Summary
Sebrafisk (Danio rerio) blir en brukte vertebrate dyr modell for mikrobiell kolonisering og patogenesen. Denne protokollen beskriver bruken av protozoan Paramecium caudatum som et redskap for matbårne infeksjon i sebrafisk larver. P. caudatum lett internalizes bakterier og bli tatt opp av larver sebrafisk gjennom naturlig utnytter atferd.
Abstract
På grunn av deres åpenhet, genetisk tractability og enkelt vedlikehold, sebrafisk (Danio rerio) har blitt en brukte virveldyr modell for infeksjonssykdommer. Larver sebrafisk naturlig tære på den encellede protozoan Paramecium caudatum. Denne protokollen beskriver bruken av P. caudatum som et redskap for matbårne infeksjon i larver sebrafisk. P. caudatum internalisere et bredt spekter av bakterier og bakterielle celler være levedyktig i flere timer. Sebrafisk deretter tære på P. caudatum, bakterielle belastningen er utgitt i foregut på fordøyelsen av paramecium bilen og bakterier kolonisere tarmkanalen. Protokollen inneholder en detaljert beskrivelse av paramecia vedlikehold, lasting bakterier, bestemmelse av bakteriell fornedrelse og dose og infeksjon i sebrafisk ved å fôre med paramecia. Fordelen av benytter denne metoden for matbårne infeksjon er at det tett etterligner infeksjon i menneskelig sykdom-modusen fører til mer robust kolonisering sammenliknet med fordypning protokoller og lar studiet av et bredt spekter av patogener. Mat-borne infeksjon i sebrafisk modell kan brukes til å undersøke bakteriell genuttrykk i vert, vert-patogen interaksjoner og kjennetegner virusets inkludert bakteriell byrden, lokalisering, formidling og sykelighet.
Introduction
Sebrafisk del morphologically og funksjonelt bevart funksjoner med pattedyr, inkludert granulocytic linjene (f.eks nøytrofile), monocytt/macrophage-lignende celler, Toll-like reseptorer, pro-inflammatoriske cytokiner og antimikrobielle peptider1 . Tarmkanalen i sebrafisk er fullt utviklet ved 6 dager innlegget befruktning (dpf) og viser morfologiske og funksjonelle bevaring med pattedyr mage-tarmkanalen, som bevarte transcriptional regulering i intestinal epitelceller 2. Dette gjør sebrafisk en utmerket modell for intestinal mikrobiell kolonisering og patogenesen. En rekke enteric mikrober har vært studert i sebrafisk modell, inkludert enterohemorrhagiske Escherichia coli3, Vibrio cholerae4,5, Salmonella enterica6, den sebrafisk bakterieflora7,8, og rollen som probiotika i intestinal immunitet9. En klar fordel av sebrafisk modell er at den er ferdig kolonisert av mange uten å forstyrre den endogene bakterieflora, som gjør etterforskningen av mikrobielle atferd i forbindelse med blandet mikrobielle populasjoner3, 6. for tiden de fleste sebrafisk modeller av gastrointestinal kolonisering og sykdom avhengige av mikrober ved bad nedsenkning, der sebrafisk er ruges i en bakteriell suspensjon for en bestemt tid10. Men dette gjør det vanskelig å fastslå den eksakte dosen av bakterier administrert og fører til begrenset kolonisering med noen mikrober, spesielt med ikke-patogene bakterier. Eventuelt en bakteriell suspensjon administreres fiske via muntlig gavage11, men dette er teknisk utfordrende og eldre larver og voksne fisk.
