL av merkings bufferen (se tabell over materialer: charge variant reagenssett) i 96 brønn plate. Klargjør merkingen reagens ved å fortynne den nødvendige mengden av merking reagens (se tabell av materialer: charge variant reagenssett) 1:30 i dimethylformamide. Ruge prøven i 10 min ved romtemperatur vekk fra lyset.
      Merk: det er viktig å tine og deretter umiddelbart bruke denne reagens og bruke den innen 10 min av blanding med DMF.
    4. Etter incubating, tilsett 60 μL av reagens kvalitet vann og bland godt av pipettering. Dekkplaten med en plate sel og sentrifuger platen ved 1 000 x g i 1 min.
  2. Klargjøre lade variant brikken
    1. Klargjør charge variant-brikken ved å fjerne lagringsløsningen og vaske brønnene 1, 3, 4, 7, 8 og 10 med vann. Deretter erstatte vannet med pH 7,2 kjører buffer (se tabell av materialer: charge variant reagens Kit).
    2. Tilsett 750 μL av pH 7,2 som kjører buffer i buffer røret, og plasser buffer røret på det indikerte stedet i øvre venstre hjørne av prøve skuffen. Fjern nå plate forseglingen fra 96-brønn platen, trykk losse plate på instrument brukergrensesnittet, og sett inn platen i GXII.
      Merk: pH 7,2 buffere ble brukt for denne analysen. pH 5.6-7.2 buffere kan brukes avhengig av protein pI. Når du bruker lavere pH-buffere, kan det være nødvendig med lengre prøve tider.
    3. Trykk på knappen for å fjerne brikken i brukergrensesnittet. Sørg for at elektrodene er fri for partikler, og hvis ikke, Rengjør med en lofri serviett. Når du setter inn chip sørge for at vinduet i midten av brikken er fri for partikler eller flekker. Rengjør om nødvendig med en lofri, myk klut.
      Merk: Når du arbeider med kapillær elektroforese chips, fjerne buffer ved vakuum aspirasjon, etterfulgt av umiddelbar tilsetning av neste løsning for å hindre at brønner tørker ut. For å minimere innføringen av bobler, øve omvendt pipettering teknikk. Ved håndtering av chip, være oppmerksom på den skjøre kapillær som strekker seg fra bunnen av brikken, og pass på at den ikke tørker ut og ikke bryte gjennom røff behandling.
    4. Lukk lokket til chip kammeret og velg HT protein charge variant analysen. Klikk på Kjør -knappen. Følg instruksjonene for å velge prøve brønnene, platetypen, analyse tiden (68, 90 eller 100 s) og filnavnet. Klikk Start på slutten av ledetekstene.
    5. Chip opprydding krever vask av hver brønn 2x med vann, etterfulgt av tilsetning av lagrings buffer (se tabell av materialer: charge variant reagens Kit). Når du er i lagrings buffer, Erstatt brikken i instrumentet, og når du blir bedt om det, velger du HT protein charge analysen. I hovedskjermbildet velger du vask i brukergrensesnittet. Når du er ferdig, fjerner du brikken, tørker av elektrodene med vann og en lofri serviett og oppbevarer brikken ved 4 ° c.
  3. Analyse av gebyr variant
    1. Åpne instrument analyseprogramvaren. Importer kjøringen ved å gå til fil ≫ Importer data fil... og klikke på ønsket *. gxd fil. Bare navnet vil bli overført til programvare, så døpe brønnene er fordelaktig (verktøy ≫ eksempel navn Editor). Velg filene som skal eksporteres, ved å holde nede SKIFT mens du velger filene. Klikk på fil ≫ Export... og velg RAW data Box og deretter AIA format eske.
    2. Åpne fanen bla gjennom prosjekter i analyseprogramvaren. Klikk på Database ≫ Importer data... og velg den eksporterte *. CDF-filer.
    3. Når importert, Naviger til injeksjoner kategorien, Velg filene som skal analyseres, høyreklikk og gå til prosessen... I vinduet som kommer opp, merker du av i boksen ved siden av Behandle og velger "Bruk spesifisert behandlingsmetode" radio boksen og ønsket behandlingsmetode fra rullegardinlisten. I rullegardinlisten rett under merket "How:" Velg Kalibrer og quantitate. Når den er behandlet, navigerer du til kategorien resultater og kontrollerer integreringen av kromatogrammene.
      Merk: behandlingsmetoden må verifiseres for hver metode. Som et utgangspunkt er parameterne som brukes for den gjeldende behandlingsmetoden, inkludert i tilleggsfilen.
      Merk: eksportering av dataene kan gjøres i form av en rapport eller bare topp kvantifisering kan eksporteres. Disse kan gjøres på samme tid som behandling eller fra resultatvinduet.

