Summary
Zebrafisk (Danio rerio) er ved at blive en meget udbredt hvirveldyr dyr model for mikrobiel kolonisering og patogenese. Denne protokol beskriver brugen af protozo Paramecium caudatum som et redskab til fødevarebåren infektion i zebrafisk larver. P. caudatum let internalizes bakterier og få taget af larve zebrafisk gennem naturlig preying adfærd.
Abstract
På grund af deres åbenhed, genetiske sporbarhed og nem vedligeholdelse zebrafisk (Danio rerio) er blevet et meget udbredt hvirveldyr model for smitsomme sygdomme. Larve zebrafisk naturligt bytte på den encellede protozo Paramecium caudatum. Denne protokol beskriver brugen af P. caudatum som et redskab til fødevarebåren infektion i larve zebrafisk. P. caudatum internalisere en bred vifte af bakterier og bakterieceller forblive levedygtige i flere timer. Zebrafisk derefter bytte om P. caudatum, den bakteriemængde er udgivet i foregut ved fordøjelse af køretøjets paramecium og bakterier kolonisere tarmkanalen. Protokollen indeholder en detaljeret beskrivelse af paramecia vedligeholdelse, indlæsning af med bakterier, bestemmelse af bakteriel nedbrydning og dosis, samt infektion af zebrafisk ved at fodre med paramecia. Fordelen ved at bruge denne metode til fødevarebåren infektion er, at det nøje efterligner tilstanden af infektion observeres i human sygdom, fører til mere robust kolonisering i forhold til fordybelse protokoller, og giver mulighed for undersøgelse af en bred vifte af patogener. Fødevarebåren infektion i zebrafisk model kan bruges til at undersøge bakterielt gen udtryk inden for den vært, vært-patogen interaktioner og kendetegnende for sygdomsfremkaldende evne herunder bakteriel byrde, lokalisering, formidling og sygelighed.
Introduction
Zebrafisk andel morfologisk og funktionelt bevaret egenskaber hos pattedyr, herunder granulocytic slægter (fx neutrofiler), monocyt/makrofag-lignende celler, Toll-lignende receptorer, pro-inflammatoriske cytokiner og antimikrobielle peptider1 . Tarmkanalen i zebrafisk er fuldt udviklet på 6 dage post befrugtning (dpf) og viser morfologiske og funktionelt bevarelse med pattedyr af mave-tarmkanalen, som bevarede transkriptionel regulering i tarm epitelceller 2. Dette gør zebrafisk en fremragende model for intestinal mikrobiel kolonisering og patogenese. En bred vifte af entero mikrober er blevet undersøgt i zebrafisk model, herunder enterohemorrhagic Escherichia coli3, Vibrio cholerae4,5, Salmonella enterica6, den zebrafisk mikrobiota7,8, og rollen af probiotika i tarm immunitet9. En klar fordel af zebrafisk model er, at det er koloniseret af mange mikrober uden at forstyrre den endogene mikrobiota, som giver mulighed for undersøgelse af mikrobielle adfærd i forbindelse med blandet mikrobielle populationer3, 6. i øjeblikket, de fleste zebrafisk modeller af gastrointestinale kolonisering og sygdom stole på administrationen af mikrober af Bad fordybelse, hvor zebrafisk inkuberes i en bakteriel suspension til et bestemt beløb af tid10. Dette gør det vanskeligt at bestemme den nøjagtige dosis af bakterier administreres og fører til begrænset kolonisering med nogle mikrober, særligt med ikke-sygdomsfremkaldende bakterier. Alternativt, en bakteriel suspension administreres for at fiske via mundtlige sonde11, men dette er teknisk udfordrende og begrænset til ældre larver og voksne fisk.