Denne protokollen beskriver bruken av den encellede protozoan Paramecium caudatum som et redskap for matbårne levering av mikrober til fordøyelsessystemet av sebrafisk larver. Paramecia er enkelt og billig å vedlikeholde og er i stand til fôring på en rekke mikrober, inkludert alger, sopp og bakterier, som de internalisere gjennom en tungeformet muntlig groove12,13,14. En gang internalisert, bakterier er holdt i vacuoles, er som til slutt syre og innholdet degradert over en periode på flere timer15. Larver sebrafisk fange paramecia som naturlig byttedyr snart etter klekking rundt 3-4 dpf avhengig av temperaturen16, og ta dem opp med høy effektivitet. Prosessen med byttedyr fange tar på gjennomsnittlig 1.2 s fra oppdagelsen å fange17, og fanget paramecia er raskt fordøyd i sebrafisk-foregut slik at internalisert levedyktig bakterier slippes tarmkanalen3. Paramecia kan resultatet brukes som en rask og enkel metode for å levere en høy og jevn dose av bakterier inn i gastrointestinal spor av sebrafisk. Leverte bakterier kan enten bli transformert til å uttrykke en fluorescerende protein, som mCherry som beskrives her, eller ved genetisk uløselige bakterier, de kan være pre beiset med et fluorescerende fargestoff tillate visualisering i den mage-tarmkanalen.
Denne protokollen beskriver matbårne levering av enteropathogenic E. coli (enterohemorrhagiske E. coli [EHEC] og tilhenger invasiv E. coli [AIEC]), og Salmonella enterica ssp. Typhimurium. Både patogene E. coli og S. typhimurium overføres via fecal-muntlige rute18,19, og kan være ervervet via forurenset mat, som kjøtt, grønnsaker og meieriprodukter. Bruke P. caudatum som et kjøretøy, kolonisere E. coli og S. typhimurium vellykket sebrafisk Larvene innen 30-60 min med co inkubering med paramecium bilen. Oppnådd bakterielle belastningen er robuste nok til å visualisere kolonisering og bestemme byrden ved plating vev homogenates.
Protocol
Sebrafisk omsorg, avl og eksperimenter beskrevet her er i henhold til guiden og bruk av forsøksdyr, og er godkjent av institusjonelle dyr velferd komiteen av University of Texas Health Science Center, protokoll antall AWC-16-0127.
1. vekst og vedlikehold av Paramecia
- Få live paramecia kulturer fra kilder som sebrafisk International Resource Center (ZIRC).
- Fra en live voksende kultur, legger du til 1 mL av paramecia kultur, 1 mL av en E. coli MG1655 kultur (optisk tetthet OD600 1.0-2.0) resuspended i 1 x E3 (0.29 finans NaCl, 13 mg/L KCl, 44 mg/L CaCl2, 81 mg/L MgSO4 0,48 finans HEPES, pH 7.0, sterilt), og 8 mL 1 x E3 i en 10 mL vev kultur kolbe. Swirl lett og deretter lagre på 22 ° C.
- For å opprettholde en kultur, annenhver uke, passasje 1 mL av en paramecia kultur i en 10 mL vev kultur kolbe med 9 mL av fersk 1 x E3 medium som inneholder 108 CFU/mL av E. coli MG1655 resuspended i 1 x E3.
2. fastsettelse av bakteriell Dose administrert til sebrafisk
-
Bestemme bakteriell half-life innen Paramecium
Merk: Halveringstiden av bakterier i paramecia bestemmes av plating levedyktig E. coli utvinnes fra paramecium, som beskrevet nedenfor.- Etter en 2t inkubasjonstiden for bakterier (OD600 1,0) med paramecia på 22 ° C, kombinere paramecia og bakteriell co kultur i en 50 mL konisk tube, vask paramecia med 1 x E3 og telle antall paramecia per milliliter (som beskrevet nedenfor i trinn 3.2.7 og 3.2.8).
- Etter å telle antall paramecia, fjerne 50 µL paramecia og bakteriell co kultur hver time (for 6 h etter eksponering) og Legg hvert utvalg i en fersk 1,5 mL tube.
- Sted 950 µL av 1% ikke-ionisert surfactant (se Tabell for materiale) i fosfat bufret (PBS) saltvann i 1,5 mL rør og vortex for 1 min til å lyse av paramecia. Utføre 1:10 fortynninger av hvert utvalg bruker sterilt PBS som en fortynner (dvs. 100 µL i 900 µL).
- Plate 100 µL av hver fortynning på selektiv plater (LB tet medium: 1 g/L tryptone, 0,5 finans gjærekstrakt, 1 g/L NaCl, 30 µg/mL tetracycline) og Inkuber ved 37 ° C i 16 h. Neste dag, teller og registrere antall bakteriell koloniene på tallerkenen (forming koloni-enheter, CFUs) ved å telle bare isolert og distinkte personlige koloniene. Identifisere en plate med en fortynning som gir 30-300 CFU.