6. aminosyre analyse

  1. Sette opp standardkurven for absolutt aminosyre kvantifisering av LC-MS
    1. Forbered den utvidede aminosyren (EAA) blandingen ved oppløsning 59,45 mg av ASN, 59,00 mg Hyp, 65,77 mg Gln, og 91,95 mg TRP i 25 mL av 0,1 N HCl. Den endelige konsentrasjonen av hver aminosyre i EAA-blandingen er 18 nmol/μL.
    2. Klargjør den interne standard (ISTD)-lager løsningen ved å oppløse 58,58 mg NVA og 44,54 mg SAR i 50 mL HCl.
    3. Forbered fullstendig aminosyre standarder ved å kombinere aminosyren lagerløsning som inneholder ala, ASP, ARG, cys, Glu, Gly, hans, Ile, leu, Met, Phe, Pro, ser, THR, TRP, Tyr, Val på 1 nmol/μL hver med EAA blanding for endelig aminosyre konsentrasjoner av 900 , 225, 90, 22,5 og 9 pmol/μL. Legg den forberedte ISTD-aksjen til aminosyre-standardene for en endelig konsentrasjon av enten 90 pmol/μL eller 900 pmol/μL for å skape "lave" og "høye" interne standarder som skal brukes som positive kontroller for metoden.
    4. Plasser aminosyre-konsentrasjonene i prøve ampuller i autosampler på UPLC. Generer en kalibrerings kurve (9 til 900 pmol/μL) i instrument programvaren basert på standard konsentrasjonene av aminosyrer ved hjelp av følgende instruksjoner.
    5. Bruk Q-ToF i electrospray ionisering (ESI) positive følsomhet modus koblet til en UPLC for intakt aminosyre analyse. For kromatografiske separasjon, bruk en normal fase kolonne laget for amino acid separasjoner. Klargjør følgende buffere med masse massespektrometri grader reagenser: A = acetonitril + 0,1% maursyre syre og B = 100 mM ammonium formiat. Sett LC strømningshastighet til 0,6 mL/min og Kol onne temperatur til 40 ° c.
    6. Bruk følgende 15-minutters graderings betingelser for separasjoner for aminosyre: 14% b (0-3 min), 14-100% B (3-10 min), 100% B (10-13 min), 100-8% B (13-14 min), 8% B (14-15 min).
    7. Bruk "sample type" og "CONC A" kolonne oppføringer i MS oppkjøpet programmet til å lage en kalibrering kurve for fremtidig analyse av rå bioreactor medier i kvantifisering programmet. Hvis du vil at disse kolonnene skal vises i anskaffelses programmet, bruker du kommandoen Tilpass visning... når du høyreklikker på den øverste menylinjen.
    8. The sample type for aminosyren standarder vil være "standard", mens Media prøvene vil være "analytt". Fyll ut "CONC A"-kolonnen med de numeriske konsentrasjonene av standardene i de nødvendige enhetene (f.eks. pmol/μL).
    9. Kjør forberedt aminosyre standard konsentrasjoner minst to ganger. Kontroller at UPLC-instrumentet og masse spektrometer fungerer riktig ved å kontrollere ISTD-toppene.
    10. Bruk alternativet Rediger metode i kvantifisering-programmet til å opprette kvantifisering-metoden (*. MDB-fil). Definer alle aminosyrer av interesse i kvantifisering-programmet, for eksempel sammensatt navn, m/z-verdi og forventet oppbevaringstid. Endre integrerings parameterne for metoden her.
    11. Bruk den opprettede aminosyre-metoden på standard prøvene for å opprette kalibreringskurven. Denne kurven kan eksporteres til en *. CDB-fil for bruk med medie eksemplene ved hjelp av kommandoen Export ≫ Calibration... .
    12. I kvantifisering-programmet lagrer du ønsket oppsett til en *. qlt-fil som skal brukes på fremtidige datasett med "lagre oppsett som...". Navn (injeksjons navn), areal og CONC er de viktigste output kolonnene.
  2. Aminosyre analyse av råolje bioreactor Media av LC-MS
    1. Sentrifuger råolje bioreactor Media på 1 962 x g i 5 minutter og passere gjennom et 0,22 μm filter.
    2. Følg opp med en perklorsyreblank syre opprydding for å fjerne protein og partikler: Bland de filtrerte bioreactor Media med 0,4 N HClO4 på et 1:1 ratio og sentrifuger på 14 700 x g i 5 min ved RT. samle avklart Media i autosampler hetteglass.
      Merk: Juster injeksjonsvolumet etter behov for å få aminosyre-konsentrasjonene til å falle innenfor kalibrerings området. Avhengig av instrumentet kan injeksjonsvolumet justeres mellom 0,1 μL og 10 μL.
    3. Kjør medie prøver i tre eksemplarer av LC-MS. Bruk "prosess prøver" under kvantifisering-programmet sammen med metoden (*. mdb) og kalibrerings filen (*. CDB). Metoden og kalibrering kurven vil automatisk bli brukt til grov Media prøvene av kvantifisering programmet når alle injeksjoner er fullført.
    4. Hvis du vil eksportere data for analyse i et annet program (for eksempel et regneark), bruker du kommandoen "Skriv ut" og oppretter en *. XPS-eller *. PDF-fil.

