Summary
דג זברה (רזבורה rerio) הופכים נפוץ חוליות במודל חיה מושבת חיידקים, פתוגנזה. פרוטוקול זה המתאר את השימוש protozoan סנדלית caudatum כרכב שמקורם במזון זיהום בדג זברה הזחלים. Caudatum פ ברצון ולהרזיה חיידקים, לקבל נלקח על ידי דג זברה זחל דרך ההתנהגות טרף ושהם הטבעיים.
Abstract
בשל שלהם שקיפות, גנטי ללקוחות שלנו, ואת קלות התחזוקה, דג זברה (רזבורה rerio) הפכו למודל חוליות נפוץ למחלות זיהומיות. דג זברה זחל מתאכזרים באופן טבעי protozoan חד־תאיות סנדלית caudatum. פרוטוקול זה מתאר את השימוש caudatum פ כרכב שמקורם במזון זיהום בדג זברה זחל. Caudatum פ להפנים מגוון רחב של חיידקים, תאים חיידקיים מורדם למשך מספר שעות. דג זברה אז לטרף. caudatum פ, עומס חיידקי הוא שוחרר את במעי הקדמי על העיכול של הרכב סנדלית, החיידקים ליישב את מערכת העיכול. הפרוטוקול כולל תיאור מפורט של paramecia תחזוקה, טעינה עם חיידקים, קביעה של השפלה חיידקי והמנה, כמו גם זיהום של דג זברה על ידי האכלה עם paramecia. היתרון בשימוש בשיטה זו של זיהום שמקורם במזון היא זה מקרוב מחקה המצב של זיהום שנצפתה מחלות אנושיות, מוביל קולוניזציה עמידים יותר בהשוואה טבילה פרוטוקולים, מאפשר המחקר של מגוון רחב של פתוגנים. זיהום שמקורם במזון במודל דג זברה יכול לשמש כדי לחקור ביטוי גנים חיידקיים בתוך המארח, אינטראקציות פתוגן-פונדקאי, המחפשים פתוגניות כולל חיידקי נטל, לוקליזציה, הפצתו, תחלואה.
Introduction
נתח דג זברה מורפולוגית והן מבחינה תפקודית והתפאורה תכונות עם יונקים, כולל granulocytic שושלות (למשל, נויטרופילים), מונוציט/macrophage, כמו תאים, כמו אגרה קולטנים, ציטוקינים פרו-דלקתיים מיקרוביאלית פפטידים1 . מערכת העיכול של דג זברה שהוא מפותחת ב 6 ימים שלאחר ההפריה (dpf) ומראה שימור פונקציונלי מורפולוגיים מערכת העיכול יונקים, כגון ויסות גנים ברמת השעתוק שנשמרת בתאי האפיתל במעי 2. זה גורם דג זברה מודל מצוין עבור מושבת חיידקים במעיים, פתוגנזה. מגוון רחב של חיידקים המעית נחקרה במודל דג זברה, כולל enterohemorrhagic Escherichia coli3,4, ויבריו cholerae5, סלמונלה enterica6, דג זברה-microbiota-7,-8, ואת התפקיד של פרוביוטיקה חסינות מעיים9. יתרון בולט של המודל דג זברה היא כי זה התנחלו על ידי חיידקים רבים מבלי להפריע את microbiota אנדוגני, אשר מאפשר החקירה של התנהגות מיקרוביאלי בהקשר של אוכלוסיות חיידקים מעורבים3, 6. נכון לעכשיו, רוב הדגמים דג זברה של מושבת במערכת העיכול ומחלות להסתמך על הממשל של חיידקים על ידי טבילה אמבט, איפה דג זברה מודגרת ב השעיה חיידקי עבור כמות מסוימת של זמן10. עם זאת, זה מקשה לקבוע את המינון המדויק של חיידקים מנוהל, ומוביל אל קולוניזציה מוגבלת עם חיידקים מסוימים, במיוחד עם חיידקים פתוגניים שאינם. לחלופין, השעיה חיידקי מנוהל לדוג via gavage אוראלי11, אבל זה טכנית מאתגר, ומוגבלת הזחלים בוגרים ודגים למבוגרים.