Denne protokol beskriver brugen af de encellede protozo Paramecium caudatum som et køretøj til fødevarebårne levering af mikrober til mave-tarmkanalen af zebrafisk larver. Paramecia er nemt og billigt at vedligeholde og er i stand til at fodre på en bred vifte af mikrober, herunder alger, svampe og bakterier, som de internalisere gennem en ciliated mundtlige groove12,13,14. Når internaliseret, bakterier holdes i vacuoles, er som i sidste ende surt og indhold forringet over en tidsramme på flere timer15. Larve zebrafisk fange paramecia som naturlige byttedyr snart efter udklækningen, omkring 3-4 dpf afhængig af temperatur16, og fylder dem med høj effektivitet. Bytte capture tager på gennemsnit 1.2 s fra registrering til at fange17, og erobrede paramecia fordøjes hurtigt i zebrafisk foregut, således at internaliseret levedygtige bakterier er udgivet i tarmkanalen3. Som et resultat, kan paramecia bruges som en hurtig og nem metode til at levere et højt og ensartet dosis af bakterier i mave-tarmkanalen af zebrafisk. De leverede bakterier kan enten blive omdannet til at udtrykke en fluorescerende proteiner, såsom mCherry, som beskrevet her, eller i tilfælde af genetisk genstridig bakterier, kan de være pre farves med et fluorescerende farvestof at tillade visualisering inden for den mave-tarmkanalen.
Denne protokol beskriver fødevarebårne levering af enteropathogenic E. coli (enterohemorrhagic E. coli [EHEC] og vedhængende invasive E. coli [AIEC]), og Salmonella enterica ssp. Typhimurium. Både sygdomsfremkaldende E. coli og S. typhimurium er overført via fækal-oral rute18,19, og kan være erhvervet via forurenede fødevarer, såsom kød, grøntsager og mejeriprodukter. Ved hjælp af P. caudatum som et køretøj, kolonisere E. coli og S. typhimurium held zebrafisk larverne indenfor 30 – 60 min co inkubation med køretøjets paramecium. Den opnåede bakterielle byrde er robuste nok til at visualisere kolonisering og bestemme byrde ved plettering væv homogeniseret.
Protocol
Zebrafisk pleje, opdræt og eksperimenter beskrevet her er i overensstemmelse med vejledning i pleje og brugen af forsøgsdyr, og er blevet godkendt af institutionelle animalsk velfærd Committee of University of Texas Health Science Center, protokol antal AWC-16-0127.
1. vækst og vedligeholdelse af Paramecia
- Få live paramecia kulturer fra kilder såsom zebrafisk International ressource Center (ZIRC).
- Fra en levende voksende kultur, der tilsættes 1 mL af paramecia kulturen, 1 mL af en E. coli MG1655 kultur (ekstinktionen OD600 1,0-2,0) genopslemmes i 1 x E3 (0,29 g/L NaCl, 13 mg/L KCl, 44 mg/L CaCl2, 81 mg/L, MgSO4 0,48 g/L HEPES, pH 7,0, sterile), og 8 mL af 1 x E3 i en 10 mL vævskultur kolbe. Swirl let og derefter gemme på 22 ° C.
- For at vedligeholde en kultur, passage hver to uger, 1 mL af en paramecia kultur i en 10 mL vævskultur kolbe med 9 mL frisk 1 x E3 medium indeholdende 108 CFU/mL af E. coli MG1655 genopslemmes i 1 x E3.
2. bestemmelse af bakteriel dosis til zebrafisk
-
Bestemme bakteriel half-life inden for Paramecium
Bemærk: Halveringstiden for bakterier inden for paramecia bestemmes af plating levedygtige E. coli inddrives fra paramecium, som beskrevet nedenfor.- Efter en 2 h inkubation af bakterier (OD600 1.0) med paramecia ved 22 ° C, kombinere paramecia og co bakteriekultur i en 50 mL konisk slange, vaske paramecia med 1 x E3, og tæller antallet af paramecia pr. milliliter (som beskrevet nedenfor i trin 3.2.7 og 3.2.8).
- Efter tælle antallet af paramecia, fjerne 50 µL af paramecia og co bakteriekulturen hver time (til 6 h efter eksponering) og tilføje hver prøve i en frisk 1,5 mL tube.
- Sted 950 µL 1% nonionisk overfladeaktivt stof (Se Tabel af materialer) i phosphat bufferet saltopløsning (PBS) i hver af 1,5 mL rør og vortex for 1 min til at lyse på paramecia. Udføre 1:10 fortyndinger af hver prøve ved hjælp af steril PBS som en fortyndingsmiddel (dvs. 100 µL i 900 µL).