- Bestemme fortynning faktor. For eksempel, hvis 1 µL av bakteriell kultur er blandet med 99 mL steril PBS, er dette en 1: 100 (0,01) fortynning. Dette antallet vil være antall CFU i fortynning. Utføre beregningen nedenfor, for alle tidspunkt, å avgjøre CFU i den opprinnelige prøven:
- Beregne og graf antall levedyktig E.coli/paramecium tilsvarer timene legge eksponering bruker paramecia konsentrasjonen beregnet i trinn 3.3.1 og bestemme halveringstiden i paramecia (figur 1).
- Bruker CFU antallet beregnes for hvert punkt, beregne og graf antall levedyktig E. coli per paramecium på y-aksen versus den timer innlegg inkubering på x-aksen, bruker paramecia konsentrasjonen beregnet i trinn 3.3.1. Bestemme halveringstiden innen paramecia.
-
Bestemme bakteriell dosering fra bakteriell half-life og utnytter rate.
Merk: For å bestemme bakteriell dosering, halveringstiden av bakterier inne i paramecia og utnytter frekvensen av sebrafisk på paramecia må (se trinn 3.4) tas i betraktning.- Bruk følgende formel til å bestemme bakteriell forfallet i paramecia:
(1)
Der N0 er første antall bakterier per paramecia etter den 2t inkubering, Nt er restantallet etter tiden t τ er tiden etter som hvor mange levedyktige bakterier har halvert og k er decay konstant. - Fra fornedrelse eksperimentet, bestemme decay konstant k bruker bakteriell halveringstiden (dvs. tid etter som hvor mye levedyktig bakterier/paramecium har halvert).
(2)
For bestemmelse av half-life, begrepet
og
(3)
eller
(4)
Merk: Basert på figur 1, er halveringstiden av E. coli i paramecia ca 2,3 h. Dermed bruker formelen (4), forfallet rate, k, for E. coli er:
(5)
- Bestemme forfallet rate (k) fra half-life forsøket å finne dosen av levedyktig bakterier (Nt) tatt opp av sebrafisk Larvene etter utnytter tid (t), der (P) er den utnytter rate eller antall paramecia spist av en fisk per time:
(6)
eller
(7)
Merk: Per figur 1, første antall bakterier per paramecia (N0) etter en 2t inkubering (t) er 790 CFU. Per film 1 og figur 2er utnytter (P) 1539. - Bruke disse til å erstatte i ligningen (7), beregne bakteriell dosering fortært av en sebrafisk etter en 2t inkubasjon som:
(8)
- Bruk følgende formel til å bestemme bakteriell forfallet i paramecia:
og
eller
eller
3. mat-borne infeksjon av sebrafisk
- Inkuber bakterier med Paramecia.
- Forberede en co kultur for paramecia og E. coli MG1655 natten før infeksjon. Kombinere 8 mL av E3 media, 1 mL av en pågående paramecia kultur og 1 mL av en E. coli MG1655 kultur (OD600 = 1.0) resuspended i 1 x E3 i T25 vev kultur flasker. Inkuber kolber ved romtemperatur (RT) over natten. For hver behandling tilstand, forberede to flasker av paramecia.
- Vaksinere bakterievekst media (LB: 1 g/L tryptone, 0,5 finans gjærekstrakt, 1 g/L NaCl) med smittsomme stamme av bakterien, ved å plukke en personlige bakterie kolonien fra en plate bruker en steril inokuleringen sløyfe. Inkuber flytende kulturen på 37 ° C og la riste på 110 rotasjoner per minutt (rpm) over natten.
Merk: Personlig verneutstyr (en laboratoriet frakk og hansker) bør brukes og biosikkerhet nivå 2 fasiliteter skal brukes når du håndterer smittestoffer. - På dagen kan du måle OD600 av natten kultur. Beregne volumet av kultur som kreves for å oppnå en OD600 1 når resuspended i 11 mL av media.