פרוטוקול זה מתאר את השימוש protozoan חד־תאיות סנדלית caudatum כרכב למסירה שמקורם במזון של חיידקים מערכת העיכול של דג זברה הזחלים. Paramecia קל וזול לשמירה, מסוגלים להאכיל במגוון רחב של חיידקים, כולל אצות, פטריות, חיידקים, אשר הם להפנים דרך החריץ אוראלי ciliated12,13,14. ברגע הפנימו, חיידקים מוחזקים וקואלות, אשר בסופו של דבר acidify, תוכן יורד מעל מסגרת זמן של מספר שעות-15. דג זברה זחל ללכוד paramecia כמו טרף טבעי זמן קצר לאחר הבקיעה, בסביבות 3-4 dpf תלוי טמפרטורה16, תעלה אותם עם יעילות גבוהה. התהליך של לכידת הטרף לוקח בממוצע 1.2 s מהגילוי ללכוד17ולאחר שנתפסו paramecia מתעכלים מהר ב במעי הקדמי דג זברה, כך חיידקים קיימא למביטה משוחררים לתוך צינור העיכול3. כתוצאה מכך, paramecia יכול לשמש כשיטה מהירה וקלה כדי לספק מנה גבוהה ועקבית של חיידקים לתוך מערכת העיכול של דג זברה. החיידק ונמסרו יכול להיהפך גם לבטא החלבון הניאון, כגון mCherry, כפי שמתואר כאן, או, במקרה של חיידקים סורר גנטית, הם יכולים להיות מוכתם מראש עם הפלורסנט כדי לאפשר ויזואליזציה בתוך מערכת העיכול.
פרוטוקול זה מתאר את המשלוח שמקורם במזון של enteropathogenic e. coli (enterohemorrhagic e. coli [EHEC], חסיד פולשנית e. coli [AIEC]), ואת ה-ssp enterica סלמונלה Typhimurium. הן פתוגניים החיידק והן ס typhimurium המועברות דרך 18,כביש בצואה אורלי19, יכולה להיות נרכשת באמצעות שזוהמו מזון, כגון בשר, ירקות, מוצרי חלב. שימוש caudatum פ כרכב, e. coli ו ס typhimurium בהצלחה ליישב את הזחלים דג זברה בתוך 30-60 דקות של דגירה שיתוף עם הרכב סנדלית. הנטל חיידקי מושגת היא יציבה מספיק כדי להמחיש קולוניזציה ולקבוע את הנטל על ידי ציפוי הרקמה homogenates.
Protocol
דג זברה, רבייה, והטיפול הניסויים המתוארים כאן הם על פי המדריך על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה, אושרו על ידי ועדת רווחת בעלי חיים מוסדיים של המרכז למדעי הבריאות אוניברסיטת טקסס, פרוטוקול מספר הרפתקאות בטבע-16-0127.
1. צמיחה ותחזוקה של Paramecia
- להשיג paramecia בשידור חי תרבויות ממקורות כגון מרכז משאבים הבינלאומי דג זברה (ZIRC).
- מתרבות גדל בשידור חי, להוסיף 1 מ"ל של התרבות paramecia, 1 מ"ל של תרבות MG1655 e. coli (צפיפות אופטית OD600 1.0-2.0) resuspended 1 x E3 (0.29 g/L NaCl, 13 mg/L. אשלגן כלורי, 44 מ ג/ליטר CaCl2, 81 מ ג/ליטר MgSO4 0.48 g/L HEPES, pH 7.0, סטרילי), ו- 8 מ של 1 x E3 לתוך בקבוקון תרביות רקמה 10 מ"ל. מערבולת בקלילות ולאחר מכן אחסן ב 22 º C.
- כדי לשמור על תרבות, כל שבועיים, המעבר 1 מ"ל של תרבות paramecia לתוך בקבוקון תרביות רקמה 10 מ"ל עם 9 מ של טרי בינוני x E3 1 המכיל 108 CFU/mL של e. coli MG1655 resuspended 1 x E3.
2. קביעת המינון חיידקי מנוהל על מנת דג זברה
-
לקבוע חיידקי מחצית חיים בתוך סנדלית
הערה: זמן מחצית החיים של חיידקים בתוך paramecia נקבעת על ידי ציפוי קיימא e. coli התאוששה סנדלית, כמתואר להלן.- בעקבות 2 h דגירה של חיידקים (OD600 של 1.0) עם paramecia ב 22 ° C, לשלב את paramecia והתרבות חיידקים שיתוף לתוך צינור חרוטי 50 מ ל, לשטוף את paramecia עם 1-E3, ו- count מספר paramecia למיליליטר (כפי שמתואר להלן בשלבים 3.2.7 ו 3.2.8).
- לאחר ספירת מספר paramecia, להסיר 50 µL של paramecia ושל התרבות חיידקי שיתוף בכל שעה (עבור 6 שעות לאחר חשיפה) ולהוסיף כל מדגם לתוך צינור mL 1.5 טריים.
- במקום 950 µL של חומרים פעילי שטח nonionic 1% (ראה טבלה של חומרים) בפוספט buffered תמיסת מלח (PBS) לתוך כל של 1.5 mL צינורות ו מערבולת עבור 1 דקות lyse את paramecia. לבצע 1:10 דילולים של כל דגימה באמצעות PBS סטרילית כמו diluent (קרי, 100 µL ב 900 µL).