- Plade 100 µL af hver fortynding på selektiv plader (LB tet medium: 30 µg/mL tetracyclin, 1 g/L NaCl, 1 g/L trypton, 0,5 g/L gærekstrakt) og inkuberes ved 37 ° C i 16 h. Den næste dag, tælle og registrere antallet af bakteriel kolonier på pladen (koloni danner enheder, CFUs) ved at tælle kun de isolerede og adskilte enkelte kolonier. Identificere en plade med en fortynding, der giver 30-300 CFU.
- Bestemme fortyndingen faktor, der anvendes. For eksempel, hvis 1 µL af bakteriekulturen er blandet med 99 mL steril PBS, er dette en 1: 100 (0,01) fortynding. Dette tal vil være antallet af CFU i fortyndingstunnelen. Udføre beregningen nedenfor for hvert tidspunkt til at bestemme CFU i den oprindelige prøve:
- Beregne og graf antallet af levedygtige E.coli/paramecium svarende til timerne post eksponering ved hjælp af den paramecia koncentration beregnet i trin 3.3.1 og bestemme half-life inden for paramecia (figur 1).
- Ved hjælp af CFU antallet beregnes for hvert tidspunkt, beregne og graf antallet af levedygtige E. coli pr. paramecium på y-aksen versus timer post inkubation på x-aksen, ved hjælp af den paramecia koncentration beregnet i trin 3.3.1. Bestemme half-life inden for paramecia.
-
Bestemme bakteriel dosering fra bakteriel half-life og preying Vurder.
Bemærk: For at bestemme den bakterielle dosering, nødt halveringstid af bakterier inde paramecia og den preying zebrafisk på paramecia (Se trin 3,4) til at tages i betragtning.- Brug følgende formel til at bestemme bakteriel forfald inden for paramecia:
(1)
Hvor N0 er det oprindelige antal bakterier pr. paramecia efter 2 h inkubation, Nt er den resterende mængde efter tiden t, τ er den tid, hvorefter antallet af levedygtige bakterier har halveret, og k er konstanten forfald. - Fra nedbrydning eksperiment, bestemme tænderne konstant k ved hjælp af den bakterielle halveringstid (dvs. den tid hvorefter har halveret mængden af levedygtige bakterier/paramecium).
(2)
Til bestemmelse af half-life, udtrykket
og
(3)
eller
(4)
Bemærk: Baseret på figur 1, er halveringstid af E. coli i paramecia ca. 2,3 h. Således, ved hjælp af formlen (4), henfaldet, k, for E. coli er:
(5)
- Bestemme henfaldet (Knudsen) fra half-life eksperiment at finde dosis af levedygtige bakterier (Nt) taget op af zebrafisk larverne efter preying tid (t), hvor (P) er den preying sats eller antallet af paramecia spist af én fisk pr. time:
(6)
eller
(7)
Bemærk: Per figur 1er det oprindelige antal bakterier pr. paramecia (N0) efter en 2 h inkubation (t) 790 CFU. Per film 1 og figur 2er den preying sats (P) 1539. - Bruger disse værdier til at erstatte i ligning (7), beregne den bakterielle dosering forbruges af en zebrafisk efter en 2 h inkubation som:
(8)
- Brug følgende formel til at bestemme bakteriel forfald inden for paramecia:
og
eller
eller
3. fødevarebåren infektion af zebrafisk
- Inkuber bakterier med Paramecia.
- Udarbejde en fælles kultur af paramecia og E. coli MG1655 natten før infektionen. Kombinere 8 mL E3 medier, 1 mL af en igangværende paramecia kultur og 1 mL af en E. coli MG1655 kultur (OD600 = 1,0) genopslemmes i 1 x E3 i T25 vævskultur flasker. Inkuber kolberne ved stuetemperatur (RT) natten over. For hver behandling betingelse, forberede to kolber af paramecia.
- Podes bakteriel vækst medier (LB: 1 g/L trypton, 0,5 g/L gær extract, 1 g/L NaCl) med smitsom stamme af bakterier, ved at vælge en individuel bakteriel koloni fra en plade ved hjælp af en steril podning løkke. Inkuber den flydende kultur ved 37 ° C og forlade Rysten på 110 rotationer pr. minut (rpm) natten over.