Representative Results

Den høstet cellekultur væsken fra den automatiserte Mikroskala bioreactor er renset ved hjelp av raske protein flytende kromatografi (FPLC), som sett i figur 1 og renset proteinene kritiske kvalitet attributter (CQAs) var preget av ulike nedstrøms analytiske metoder. Dette er en viktig fordel ved det automatiserte microbioreactor systemet; forskjeller i CQAs kan raskt vurderes på tvers av et bredt spekter av forhold. N-glycan data fra CHO-produserte mAbs som behandles av masse massespektrometri skal fremstå som kromatogrammene vist i figur 2. Figuren viser en sammenligning mellom to kromatogrammene som viser at mannose 5 Peak (M5) fra en prøve er betydelig lavere. Hvis bare en støyende Baseline er observert i stedet for topper, kan dette bety at kromatografi-oppsettet er defekt eller at prosedyren ikke er vellykket. Ved hjelp av kontroller kan feilsøking forenkles. Først vurdere FLR toppene fra dextran stigen; disse toppene indikerer at kromatografiske systemet fungerer som det skal. Neste, sammenligne eksperimentelt innhentet topper med de Hentet fra en behandlet intakt mAb standard. Hvis toppene fra standarden er synlige, men ingen utvalg topper er identifisert, så mAb prøvene ble ikke behandlet på riktig måte. Dette kan skyldes SDS eller nukleofilen tilstedeværelse i bufferen forstyrrer N-glycan merking og rensing.

SEC-MALS kan brukes til å vurdere to CQAs: aggregering profilen og Molekylvekten av antistoff. En representativ SEC-MALS-kromatogram kan sammenlignes med den som vises i Figur 3. Den molekylære masse fordelingen og den absolutte Molekylvekten ble bestemt ved hjelp av den nødvendige programvaren med en utryddelse koeffisient på 1,37 mL * (mg * cm)-1 og en DN/dc på 0,185 ml/g. Som peak ringe og sette Baseline i programvaren utføres manuelt, kan resultatene variere noe fra bruker til bruker. Den absolutte Molekylvekten av monomere IgG1 fra Figur 3 er 1,504 x 105 da ± 0,38% (blå) og høyere bestillings kompleks er 7,799 x 105 da ± 3,0% (rød). Polydispersitet av aggregater er mye større enn for monomer, som indikert av den røde molar masse fordelingen av peak 1 (Figur 3). Den lille mengden av prøven og viktigheten av aggregering som en CQA gjør denne teknikken en svært verdifull komplementære analytisk verktøy til automatisert microbioreactor systemet.

Resultatet av mCZE er en elektroferogrammet, for eksempel i Figur 4, som viser lade variant profilen for et monoklonale antistoff. Profilen er en unik signatur for proteinet som undersøkes og er svært følsom for drifts pH. Også synlig er en fri-Dye peak til venstre for belastningen variant profil. Ved etablering av en drifts pH, er det noe skjønn til operatøren å balansere oppløsning og signal; i tillegg må operatøren sikre god separasjon fra fri-Dye peak som migrerer på ~ 30 s. Prøven kan være avsalte etter merking for å fjerne denne toppen, selv om dette fører til et betydelig tap i signal. Når en pH-drift er etablert, kan utvalgs profilene sammenlignes. Selv om endringer i merkings effektiviteten eller forskjellene i hjelpestoffer generelt er konsekvente, kan det føre til mindre forskjeller i migreringen av en prøve og en variant profil som gjør electropherograms vanskelig å sammenligne direkte. I stedet er metoden for sammenligning vanligvis basert på prosenter av grunnleggende, viktigste, og sure arter. I dette tilfellet kan relative forskjeller så små som 1-2% identifiseres ved hjelp av mCZE.