- צלחת 100 µL של כל דילול על גבי לוחות סלקטיבי (ט LB בינוני: 1 g/L טריפטון תמצית שמרים 0.5 g/L, 1 g/L NaCl, 30 µg/mL טטרציקלין) דגירה ב 37 ° C עבור 16 h. למחרת, לספור והקלט מספר מושבות חיידקים על הצלחת (יחידות ויוצרים של המושבה, CFUs) על ידי ספירת רק מבודדים ומובחנת בודדים המושבות. זיהוי צלחת לדילול שנותן CFU 30-300.
- לקבוע הדילול פקטור המשמש. לדוגמה, אם µL 1 של התרבות חיידקי מעורבב עם 99 מ של PBS סטרילי, זוהי לדילול בטחונות (0.01). מספר זה יהיה מספר CFU בהדילול. לבצע את החישוב להלן, על כל נקודת זמן, כדי לקבוע את CFU במדגם המקורי:
- לחשב, גרף את המספר של קיימא e.coli/סנדלית המתאימה לשעות פוסט החשיפה באמצעות ריכוז paramecia שחושבו בצעד 3.3.1 ולקבוע זמן מחצית החיים בתוך paramecia (איור 1).
- באמצעות CFU את המספר מחושב עבור כל נקודת זמן, לחשב גרף של המספר של קיימא e. coli לכל סנדלית בציר ה-y לעומת שעות שלאחר הדגירה בציר ה-x, באמצעות ריכוז paramecia שחושבו בצעד 3.3.1. לקבוע את זמן מחצית החיים בתוך paramecia.
-
לקבוע מינון מ- half-life חיידקי חיידקי, ובעידן לדרג.
הערה: כדי לקבוע את המינון חיידקי, זמן מחצית החיים של החיידקים בתוך paramecia הקצב הצייד של דג זברה על paramecia (ראה שלב 3.4) יש לקחת בחשבון.- השתמש בנוסחה הבאה כדי לקבוע חיידקי הריקבון בתוך paramecia:
(1)
כאשר N0 הוא הכמות הראשונית של חיידקים לכל paramecia לאחר הדגירה 2 h, Nt הוא הכמות הנותרת לאחר זמן t, τ הוא הזמן לאחר מכן מספר החיידקים קיימא יש חצוי ו k הוא קבוע דעיכה. - מהניסוי השפלה, לקבוע את k קבוע דעיכה באמצעות חיידקים זמן מחצית החיים (כלומר, הזמן שלאחריו יש כמות החיידקים קיימא/סנדלית חצוי).
(2)
מצפני half-life, המונח
,
(3)
או
(4)
הערה: בהתבסס על איור 1, זמן מחצית החיים של e. coli ב paramecia הוא כ- 2.3 h. לכן, באמצעות נוסחה (4), קצב הדעיכה, k, e. coli הוא:
(5)
- לקבוע את קצב הדעיכה (k) מהניסוי מחצית חיים כדי למצוא את המינון של חיידקים קיימא (Nt) נלקח על ידי הזחלים דג זברה אחרי פעם טרף ושהם (t), איפה (P) את שיעור טרף ושהם או מספר paramecia נאכלים על ידי דגים אחת לשעה:
(6)
או
(7)
הערה: לכל איור 1, הכמות הראשונית של חיידקים לכל paramecia (N0) לאחר דגירה 2 h (t) הוא 790 CFU. לכל סרט 1 ו- 2 איור, שיעור טרף ושהם (P) הוא 1539. - שימוש בערכים אלה כדי מחליפים במשוואה (7), חישוב המינון חיידקי נצרך על ידי דג לאחר דגירה של 2 h כמו:
(8)
- השתמש בנוסחה הבאה כדי לקבוע חיידקי הריקבון בתוך paramecia:
,
או
או
3. שמקורם במזון זיהום של דג זברה
- דגירה חיידקים עם Paramecia.
- להכין תרבות משותפת של paramecia ו- e. coli MG1655 בלילה לפני זיהום. לשלב 8 מ של E3 מדיה 1 מ"ל של תרבות paramecia מתמשך, 1 מ"ל של תרבות MG1655 e. coli (OD600 = 1.0) resuspended 1 x E3 ב T25 תרביות רקמה מבחנות. דגירה המבחנות בטמפרטורת החדר (RT) בן לילה. עבור כל תנאי הטיפול, להכין שתי צלוחיות של paramecia.
- לחסן את התפתחות חיידקים מדיה (LB: 1 g/L טריפטון, תמצית שמרים 0.5 g/L, 1 g/L NaCl) עם מדבקת של חיידקים, על-ידי בחירת של מושבת חיידקים בודדים מצלחת באמצעות לולאה חיסון סטרילי. דגירה התרבות נוזלי ב 37 מעלות צלזיוס ולהשאיר רועדת-110 סיבובים לדקה (סל ד) בן לילה.