Bemærk: Personlige værnemidler (en laboratoriekittel og handsker) skal bæres og biosikkerhed niveau 2 faciliteter bør anvendes, når du håndterer smitsomme agenser. - Den næste dag, måle OD600 overnight kultur. Beregne omfanget af kultur kræves for at opnå en OD600 1 når genopslemmes i 11 mL af medier.
- Høste mængden af bakterier fra trin 3.1.2 via centrifugering ved 6.000 x g i 5 min, én diskenhed for hver kolbe af paramecia. Supernatanten og bakteriel resuspenderes i 1 mL af E3 medier.
- Du kan vælge, pre pletten bakterier med et fluorescerende farvestof.
- Tilføj 1 µL af FM 4-64FX bakteriel pletten (5 mg/mL stamopløsning). Dække tube med folie for at beskytte mod photobleaching og inkuberes roterende over slut på RT for 15 min.
- Fjern overskydende farvestof ved at vaske med 1 x E3: Pellet bakterier via centrifugering ved 6.000 x g for 1,5 min, så resuspend pellet i 1 mL af E3 medier. Gentag vask trin to gange.
- Høste farvede bakterier via centrifugering ved 6.000 x g i 5 min. Fjern supernatanten og bakteriel resuspenderes i 1 mL af E3 medier.
- Der tilsættes 1 mL af de bakterielle suspensioner til hver af de to kolber af friske paramecia. Der inkuberes ved RT i 2 h.
Bemærk: Hvis arbejder med farvede bakterier, inkuberes i mørke på RT for 2 h.
- Vask bakterier/paramecia fælles kultur.
- Kombinere indholdet af begge flasker af paramecia/bakterier Co kultur ind i en 50 mL konisk rør. Centrifuge prøver på 300 x g ved 15 ° C i 10 min. Sørg for, at centrifugen er pre afkølede før dette trin.
- Fjern ca. 10 mL E3 supernatanten ved hjælp af en serologisk pipette og tilsæt ca. 10 mL frisk 1 x E3 til den koniske rør.
Bemærk: Under alle wash skridt er det vigtigt at være meget hurtig, når du fjerner supernatanten, som paramecia vil begynde at svømme ud af toerstoffet. Spin og Fjern supernatanten fra et rør på et tidspunkt at sikre hurtig nok håndtering på dette trin, og undgå tab af paramecia i supernatanten. - Spin prøver via centrifugering ved 300 x g ved 15 ° C til 5 min. fjernes ca. 10 mL E3 supernatanten ved hjælp af en serologisk pipette, og tilsæt ca. 10 mL frisk 1 x E3 til den koniske rør. Gentag dette trin to gange.
- Centrifuge prøver på 300 x g ved 15 ° C i 5 min. fjernes ca. 10 mL E3 supernatanten, pas på ikke for at forstyrre pelleten.
- Resuspend pellet i de resterende 10 mL af E3 medier og overføre 500 µL af suspensionen ind i en ny 1,5 mL microcentrifuge rør. Pellet de 500 µL af paramecia ved centrifugering ved 300 x g i 5 min til at tælle antallet af paramecia.
- Fjerne 400 µL af E3 supernatanten fra 500 µL prøven. Tilføj 20 µL af 36,5% formaldehyd løsning til de resterende 100 µL af paramecia og forsigtigt resuspend og Inkuber i 5 min. ved 22 ° C.
Bemærk: Dette trin dræber paramecia at give mulighed for at tælle. - Måle faktiske samlede diskenhed ved hjælp af pipetten og post. Fortynd paramecia suspension 1:1 v/v med 0,4% trypan blå løsning.
- Brug en celle counter eller hemocytometer til at tælle antallet af døde paramecia/mL.
Bemærk: På grund af det forudgående fiksering skridt, de fleste paramecia vil være død på dette tidspunkt, men dette tal afspejler antallet af live paramecia for Co inkubation eksperiment. Forfatterne har ikke fundet betydelige paramecia død på grund af bakteriel Co inkubation, så dette kan tilsidesættes som en faktor her.
- Co inkuberes Paramecia og zebrafisk larver.
- Beregne koncentrationen af paramecia:
Bemærk: Denne beregning giver koncentrationen af paramecia i 50 mL konisk røret fra trin 3.2.5. - Beregne omfanget af vasket paramecia kræves til en koncentration på 2 x 105 paramecia/mL i en endelige mængden af 3 mL af E3.