- Høste volumet av bakterier fra trinn 3.1.2 via sentrifugering på 6000 x g i 5 min, ettall volumet for hver kolbe av paramecia. Forkast nedbryting og resuspend bakteriell pellet i 1 mL av E3 media.
- Eventuelt pre flekken bakterier med et fluorescerende fargestoff.
- Legg 1 µL av FM 4-64FX bakteriell flekk (5 mg/mL lager løsning). Dekk rør med folie å beskytte mot photobleaching og ruge roterende over-gjennomgående på RT i 15 min.
- Fjerne overflødig fargestoff ved å vaske med 1 x E3: pellets bakterier via sentrifugering 6000 x g for 1,5 min, så resuspend pellets i 1 mL av E3 media. Gjenta wash trinn to ganger.
- Høste farget bakterier via sentrifugering 6000 x g for 5 min. Forkast nedbryting og resuspend bakteriell pellet i 1 mL av E3 media.
- Legge til 1 mL av bakteriell suspensjon i hver av de to flasker av ferske paramecia. Ruge på RT 2 h.
Merk: Hvis arbeider med farget bakterier, ruge i mørket på RT 2T.
- Vask bakterier/paramecia co kultur.
- Kombinere innholdet i begge flasker av paramecia/bakterier co kultur i en 50 mL konisk rør. Sentrifuger eksempler på 300 x g ved 15 ° C i 10 min. Kontroller at sentrifuge er pre-avkjølt før dette trinnet.
- Fjerner ca 10 mL av E3 nedbryting bruker en serologisk pipette og legger ca 10 mL av fersk 1 x E3 til konisk røret.
Merk: Under alle vask trinnene er det viktig å være rask når du fjerner nedbryting, som paramecia vil begynne å svømme ut av pellet. Spinn og fjerne nedbryting fra en tube å sikre rask nok behandling på dette trinnet, og unngå tap av paramecia i nedbryting. - Spin prøver via sentrifugering 300 x g ved 15 ° C for 5 min. fjerner ca 10 mL av E3 nedbryting bruker en serologisk pipette, og legge til ca 10 mL av fersk 1 x E3 til konisk røret. Gjenta dette trinnet to ganger.
- Sentrifuger eksempler på 300 x g ved 15 ° C i 5 min. fjerne ca 10 mL av E3 nedbryting, ta vare ikke for å forstyrre pellet.
- Resuspend pellets i de resterende 10 mL av E3 media og overføre 500 µL av suspensjon i en ny 1,5 mL microcentrifuge tube. Pellets 500 µL av paramecia av sentrifugering på 300 x g i 5 min til å telle antall paramecia.
- Fjern 400 µL av E3 supernatant fra 500 µL prøven. Legge til 20 µL av 36,5% formaldehyd løsning det resterende 100 µL av paramecia forsiktig resuspend og ruge i 5 min på 22 ° C.
Merk: Dette trinnet dreper paramecia å tillate for opptelling. - Måle faktiske totale volumet med Pipetter og posten. Fortynn paramecia suspensjon 1:1 v/v med 0,4% trypan blå løsning.
- Bruk en celle teller eller hemocytometer for å telle antall døde paramecia/mL.
Merk: På grunn av det tidligere fiksering trinnet, de fleste paramecia vil være død på dette punktet, men dette tallet gjenspeiler antall live paramecia for co inkubasjon eksperimentet. Forfatterne har ikke funnet betydelige paramecia død på grunn av bakteriell co inkubering, så dette kan bli oversett som en faktor her.
- Co ruge Paramecia og sebrafisk larver.
- Beregn konsentrasjonen av paramecia:
Merk: Denne beregningen gir konsentrasjonen av paramecia 50 mL konisk røret fra trinn 3.2.5. - Beregne volumet av vasket paramecia kreves for en konsentrasjon av 2 x 105 paramecia/mL i et siste volum på 3 mL E3.
