Summary
Zebrafish (Danio rerio) stanno diventando un modello animale vertebrato ampiamente usato per colonizzazione microbica e patogenesi. Questo protocollo descrive l'uso di protozoo Paramecium caudatum come veicolo di infezione alimentare nelle larve di zebrafish. P. caudatum prontamente interiorizza batteri e ottenere ripreso da larvale zebrafish attraverso il naturale comportamento di predazione.
Abstract
Grazie alla loro trasparenza, trattabilità genetica e facilità di manutenzione, zebrafish (Danio rerio) sono diventati un modello vertebrato ampiamente usato per le malattie infettive. Zebrafish larvale predano naturalmente unicellulare protozoo Paramecium caudatum. Questo protocollo descrive l'uso di p. caudatum come veicolo di infezione alimentare in zebrafish larvale. P. caudatum interiorizzare una vasta gamma di batteri e cellule batteriche rimangono vitali per diverse ore. Zebrafish predano poi p. caudatum, la carica batterica viene rilasciata in foregut sulla digestione del veicolo paramecio e i batteri colonizzano il tratto intestinale. Il protocollo comprende una descrizione dettagliata di manutenzione Paramisha, caricamento con batteri, determinazione di degradazione batterica e la dose, così come infezione di zebrafish alimentandosi con Paramisha. Il vantaggio di questo metodo di infezione alimentare è strettamente imita il modo di infezione osservata nella malattia umana, conduce alla colonizzazione più robusto rispetto ai protocolli di immersione che permette lo studio di una vasta gamma di agenti patogeni. Infezione di origine alimentare nel modello zebrafish può essere utilizzato per studiare l'espressione genica batterica all'interno di host, interazioni ospite-patogeno e caratteristiche di patogenicità tra cui carica batterica, la localizzazione, la diffusione e la morbosità.
Introduction
Condivisione di zebrafish morfologicamente e funzionalmente conservato caratteristiche con i mammiferi, tra cui lignaggi granulocytic (ad es., neutrofili), monocito/macrofago-come le cellule, recettori Toll-like, citochine pro-infiammatorie e peptidi antimicrobici1 . Il tratto intestinale in zebrafish è completamente sviluppato 6 giorni post fertilizzazione (dpf) e Mostra conservazione morfologica e funzionale con il tratto gastrointestinale dei mammiferi, come ad esempio conservato regolazione trascrizionale in cellule epiteliali intestinali 2. questo rende zebrafish un modello eccellente per colonizzazione microbica intestinale e patogenesi. Una vasta gamma di microbi enterici è stata studiata nel modello zebrafish, tra cui3di Escherichia colienteroemorragica, Vibrio cholerae4,5, Salmonella enterica6, il zebrafish microbiota7,8e il ruolo dei probiotici in immunità intestinale9. Un netto vantaggio del modello zebrafish è che esso è colonizzato da molti microbi senza interrompere il microbiota endogeno, che permette l'indagine del comportamento microbico nel contesto delle popolazioni microbiche miste3, 6. attualmente, maggior parte dei modelli di zebrafish di colonizzazione gastrointestinale e malattia si basano sulla somministrazione di microbi di immersione in bagno, dove zebrafish sono incubati in una sospensione batterica per un determinato lasso di tempo10. Tuttavia, questo rende difficile determinare la dose esatta di batteri amministrato e porta alla colonizzazione limitata con alcuni microbi, specialmente con i batteri non patogeni. In alternativa, una sospensione batterica viene somministrata per pesce tramite sonda gastrica orale11, ma questo è tecnicamente impegnativo e limitato ai pesci adulti e larve più anziani.
Questo protocollo descrive l'uso di unicellulare protozoo Paramecium caudatum come un veicolo per la consegna di tossinfezione alimentare di microbi al tratto gastrointestinale di larve di zebrafish. Paramisha è facile ed economico da mantenere e è in grado di alimentare su un'ampia varietà di microbi, tra cui alghe, funghi e batteri, che essi interiorizzare attraverso una scanalatura orali ciliati12,13,14. Una volta interiorizzato, batteri si svolgono nei vacuoli, che alla fine acidificare e il contenuto vengono degradati per un lasso di tempo di diverse ore15. Zebrafish larvale catturare Paramisha come prede naturali presto dopo la schiusa, circa 3 – 4 dpf a seconda temperatura16e portarli fino ad alta efficienza. Il processo di cattura di prede prende media 1.2 s dal rilevamento per catturare17e Paramisha catturati è rapidamente digeriti nel foregut di zebrafish, tale che interiorizzati batteri vitali vengono rilasciati nel tratto intestinale3. Di conseguenza, Paramisha utilizzabile come un metodo rapido e facile di trasportare una dose elevata e costante di batteri nel tratto gastrointestinale di zebrafish. I batteri trasportati o possono essere trasformati per esprimere una proteina fluorescente, come mCherry come descritto qui, o, nel caso di batteri geneticamente insolubili, possono essere pre-tinto con un colorante fluorescente per permettere la visualizzazione all'interno del tratto gastrointestinale.