הערה: ציוד מגן אישי (מעיל מעבדה וכפפות) צריך להיות שחוקים, אבטחה ברמה 2 מתקנים אמור לשמש בעת טיפול מדבקים. - ביום הבא, למדוד את יתר600 של התרבות לילה. חישוב הנפח של תרבות הדרוש להשגת של יתר600 1 בעת resuspended ב- 11 מ של מדיה.
- לקצור את עוצמת הקול של חיידקים מהשלב 3.1.2 באמצעות צנטריפוגה בגובה 6000 x g עבור 5 דקות, אמצעי אחסון אחד עבור כל הבקבוק של paramecia. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend בגדר חיידקי ב 1 מ"ל של מדיה E3.
- באופן אופציונלי, מראש כתם של חיידקים הפלורסנט.
- להוסיף 1 µL של FM 4-64FX חיידקי כתם (פתרון מניות 5 מ"ג/מ"ל). מכסים צינור עם רדיד כדי להגן מפני photobleaching, דגירה מסתובב מעל קצה-ב RT למשך 15 דקות.
- להסיר עודפי צבע על-ידי כביסה עם 1 x E3: גלולה חיידקים באמצעות צנטריפוגה ב x 6,000 g 1.5 דקות ולאחר מכן resuspend צנפה ב 1 מ"ל של מדיה E3. חזור על שלב לשטוף פעמיים.
- הקציר מוכתם חיידקים באמצעות צנטריפוגה ב 6,000 x g עבור 5 דק. להשליך את תגובת שיקוע, resuspend בגדר חיידקי ב 1 מ"ל של מדיה E3.
- להוסיף 1 מ"ל של המתלים חיידקי כל אחד שתי המבחנות של paramecia טריים. דגירה-RT כבר שעתיים.
הערה: אם עובדים עם חיידקים מוכתם, דגירה בחושך ב RT כבר שעתיים.
- שטיפת חיידקים/paramecia תרבות משותפת.
- לשלב את התוכן של שתי צלוחיות של תרבות משותפת paramecia/חיידקים לתוך צינור חרוטי 50 מ. צנטריפוגה דגימות ב x 300 גר' ב- 15 מעלות במשך 10 דקות ודא לצנטריפוגה טרום מקורר לפני צעד זה.
- להסיר כ- 10 מ"ל של תגובת שיקוע E3 באמצעות פיפטה סרולוגית ולהוסיף כ 10 מ ל 1 טריים x E3 אל הצינור חרוט.
הערה: במהלך כל השלבים לשטוף, זה הכרחי כדי להיות מהירה מאוד בעת הסרת את תגובת שיקוע, כמו paramecia יתחילו לשחות מחוץ בגדר. ספין להסיר תגובת שיקוע שפופרת אחת בכל פעם על מנת להבטיח טיפול מהיר מספיק בשלב זה, ואתה למנוע אובדן paramecia ב תגובת שיקוע. - ספין דגימות באמצעות צנטריפוגה ב g x 300 ב 15 מעלות צלזיוס במשך כ- 10 מ"ל של תגובת שיקוע E3 באמצעות פיפטה סרולוגית להסיר 5 דק, להוסיף כ- 10 מ"ל של טרי 1 x E3 אל הצינור חרוט. חזור על שלב זה פעמיים.
- צנטריפוגה דגימות ב x 300 גרם ב 15 מעלות צלזיוס במשך 5 דק להסיר כ- 10 מ"ל של תגובת שיקוע E3, מטפל לא להפריע בגדר.
- Resuspend צנפה לתוך mL 10 הנותרים של E3 מדיה ולהעביר µL 500 של ההשעיה לתוך צינור 1.5 מ ל microcentrifuge. גלולה את µL 500 של paramecia על ידי צריך שתוציאו ב x 300 גרם במשך 5 דקות כדי לספור את מספר paramecia.
- הסר µL 400 של E3 supernatant מדגם 500 µL. להוסיף µL 100 הנותרים של paramecia µL 20 של 36.5% פורמלדהיד פתרון בעדינות resuspend ואת תקופת דגירה של 5 דקות-22 מעלות צלזיוס.
הערה: שלב זה הורג את paramecia כדי לאפשר ספירה. - למדוד בפועל הנפח הכולל באמצעות פיפטה הרשומה. לדלל את paramecia ההשעיה 1:1 v/v עם פתרון trypan blue 0.4%.
- השתמש תא מונה או hemocytometer כדי לספור את מספר paramecia מת/mL.
הערה: בגלל השלב פיקסציה מוקדמת, paramecia רוב ימות בנקודה זו, אך מספר זה משקפים את מספר paramecia חיים לניסוי משותף הדגירה. המחברים לא מצאו paramecia משמעותי למוות בשל הדגירה שיתוף חיידקי, אז זה יכול להיות התעלמו כגורם כאן.