Aminosyre-forbruk kan overvåkes for å fastslå om reduksjonen forårsaker endringer i CQAs. Kromatogram readouts fra massen spektrometer kan brukes til å evaluere vellykket etablering av en kalibrering kurve for den absolutte kvantifisering av aminosyrer i rå bioreactor medier prøver. Figur 5 viser to totale ion KROMATOGRAMMENE (TIC) og en ekstrahert ion KROMATOGRAM (XIC) som representative resultater under denne prosessen. I figur 5A, den Tic vist viser bakgrunnen signalet fra buffer systemet som bare en vann blank ble injisert. Figur 5 B viser en representativ Tic av aminosyren standarden der, sammenlignet med vann blank, små topper som tilsvarer den enkelte aminosyre arter kan observeres (for eksempel lysin på 7,96 minutter). Å integrere det fjellpigg og letter det kvantifisering av fjellpigg område (og derfor konsentrasjonen), det XIC brukes der hvor bare signalet fra en definerte "kromatogram masse vindu" er vist. Avhengig av følsomheten til instrumentet og kvaliteten på kromatografiske separasjon, vil den optimale massen vinduet må bestemmes av brukeren. I dette eksempelet (figur 5C), XIC av lysin (m/z = 147,1144) med en masse vindu på 10 ppm er vist hvor lysin i aminosyren standard elutes av kolonnen på 8,03 minutter.

Figure 1
Figur 1 . Representative kromatogram av rensing ordningen ved hjelp av fast protein Liquid kromatografi (FPLC) teknikk. Rensing metode faser tilsvarende volum (mL) er merket langs x-aksen. UV-absorbansen ved 280 NM (mAU y-akse, heltrukket linje) overvåkes gjennom rense syklusen. Ikke-spesielt bundet urenheter er forskjøvet ved å øke ledningsevne (mS/cm y-aksen, stiplet linje) under High salt Wash. antistoff er eluert fra protein en kolonne med innføringen av eluering buffer (CONC B, stiplet linje) når pH synker til 4 (ikke vises). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2En representativ fluorescens kromatogram innhentet fra merkede glykaner som er masse verifisert. X-aksen er oppbevaringstid (minutter) mens y-aksen er signal intensitet. Toppen på 14,94 min representerer mannose 5 (M5) glycan, der en stor forskjell mellom M5 signalstyrken kan observeres mellom de to prøvene som er kledde. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3Molekylær vektfordeling av IgG1 monoklonale antistoff. Kromatogram av et intakt IgG1 monoklonale antistoff separert etter størrelses ekskludering kromatografi i 1x PBS (pH 7.4). Absorbansen overvåkes ved 280 NM (svart, venstre akse) og lysspredning og brytningsindeks detektorer ble brukt til å beregne den absolutte Molekylvekten til hver topp (rød og blå; høyre akse). Høy molekylvekt arter er indikert med toppen merket "HMW". Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 . Lade variant profilen til et IgG1 monoklonale antistoff. Denne elektroferogrammet genereres på en mCZE-plattform. En fri-Dye peak migrerer på ~ 30 s og er godt adskilt fra IgG1. For kvantifisering, topper ble delt inn i grunnleggende, viktigste, og sure arter ved hjelp av instrument dataanalyse programvare. Den røde linjen skisserer de integrerte topp områdene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5Representative resultater av ion-kromatogrammene for masse massespektrometri-basert aminosyre-analyse av råolje bioreactor medier. X-aksen er tid (minutter) mens y-aksen er signal intensitet (a) a vann blank fungerer som den negative kontrollen og avslører bakgrunns signalet observert i løpet av væsken kromatografi gradient (B) 225 pmol/μL aminosyre standarden er brukt her som en positiv kontroll, som de enkelte toppene observert i denne totale ion kromatogram representerer de ulike aminosyrer av standard Mix blir løst chromatographically (C) en representant ekstrahert ion kromatogram for m /z 147,1144, som er lysin. Den 7,96 min topp i B tilsvarer 8,03 topp i C av lysin. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