Questo protocollo descrive la consegna di tossinfezione alimentare di enteropatogeni Escherichia coli (enteroemorragica e. coli [EHEC] e aderente dilagante e. coli [AIEC]) e Salmonella enterica SSP. Typhimurium. Sia patogeni di e. coli e S. typhimurium sono trasmessi attraverso la via fecale-orale18,19e può essere acquistata tramite contaminato alimenti come carne, verdura e prodotti lattiero-caseari. Utilizzando p. caudatum come un veicolo, e. coli e S. typhimurium colonizzare con successo le larve di zebrafish entro 30-60 min di co-incubazione con il veicolo di paramecio. La carica batterica raggiunto è abbastanza robusto per visualizzare colonizzazione e determinare oneri da omogenati di placcatura.
Protocol
Zebrafish cura, l'allevamento ed esperimenti descritti qui sono in conformità con la guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio e sono stati approvati dal comitato di benessere animale istituzionale della University of Texas Health Science Center, protocollo numero AWC-16-0127.
1. crescita e il mantenimento dei Paramisha
- Ottenere dal vivo Paramisha culture da fonti quali Zebrafish International Resource Center (ZIRC).
- Da una crescente cultura dal vivo, aggiungere 1 mL della cultura Paramisha, 1 mL di una coltura di Escherichia coli MG1655 (densità ottica OD600 1.0 – 2.0) risospesi in 1 x E3 (0,29 g/L NaCl, KCl, 13 mg/L 44 mg/L CaCl2, 81 mg/L di MgSO4 HEPES, pH 7.0, sterile 0,48 g/L) e 8 mL di 1 x E3 in un matraccio di cultura del tessuto da 10 mL. Agitare leggermente e quindi memorizzare a 22 ° C.
- Per mantenere una cultura, ogni due settimane, passaggio 1 mL di una cultura Paramisha in un matraccio di cultura del tessuto 10ml con 9 mL di mezzo x E3 fresco 1 contenente 108 CFU/mL di e. coli MG1655 risospesi in 1 x E3.
2. determinazione della batterica Dose somministrata di Zebrafish
-
Determinare emivita batterica all'interno di Paramecium
Nota: L'emivita di batteri all'interno Paramisha è determinato dalla placcatura praticabile e. coli recuperato da paramecio, come descritto di seguito.- Dopo un'incubazione di 2 h di batteri (OD600 di 1.0) con Paramisha a 22 ° C, unire il Paramisha e co-coltura in una provetta conica da 50 mL, lavare i Paramisha con 1 E3 e il conteggio del numero di Paramisha per millilitro (come descritto nella procedura 3.2.7 e 3.2.8).
- Dopo il conteggio del numero di Paramisha, rimuovere 50 µ l dei Paramisha e co-coltura batterica ogni ora (per 6 ore di post-esposizione) e aggiungere ciascun campione in una provetta di fresco 1,5 mL.
- Posto 950 µ l di tensioattivo non ionico 1% (Vedi Tabella materiali) in fosfato (PBS) soluzione tampone in ciascuna delle provette da 1,5 mL e vortexare per 1 min a lisare il Paramisha. 01:10 di eseguire diluizioni di ciascun campione con PBS sterile come un diluente (cioè, 100 µ l a 900 µ l).
- 100 µ l di ciascuna diluizione sulle piastre selettive del piatto (medio LB tet: tryptone di 1 g/L, 0,5 g/L estratto di lievito, 1 g/L NaCl, tetraciclina di 30 µ g/mL) e incubare a 37 ° C per 16 h. Il giorno successivo, contare e registrare il numero di colonie batteriche sulla piastra (unità formanti colonie, CFUs) contando solo le colonie individuali isolate e distinte. Identificare un piatto con una diluizione che dà 30 – 300 CFU.