Merk: Konsentrasjonen av paramecia kan bli justert basert på ønsket bakteriell dosering, som er gjenstand for optimalisering. - Bedøve sebrafisk ved å legge til tricaine i 100 mM Tris pH 8.0 til en siste konsentrasjon av 100 mg/L. overføring 10 sebrafisk i hver brønn av en 6-vel plate i et totalt volum på 3 mL frisk E3 som inneholder den aktuelle konsentrasjonen av paramecia (beregnet i trinn 3.3.2). sikre overføre larver i en minimal mengde væske, å sikre de komme bedøvelsen mottaker brønnen.
- Ruge på 30 ° C for 2t i en dagaktive inkubator under dagslys forhold, for å sikre optimal lyn betingelser for utnytter.
- Vask sebrafisk minst 5 ganger ved å overføre fisk i en ny godt med 3 mL frisk E3 som inneholder 100 mg/L tricaine hver gang.
Merk: Ikke forsøk å utelate tricaine under vask trinnet. Overføre mobile Larvene uten bedøvelse øker risikoen for skade og nød til dyret. - Eventuelt forberede sebrafisk bildebehandling ved å bygge sebrafisk i 3 mL 1% lav-smelte agarose i en svart vegger 6-vel plate: lav-smelte agarose er laget i 1xE3 og varmet i mikrobølgeovn. Når smeltet, legge tricaine til en siste konsentrasjon av 160 mg/mL. Posisjon fisken under en stereomicroscope, bruker en avkuttet gel lasting tips, at hodet er på venstre og halen er til høyre (Figur 3). Vente i 5 minutter for agarose angi og overlegg innebygde fisken med 1 x E3 med 160 mg/mL tricaine for bildebehandling.
- Beregn konsentrasjonen av paramecia:
- Finn utnytter hastigheten.
Merk: Ingen egen eksperiment må defineres til å bestemme utnytter frekvensen. Snarere, kan dette gjøres under trinn 3.3.4, som beskrevet nedenfor.- Under trinn 3.3.4, vise utnytter sebrafisk på en stereomicroscope og fange video-opptakene av byttedyr fangst.
- Score videoopptak. Byttedyr fangst er preget av slående av sebrafisk mot byttedyr. Telle hver streik som en byttedyr fange hendelsen, men dette er bare en tilnærming (se diskusjon).
- Beregne gjennomsnittlig antall byttedyr fange hendelser per time fra flere videoklipp, hver representerer en annen sebrafisk Larven (figur 2).
Representative Results
Paramecium caudatum internalizes lett en rekke bakterier i lagring vacuoles. Intracellulær bakteriell tetthet avhengig av tettheten av bakterier og paramecia i co kultur, samt bakterie-art brukes. Over tid, vacuoles syre og bakteriell fornedrelse følger. Frekvensen av nedbrytning har bestemmes individuelt for alle stammer brukes. Patogene E. coli, første bakteriell tetthet er 790 bakterier /parameciumog bakterier er forringet med en halveringstid på ca 2,3 h (figur 1).
Figur 1: bestemmelse av bakteriell halveringstid i paramecia. (A) følgende 2 h med co inkubering med smittsomme E. coli P. caudatum ble vasket og overført til medium uten bakterier. På de angitte tidspunkt, tall av levedyktig E. coli celler ble fastsatt av fortynning plating på selektiv agar. Resultatene er ± standardfeil av gjsnitt (SEM, n = 3). (B) typiske bildet av paramecium bærer internalisert bakterier, med lyse felt (Bi), fluorescerende bakterier (Bii), og flettet kanaler (Biii). Skala bar = 20 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Videre, sebrafisk utnytter rate, dvs hastigheten som sebrafisk internalisere bakterier lastet paramecia på co inkubering, ble studert. Larver sebrafisk begynner å jakte og fange levende byttedyr 5 dpf20, selv om det ble funnet at når reist på 30 ° C, larver utvikling er akselerert og dyr viser utnytter oppførsel fra 4 dpf. Utnytter ledsages av en karakteristisk slående atferd20 (figur 2A) og fastsetting av utnytter prisen er basert på antagelsen om at hver strike fører til internalisering av en paramecium, selv om dette kan bare anses en tilnærming (se diskusjon). Basert på her beskrevet observasjoner av utnytter sebrafisk larver, er paramecia opptak ca 1,539 per h (figur 2B).