HCCF inneholder rusk og store partikler som kan tette og ødelegge kostbare instrumentering, og dermed kultur avklaring er nødvendig før videre nedstrøms behandling. Sentrifugering er vanligvis den første tilnærmingen til å skille celler og andre uløselig partikler fra proteiner etterfulgt av filtrering. Denne filtrerte HCCF blir deretter utsatt for fast protein Liquid kromatografi (FPLC) for rensing. Rensing av HCCF fra automatiserte microbioreactors for å få produktet er et viktig skritt i nedstrøms behandling. Her, en stasjonære FPLC system med et protein en kolonne brukes til å få monoklonale antistoffer fra HCCF. Analyse for oppstrøms prosesser kan gi nyttig innsikt i celle adferd og veilede bioprosessen design, noe som bidrar til å oppnå et konsistent og pålitelig kvalitetsprodukt. I Analytics kan vi også knytte kritiske kvalitetsegenskaper (CQAs) til oppstrøms og nedstrøms prosesser. Presenteres her er fire analyser som er ofte brukt i karakterisering av monoklonale antistoffer. Disse teknikkene er robuste, pålitelige og lett å kunne distribueres for prosess-og produkt analyse fra en rekke oppstrøms kilder som bare er delvis renset og kan fortsatt inneholde gjenværende nivåer av DNA og HCP.

Når du rydder opp prøver for analyse, må det treffes en viktig balanse mellom å lage en prøve som er tilstrekkelig ren for analyse og samtidig bevare variasjonen som finnes i bioreactor. De to vanligste forurensninger som påvirker produktet er DNA og HCP, som kan kontrolleres ved å måle forholdet absorbansen ved 260/280 NM og gjennom SDS-PAGE eller μCE-SDS. Analysene som presenteres her er ikke følsomme for lave nivåer av DNA-innhold. Renheten av produktet er > 95% ren, som bestemmes av μCE-SDS.

Microcapillary elektroforese system gir en høy gjennomstrømmings metode for å identifisere lade varianter, med sjetonger og reagenser som er relativt enkle å implementere. Arten av teknikken og kjemi av merkingen reagens er både følsomme for hjelpestoffer og andre primære aminer, og dermed krever en avsaltingsspisser overlegne sammenlignet trinn for de fleste sample matriser. Av erfaring, lave nivåer av DNA co-migrere med fri-Dye fra merking reaksjonen og ikke påvirke kvaliteten på resultatene. Mens variasjon av grunnleggende, viktigste og sure peak kvantifisering er vanligvis < 1%, høyere nivåer av DNA og andre forurensninger kan øke variasjonen av analysen. Det er svært viktig å være forenlig med protein merking og sikre rask bruk av DMF etter fjerning fra flasken og blandes med fargestoff. Lysin og/eller histidin standarder anbefales som merking kontroller. Over tid og avhengig av sample kvalitet, chips kan foul eller miste belegget på materialer kanaler, fører til større støy, tilstedeværelsen av spøkelse topper, og større sample-til-sample variasjon. For å identifisere denne forekomsten, blanks og et system egnethet standard (dvs. NISTmAb) ble samtidig analysert med prøvene med jevne mellomrom. Når chip problemer oppstår, kan brikkene vaskes med lagringsløsning eller erstattes.

Metodene som brukes for glycan analyse av terapeutisk glykoproteiner primært innebærer flytende kromatografi (LC) og/eller masse massespektrometri (MS), med Lektiner Microarray analyse popularitet som et tredje alternativ25. Metoden beskrevet i denne utredningen bruker både LC og MS, som har fordeler og ulemper. Mass spectrometric metoder har fordelen av masse verifisering av analysert glykaner, som ikke er mulig med LC-baserte metoder ved hjelp av en fluorescerende deteksjon utgang eller Lektiner Microarrays. Denne metoden bruker LC og fluorescens deteksjon å tildele glycan identiteter ved hjelp av oppbevaring tid sammenligning til en dextran stigen standard. Fluorescens avlytting innrømmer for forhøyet følsomheten og kvantifisering på grunn av det lette av dens oppdagelsen, der hvor MULTIPLE SCLEROSIS alene kunne ikke være i stand til kvantifisere lav overflod art på grunn av det fattig ionisering effektiviteten av oligosaccharides. Masse informasjonen fra MS brukes til å bekrefte glycan identiteter, men behandlingsprogramvaren bruker ikke masse informasjon som de primære tilordnings kriteriene. Derfor, uten reproduserbar kromatografi og lett kan løses topper, denne metoden kan lide om glycan oppgaver. Heldigvis kan masse informasjonen hjelpe med glycan oppgaver selv i situasjoner der kromatografi er subpar, for eksempel skift i oppbevaringstid som hindrer reproduserbar glycan tildelinger. Hvis denne metoden brukes uten MS, må kromatografi være på høyeste nivå, siden masse informasjon ikke kan brukes til å korrigere for oppholdstid drift.