- Determinare la diluizione fattore utilizzato. Ad esempio, se 1 µ l di coltura batterica è miscelato con 99 mL di PBS sterile, questo è una diluizione 1: 100 (0,01). Questo numero sarà il numero di CFU nella diluizione. Eseguire il calcolo di seguito, per ogni punto di tempo, per determinare il CFU nel campione originale:
- Calcolare e graph il numero di vitali e.coli/paramecio corrispondente alle ore dopo l'esposizione usando la concentrazione Paramisha calcolata nel passaggio 3.3.1 e determinare il tempo di dimezzamento entro il Paramisha (Figura 1).
- Utilizzando il CFU numero calcolato per ciascun punto di tempo, calcolare e rappresentare graficamente il numero di vitali e. coli a paramecio sull'asse y contro l'incubazione post ore sull'asse x, usando la concentrazione Paramisha calcolata al punto 3.3.1. Determinare il tempo di dimezzamento entro il Paramisha.
-
Determinare il dosaggio da Half-Life batterica batterica e predare tasso.
Nota: Per determinare il dosaggio batterico, l'emivita dei batteri all'interno i Paramisha e il tasso di predazione di zebrafish su Paramisha (Vedi punto 3.4) devono essere presi in considerazione.- Utilizzare la seguente formula per determinare il decadimento batterico all'interno Paramisha:
(1)
Dove N0 è la quantità iniziale di batteri per Paramisha dopo l'incubazione di 2 h, Nt è la quantità rimanente dopo il tempo t, τ è il tempo dopo il quale si è dimezzato il numero di batteri vitali e k è la costante di decadimento. - Dall'esperimento di degradazione, determinare la costante di decadimento k utilizzando l'emivita batterica (cioè, il tempo dopo il quale ha dimezzato la quantità di batteri vitale/paramecio).
(2)
Per la determinazione del tempo di dimezzamento, il termine
e
(3)
o
(4)
Nota: Basato su Figura 1, l'emivita di e. coli in Paramisha è circa 2,3 h. Così, utilizzando la formula (4), il tasso di decadimento, k, per e. coli è:
(5)
- Determinare il tasso di decadimento (k) dall'esperimento di Half-Life per trovare la dose di batteri vitali (Nt) ripreso dalle larve di zebrafish dopo tempo predante (t), dove (P) è il tasso di predazione o il numero dei Paramisha mangiato da un pesce all'ora:
(6)
o
(7)
Nota: Per ogni Figura 1, la quantità iniziale di batteri per Paramisha (N0) dopo un'incubazione di 2 h (t) è 790 CFU. A Movie 1 e Figura 2, il tasso di predazione (P) è 1539. - Utilizzando questi valori per sostituire nell'equazione (7), calcolare il dosaggio batterico consumato da un zebrafish dopo un'incubazione di 2 h come:
(8)
- Utilizzare la seguente formula per determinare il decadimento batterico all'interno Paramisha:
e
o
o
3. alimentare l'infezione di Zebrafish
- Incubare i batteri con Paramisha.
- Preparare una co-coltura di Paramisha ed Escherichia coli MG1655 la notte prima dell'infezione. Combinare 8 mL di E3 media, 1 mL di una cultura di continuo Paramisha e 1 mL di una coltura di Escherichia coli MG1655 (OD600 = 1.0) risospesi in 1 x E3 in recipienti di coltura del tessuto T25. Incubare per una notte le beute a temperatura ambiente (TA). Per ciascuna condizione di trattamento, preparare due boccette di Paramisha.
- Inoculare i terreni di coltura batterica (LB: tryptone di 1 g/L, Estratto di lievito 0,5 g/L, 1 g/L NaCl) con infettiva ceppo di batteri, con la scelta di un singolo Colonia batterica da una piastra utilizzando un ciclo di inoculazione sterile. Incubare la coltura liquida a 37 ° C e lasciare agitazione a 110 rotazioni al minuto (rpm) durante la notte.
Nota: Indossare dispositivi di protezione individuale (guanti e un camice da laboratorio) e servizi di livello 2 di biosicurezza dovrebbero essere usati durante la manipolazione di agenti infettivi. - Il giorno successivo, misurare il OD600 della cultura durante la notte. Calcolare il volume della cultura necessaria per ottenere un OD600 di 1 quando risospesi in 11 mL di media.