Bemærk: Koncentrationen af paramecia kan justeres baseret på den ønskede bakteriel dosering, som er genstand for optimering. - Bedøver zebrafisk ved at tilføje tricaine i 100 mM Tris pH 8.0 til en endelig koncentration på 100 mg/L. overførsel 10 zebrafisk i hver brønd med en 6-godt plade i en samlet maengde paa 3 mL frisk E3 indeholdende den passende koncentration af paramecia (beregnet i trin 3.3.2). sikre at overføre larver i en minimal mængde væske, at sikre, at de tilbagesøge anæstesi i den modtagende godt.
- Der inkuberes ved 30 ° C i 2 timer i en temperaturprofil inkubator day-light betingelser, at sikre optimal lyn betingelser for preying.
- Vask zebrafisk mindst 5 gange ved at overføre fisk ind i et nyt godt indeholdende 3 mL af frisk E3 indeholdende 100 mg/L tricaine hver gang.
Bemærk: Forsøg ikke at udelade tricaine under trinnet vask. Overførsel af mobil larver uden bedøvelse øger risikoen for skader og lidelser for dyr. - Eventuelt forberede zebrafisk billeddannelse ved at integrere zebrafisk i 3 mL 1% lav-Smelt Agarosen i en sort-walled 6-godt plade: lav-Smelt Agarosen er gjort i 1xE3 og opvarmet i mikrobølgeovn. Når smeltet, skal du føje tricaine til en endelig koncentration på 160 mg/mL. Position fisk under et stereomikroskop, ved hjælp af en klippede gel ladning tip, og sørg for, at lederen er til venstre og halen er til højre (figur 3). Vent 5 minutter til Agarosen at indstille, så overlay den integrerede fisk med 1 x E3 der indeholder 160 mg/mL tricaine til billedbehandling.
- Beregne koncentrationen af paramecia:
- Bestemme den preying sats.
Bemærk: Ingen særskilt eksperiment skal sættes op til at bestemme den preying sats. Dette kan derimod ske under trin 3.3.4, som beskrevet nedenfor.- Under trin 3.3.4, se preying zebrafisk på et stereomikroskop og fange video optagelser af bytte capture.
- Score video-optagelser. Bytte capture er karakteriseret ved slående af zebrafisk mod bytte. Tæller hver strejke som et bytte fange begivenhed, selv om dette er kun en tilnærmelse (Se diskussion).
- Beregne det gennemsnitlige antal bytte fange hændelser i timen fra flere videoklip, hver repræsenterer en anderledes zebrafisk larver (figur 2).
Representative Results
Paramecium caudatum internalizes let en bred vifte af bakterier i opbevaring vacuoles. Den intracellulære bakteriel tæthed afhænger tætheder af bakterier og paramecia i fælles kultur, samt bakteriearter anvendes. Over tid, vacuoles surt og bakteriel nedbrydning ensues. Hastigheden nedbrydning har fastsættes individuelt for alle stammer, der anvendes. For sygdomsfremkaldende E. coli, den oprindelige bakteriel tæthed er 790 bakterier /paramecium, og bakterier er forringet med en halveringstid på ca. 2,3 h (figur 1).
Figur 1: bestemmelse af bakteriel halveringstiden i paramecia. (A) følgende 2 h Co inkubation med smitsomme E. coli, P. caudatum blev vasket og overført til medium uden bakterier. På de angivne tidspunkter, numre levedygtige E. coli celler blev fastlagt ved fortynding plating på selektiv agar. Resultaterne er middel ± standardfejl af middelværdien (SEM; n = 3). (B) typisk billede af paramecium transporterer internaliseret bakterier, med lyse felt (Bi), fluorescerende bakterier (Bii), og fusionerede kanaler (Biii). Skalalinjen = 20 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Yderligere, zebrafisk preying sats, dvs hastigheden, som zebrafisk internalisere bakterier-indlæst paramecia på Co inkubation, var undersøgt. Larve zebrafisk begynde at jage og fange levende bytte fra 5 dpf20, selv om det blev konstateret, at når op på 30 ° C, larve udvikling er accelereret og dyr vise preying adfærd fra 4 dpf. Preying er ledsaget af en karakteristisk slående adfærd20 (figur 2A) og bestemmelse af den preying sats er baseret på den antagelse, at hver strejke fører til internalisering af en paramecium, selv om dette kan kun betragtes en tilnærmelse (Se diskussion). Baseret på de heri beskrevne observationer af preying zebrafisk larver, er paramecia optagelse ca 1,539 per Hansen (figur 2B).