Aminosyren analysemetoden beskrevet her benytter LC-MS for rask kvantifisering av underivatized aminosyrer i råolje cellekultur Media. Alternative aminosyre analysemetoder krever amino acid derivatization agenter for å aktivere UV deteksjon26. LC-MS metoden gir viktige fordeler i forhold til LC-UV-metoden: det gir mulighet for identifisering basert på både oppbevaring tid og Ion masse i motsetning til LC-UV-metoden, som er begrenset av mangel på masse karakterisering. I tillegg gir LC-MS-metoden tid og reproduserbarhet fordeler, ettersom LC-UV-metoden krever en tidkrevende derivatization reaksjon, som kan formidle utvalgs variasjon27. Imidlertid, det injeksjon av grov cellen kulturen Media inne det LC-MULTIPLE SCLEROSIS metoden kanne anledning ugunstig virkninger opp på MULTIPLE SCLEROSIS signal på grunn av ion skimmer forurensning. En kalibrerings stige injiseres ofte som et system egnethet sjekk, og prøven rekkefølge er randomisert til å hindre bias i dataene.

Cellekultur prosessen for antistoff produksjon ved hjelp av microbioreactors er tidligere beskrevet9. I denne studien er detaljerte protokoller for monoklonale antistoff karakterisering metoder som maksimerer data ervervet fra begrenset utvalg volumer veldefinerte. Begrensede mengder høstet cellekultur væske kan noen ganger begrense produktinformasjonen ervervet og valg av riktige analytiske prosedyrer for å oppnå produktkvalitet data er avgjørende. Analytics er viktig å knytte sammen oppstrøms prosessparametre til endringer i produktkvalitet. Her er en retningslinje gitt for brukere å karakterisere mAbs når du arbeider med microbioreactors.

Disclosures

Denne publikasjonen reflekterer synspunktene til forfatteren og bør ikke tolkes til å representere FDA ' s synspunkter eller politikk.