- שיתוף תדגור הזחלים Paramecia , דג זברה
- לחשב את הריכוז של paramecia:
הערה: חישוב זה נותן את ריכוז paramecia בצינור חרוט 50 מל מ שלב 3.2.5. - חישוב הנפח של שטף paramecia נדרש ריכוז של 2 x 105 paramecia/mL באמצעי אחסון הסופי של 3 מ"ל של E3.
הערה: הריכוז של paramecia ניתן להתאים בהתבסס על המינון הרצוי חיידקי, הכפוף אופטימיזציה. - עזים ומתנגד דג זברה על-ידי הוספת tricaine 100 מ מ טריס pH 8.0 כדי ריכוז סופי של 100 מ ג/ל' העברת 10 דג זברה לתוך כל טוב של צלחת 6-ובכן לתוך הנפח הכולל של 3 מ"ל של E3 טריים המכילים הריכוז המתאים של paramecia (שחושבו בצעד 3.3.2). ודא להעביר הזחלים בכמות מינימלית של נוזלים, כדי להבטיח שהם להתאושש הרדמה בבאר הנמען.
- דגירה ב 30 ° C עבור 2 h ב חממה ההשתנות היומית בתנאים באור יום, כדי להבטיח תנאי תאורה אופטימלית עבור נפילת אפים.
- רחץ דג זברה לפחות 5 פעמים על ידי העברת דגים לתוך חדש טוב המכיל 3 מ"ל של E3 טריים המכיל 100 מ ג/ליטר tricaine בכל פעם.
הערה: אל תנסו להשמיט את tricaine במהלך השלב כביסה. העברת הזחלים ניידים ללא הרדמה מגביר את הסיכון של נזק ומצוקה לחיה. - לחלופין, להכין דג זברה הדמיה על ידי שתילת דג זברה ב- 3 מ"ל של 1% agarose נמוך-להמיס לתוך צלחת 6-ובכן עם קירות שחור: agarose נמוך-להמיס שהוכנה במעבדה 1xE3, מחוממת במיקרוגל. לאחר מותך, להוסיף tricaine ריכוז סופי של 160 מ"ג/מ"ל. תנוחת הדג תחת stereomicroscope, באמצעות ג'ל החתוכים טעינת עצה, מוודא כי הראש בצד השמאל ואת הזנב הוא בצד הימין (איור 3). לחכות חמש דקות agarose להגדיר ולאחר מכן כיסוי הדג מוטבעים עם 1 x E3 המכילים 160 מ"ג/מ"ל tricaine עבור הדמיה.
- לחשב את הריכוז של paramecia:
- לקבוע את שיעור טרף ושהם.
הערה: לא ניסוי נפרד צריך להגדיר כדי לקבוע את שיעור טרף ושהם. במקום זאת, ניתן לבצע זאת במהלך שלב 3.3.4, כמתואר להלן.- במהלך שלב 3.3.4, תחביבים טרף ושהם דג זברה stereomicroscope וללכוד קטעי וידאו של לכידת הטרף.
- תוצאת הצילום וידאו. לכידת הטרף מאופיין על ידי ההכאה של דג זברה לעבר הטרף. נחשב בכל מכה אירוע ללכוד טרף אחד, למרות זאת הוא רק הערכה (ראה דיון).
- לחשב את המספר הממוצע של אירועים ללכוד טרף לשעה של סרטוני וידאו מרובים, שכל אחד מהם מייצג זחל דג זברה שונים (איור 2).
Representative Results
סנדלית caudatum ולהרזיה בקלות מגוון רחב של חיידקים לתוך אחסון וקואלות. צפיפות חיידקי תאיים תלוי הצפיפויות של חיידקים, paramecia תרבות משותפת, כמו גם המין בקטריאלי בשימוש. במשך הזמן, acidify וקואלות, השפלה חיידקי מתפתח. הקצב של השפלה צריך להיקבע באופן אינדיבידואלי עבור כל זנים בשימוש. עבור פתוגניים החיידק, צפיפות חיידקי הראשונית היא חיידקים 790 /סנדלית, וחיידקים מושפל עם תוחלת חיים של 2.3 h (איור 1).