Figur 2: bestemmelse af zebrafisk preying sats. (A) stillbilleder fra en preying video, der viser en zebrafisk larver (5 dpf) preying på paramecia transporterer fluorescerende bakterier. Gang i [sekunder]. Pilen angiver de vigtigste akse af bevægelse under slående. (B) kvantificering af preying sats (paramecia indtag pr. time), baseret på n = 10 videoer taget over fuld 2 h eksponeringstid. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Efter internalisering af paramecia forringer zebrafisk effektivt bytte i foregut, frigive smitsomme bakterier ind i fordøjelsessystemet. Som beskrevet heri, paramecia nedbrydning forløber hurtigt og gratis bakterier kan påvises i tarmkanalen inden for 30 minutter af preying. Gratis bakterier og derefter flytte fra foregut til midten og posterior tarmen, hvor de registreres ca. 1-2 h efter begyndelsen af preying (figur 3). Bakteriel persistens i tarmen afhænger af arter og dosis men spænder fra flere h til flere dage for E. coli og S. enterica. S. enterica lokaliserer primært i de intestinale mucosae, med nogle epitelial invasion (figur 3D), fører til infiltration af neutrofiler i epitel (figur 3 c).
Figur 3: kolonisering af zebrafisk med bakterier. Zebrafisk på 5 dpf blev forladt uinficeret (A) eller koloniserede med mCherry udtryk for (B) E. coli eller (C) S. enterica. Infektion eksperimenter kan udføres i vildtype (A og B) fisk eller transgene linjer (fx linje Tg (MPO::EGFP) jeg114 udtrykker grøn fluorescerende neutrofiler anført i (C). Den endetarmen åbning er præget af en pil. (D) højere forstørrelse af tarm afsnit fra hele-mount integrerede larver inficeret med Salmonella enterica infektion. (Di) blå = Hoechst mærkning kerner, (Dii) lilla = phalloidin mærkning F-actin, (Diii) rød = Salmonella, (Div) Flet. Skalalinjen = 5 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Movie 1: Video optagelser af bytte erobringen. Venligst klik her for at downloade denne video.
Discussion
Grundlæggende protokollen beskrevet her er blevet optimeret til sygdomsfremkaldende E. coli, og er blevet med held tilpasset for andre bakteriearter, herunder Salmonella enterica og Vibrio cholerae. For nogle arter, der ikke koloniser zebrafisk tarmen efter bad fordybelse, herunder nogle Salmonella enterica stammer og nogle anaerober kan fødevarebåren infektion som beskrevet her bruges til at etablere vellykket kolonisering. I forhold til microgavage, der bruges også til at etablere høj bakteriel byrder i larve tarmkanalen, fødevarebåren infektion er teknisk mindre udfordrende og kræver mindre specialiseret udstyr. Imidlertid skal kritiske parametre optimeres for de bakteriearter og stammer skal anvendes. Disse faktorer omfatter bakteriel og paramecium tæthed for bakterier-paramecium Co kultur trin: Hvis bakteriel numre inden for paramecia er lav, dette kunne forbedres ved at øge den bakterielle tæthed taktfast Co kultur. Nogle bakteriearter kan forårsage skade på paramecium vært, og dette bør vurderes ved mikroskopi.
En anden vigtig faktor i denne protokol er bytte opsamling af zebrafisk. Den preying sats er som beskrevet her baseret på den antagelse, at hver bytte capture strike resultater i indtagelse af et paramecium. Høje tætheder af paramecia pr. fisk bruges i protokollen til at sikre høj preying priser. Dog bytte capture er afhængig af tæthed af paramecia i systemet, og i meget fortyndet paramecium kulturer, preying priser kan være så lav som 13 – 15 paramecia pr. time21,22. En begrænsning er at bytte fange satser er også stærkt afhængig af lysforhold og i mørke, fange satser er 80% lavere end i lysforhold21 , og dette bør tages i betragtning ved opsætning af eksperimenter. Hvis eksponering gange at bytte skal udvides til at optimere kolonisering, har overvejelser skal gives til sekundær eksponering for bakterier gennem afføring. På betingelser beskrevet ovenfor – 2 h af bytte eksponering – er denne eksponering ubetydelig, da gut passage tid af bakterier er mere end 1 h og koncentrationen af bakterier i køretøjet er meget højere end i afføring. Men hvis bytte eksponeringstid er steget betydeligt, kan dette blive en væsentlig faktor.