Acknowledgments

Forfatterne vil gjerne takke Scott lutt for den analytiske støtten han ga. Delvis intern finansiering og støtte for dette arbeidet er gitt av CDER kritisk bane program (CA #1-13). Dette prosjektet er støttet delvis av en avtale til internship/forskning deltakelse program på Office of bioteknologi produkter, US Food and Drug Administration, administrert av Oak Ridge Institute for Science and Education gjennom en Interagency avtale mellom US Department of Energy og FDA.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CHO DG44 Cell Line Invitrogen A1100001
Akta Avant 25 General Electric Life Sciences 28930842
Pro Sep vA Ultra Chromatography Resin Millipore Sigma 115115830 Purification Stationary Phase
Omnifit 10cm Column Diba Fluid Intelligence 006EZ-06-10-AA Housing for Stationary Phase
Tris Base Fisher Scientific BP154-1
Superloop 10 mL GE Healthcare 18-1113-81
µDawn Multi Angle Light Scattering Detector Wyatt WUDAWN-01
0.22 µm Millex GV Filter Unit PVDF Membrane Merck Millipore SLGV033RB
10X Phosphate Buffered Saline Corning 46-013-CM
12 mL Syringe Covidien 8881512878
1290 Infinity Binary Pump Agilent Technologies G4220A
1290 Infinity DAD  Agilent Technologies G4212A
1290 Infinity Sampler Agilent Technologies G4226A
1290 Infinity Thermostat Agilent Technologies G1330B
1290 Infinity Thermostatted Column Compartment Agilent Technologies G1316C
15 mL Falcon tube Corning Inc. 352097
150 uL Glass Inserts with Polymer Feet  Agilent Technologies 5183-2088
50 mL Falcon tube Corning Inc. 352070
96-Well Plate Bio-Rad 127737
Acetic Acid Sigma-Aldrich 695072
Acetonitrile Fisher Chemical BPA996-4
ACQUITY I-Class UPLC BSM Waters Corporation 18601504612
ACQUITY I-Class UPLC Sample Manager Waters Corporation 186015000
ACQUITY UPLC FLR Detector Waters Corporation 176015029
Amicon Ultra-4 100 kDa centrifugal filters Merck Millipore UFC810096
Amino Acid Standard, 1 nmol/µL  Agilent Technologies 5061-3330
Amino Acid Supplement Agilent Technologies 5062-2478
Ammonium Formate Solution - Glycan Analysis Waters Corporation 186007081
Blue Screw Caps with Septa Agilent Technologies 5182-0717
CD OptiCHO AGT Medium Thermo Fisher Scientific A1122205
Centrifuge Tubes Eppendorf 22363352
Charge Variant Chip Perkin Elmer 760435
Charge Variant Reagent Kit Perkin Elmer CLS760670
Chromatography Water (MS Grade) Fisher Chemical W6-4
Dimethylformamide Thermo Scientific 20673
Extraction Plate Manifold for Oasis 96-Well Plates Waters Corporation 186001831
Formic Acid Fisher Chemical A117-50
GlycoWorks RapiFlour-MS N-Glycan Starter Kit - 24 Sample Waters Corporation 176003712
GXII Buffer Tubes E&K Scientific 697075- NC
GXII Detection Window Cleaning Cloth VWR 21912-046
GXII HT Touch Perkin Elmer CLS138160
GXII Ladder Tubes Genemate C-3258-1
GXII Lint-Free Swab ITW Texwipe TX758B
Hydrochloric Acid Fisher Scientific A144-500
Intact mAb Mass Check Standard Waters Corporation 186006552
Intrada Amino Acid Column 150 x 2 mm Imtakt WAA25
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific 840274100
Optilab UT-rEX Differential Refractive Index Detector Wyatt WTREX-11
Perchloric acid Aldrich Chemistry 311421
Pipet Tips with Microcapillary for Loading Gels Labcon 1034-960-008
Polypropylene 96-Well Microplate, F-bottom, Chimney-style, Black Greiner Bio-One 655209
RapiFlour-MS Dextran Calibration Ladder Waters Corporation 186007982
Screw Top Clear Vial 2mL Agilent Technologies 5182-0715
Sodium Chloride Fisher Scientific S271-1
Sodium Iodide Sigma Aldrich 383112
TSKgel UP-SW3000 4.6mm ID x 30 cm L Tosoh Biosciences 003449
UNIFI Scientific Information System Waters Corporation 667005138
Vacuum Manifold Shims Waters Corporation 186007986
Vacuum Pump Waters Corporation 725000604
Xevo G2 Q-ToF Waters Corporation 186005597
Zeba Spin Desalting Column, 0.5 mL Thermo Scientific 89883