איור 1: נחישות של חיידקי מחצית חיים ב- paramecia. (א) h 2 הבאים של דגירה שיתוף עם מדבקת e. coli, caudatum פ היה שטף, הועבר בינונית ללא חיידקים. בנקודות זמן המצוין, מספרים של קיימא e. coli בתאי נקבעו על ידי דילול ציפוי סלקטיבי אגר. התוצאות הן אמצעי ± שגיאת התקן של הממוצע (SEM; n = 3). תמונה אופיינית (ב') נשיאת סנדלית הפנימו חיידקים, עם שדה בהיר (Bi), חיידקים פלורסנט (Bii), ואת מיזוג ערוצים (ביל). סרגל קנה מידה = 20 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
עוד יותר, דג זברה ובעידן קצב, כלומר, הקצב איזה דג זברה להפנים שנטענו חיידקים paramecia על שיתוף דגירה, נחקר. דג זברה זחל להתחיל לצוד, ללכוד טרף חי dpf 520, למרות נמצא כי, כאשר גדל ב 30 מעלות צלזיוס, זחל פיתוח מואץ ולהציג חיות טרף ושהם להתנהגות 4 dpf. נפילת אפים מלווה מאפיין בולט התנהגות20 (איור 2 א) ולאחר קביעת הקצב טרף ושהם מבוססת על ההנחה כי בכל מכה מוביל הפנמה של אחד סנדלית, למרות שזה רק יכול להיחשב קירוב (ראה דיון). על סמך התצפיות המתוארים במסמך זה של טורף דג זברה הזחלים, שיעור ספיגת paramecia הוא כ 1,539 לכל h (איור 2B).
איור 2: קביעת קצב טרף ושהם דג זברה. (א) עדיין תמונות מווידאו טרף ושהם, מציג דג הזחלים (5 dpf) ובעידן paramecia נושאת חיידקים פלורסנט. הזמן [בשניות]. החץ מצביע על הציר המרכזי של התנועה במהלך מרשים. (B) כימות של טרף ושהם קצב (צריכת paramecia לשעה), המבוסס על n = 10 סרטונים השתלט על הזמן חשיפה מלאה 2 h. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
בעקבות הפנמה של paramecia, דג זברה ביעילות מבזה את הטרף ב במעי הקדמי, שחרור חיידקים זיהומיות לתוך מערכת העיכול. כמתואר להלן, השפלה paramecia מתקדם במהירות, ניתן להבחין העיכול חיידקים חינם בתוך 30 דקות של נפילת אפים. ללא חיידקים ואז להעביר במעי הקדמי המעי באמצע, האחורי, איפה הם מזוהים כ 1-2 שעות לאחר תחילת טרף ושהם (איור 3). התמדה חיידקי במעי תלוי מינים, מנה אבל טווחים של מספר h כדי מספר ימים במקרה של e. coli ו ס enterica. Enterica ס . רגישה בעיקר בתחום mucosae מעיים, עם הפלישה אפיתל מסוימים (דמות תלת-ממד), המוביל אל חדירה של נויטרופילים לתוך האפיתל (איור 3C).
איור 3: התיישבות דג זברה עם חיידקים. דג זברה-5 dpf היו שמאלה נגוע (A) או התנחלו עם mCherry (B) e. coli או (ג) ס enterica. ניתן לבצע ניסויים זיהום פראי סוג דגים (A ו- B) או קווים הטרנסגניים (למשל, קו Tg (MPO::EGFP) אני114 לבטא נויטרופילים ניאון ירוק שמוצג (C). פתיחת פי הטבעת מסומן על ידי חץ. (ד) הגדלה גבוהה יותר של מקטע המעי של הזחלים מוטבעת כולה-הר נגועים זיהום סלמונלה enterica . כחול (Di) = Hoechst סימון גרעינים, סגול (Dii) = phalloidin סימון F-אקטין, אדום (תרטר) = סלמונלה, מיזוג (Div). סרגל קנה מידה = 5 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
סרט 1: תיעוד וידאו של לכידת הטרף. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.
Discussion
פרוטוקול בסיסי המתוארים כאן כבר מותאם ל פתוגניים החיידק, עבר בהצלחה מותאם מיני חיידקים אחרים, לרבות סלמונלה enterica ויבריו cholerae. עבור מינים מסוימים זה לא ליישב את הבטן דג זברה בעקבות אמבט טבילה, כולל כמה זנים enterica סלמונלה, קצת anaerobes, זיהום שמקורם במזון כפי שמתואר כאן ניתן להקים בהצלחה קולוניזציה. בהשוואה microgavage, אשר משמש גם להקים גבוהה בנטל חיידקי מערכת העיכול זחל, זיהום שמקורם במזון היא טכנית פחות מאתגר ודורש ציוד מיוחד פחות. עם זאת, צריך להיות מוטבת פרמטרים קריטיים על חיידקים ועל זנים כדי לשמש. גורמים כגון כוללות צפיפות בקטריאלי, סנדלית עבור השלב שיתוף התרבות חיידקים-סנדלית: אם המספרים חיידקי בתוך paramecia נמוכות, זה יכולים להשתפר על ידי הגדלת הצפיפות חיידקי בשלב תרבות משותפת. מינים חיידקים מסוימים עלול לגרום נזק למחשב המארח סנדלית, זה צריך להיות מוערך על ידי מיקרוסקופ.