Figur 2: besluttsomhet sebrafisk utnytter rate. (A) stillbilder fra en utnytter video, viser en sebrafisk Larvene (5 dpf) utnytter på paramecia bærer fluorescerende bakterier. Tiden i [sekunder]. Pilen viser hovedaksen bevegelse under slående. (B) kvantifisering utnytter rate (paramecia inntak per time), basert på n = 10 videoer tatt over hele 2t eksponeringstid. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Etter internalization paramecia forringer sebrafisk effektivt byttedyr i foregut, slipper smittsomme bakterier i fordøyelsessystemet. Som beskrevet her, paramecia nedbrytning fortsetter raskt, og gratis bakterier kan påvises i tarmkanalen innen 30 minutter av utnytter. Gratis bakterier og flytte fra foregut til midten- og bakre tarmen, hvor de er oppdaget ca 1-2 h etter utnytter (Figur 3). Bakteriell utholdenhet i tarmen, avhenger av arter og dose men varierer fra flere h til flere dager E. coli og S. enterica. S. enterica regionaliserer i de intestinal mucosae, med noen epithelial invasjonen (figur 3D), fører til infiltrasjon av nøytrofile i epitel (Figur 3 c).
Figur 3: kolonisering av sebrafisk med bakterier. Sebrafisk på 5 dpf var igjen infisert (A) eller kolonisert med mCherry uttrykke (B) E. coli eller (C) S. enterica. Infeksjon eksperimenter kan utføres i vill type (A og B) fisk eller transgene linjer (f.eks linjen vs (MPO::EGFP) jeg114 uttrykke grønne fluorescerende nøytrofile vises i (C). Det endetarms åpningen er merket med en pil. (D) høyere forstørrelsen av intestinal delen fra hele-mount innebygde Larvene infisert med Salmonella enterica infeksjon. (Di) blå = Hoechst merking kjerner, (Dii) lilla = phalloidin merking F-utgangen, (Diii) rød = Salmonella, (Div) flettingen. Skala bar = 5 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Film 1: Video-opptakene av byttedyr webhentingen. Klikk her for å laste ned denne videoen.
Discussion
Grunnleggende protokollen beskrevet her er optimalisert for patogene E. coli, og har vært vellykket tilpasset andre bakterielle arter, inkludert Salmonella enterica og Vibrio cholerae. For enkelte arter som ikke kan kolonisere sebrafisk tarmen etter bad nedsenkning, inkludert noen Salmonella enterica stammer og noen anaerobes, kan matbårne infeksjon som beskrevet her brukes til å lykkes med å etablere kolonisering. Sammenlignet med microgavage, som også brukes til å opprette høy bakteriell byrder i larver tarmkanalen, matbårne infeksjon er teknisk mindre utfordrende og krever mindre spesialisert utstyr. Men skal kritiske parametere være optimalisert for bakterie-art og stammer skal brukes. Slike faktorer omfatter bakteriell og paramecium tetthet for bakterier-paramecium co kultur trinn: om bakteriell tall innenfor paramecia er lav, dette kan forbedres ved å øke bakteriell tettheten i co kultur trinn. Noen bakteriell arter kan forårsake skade på paramecium verten, og dette bør vurderes av mikroskopi.
En annen viktig faktor i denne protokollen er byttedyr fangst av sebrafisk. Utnytter hastigheten er som beskrevet her basert på antagelsen om at hver byttedyr fange strike resultater i inntak av en paramecium. Høye tettheter av paramecia per fisk brukes i protokollen for å sikre høy utnytter priser. Imidlertid byttedyr fangst er avhengig av tettheten av paramecia i systemet, og i svært fortynne paramecium kulturer, utnytter priser kan være så lite som 13-15 paramecia per time21,22. En begrensning er at byttedyr fangst priser er også sterkt avhengig av lysforholdene og i mørket, fangst priser er 80% lavere enn i lys21 og dette bør tas i betraktning når du setter opp eksperimenter. Hvis eksponeringstider å bytte må utvides til å optimalisere kolonisering, må vurdering gis til sekundære eksponering for bakterier gjennom avføring. Under forholdene beskrevet ovenfor-2 h byttedyr eksponering-er denne eksponeringen ubetydelig, siden gut passeringstider av bakterier er mer enn 1 h og konsentrasjonen av bakterier i kjøretøyet er mye høyere enn i avføring. Men hvis byttedyr eksponeringstid økes betydelig, kan dette bli en betydelig faktor.