- Raccolto il volume dei batteri dal punto 3.1.2 tramite centrifugazione a 6.000 x g per 5 min, un volume per ciascuna beuta di Paramisha. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet batterico in 1 mL di E3 media.
- Facoltativamente, pre-macchia i batteri con un colorante fluorescente.
- Aggiungere 1 µ l di macchia di FM 4-64FX batterica (5 mg/mL di soluzione madre). Coprire il tubo con un foglio per proteggere da photobleaching e incubare rotante sopra fine a RT per 15 min.
- Rimuovere il colorante in eccesso mediante lavaggio con 1 x E3: Pellet batteri tramite centrifugazione a 6.000 x g per 1,5 min, quindi risospendere il pellet in 1 mL di E3 media. Ripetere il lavaggio due volte.
- Raccogliere macchiato batteri tramite centrifugazione a 6.000 x g per 5 min, scartare il supernatante e risospendere il pellet batterico in 1 mL di E3 media.
- Aggiungere 1 mL di sospensioni batteriche a ciascuna delle due beute di fresco Paramisha. Incubare a temperatura ambiente per 2 h.
Nota: Se lavora con i batteri macchiati, incubare al buio a temperatura ambiente per 2 h.
- Lavare i batteri/Paramisha co-coltura.
- Combinare il contenuto di due boccette di Paramisha/batteri co-coltura in una provetta conica da 50 mL. Centrifugare i campioni a 300 x g e a 15 ° C per 10 min. Assicurarsi che la centrifuga sia pre-raffreddata prima di questo passaggio.
- Prelevare circa 10 mL del surnatante E3 utilizzando una pipetta sierologica e aggiungere circa 10 mL di 1 fresco x E3 al tubo conico.
Nota: Durante tutte le fasi di lavaggio, è essenziale essere molto rapido quando si rimuove il supernatante, come i Paramisha inizierà a nuotare fuori il pellet. Spin e rimuovere il surnatante da un tubo alla volta per garantire la gestione abbastanza veloce a questo punto e prevenire la perdita dei Paramisha nel surnatante. - Spin di campioni tramite centrifugazione a 300 x g a 15 ° C per 5 minuti circa 10 mL di surnatante E3 utilizzando una pipetta sierologica, rimuovere e aggiungere circa 10 mL di fresco 1 x E3 al tubo conico. Ripetere questo passaggio due volte.
- Centrifugare i campioni a 300 x g a 15 ° C per 5 min, rimuovere circa 10 mL di surnatante E3, facendo attenzione a non per disturbare il pellet.
- Risospendere il pellet nei rimanenti 10 mL di E3 media e trasferire 500 µ l della sospensione in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL nuovo. Pallina la 500 µ l di Paramisha mediante centrifugazione a 300 x g per 5 min contare il numero dei Paramisha.
- Togliere 400 µ l di supernatante E3 la 500 µ l di campione. Aggiungere 20 µ l di soluzione di formaldeide 36,5% per i restanti 100 µ l di Paramisha e Risospendere delicatamente e incubare per 5 min a 22 ° C.
Nota: Questo passaggio uccide i Paramisha per consentire per il conteggio. - Misurare il volume totale effettivo utilizzando la pipetta e registrare. Diluire il Paramisha sospensione 1:1 v/v con soluzione di blu di trypan 0,4%.
- È possibile utilizzare un contatore di cellule o emocitometro per contare il numero di morti Paramisha/mL.
Nota: A causa il passaggio di fissazione preventiva, maggior parte dei Paramisha sarà morto a questo punto, ma questo numero riflette il numero dei Paramisha dal vivo per l'esperimento di co-incubazione. Gli autori non hanno trovato la morte Paramisha significativi a causa batterica co-incubazione, quindi questo può essere ignorato come un fattore qui.
- Co-Incubare larve Paramisha e zebrafish.
- Calcolare la concentrazione dei Paramisha:
Nota: Questo calcolo dà la concentrazione dei Paramisha nella provetta conica da 50 mL dal punto 3.2.5. - Calcolare il volume di lavato Paramisha necessaria per una concentrazione di 2 x 105 Paramisha/mL in un volume finale di 3 mL di E3.