גורם חשוב נוסף פרוטוקול זה הוא לכידת הטרף על ידי דג זברה. הקצב טרף ושהם כפי שמתואר כאן מבוססת על ההנחה כי כל ללכוד טרף פוגע תוצאות הבליעה של סנדלית אחד. צפיפות גבוהה של paramecia לכל הדגים נמצאים בשימוש בפרוטוקול כדי להבטיח שיעורי טרף ושהם גבוהים. עם זאת, לכידת הטרף הוא תלוי הצפיפות של paramecia במערכת, בתרבויות מאוד שתדללו סנדלית, טרף ושהם ייתכנו מחירים המתחילים paramecia 13 – 15 לכל שעה21,22. מגבלה היא המחירים לכידת הטרף תלויות גם בחום על תאורה תנאים, בחושך, לכידת תעריפי 80% נמוך יותר מאשר בתנאי אור21 ואת זה צריך להילקח בחשבון בעת הגדרת ניסויים. אם פעמים חשיפה לטרף יש יתרחב כדי למטב קולוניזציה, התחשבות חייב להינתן חשיפה משני חיידקים דרך הצואה. בתנאים שתוארו לעיל – 2 h החשיפה טרף – חשיפה זו הוא זניח, שכן הבטן זמן מעבר של חיידקים יותר מ 1 h, ריכוז חיידקים ברכב היא גבוהה הרבה יותר בצואה. עם זאת, אם זמן החשיפה הטרף הוא גדל באופן משמעותי, זה עשוי להיות גורם משמעותי.
הפקדים המתאימים צריכים להיכלל פרוטוקול זה, לרבות התיישבות דג זברה בעקבות האכלה עם paramecia המכיל פתוגניים שאינם e. coli MG1655. אם מספר זני חיידקים מושווים ביכולתם לישוב המארח דג זברה, חשוב לבחון אם מחצית שלהם חיים בתוך paramecia דומה. מוטציות חיידקיים, כולל אלה להתפשר על קיר התא שלמות או חישה חומצה, עלול לפגוע ביציבות חיידקי בתוך paramecia. במקרים כאלה, דג זברה האכלה ויש ליישרו לחשבון את ההבדלים במינון.
הפרוטוקול המתואר כאן יכול לשמש כדי לחקור מושבת חיידקים והשלכותיו, כולל על ידי הדמיה חיידקי התיישבות דג זברה כמתואר לעיל, כמו גם על-ידי קביעת CFU לכל דג זברה רקמת homogenate3, או חוקרים הקשורים לזיהום התחלואה והתמותה. באופן אידיאלי, להמחשת חיידקי, זני חיידקים פלורסנט חלבונים כגון mCherry או חלבון פלואורסצנטי אדום (RFP) אמור לשמש. זה יאפשר את הפריט החזותי של גידול אוכלוסיות חיידקים. אם המתח חיידקית אינה גנטית צייתן או השימוש של ביטוי חלבון פלואורסצנטי היא מנעה מסיבות אחרות, חיידקים עשוי להיות מוכתם של הפלורסנט, כגון FM 4-64FX, לפני תרבות משותפת עם paramecia. בעת שימוש בפרוטוקול המתוארת כאן, תרבות משותפת עם paramecia לא להפחית את הבהירות של לצבוע, חיידקים מוכתמים הם נראים בבירור במעי דג זברה. עם זאת, לצבוע להיות מדולל לאורך זמן צריך שגשוג חיידקים משמעותית להתרחש בתוך המארח דג זברה. בכל מקרה, אדום-פלורסנט חיידקים עדיפים על חיידקים ירוק-פלורסנט, שכן רקמת autofluorescence יכול להיות גבוה יותר הירוק מכל ערוץ הצבע האדום.
זה נמצא כי פרוטוקול זה יכול להיות מותאם אירובי ו microaerophilic מינים חיידקי. ייתכן שתהיה אפשרות להתאימה עבור ההזנה של נבגים ומינים פטרייתי, למרות שזה ישאר להיבדק השפעול.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
ברצוננו להודות חברי הקבוצה Krachler קריאה ביקורתית והערות על כתב היד. עבודה זו מומן על ידי פרס UT מערכות כוכבים, את BBSRC ואת NIH (R01AI132354).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paramecium caudatum, live | Carolina | 131554 | no not store growing cultures below room temperature |
| 0.4% Trypan Blue Solution | Sigma | T8154-20ML | liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture; prepared in 0.81% sodium chloride and 0.06% potassium phosphate, dibasic |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | 276855-100ML | store in a solvent safety cabinet |
| Escherichia coli, MG1655 | ATCC | ATCC 700926 | can be replaced by any other non-pathogenic E. coli strain |
| FM 4-64FX stain | Thermo Fisher | F34653 | aliquot and store frozen |
| Formaldehyde | Sigma | F8775-4X25ML | |
| LB Broth | Sigma | L3397-1KG | |
| Phosphate buffered saline tablets | Thermo Fisher | 18912014 | |
| Tetracycline | Sigma | 87128-25G | toxic, irritant |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma | E10521-10G | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-100ML | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Sigma | 93595-50ML | |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Thermo Fisher | 16520050 | |
| hemocytometer or cell counter | any | ||
| stereomicroscope | any | ||
| table-top centrifuge | |||
| microwave | |||
| rotator wheel | |||
| heated shaking incubator | |||
| aquatics facilities | |||
| breeding tanks |
References
- Broz, P., Ohlson, M. B., Monack, D. M. Innate immune response to Salmonella Typhimurium, a model enteric pathogen. Gut Microbes. 3 (2), 62-70 (2012).