Passende kontrol bør indgå i denne protokol, herunder kolonisering af zebrafisk efter fodring med paramecia som indeholder ikke-sygdomsfremkaldende E. coli MG1655. Hvis flere bakteriestammer er i forhold til deres evne til at kolonisere zebrafisk værten, er det vigtigt at teste, om deres halveringstiden i paramecia er sammenlignelige. Bakteriel mutationer, herunder at kompromittere cellevæg integritet eller syre sensing, kan kompromittere bakteriel stabilitet inden for paramecia. I sådanne tilfælde har zebrafisk fodring tilpasses at tage højde for forskelle i doseringen.
Protokollen beskrevet her kan bruges til at undersøge bakteriel kolonisering og konsekvenserne heraf, herunder af imaging bakteriel kolonisering af zebrafisk som beskrevet ovenfor, samt ved at bestemme CFU pr. zebrafisk fra væv homogenatet3, eller undersøge infektion-associerede sygelighed og dødelighed. Ideelt, for bakteriel visualisering, bakteriestammer udtrykker fluorescerende proteiner som mCherry eller rødt fluorescerende proteiner (RFP) bør anvendes. Dette vil tillade visualisering af voksende bakteriel populationer. Hvis den bakterielle stamme er ikke genetisk tractable eller brug ekspression af fluorescerende proteiner er udelukket af andre grunde, kan bakterier være farvet med et fluorescerende farvestof, som FM 4-64FX, forud for Co kultur med paramecia. Når du bruger protokollen beskrevet her, fælles kultur med paramecia mindske ikke lysstyrken af farvestoffet og farvede bakterier er klart synlig i zebrafisk tarmen. Farvestoffet vil dog fortyndes med tiden bør betydelig bakteriel spredning sker inden for zebrafisk vært. I begge tilfælde er rødt-fluorescerende bakterier at foretrække over grønt-fluorescerende bakterier, da væv autofluorescence kan være højere i grønne end i den røde kanal.
Det er blevet konstateret, at denne protokol kan tilpasses for aerobe og microaerophilic bakteriearter. Det kan være muligt at tilpasse det til fodring af sporer og svampe arter, selv om dette stadig afprøves eksperimentelt.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke medlemmerne af gruppen Krachler for kritisk læsning og kommentarer på manuskriptet. Dette arbejde blev finansieret af en UT systemer STAR award, BBSRC og NIH (R01AI132354).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paramecium caudatum, live | Carolina | 131554 | no not store growing cultures below room temperature |
| 0.4% Trypan Blue Solution | Sigma | T8154-20ML | liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture; prepared in 0.81% sodium chloride and 0.06% potassium phosphate, dibasic |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | 276855-100ML | store in a solvent safety cabinet |
| Escherichia coli, MG1655 | ATCC | ATCC 700926 | can be replaced by any other non-pathogenic E. coli strain |
| FM 4-64FX stain | Thermo Fisher | F34653 | aliquot and store frozen |
| Formaldehyde | Sigma | F8775-4X25ML | |
| LB Broth | Sigma | L3397-1KG | |
| Phosphate buffered saline tablets | Thermo Fisher | 18912014 | |
| Tetracycline | Sigma | 87128-25G | toxic, irritant |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma | E10521-10G | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-100ML | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Sigma | 93595-50ML | |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Thermo Fisher | 16520050 | |
| hemocytometer or cell counter | any | ||
| stereomicroscope | any | ||
| table-top centrifuge | |||
| microwave | |||
| rotator wheel | |||
| heated shaking incubator | |||
| aquatics facilities | |||
| breeding tanks |
References
- Broz, P., Ohlson, M. B., Monack, D. M. Innate immune response to Salmonella Typhimurium, a model enteric pathogen. Gut Microbes. 3 (2), 62-70 (2012).