Egnede kontroller skal inkluderes i denne protokollen, inkludert kolonisering av sebrafisk etter fôring med paramecia som inneholder ikke-patogene E. coli MG1655. Hvis flere bakteriell stammer sammenlignes for deres evne til å kolonisere sebrafisk verten, er det viktig å teste om deres half-life i paramecia sammenlignes. Bakteriell mutasjoner, inkludert de akkord cellevegg integritet eller syre sensing, kan kompromittere bakteriell stabilitet i paramecia. I slike tilfeller har sebrafisk fôring justeres kontoen for forskjellene i dosering.
Protokollen beskrevet her kan brukes til å undersøke bakteriell kolonisering og dens konsekvenser, herunder imaging bakteriell kolonisering av sebrafisk som beskrevet ovenfor og bestemme CFU per sebrafisk fra vev homogenate3, eller undersøker infeksjon-assosiert sykelighet og dødelighet. Ideelt for bakteriell visualisering, skal bakteriell stammer uttrykke fluorescerende proteiner som mCherry eller rød fluorescerende protein (RFP) brukes. Dette vil tillate visualisering av voksende bakteriell befolkninger. Hvis bakterielle belastningen er ikke genetisk medgjørlig eller bruk av fluorescerende protein uttrykk er utelukket av andre grunner, kan bakterier være farget med et fluorescerende fargestoff, som FM 4-64FX, før co kultur med paramecia. Når du bruker protokollen beskrevet her, co kultur med paramecia redusere ikke lysstyrken i fargen og farget bakterier er synlig i sebrafisk tarmen. Imidlertid vil fargestoff bli utvannet over tid bør betydelig bakteriell spredning skje innen sebrafisk verten. Uansett er rød-selvlysende bakterier å foretrekke over green-selvlysende bakterier, siden vev autofluorescence kan være høyere i grønne enn i den røde kanalen.
Det har blitt funnet at denne protokollen kan tilpasses for aerobic og gram-negative bakterie-art. Det kan være mulig å tilpasse den for fôring av sporer og fungal arter, selv om dette gjenstår å bli testet eksperimentelt.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke medlemmer av gruppen Krachler for kritisk lesing og kommentarer på manuskriptet. Dette arbeidet ble finansiert av en UT systemer STAR award, BBSRC og NIH (R01AI132354).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paramecium caudatum, live | Carolina | 131554 | no not store growing cultures below room temperature |
| 0.4% Trypan Blue Solution | Sigma | T8154-20ML | liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture; prepared in 0.81% sodium chloride and 0.06% potassium phosphate, dibasic |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | 276855-100ML | store in a solvent safety cabinet |
| Escherichia coli, MG1655 | ATCC | ATCC 700926 | can be replaced by any other non-pathogenic E. coli strain |
| FM 4-64FX stain | Thermo Fisher | F34653 | aliquot and store frozen |
| Formaldehyde | Sigma | F8775-4X25ML | |
| LB Broth | Sigma | L3397-1KG | |
| Phosphate buffered saline tablets | Thermo Fisher | 18912014 | |
| Tetracycline | Sigma | 87128-25G | toxic, irritant |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma | E10521-10G | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-100ML | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Sigma | 93595-50ML | |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Thermo Fisher | 16520050 | |
| hemocytometer or cell counter | any | ||
| stereomicroscope | any | ||
| table-top centrifuge | |||
| microwave | |||
| rotator wheel | |||
| heated shaking incubator | |||
| aquatics facilities | |||
| breeding tanks |
References
- Broz, P., Ohlson, M. B., Monack, D. M. Innate immune response to Salmonella Typhimurium, a model enteric pathogen. Gut Microbes. 3 (2), 62-70 (2012).
- Lickwar, C. R., et al. Genomic dissection of conserved transcriptional regulation in intestinal epithelial cells. PLoS Biology. 15 (8), e2002054 (2017).