Nota: La concentrazione di Paramisha può essere regolata in base alla dose desiderata batterica, che è oggetto di ottimizzazione. - Anestetizzare zebrafish aggiungendo tricaina in 100 mM a Tris pH 8.0 a una concentrazione finale di 100 mg/L. trasferimento 10 zebrafish in ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti in un volume totale di 3 mL di fresco E3 contenente la concentrazione appropriata di Paramisha (calcolato al passaggio 3.3.2). Assicurarsi di trasferire le larve in una quantità minima di liquido, per garantire che riprendersi da anestesia nel pozzo destinatario.
- Incubare a 30 ° C per 2 h in un incubatore diurno in condizioni di luce del giorno, per garantire condizioni di illuminazione ottimali per predare.
- Lavare almeno 5 volte di zebrafish trasferendo il pesce in un nuovo contenente 3 mL di fresco E3 contenente 100 mg/L tricaina ogni volta.
Nota: Non tentare di omettere la tricaina durante la fase di lavaggio. Trasferimento mobile larve senza anestesia aumenta il rischio di danni e sofferenze agli animali. - Facoltativamente, preparare zebrafish per l'imaging incorporando zebrafish in 3 mL di agarosio all'1% low-melt in una piastra a 6 pozzetti nero-murato: basso-fusione dell'agarosi sono costituito in 1xE3 e riscaldata in un forno a microonde. Una volta fuso, aggiungere tricaina ad una concentrazione finale di 160 mg/mL. Posizione il pesce sotto un microscopio stereoscopico, utilizzando un punta, facendo attenzione che la testa sia a sinistra e la coda di caricamento del gel ritagliato è a destra (Figura 3). Attendere 5 minuti per l'agarosio impostare, quindi sovrapporre il pesce incorporato con 1 x E3 contenenti tricaina di 160 mg/mL per l'imaging.
- Calcolare la concentrazione dei Paramisha:
- Determinare il tasso di predazione.
Nota: Nessun esperimento separato deve essere impostato per determinare il tasso di predazione. Piuttosto, questo può essere fatto durante passaggio 3.3.4, come descritto di seguito.- Durante il passaggio 3.3.4, Mostra zebrafish predante su un stereomicroscopio e cattura video riprese della cattura di prede.
- Punteggio ottenuto il filmato. Cattura di prede è caratterizzata da notevole di zebrafish verso la preda. Conta ogni colpo come evento di cattura di una preda, anche se questa è solo un'approssimazione (Vedi discussione).
- Calcolare il numero medio di eventi cattura prede ogni ora da più clip video, ognuno dei quali rappresenta una larva di zebrafish diversi (Figura 2).
Representative Results
Paramecium caudatum interiorizza facilmente una vasta gamma di batteri nei vacuoli di deposito. La densità batterica intracellulare dipende la densità dei batteri e dei Paramisha in co-coltura, come pure le specie batteriche utilizzate. Nel corso del tempo, i vacuoli acidificano e degradazione batterica ensues. La velocità di degradazione deve essere determinato individualmente per tutti i ceppi utilizzati. Per patogeni di Escherichia coli, la densità batterica iniziale è 790 batteri /paramecioe batteri sono degradati con un'emivita di circa 2,3 h (Figura 1).
Figura 1: determinazione del tempo di dimezzamento batterica in Paramisha. (A) seguente 2 h di co-incubazione con infettive e. coli, p. caudatum è stato lavato e trasferite al medium senza batteri. Presso i punti di tempo indicato, numeri di vitali Escherichia coli cellule sono state determinate mediante placcatura di diluizione in agar selettivo. Risultati sono mezzi ± errore standard della media (SEM; n = 3). (B) immagine tipica di paramecio trasportare interiorizzato batteri, con campo chiaro (Bi), batteri fluorescenti (Bii) e unite canali (Biii). Barra della scala = 20 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Ulteriormente, il danio zebrato predare tasso, cioè il tasso al quale zebrafish interiorizzare Paramisha batteri-caricato sopra co-incubazione, è stato studiato. Zebrafish larvale iniziano a cacciare e catturare prede vive da 5 dpf20, anche se è stato trovato che, quando ha sollevato a 30 ° C, lo sviluppo larvale è accelerato e animali display predante comportamento da 4 dpf. Predare è accompagnata da una caratteristica sorprendente comportamento20 (Figura 2A), e la determinazione del tasso di predazione si basa sul presupposto che ogni sciopero porta all'interiorizzazione di un paramecio, anche se questo può solo essere considerato un approssimazione (Vedi discussione). Basato sulle osservazioni ivi descritte di predare larve di zebrafish, il tasso di assorbimento Paramisha è circa 1.539 a h (Figura 2B).