- Lickwar, C. R., et al. Genomic dissection of conserved transcriptional regulation in intestinal epithelial cells. PLoS Biology. 15 (8), e2002054 (2017).
- Stones, D. H., et al. Zebrafish (Danio rerio) as a Vertebrate Model Host To Study Colonization, Pathogenesis, and Transmission of Foodborne Escherichia coli O157. mSphere. 2 (5), (2017).
- Mitchell, K. C., Breen, P., Britton, S., Neely, M. N., Withey, J. H. Quantifying Vibrio cholerae enterotoxicity in a zebrafish infection model. Applied and Environmental Microbiology. , 00783 (2017).
- Logan, S. L., et al. The Vibrio cholerae type VI secretion system can modulate host intestinal mechanics to displace gut bacterial symbionts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (16), E3779-E3787 (2018).
- Howlader, D. R., et al. Zebrafish as a novel model for non-typhoidal Salmonella pathogenesis, transmission and vaccine efficacy. Vaccine. 34 (42), 5099-5106 (2016).
- Troll, J. V., et al. Microbiota promote secretory cell determination in the intestinal epithelium by modulating host Notch signaling. Development. 145 (4), (2018).
- Wiles, T. J., et al. Host Gut Motility Promotes Competitive Exclusion within a Model Intestinal Microbiota. PLoS Biology. 14 (7), e1002517 (2016).
- Rendueles, O., et al. A new zebrafish model of oro-intestinal pathogen colonization reveals a key role for adhesion in protection by probiotic bacteria. PLoS Pathogens. 8 (7), e1002815 (2012).
- Varas, M., et al. Salmonella Typhimurium induces cloacitis-like symptomsin zebrafish larvae. Microbial Pathogenesis. 107, 317-320 (2017).
- Runft, D. L., et al. Zebrafish as a natural host model for Vibrio cholerae colonization and transmission. Applied and Environmental Microbiology. 80 (5), 1710-1717 (2014).
- Meier, R., Wiessner, W. Infection of algae-free Paramecium bursaria with symbiotic Chlorella sp. Isolated from green paramecia: I. Effect of the incubation period. European Journal of Protistology. 24 (1), 69-74 (1988).
- Miura, T., Moriya, H., Iwai, S. Assessing phagotrophy in the mixotrophic ciliate Paramecium bursaria using GFP-expressing yeast cells. FEMS Microbiology Letters. 364 (12), (2017).
- Watanabe, K., et al. Ciliate Paramecium is a natural reservoir of Legionella pneumophila. Scientific Reports. 6, 24322 (2016).
- Bragg, A. N., Hulpieu, H. A Method of Demonstrating Acidity of Food Vacuoles in Paramecium. Science. 61 (1580), 392 (1925).
- Borla, M. A., Palecek, B., Budick, S., O'Malley, D. M. Prey capture by larval zebrafish: evidence for fine axial motor control. Brain, Behavior and Evolution. 60 (4), 207-229 (2002).
- Patterson, B. W., Abraham, A. O., MacIver, M. A., McLean, D. L. Visually guided gradation of prey capture movements in larval zebrafish. Journal of Experimental Biology. 216 (Pt 16), 3071-3083 (2013).
- Megraud, F. Transmission of Helicobacter pylori: faecal-oral versus oral-oral route. Alimentary Pharmacology & Therapeutics. 9 Suppl 2, 85-91 (1995).
- Spears, K. J., Roe, A. J., Gally, D. L. A comparison of enteropathogenic and enterohaemorrhagic Escherichia coli pathogenesis. FEMS Microbiology Letters. 255 (2), 187-202 (2006).
- Bianco, I. H., Kampff, A. R., Engert, F. Prey capture behavior evoked by simple visual stimuli in larval zebrafish. Frontiers in Systems Neuroscience. 5, 101 (2011).
- Gahtan, E., Tanger, P., Baier, H. Visual prey capture in larval zebrafish is controlled by identified reticulospinal neurons downstream of the tectum. Journal of Neuroscience. 25 (40), 9294-9303 (2005).
- Westphal, R. E., O'Malley, D. M. Fusion of locomotor maneuvers, and improving sensory capabilities, give rise to the flexible homing strikes of juvenile zebrafish. Frontiers in Neural Circuits. 7, 108 (2013).