- Stones, D. H., et al. Zebrafish (Danio rerio) as a Vertebrate Model Host To Study Colonization, Pathogenesis, and Transmission of Foodborne Escherichia coli O157. mSphere. 2 (5), (2017).
- Mitchell, K. C., Breen, P., Britton, S., Neely, M. N., Withey, J. H. Quantifying Vibrio cholerae enterotoxicity in a zebrafish infection model. Applied and Environmental Microbiology. , 00783 (2017).
- Logan, S. L., et al. The Vibrio cholerae type VI secretion system can modulate host intestinal mechanics to displace gut bacterial symbionts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (16), E3779-E3787 (2018).
- Howlader, D. R., et al. Zebrafish as a novel model for non-typhoidal Salmonella pathogenesis, transmission and vaccine efficacy. Vaccine. 34 (42), 5099-5106 (2016).
- Troll, J. V., et al. Microbiota promote secretory cell determination in the intestinal epithelium by modulating host Notch signaling. Development. 145 (4), (2018).
- Wiles, T. J., et al. Host Gut Motility Promotes Competitive Exclusion within a Model Intestinal Microbiota. PLoS Biology. 14 (7), e1002517 (2016).
- Rendueles, O., et al. A new zebrafish model of oro-intestinal pathogen colonization reveals a key role for adhesion in protection by probiotic bacteria. PLoS Pathogens. 8 (7), e1002815 (2012).
- Varas, M., et al. Salmonella Typhimurium induces cloacitis-like symptomsin zebrafish larvae. Microbial Pathogenesis. 107, 317-320 (2017).
- Runft, D. L., et al. Zebrafish as a natural host model for Vibrio cholerae colonization and transmission. Applied and Environmental Microbiology. 80 (5), 1710-1717 (2014).
- Meier, R., Wiessner, W. Infection of algae-free Paramecium bursaria with symbiotic Chlorella sp. Isolated from green paramecia: I. Effect of the incubation period. European Journal of Protistology. 24 (1), 69-74 (1988).
- Miura, T., Moriya, H., Iwai, S. Assessing phagotrophy in the mixotrophic ciliate Paramecium bursaria using GFP-expressing yeast cells. FEMS Microbiology Letters. 364 (12), (2017).
- Watanabe, K., et al. Ciliate Paramecium is a natural reservoir of Legionella pneumophila. Scientific Reports. 6, 24322 (2016).
- Bragg, A. N., Hulpieu, H. A Method of Demonstrating Acidity of Food Vacuoles in Paramecium. Science. 61 (1580), 392 (1925).
- Borla, M. A., Palecek, B., Budick, S., O'Malley, D. M. Prey capture by larval zebrafish: evidence for fine axial motor control. Brain, Behavior and Evolution. 60 (4), 207-229 (2002).
- Patterson, B. W., Abraham, A. O., MacIver, M. A., McLean, D. L. Visually guided gradation of prey capture movements in larval zebrafish. Journal of Experimental Biology. 216 (Pt 16), 3071-3083 (2013).
- Megraud, F. Transmission of Helicobacter pylori: faecal-oral versus oral-oral route. Alimentary Pharmacology & Therapeutics. 9 Suppl 2, 85-91 (1995).
- Spears, K. J., Roe, A. J., Gally, D. L. A comparison of enteropathogenic and enterohaemorrhagic Escherichia coli pathogenesis. FEMS Microbiology Letters. 255 (2), 187-202 (2006).
- Bianco, I. H., Kampff, A. R., Engert, F. Prey capture behavior evoked by simple visual stimuli in larval zebrafish. Frontiers in Systems Neuroscience. 5, 101 (2011).
- Gahtan, E., Tanger, P., Baier, H. Visual prey capture in larval zebrafish is controlled by identified reticulospinal neurons downstream of the tectum. Journal of Neuroscience. 25 (40), 9294-9303 (2005).
- Westphal, R. E., O'Malley, D. M. Fusion of locomotor maneuvers, and improving sensory capabilities, give rise to the flexible homing strikes of juvenile zebrafish. Frontiers in Neural Circuits. 7, 108 (2013).