Figura 2: determinazione del tasso di predazione di zebrafish. (A) immagini da un video predante, mostrando un zebrafish larve (5 dpf) predano Paramisha che trasportano batteri fluorescenti. Ora in [secondi]. Freccia indica l'asse principale del movimento durante colpire. (B) quantificazione del tasso di predazione (assunzione Paramisha ogni ora), basato su n = 10 video ripreso il tempo di esposizione completa 2 h. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
A seguito di interiorizzazione dei Paramisha, zebrafish degrada in modo efficiente la preda in foregut, rilascio di batteri infettivi nell'apparato digerente. Come descritto nel presente documento, degradazione Paramisha procede velocemente, e batteri liberi possono essere rilevati nel tratto intestinale entro 30 minuti di predare. Gratis i batteri per poi passare dal foregut all'intestino medio e posteriore, dove vengono rilevati circa 1 – 2 h dopo l'inizio della predazione (Figura 3). Persistenza batterica nell'intestino dipende dalla specie e dose ma spazia da diverse ore a diversi giorni nel caso di e. coli e S. enterica. S. enterica si localizza principalmente nelle mucose intestinali, con qualche invasione epiteliale (Figura 3D), che conduce all'infiltrazione dei neutrofili nell'epitelio (Figura 3).
Figura 3: colonizzazione di zebrafish con batteri. Zebrafish al dpf 5 erano lasciato non infetti (A) o colonizzato con mCherry esprimendo (B) e. coli o (C) S. enterica. Esperimenti di infezione devono essere eseguiti in wild-type (A e B) pesce o linee transgeniche (ad es., la linea Tg (MPO::EGFP) ho114 esprimendo i neutrofili fluorescenti verdi indicati in (C). L'apertura rettale è contrassegnato da una freccia. (D) maggiore ingrandimento della sezione intestinale da intero-monta incorporate larve infettati con l'infezione di Salmonella enterica . (Di) blu = Hoechst marcatura nuclei, viola (Dii) = falloidina marcatura F-actina, rosso (Diii) = Salmonella, Unione (Div). Barra della scala = 5 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Movie 1: riprese Video della cattura prede. Per favore clicca qui per scaricare questo video.
Discussion
Il protocollo di base descritto qui è stato ottimizzato per patogeni di Escherichia colied è stato adattato con successo per altre specie batteriche, tra cui Salmonella enterica e Vibrio cholerae. Per alcune specie che non colonizzare l'intestino di zebrafish dopo immersione in bagno, tra cui alcuni ceppi di Salmonella enterica e alcuni anaerobi, infezione di origine alimentare come descritto qui può essere utilizzato per stabilire con successo la colonizzazione. Rispetto al microgavage, che è utilizzato anche per stabilire elevati oneri batterici nel tratto intestinale larvale, infezione di origine alimentare è tecnicamente meno impegnativa e richiede attrezzature meno specializzate. Tuttavia, i parametri critici dovrebbero essere ottimizzati per la specie batteriche e gli sforzi per essere utilizzato. Tali fattori includono densità batterica e paramecium per il passo di co-coltura di batteri-paramecio: se i numeri batterici all'interno Paramisha sono bassi, questo potrebbe essere migliorata aumentando la densità batterica nel passaggio co-coltura. Alcune specie batterica può causare danni all'host di paramecio, e questo dovrebbe essere valutato da microscopia.
Un altro fattore importante in questo protocollo è la cattura di prede di zebrafish. Il tasso di predazione come qui descritto si basa sul presupposto che ogni cattura di prede sciopero risultati nell'ingestione di un paramecio. Alta densità di Paramisha al pesce sono utilizzate nel protocollo per garantire alti tassi di predazione. Tuttavia, cattura di prede è dipenda dalla densità dei Paramisha nel sistema e nelle culture di paramecio molto diluite, predante tariffe possono essere à partire de 13 – 15 Paramisha per ore21,22. Una limitazione è che tassi di cattura di prede sono anche fortemente dipendenti su condizioni di luce e il buio, tassi di cattura sono inferiori in condizioni di luce21 e questo dovrebbe essere presi in considerazione durante l'impostazione di esperimenti del 80%. Se i tempi di esposizione alla preda devono essere espansi per ottimizzare la colonizzazione, considerazione deve essere dato all'esposizione secondaria ai batteri attraverso le feci. Nelle condizioni descritte sopra – 2 h di esposizione preda – questa esposizione è trascurabile, dal momento che il tempo di passaggio dell'intestino di batteri è più di 1 h e la concentrazione dei batteri nel veicolo è molto superiore nelle feci. Tuttavia, se il tempo di esposizione di preda è aumentato significativamente, questo può diventare un fattore significativo.
Opportuni controlli dovrebbero essere incluso nel presente protocollo, tra cui la colonizzazione di zebrafish segue l'alimentazione con Paramisha contenente non patogeni di e. coli MG1655. Se più ceppi batterici sono confrontati per la loro capacità di colonizzare l'host di zebrafish, è importante verificare se il loro tempo di dimezzamento entro Paramisha è paragonabile. Mutazioni batteriche, comprese quelle compromettere l'integrità della parete cellulare o acido di rilevamento, possono compromettere la stabilità batterica all'interno Paramisha. In tali casi, zebrafish alimentazione dev'essere adattate all'account per le differenze di dosaggio.
Il protocollo descritto qui può essere utilizzato per indagare la colonizzazione batterica e le sue conseguenze, tra cui da colonizzazione batterica di zebrafish di imaging, come descritto in precedenza, nonché determinando CFU per zebrafish da tessuto omogeneato3, o indagando su mortalità e morbilità associata a infezione. Idealmente, per la visualizzazione batterica, ceppi batterici che esprimono le proteine fluorescenti come mCherry o proteina fluorescente rossa (RFP) devono essere utilizzati. Questo permetterà la visualizzazione delle popolazioni batteriche in crescita. Se il ceppo batterico non è geneticamente trattabile o l'uso dell'espressione della proteina fluorescente è preclusa la possibilità per altri motivi, batteri possono essere colorati con un colorante fluorescente, come FM 4-64FX, prima del co-cultura con Paramisha. Quando si utilizza il protocollo descritto qui, co-coltura con Paramisha non diminuisce la luminosità del colorante e macchiati batteri sono chiaramente visibili nell'intestino zebrafish. Tuttavia, la tintura sarà diluita nel tempo dovrebbe verificarsi di proliferazione batterica significativa all'interno dell'host di zebrafish. In entrambi i casi, rosso fluorescente batteri sono preferibili sopra verde fluorescente batteri, poiché autofluorescenza del tessuto può essere superiore nel verde che nel canale del rosso.
È stato trovato che questo protocollo può essere adattato per aerobica e microaerofili specie batteriche. È possibile adattarlo per l'alimentazione di spore e specie fungine, anche se questo rimane per essere verificata sperimentalmente.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare i membri del gruppo Krachler per lettura critica e commenti sul manoscritto. Quest'opera è stata finanziata da un UT sistemi STAR award, il BBSRC e NIH (R01AI132354).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paramecium caudatum, live | Carolina | 131554 | no not store growing cultures below room temperature |
| 0.4% Trypan Blue Solution | Sigma | T8154-20ML | liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture; prepared in 0.81% sodium chloride and 0.06% potassium phosphate, dibasic |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | 276855-100ML | store in a solvent safety cabinet |
| Escherichia coli, MG1655 | ATCC | ATCC 700926 | can be replaced by any other non-pathogenic E. coli strain |
| FM 4-64FX stain | Thermo Fisher | F34653 | aliquot and store frozen |
| Formaldehyde | Sigma | F8775-4X25ML | |
| LB Broth | Sigma | L3397-1KG | |
| Phosphate buffered saline tablets | Thermo Fisher | 18912014 | |
| Tetracycline | Sigma | 87128-25G | toxic, irritant |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma | E10521-10G | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-100ML | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Sigma | 93595-50ML | |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Thermo Fisher | 16520050 | |
| hemocytometer or cell counter | any | ||
| stereomicroscope | any | ||
| table-top centrifuge | |||
| microwave | |||
| rotator wheel | |||
| heated shaking incubator | |||
| aquatics facilities | |||
| breeding tanks |
References
- Broz, P., Ohlson, M. B., Monack, D. M. Innate immune response to Salmonella Typhimurium, a model enteric pathogen. Gut Microbes. 3 (2), 62-70 (2012).
- Lickwar, C. R., et al. Genomic dissection of conserved transcriptional regulation in intestinal epithelial cells. PLoS Biology. 15 (8), e2002054 (2017).
- Stones, D. H., et al. Zebrafish (Danio rerio) as a Vertebrate Model Host To Study Colonization, Pathogenesis, and Transmission of Foodborne Escherichia coli O157. mSphere. 2 (5), (2017).
- Mitchell, K. C., Breen, P., Britton, S., Neely, M. N., Withey, J. H. Quantifying Vibrio cholerae enterotoxicity in a zebrafish infection model. Applied and Environmental Microbiology. , 00783 (2017).
- Logan, S. L., et al. The Vibrio cholerae type VI secretion system can modulate host intestinal mechanics to displace gut bacterial symbionts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (16), E3779-E3787 (2018).
- Howlader, D. R., et al. Zebrafish as a novel model for non-typhoidal Salmonella pathogenesis, transmission and vaccine efficacy. Vaccine. 34 (42), 5099-5106 (2016).
- Troll, J. V., et al. Microbiota promote secretory cell determination in the intestinal epithelium by modulating host Notch signaling. Development. 145 (4), (2018).
- Wiles, T. J., et al. Host Gut Motility Promotes Competitive Exclusion within a Model Intestinal Microbiota. PLoS Biology. 14 (7), e1002517 (2016).
- Rendueles, O., et al. A new zebrafish model of oro-intestinal pathogen colonization reveals a key role for adhesion in protection by probiotic bacteria. PLoS Pathogens. 8 (7), e1002815 (2012).
- Varas, M., et al. Salmonella Typhimurium induces cloacitis-like symptomsin zebrafish larvae. Microbial Pathogenesis. 107, 317-320 (2017).
- Runft, D. L., et al. Zebrafish as a natural host model for Vibrio cholerae colonization and transmission. Applied and Environmental Microbiology. 80 (5), 1710-1717 (2014).
- Meier, R., Wiessner, W. Infection of algae-free Paramecium bursaria with symbiotic Chlorella sp. Isolated from green paramecia: I. Effect of the incubation period. European Journal of Protistology. 24 (1), 69-74 (1988).
- Miura, T., Moriya, H., Iwai, S. Assessing phagotrophy in the mixotrophic ciliate Paramecium bursaria using GFP-expressing yeast cells. FEMS Microbiology Letters. 364 (12), (2017).
- Watanabe, K., et al. Ciliate Paramecium is a natural reservoir of Legionella pneumophila. Scientific Reports. 6, 24322 (2016).
- Bragg, A. N., Hulpieu, H. A Method of Demonstrating Acidity of Food Vacuoles in Paramecium. Science. 61 (1580), 392 (1925).
- Borla, M. A., Palecek, B., Budick, S., O'Malley, D. M. Prey capture by larval zebrafish: evidence for fine axial motor control. Brain, Behavior and Evolution. 60 (4), 207-229 (2002).
- Patterson, B. W., Abraham, A. O., MacIver, M. A., McLean, D. L. Visually guided gradation of prey capture movements in larval zebrafish. Journal of Experimental Biology. 216 (Pt 16), 3071-3083 (2013).
- Megraud, F. Transmission of Helicobacter pylori: faecal-oral versus oral-oral route. Alimentary Pharmacology & Therapeutics. 9 Suppl 2, 85-91 (1995).
- Spears, K. J., Roe, A. J., Gally, D. L. A comparison of enteropathogenic and enterohaemorrhagic Escherichia coli pathogenesis. FEMS Microbiology Letters. 255 (2), 187-202 (2006).
- Bianco, I. H., Kampff, A. R., Engert, F. Prey capture behavior evoked by simple visual stimuli in larval zebrafish. Frontiers in Systems Neuroscience. 5, 101 (2011).
- Gahtan, E., Tanger, P., Baier, H. Visual prey capture in larval zebrafish is controlled by identified reticulospinal neurons downstream of the tectum. Journal of Neuroscience. 25 (40), 9294-9303 (2005).
- Westphal, R. E., O'Malley, D. M. Fusion of locomotor maneuvers, and improving sensory capabilities, give rise to the flexible homing strikes of juvenile zebrafish. Frontiers in Neural Circuits. 7, 108 (2013).