- Lickwar, C. R., et al. Genomic dissection of conserved transcriptional regulation in intestinal epithelial cells. PLoS Biology. 15 (8), e2002054 (2017).
- Stones, D. H., et al. Zebrafish (Danio rerio) as a Vertebrate Model Host To Study Colonization, Pathogenesis, and Transmission of Foodborne Escherichia coli O157. mSphere. 2 (5), (2017).
- Mitchell, K. C., Breen, P., Britton, S., Neely, M. N., Withey, J. H. Quantifying Vibrio cholerae enterotoxicity in a zebrafish infection model. Applied and Environmental Microbiology. , 00783 (2017).
- Logan, S. L., et al. The Vibrio cholerae type VI secretion system can modulate host intestinal mechanics to displace gut bacterial symbionts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (16), E3779-E3787 (2018).
- Howlader, D. R., et al. Zebrafish as a novel model for non-typhoidal Salmonella pathogenesis, transmission and vaccine efficacy. Vaccine. 34 (42), 5099-5106 (2016).
- Troll, J. V., et al. Microbiota promote secretory cell determination in the intestinal epithelium by modulating host Notch signaling. Development. 145 (4), (2018).
- Wiles, T. J., et al. Host Gut Motility Promotes Competitive Exclusion within a Model Intestinal Microbiota. PLoS Biology. 14 (7), e1002517 (2016).
- Rendueles, O., et al. A new zebrafish model of oro-intestinal pathogen colonization reveals a key role for adhesion in protection by probiotic bacteria. PLoS Pathogens. 8 (7), e1002815 (2012).
- Varas, M., et al. Salmonella Typhimurium induces cloacitis-like symptomsin zebrafish larvae. Microbial Pathogenesis. 107, 317-320 (2017).
- Runft, D. L., et al. Zebrafish as a natural host model for Vibrio cholerae colonization and transmission. Applied and Environmental Microbiology. 80 (5), 1710-1717 (2014).
- Meier, R., Wiessner, W. Infection of algae-free Paramecium bursaria with symbiotic Chlorella sp. Isolated from green paramecia: I. Effect of the incubation period. European Journal of Protistology. 24 (1), 69-74 (1988).
- Miura, T., Moriya, H., Iwai, S. Assessing phagotrophy in the mixotrophic ciliate Paramecium bursaria using GFP-expressing yeast cells. FEMS Microbiology Letters. 364 (12), (2017).
- Watanabe, K., et al. Ciliate Paramecium is a natural reservoir of Legionella pneumophila. Scientific Reports. 6, 24322 (2016).
- Bragg, A. N., Hulpieu, H. A Method of Demonstrating Acidity of Food Vacuoles in Paramecium. Science. 61 (1580), 392 (1925).
- Borla, M. A., Palecek, B., Budick, S., O'Malley, D. M. Prey capture by larval zebrafish: evidence for fine axial motor control. Brain, Behavior and Evolution. 60 (4), 207-229 (2002).
- Patterson, B. W., Abraham, A. O., MacIver, M. A., McLean, D. L. Visually guided gradation of prey capture movements in larval zebrafish. Journal of Experimental Biology. 216 (Pt 16), 3071-3083 (2013).
- Megraud, F. Transmission of Helicobacter pylori: faecal-oral versus oral-oral route. Alimentary Pharmacology & Therapeutics. 9 Suppl 2, 85-91 (1995).
- Spears, K. J., Roe, A. J., Gally, D. L. A comparison of enteropathogenic and enterohaemorrhagic Escherichia coli pathogenesis. FEMS Microbiology Letters. 255 (2), 187-202 (2006).
- Bianco, I. H., Kampff, A. R., Engert, F. Prey capture behavior evoked by simple visual stimuli in larval zebrafish. Frontiers in Systems Neuroscience. 5, 101 (2011).
- Gahtan, E., Tanger, P., Baier, H. Visual prey capture in larval zebrafish is controlled by identified reticulospinal neurons downstream of the tectum. Journal of Neuroscience. 25 (40), 9294-9303 (2005).
- Westphal, R. E., O'Malley, D. M. Fusion of locomotor maneuvers, and improving sensory capabilities, give rise to the flexible homing strikes of juvenile zebrafish. Frontiers in Neural Circuits. 7, 108 (2013).