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pharmaceutical cGMPs for the 21st Century: A Risk-Based Approach. , (2004).
  2. New Molecular Entity (NME) Drug and New Biologic Approvals. FDA. , Available from: https://www.dfa.gov/Drugs/DevelopmentApprovalProcess/HowDrugsareDevelopedandApproved/DrugandBiologicAprrovalReports/NDAandBLAApprovalReports/ucm373420.htm (2015).
  3. Foltz, I. N., Karow, M., Wasserman, S. M. Evolution and Emergence of Therapeutic Monoclonal Antibodies. Circulation. 127, 2222-2230 (2013).
  4. Kondragunta, B., Drew, J. L., Brorson, K. A., Moreira, A. R., Rao, G. Advances in clone selection using high-throughput bioreactors. Biotechnology Progress. 26 (4), 1095-1103 (2010).
  5. Hmiel, L., Brorson, K., Boyne, M. Post-translational structural modifications of immunoglobulin G and their effect on biological activity. Analytical & Bioanalytical Chemistry. 407 (1), 79-94 (2015).
  6. Rathore, A. S. Roadmap for implementation of quality by design (QbD) for biotechnology products. Trends in Biotechnology. 27 (9), 546-553 (2009).
  7. International Council for Harminisation of Techinical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use. ICH. , ed specifications: test procedures and acceptance criteria for biotechnological/biological products Q6B (1999).
  8. Berkowitz, S. A., Engen, J. R., Mazzeo, J. R., Jones, G. B. Analytical tools for characterizing biopharmaceuticals and the implications for biosimilars. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (7), 527-540 (2012).
  9. Velugula-Yellela, S. R., et al. Use of high-throughput automated microbioreactor system for production of model IgG1 in CHO cells. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
  10. Largy, E., Cantais, F., Van Vyncht, G., Beck, A., Delobel, A. Orthogonal liquid chromatography-mass spectrometry methods for the comprehensive characterization of therapeutic glycoproteins, from released glycans to intact protein level. Journal of Chromatography A. 1498, 128-146 (2017).
  11. Yang, J. -M., et al. Investigation of the correlation between charge and glycosylation of IgG1 variants by liquid chromatography-mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 448, 82-91 (2014).
  12. Agarabi, C. D., et al. Bioreactor Process Parameter Screening Utilizing a Plackett-Burman Design for a Model Monoclonal Antibody. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (6), 1919-1928 (2015).
  13. Wen, J., Arakawa, T., Philo, J. S. Size-Exclusion Chromatography with On-Line Light-Scattering, Absorbance, and Refractive Index Detectors for Studying Proteins and Their Interactions. Analytical Biochemistry. 240 (2), 155-166 (1996).
  14. Veurink, M., Stella, C., Tabatabay, C., Pournaras, C. J., Gurny, R. Association of ranibizumab (Lucentis) or bevacizumab (Avastin) with dexamethasone and triamcinolone acetonide: An in vitro stability assessment. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 78 (2), 271-277 (2011).
  15. Li, Y., Weiss, W. F., Roberts, C. J. Characterization of high-molecular-weight nonnative aggregates and aggregation kinetics by size exclusion chromatography with inline multi-angle laser light scattering. Journal of Pharmaceutical Sciences. 98 (11), 3997-4016 (2009).
  16. Espinosa-de la Garza, C. E., et al. Analysis of recombinant monoclonal antibodies by capillary zone electrophoresis. Electrophoresis. 34 (8), 1133-1140 (2013).
  17. Han, H., Livingston, E., Chen, X. High throughput profiling of charge heterogeneity in antibodies by microchip electrophoresis. Analytical Chemistry. 83 (21), 8184-8191 (2011).
  18. Wheeler, T. D., et al. Microchip zone electrophoresis for high-throughput analysis of monoclonal antibody charge variants. Analytical Chemistry. 86 (11), 5416-5424 (2014).
  19. Carrillo-Cocom, L., et al. Amino acid consumption in naive and recombinant CHO cell cultures: producers of a monoclonal antibody. Cytotechnology. 67 (5), 809-820 (2015).
  20. Chen, P., Harcum, S. W. Effects of amino acid additions on ammonium stressed CHO cells. Journal of Biotechnology. 117 (3), 277-286 (2005).
  21. Xing, Z., et al. Optimizing amino acid composition of CHO cell culture media for a fusion protein production. Process Biochemistry. 46 (7), 1423-1429 (2011).
  22. Fan, Y., et al. Amino acid and glucose metabolism in fed-batch CHO cell culture affects antibody production and glycosylation. Biotechnology and Bioengineering. 112 (3), 521-535 (2015).
  23. Read, E. K., et al. Fermentanomics informed amino acid supplementation of an antibody producing mammalian cell culture. Biotechnology Progress. 29 (3), 745-753 (2013).
  24. Mazzer, A. R., Perraud, X., Halley, J., O'Hara, J., Bracewell, D. G. Protein A chromatography increases monoclonal antibody aggregation rate during subsequent low pH virus inactivation hold. Journal of Chromatography. A. 1415, 83-90 (2015).
  25. Zhang, L., Luo, S., Zhang, B. Glycan analysis of therapeutic glycoproteins. MAbs. 8 (2), 205-215 (2016).
  26. Wahl, O., Holzgrabe, U. Amino acid analysis for pharmacopoeial purposes. Talanta. 154, 150-163 (2016).
  27. Le, A., Ng, A., Kwan, T., Cusmano-Ozog, K., Cowan, T. M. A rapid, sensitive method for quantitative analysis of underivatized amino acids by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). Journal of Chromatography B. 944, 166-174 (2014).

Tags

Bioteknologi mikro-bioreactor kinesisk hamster eggstokk celler cellekultur screening glykaner monoklonale antistoff størrelse eksklusjon kromatografi multi-vinkel lysspredning
Rensing og analyse av en monoklonale antistoff fra kinesisk hamster eggstokk celler ved hjelp av en automatisert Microbioreactor system
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Velugula-Yellela, S. R., Powers, D.More

Velugula-Yellela, S. R., Powers, D. N., Angart, P., Faustino, A., Faison, T., Kohnhorst, C., Fratz-Berilla, E. J., Agarabi, C. D. Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System. J. Vis. Exp. (147), e58947, doi:10.3791/58947 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter