Summary
Данио рерио (Danio рерио) становятся широко используется позвоночных животных модель микробная колонизация и патогенеза. Этот протокол описывает использование простейших Парамеции туфелька в качестве инструмента для пищевого инфекции данио рерио личинки. P. туфелька легко усваивает бактерий и получить принятые личиночной данио рерио через естественное поведение хищными.
Abstract
За счет их прозрачности, отслеживаемости генетических и простота обслуживания данио рерио (Danio рерио) стали широко использоваться позвоночных моделью для инфекционных заболеваний. Личинок данио рерио естественно добычу на одноклеточных простейших Парамеции туфелька. Этот протокол описывает использование P. туфелька в качестве инструмента для пищевого заражения в личиночной данио рерио. P. туфелька интернализировать широкий спектр бактерий и бактериальной клетки остаются жизнеспособными на несколько часов. Данио рерио затем охотятся на P. туфелька, бактериальной нагрузки выпущен в Передняя кишка после переваривания Парамеции транспортного средства, и бактерии колонизации кишечного тракта. Протокол включает в себя подробное описание paramecia обслуживания, Загрузка с бактериями, определение бактериальной деградации и дозы, а также инфекции данио рерио кормления с paramecia. Преимущество использования этого метода пищевого заражения является что тесно имитирует режим инфекции наблюдаются в болезни человека, приводит к более надежной колонизации, по сравнению с погружения протоколов и позволяет изучение широкого спектра возбудителей. Пищевого заражения в zebrafish модель может использоваться для изучения экспрессии генов бактерий внутри хоста, хост возбудитель взаимодействия и клейма патогенности, включая бактериальные бремя, локализации, распространения и заболеваемости.
Introduction
Данио рерио доля морфологически и функционально сохранены функции с млекопитающих, в том числе гранулоцитарного линий (например, нейтрофилов), моноцитов/макрофагов как клетки, Толл подобные рецепторы, провоспалительных цитокинов и противомикробные пептиды1 . Кишечного тракта в zebrafish полностью разработана в 6 дней поста оплодотворение (dpf) и показывает морфологических и функциональных сохранения с млекопитающих желудочно-кишечного тракта, например сохранены регуляцию в эпителиальных клетках кишечника 2. это делает данио рерио отличную модель для кишечного микробного колонизации и патогенеза. Широкий спектр кишечными микробами была изучена в zebrafish модели, включая энтерогеморрагические Escherichia coli3, холерный вибрион4,5, Salmonella enterica6, Данио рерио микробиоты7,8и роль пробиотиков кишечного иммунитета9. Явное преимущество в zebrafish модель является, что он является колонизировали многие микробы не нарушая эндогенного микрофлору, которая позволяет расследования микробной поведения в контексте смешанных микробных популяций3, 6. в настоящее время, большинство моделей данио рерио желудочно-кишечного тракта колонизации и болезней полагаются на администрации микробов путем погружения Ванна, где данио рерио инкубируют в бактериальных подвеска на определенное время10. Однако это делает его трудно определить точную дозу бактерий осуществляется и приводит к ограниченным колонизации с некоторых микробов, особенно с непатогенные бактерии. Кроме того бактериальный подвеска администрируется рыбы через пероральная затравка11, но это технически сложной и ограничивается старшего возраста личинок и взрослых рыб.
Этот протокол описывает использование одноклеточных простейших Парамеции туфелька в качестве транспортного средства для доставки пищевых микробов желудочно-кишечного тракта у рыбок данио личинок. Paramecia легко и дешево поддерживать и способны кормления на широкий спектр микробов, в том числе водорослей, грибков и бактерий, которые они усвоить через мерцательного устные паз12,,1314. После интернализации, бактерии проводятся в вакуолей, который в конечном итоге подкислять и содержание деградировавших течение времени нескольких часов15. Личинок данио рерио захватить paramecia в качестве естественной добычей вскоре после вылупления, около dpf 3 – 4, в зависимости от температуры16и принимать их с высокой эффективностью. Процесс захвата добычи занимает в среднем 1,2 s от обнаружения захватить17, и захватили paramecia быстро перевариваются в zebrafish Передняя кишка, таким образом, что внутреннюю жизнеспособные бактерии попадают в желудочно-кишечном тракте3. В результате paramecia может использоваться как быстрый и простой метод для доставки высокого и последовательного дозу бактерий в желудочно-кишечного тракта у рыбок данио. Поставленный бактерии могут быть преобразованы либо выразить флуоресцентного белка, такие как mCherry, как описано здесь, или, в случае генетически неразрешимыми бактерии, они могут быть предварительно окрашенные с Люминесцентную краску, чтобы позволить визуализации в рамках желудочно-кишечного тракта.
Этот протокол описывает пищевого доставки энтеропатогенные E. coli (энтерогеморрагические E. coli [ЭГКП] и сторонником инвазивной кишечной палочки [AIEC]) и Salmonella enterica ssp. Typhimurium. Патогенной кишечной палочки и S. typhimurium передаваемых через фекально оральным механизмом передачи18,19и может быть приобретенных через загрязненные продукты питания, таких как мясо, овощи и молочные продукты. С помощью P. туфелька как транспортное средство, E. coli и S. typhimurium успешно колонизировать данио рерио личинок в течение 30 – 60 минут совместного инкубации с Парамеции транспортного средства. Достигнутые бактериальных бремя является достаточно прочным, чтобы визуализировать колонизации и определить бремя покрытия гомогенатах ткани.
Protocol
Данио рерио уход, разведение, эксперименты, описанные здесь, в соответствии с руководство по уходу и использованию лабораторных животных и были утверждены Комитетом институциональных Благосостояние животных из центра науки здоровья университета Техаса, протокол номер AWC-16-0127.
1. рост и техническое обслуживание Paramecia
- Получите живой paramecia культур от источников например, данио рерио центр ресурсов международного (ZIRC).
- От живой растущей культуры, добавьте 1 mL paramecia культуры, 1 мл культуры е. coli MG1655 (оптическая плотность OD600 1.0-2.0) высокомобильна в 1 x E3 (0,29 г/Л NaCl, 13 мг/Л хлористого калия, 44 мг/Л CaCl2, 81 мг/Л MgSO4 0,48 г/Л HEPES, рН 7,0, стерильные) и 8 mL 1 x E3 в колбе 10 мл культуры ткани. Вихрем слегка и затем хранить в 22 ° C.
- Для поддержания культуры, каждые две недели, проход 1 мл paramecia культуры в 10 мл культуры ткани колба с 9 мл свежего 1 x E3 среды, содержащие 108 кое/мл MG1655 E. coli высокомобильна в 1 x E3.
2. Определение бактериальной дозы вводят данио рерио
-
Определить бактериальных half-life в пределах Парамеции
Примечание: Период полураспада бактерий в paramecia определяется обшивка жизнеспособных E. coli оправился от Парамеции, как описано ниже.- После 2 ч инкубации бактерий (OD600 1.0) с paramecia при 22 ° C, сочетают в себе paramecia и бактериальной культуры сотрудничества в 50 мл Конические трубки, мыть paramecia с 1 x E3 и count количество paramecia на миллилитр (как описано ниже 3.2.7 и 3.2.8).
- После подсчета количества paramecia, удалите 50 мкл paramecia и бактериальной культуры сотрудничества каждый час (за 6 ч после воздействия) и добавьте каждого образца в свежий 1,5 мл трубку.
- Место 950 мкл 1% неионогенных поверхностно-активных веществ (см. Таблицу материалы) в фосфат буфер солевой раствор (PBS) в каждой из 1.5 мл пробирок и вихревые за 1 мин до лизируют paramecia. Выполнить 1:10 разведений каждого образца, используя стерильные PBS в качестве разбавителя (т.е., 100 мкл в 900 мкл).
- Пластина 100 мкл каждого разведения на выборочной пластин (LB тет средний: триптон 1 г/Л, 0,5 г/Л дрожжевого экстракта, 1 г/Л NaCl, тетрациклин 30 мкг/мл) и инкубировать при 37 ° C для 16 h. На следующий день, рассчитывать и записывать количество бактериальных колоний на пластину (образуя колонии единиц, CFUs), считая только изолированные и различных отдельных колоний. Идентифицировать тарелку с разрежения, которая дает кое 30 – 300.
- Определить разбавления используемый коэффициент. Например если 1 мкл бактериальной культуры смешивается с 99 мл стерильного PBS, это разведение 1: 100 (0.01). Это число будет количество кое в разведении. Выполните расчет ниже, каждый момент времени, чтобы определить кое в исходного образца:
- Рассчитать и граф количество жизнеспособных E.coli/Парамеции соответствующий часов пост воздействия с использованием paramecia концентрации, рассчитанные на шаге 3.3.1 и определить период полураспада в paramecia (рис. 1).
- С помощью кое число вычисляется для каждой точки времени, расчета и граф количество жизнеспособных E. coli за Парамеции на оси y против часов инкубации пост на оси x, с использованием paramecia концентрации, рассчитанные на шаге 3.3.1. Определите период полураспада в пределах paramecia.
-
Определите, что бактериальные дозирования от бактериальных half-life и охотились.
Примечание: Чтобы определить бактериальных дозировку, half-life бактерий внутри paramecia и хищными скорость данио рерио на paramecia (см. шаг 3.4) должны приниматься во внимание.- Используйте следующую формулу для определения бактерий гниения внутри paramecia:
(1)
Начальное количество бактерий в paramecia, где N0 после 2 ч инкубации, Nt оставшееся количество после времени t, τ-время, после чего сократился вдвое количество жизнеспособных бактерий, и k — константа распада. - От деградации эксперимент, определить распада константа k, с использованием бактериальной half-life (то есть, время, после чего сократился вдвое количество жизнеспособных бактерий/Парамеции).
(2)
Для определения half-life термин
и
(3)
или
(4)
Примечание: Основываясь на рисунке 1, период полураспада E. coli в paramecia составляет приблизительно 2.3 h. Таким образом с помощью формулы (4), скорость распада, k, для е. coli является:
(5)
- Определить скорость распада (k) из half-life эксперимент, чтобы найти доза жизнеспособных бактерий (Nt) принятые данио рерио личинок после хищными времени (t), где (P) является хищными стоимость или количество paramecia, съел одну рыбу в час:
(6)
или
(7)
Примечание: На рисунке 1начальное количество бактерий в paramecia (N0) после 2 ч инкубации (t)-790 кое. Фильм 1 и на рисунке 2хищными (P) стоимость 1539. - Чтобы подставить в уравнение (7), рассчитать бактериальных дозировка, потребляемых данио рерио после 2 ч инкубации как с помощью этих значений:
(8)
- Используйте следующую формулу для определения бактерий гниения внутри paramecia:
и
или
или
3. пищевыми инфекции данио рерио
- Инкубируйте бактерий с Paramecia.
- Подготовка совместного культуры paramecia и E. coli MG1655 ночь до инфекции. Объединить 8 мл E3 медиа, 1 мл текущих paramecia культуры и 1 мл культуры е. coli MG1655 (ОД600 = 1.0) высокомобильна в 1 x E3 в колбах T25 культуры ткани. Инкубируйте фляги при комнатной температуре (RT) на ночь. Для каждого условия лечения Подготовьте две фляги paramecia.
- Прививать бактериальных питательных сред (LB: триптон 1 г/Л, 0,5 г/Л дрожжевой экстракт, 1 г/Л NaCl) с инфекционным штамм бактерий, выбирая отдельные бактериальные колонии от пластины с помощью стерильных прививка цикла. Инкубировать культур в жидкой среде при 37 ° C и оставить встряхивания на 110 оборотов в минуту (об/мин) на ночь.
Примечание: Следует носить средства индивидуальной защиты (лабораторный халат и перчатки) и зал 2-го уровня биобезопасности должен использоваться при обработке инфекционных агентов. - На следующий день Измерьте ОД600 ночь культуры. Рассчитайте объем культуры, необходимые для достижения ОД600 1 когда высокомобильна 11 мл средств массовой информации.
- Урожай объем бактерий из шага 3.1.2 через центрифугирования в 6000 x g 5 мин, один объем для каждого настой paramecia. Отменить супернатант и Ресуспензируйте бактериальных Пелле в 1 мл E3 медиа.
- При необходимости, предварительно пятно бактерий с флуоресцентной краской.
- 1 мкл FM 4-64FX бактериальной пятно (Стоковый раствор 5 мг/мл). Покрытия труб пленкой для защиты от Фотообесцвечивание и инкубировать вращающейся-над конца в РТ за 15 мин.
- Удалите излишки красителя, мытье с 1 x E3: Пелле бактерий через центрифугирования в 6000 x g для 1,5 мин, затем Ресуспензируйте Пелле в 1 мл E3 медиа. Повторите шаг мыть два раза.
- Урожай окрашенных бактерий через центрифугирования в 6000 x g для 5 минут удалить супернатант и Ресуспензируйте бактериальных Пелле в 1 мл E3 медиа.
- Добавьте 1 mL бактериальных суспензий для каждого из двух колб свежих paramecia. Проинкубируйте 2 ч в рт.
Примечание: При работе с окрашенных бактерий, Инкубируйте в темноте в РТ за 2 ч.
- Промойте бактерий/paramecia совместно культуры.
- Объединить содержимое обоих колбы со культуры paramecia/бактерий в 50 мл Конические трубки. Центрифуга образцы на 300 x g , при 15 ° C на 10 мин убедитесь, что центрифуги предварительно охлажденным до этого шага.
- Удаление приблизительно 10 мл супернатант E3, используя Серологические Пипетки и добавить примерно 10 мл свежего 1 x E3 конические трубы.
Примечание: На всех этапах мыть важно быть очень быстро при удалении супернатанта, как paramecia начинают плавать из гранул. Спина и удалить супернатант из одной трубы одновременно, чтобы обеспечить достаточно быстрое обращение на этот шаг и избежать потери paramecia в надосадке. - Спина образцы через центрифугирования в 300 x g, при 15 ° C за 5 минут удалить супернатант E3, используя Серологические Пипетки приблизительно 10 мл и добавить примерно 10 мл свежего 1 x E3 конические трубы. Повторите этот шаг два раза.
- Центрифуга образцы на 300 x g , при 15 ° C за 5 минут удалить супернатант E3, стараясь не нарушить гранулы примерно 10 мл.
- Ресуспензируйте Пелле в оставшиеся 10 мл E3 медиа и передачи 500 мкл суспензии в новые пробки microcentrifuge 1,5 мл. Пелле 500 мкл paramecia центрифугированием при 300 x g на 5 минут, чтобы подсчитать количество paramecia.
- Удалите из 500 мкл пример 400 мкл E3 супернатант. 20 мкл раствора формальдегида 36,5% в оставшиеся 100 мкл paramecia и нежно ресуспензируйте и инкубировать в течение 5 мин при температуре 22 ° C.
Примечание: Этот шаг убивает paramecia для подсчета. - Измерить фактический объем с помощью пипетки и запись. Разбавьте подвеска paramecia 1:1 v/v с 0,4% раствор Трипановый синий.
- Используйте счетчик соматических клеток или Горяева подсчитать количество мертвых paramecia/мл.
Примечание: Из-за шаг до фиксации большинство paramecia будет мертв на данный момент, но это число отражает количество живой paramecia для эксперимента, Сопредседатель инкубации. Авторы не нашли значительные paramecia смерти из-за бактериальной Сопредседатель инкубации, поэтому это могут быть проигнорированы как фактор здесь.
- Инкубируйте совместно Paramecia и данио рерио личинки.
- Рассчитайте концентрацию paramecia:
Примечание: Этот расчет дает концентрация paramecia в 50 мл Конические трубки из шага 3.2.5. - Рассчитайте объем промывают paramecia, необходимых для концентрации 2 x 105 paramecia/мл в окончательном объеме 3 мл E3.
Примечание: Концентрация paramecia может быть скорректирована по желаемой бактериальных дозировки, которая подлежит оптимизации. - Анестезировать данио рерио, добавив tricaine в 100 мм трис pH 8.0 до конечной концентрации 100 данио рерио передачи 10 мг/л в каждой скважине 6-ну пластине в суммарный объем 3 мл свежего E3 содержащие соответствующую концентрацию paramecia (рассчитаны на шаге 3.3.2). обеспечить для переноса личинок в минимальное количество жидкости, чтобы они оправиться от анестезии в поле получателя.
- Инкубируйте на 30 ° C в течение 2 ч в суточный инкубатора в условиях дневного света, для обеспечения оптимальной Молния условия для наживаться.
- Вымойте данио рерио по крайней мере 5 раз передавая рыбы в новой хорошо содержащие 3 мл свежего E3 содержит tricaine 100 мг/Л каждый раз.
Примечание: Не пытайтесь опускать tricaine на этапе стирки. Перенос мобильных личинки без анестезии увеличивает риск ущерба и страданий для животного. - При необходимости, подготовить данио рерио для изображений путем внедрения данио рерио в 3 мл агарозы 1% температура расплава в тарелку со стенами черный 6-ну: низкий расплава агарозы в 1xE3 и нагреве в микроволновой. Когда расплавленный, добавьте tricaine в конечной концентрации 160 мг/мл. Положение рыбы под стереомикроскопом, используя обрезанный гель загрузки кончиком, убедившись, что руководитель находится слева, а хвост находится справа (рис. 3). Подождите 5 минут для агарозы для задания, а затем наложение встроенные рыбы с 1 x E3 содержащий 160 мг/мл tricaine для обработки изображений.
- Рассчитайте концентрацию paramecia:
- Определите уровень хищными.
Примечание: Нет отдельной эксперимент должен быть установлен определить уровень хищными. Скорее это можно сделать во время шага 3.3.4, как описано ниже.- Во время шага 3.3.4 посмотреть хищными данио рерио на стереомикроскопом и захвата видео кадры захвата добычу.
- Оценка видео кадры. Добычей захвата характеризуется поражать данио рерио сторону добычу. Граф каждый удар как один добычу захвата событий, хотя это только приблизительное (см. обсуждение).
- Вычислите среднее количество хищных захвата событий в час из нескольких видеоклипов, каждый из которых представляет различные данио рерио личинки (рис. 2).
Representative Results
Парамеции туфелька легко усваивает широкий спектр бактерий в хранения вакуоли. Внутриклеточных бактериальных плотность зависит от плотности бактерий и paramecia в сотрудничестве культуры, а также бактериальных видов, используемых. Со временем вакуоли подкислять и вытекает бактериальная деградации. Скорость деградации должен быть индивидуально определены для всех штаммов, используемых. Для патогенных кишечной палочки, первоначальный бактериальных плотность составляет 790 бактерий /Парамециии бактерии являются деградация с периодом полураспада примерно 2.3 h (рис. 1).
Рисунок 1: определение бактериальной half-life в paramecia. (A) после 2 h совместно инкубации с инфекционными E. coli, P. туфелька был промывают и переведен в среде без бактерий. В назначенное время точках, числа жизнеспособных E. coli клетки были определены путем разбавления покрытий на выборочной агар. Результаты являются средством ± Среднеквадратичная ошибка среднего значения (SEM; n = 3). (B) типичный образ Парамеции проведения интернализации бактерий, с ярким полем (Bi), флуоресцентный бактерий (ВП) и объединить каналы (Biii). Шкалы бар = 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Кроме того данио рерио, пренебрегая ставки, то есть скорость, с которой у рыбок данио интернализировать загружен бактерии paramecia после совместного инкубации, был изучен. Данио рерио личинок начинают охотиться и захватить живой добычей от 5 dpf20, хотя было установлено, что, когда возникает при 30 ° C, ускорения развития личинок и животных отображения хищными поведение от 4 dpf. Пренебрегая сопровождается характеристика поражает поведение20 (рисунок 2A), и определение хищными ставки основывается на предположении, что каждый удар приводит к интернализации один Парамеции, хотя это можно рассматривать лишь приближение (см. обсуждение). Основываясь на здесь описано наблюдений наживаться данио рерио личинки, скорость поглощения paramecia является примерно 1,539 за h (рис. 2B).
Рисунок 2: определение хищными ставки данио рерио. (A) изображений с хищными видеозапись, данио рерио личинки (5 dpf) наживаться на paramecia, ношение флуоресцентные бактерий. Время в [секунд]. Стрелка указывает основной оси движения во время поражать. (B) количественную оценку темпов хищными (paramecia потребление в час), основанный на n = 10 видео, принятых за время экспозиции полный 2 h. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
После интернализации paramecia данио рерио эффективно снижает добычу в Передняя кишка, выпуская инфекционных бактерий в пищеварительной системе. Как описано здесь, paramecia деградации продолжается быстро и бесплатно бактерии могут быть обнаружены в желудочно-кишечном тракте в течение 30 минут наживаться. Свободной от бактерий, а затем перейти от Передняя кишка средне - и задней кишки, где они обнаруживаются примерно 1-2 ч после начала хищными (рис. 3). Бактериальные сохраняемости в кишечнике зависит от видов и доза, но колеблется от нескольких h до нескольких дней в случае E. coli и S. enterica. S. enterica локализуется преимущественно в кишечной mucosae, с некоторыми эпителиальных вторжения (рис. 3D), привело к проникновению нейтрофилов в эпителии (рис. 3 c).
Рисунок 3: Колонизация данио рерио с бактериями. Данио рерио на 5 dpf были оставил неинфицированных (A) или колонизировали с mCherry, выражая E. coli (B) или (C) S. enterica. Инфекция может быть эксперименты в дикого типа (A и B) рыбы или трансгенных линий (например, линии тг (MPO::EGFP) я114 , выражая Зеленый флуоресцентный нейтрофилов, показано на (C). Ректальное отверстие отмечена стрелкой. (D) увеличение кишечных секции из состава Гора встраиваемых личинки инфицированных с Salmonella enterica инфекции. (Ди) синий = Hoechst, маркировка ядер, фиолетовый (дии) = Фаллоидин маркировка F-актина, красный (Diii) = сальмонеллы, слияние (Div). Шкалы бар = 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Фильм 1: видео кадры захвата добычей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Discussion
Основной протокол, описанные здесь был оптимизирован для патогенных кишечной палочкии был успешно адаптирован для других бактериальных видов, включая Salmonella enterica и Vibrio cholerae. Для некоторых видов, которые не заселять кишечник данио рерио, после погружения Ванна, включая некоторые штаммы Salmonella enterica и некоторых анаэробов пищевого заражения как описано здесь может использоваться для успешного создания колонизации. По сравнению с microgavage, который также используется для создания высокой бактериальной бремя в личиночной кишечного тракта, пищевого заражения является технически менее сложной и требует менее специализированного оборудования. Однако критические параметры должны быть оптимизированы для бактериальных видов и штаммов, которые будут использоваться. Такие факторы включают плотности бактериальных и Парамеции для этапа совместного культуры бактерий Парамеции: если бактериальная чисел в пределах paramecia являются низкими, это может быть улучшено путем увеличения бактериальной плотности на шаге Сопредседатель культуры. Некоторые виды бактерий может привести к повреждению Парамеции хост, и это должно оцениваться по микроскопии.
Еще одним важным фактором в этот протокол является захват хищных рыбок данио. Хищными ставка как описано здесь основан на предположении, что каждый захват добычу забастовку результаты в пищу один Парамеции. Высокая плотность paramecia за рыба используются в протоколе для обеспечения высоких хищными. Однако захвата добычи зависит от плотности paramecia в системе, и в очень разбавленных Парамеции культур, хищными тарифы могут быть как низко как paramecia 13 – 15 за час21,22. Ограничение заключается в том, что жертвами захвата ставки также сильно зависит от условий освещения и в темноте, захват ставки 80% ниже, чем в условиях освещенности21 и это должно приниматься во внимание при настройке экспериментов. Если воздействия раз жертвой должны быть расширен для оптимизации колонизации, рассмотрение должно отдаваться вторичного воздействия бактерий через фекалии. В условиях, описанных выше – 2 h добычу воздействия – это воздействие является незначительным, поскольку время прохода кишки бактерий является более чем 1 час и концентрация бактерий в транспортное средство намного выше, чем в фекалиях. Однако если время экспозиции добычу значительно увеличивается, это может стать существенным фактором.
Соответствующие элементы должны быть включены в этот протокол, включая колонизации данио рерио после кормления с paramecia, содержащие непатогенные E. coli MG1655. Если несколько бактериальных штаммов сравниваются для их способность колонизировать узел данио рерио, важно проверить ли их полураспада в пределах paramecia сопоставимы. Бактериальные мутации, в том числе ущерба целостности клеточной стенки или кислоты зондирования, может скомпрометировать бактериальных стабильности в paramecia. В таких случаях данио рерио кормления должен корректироваться для учета различий в дозировке.
Протокол, описанные здесь может использоваться для изучения бактериальной колонизации и его последствий, в том числе изображений бактериальной колонизации данио рерио, как описано выше, а также определения кое за данио рерио из ткани огневки3, или расследования, связанные с инфекцией заболеваемости и смертности. В идеале для бактериальных визуализации, должны использоваться бактериальных штаммов, выражая флуоресцентных белков, таких как mCherry или красный флуоресцирующий белок (ППП). Это позволит визуализации растущего бактериальных популяций. Если бактериальный штамм не генетически шансов справиться с возникающими или по другим причинам, исключается использование флуоресцентных белков, бактерии могут быть запятнано с Люминесцентную краску, такие как FM 4-64FX, до их культуры совместно с paramecia. При использовании протокола описаны здесь, Сопредседатель культуры с paramecia не уменьшить яркость краски и окрашенных бактерии в кишечнике данио рерио хорошо видны. Однако краска будет разбавлен со временем произойдет значительное распространение бактериальной в узле данио рерио. В любом случае красный люминесцентные бактерии являются предпочтительнее над Грин люминесцентные бактерий, поскольку аутофлюоресценция ткани может быть выше в зеленом чем красного канала.
Было установлено, что этот протокол может быть адаптирован для аэробных и микроаэрофильных бактерий видов. Это может быть возможным адаптировать его для кормления споры и грибковых видов, хотя это по-прежнему быть проверены экспериментально.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить членов группы Krachler для критических чтении и комментариев на рукопись. Эта работа финансировалась на UT систем STAR award, СИББН и низ (R01AI132354).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paramecium caudatum, live | Carolina | 131554 | no not store growing cultures below room temperature |
| 0.4% Trypan Blue Solution | Sigma | T8154-20ML | liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture; prepared in 0.81% sodium chloride and 0.06% potassium phosphate, dibasic |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | 276855-100ML | store in a solvent safety cabinet |
| Escherichia coli, MG1655 | ATCC | ATCC 700926 | can be replaced by any other non-pathogenic E. coli strain |
| FM 4-64FX stain | Thermo Fisher | F34653 | aliquot and store frozen |
| Formaldehyde | Sigma | F8775-4X25ML | |
| LB Broth | Sigma | L3397-1KG | |
| Phosphate buffered saline tablets | Thermo Fisher | 18912014 | |
| Tetracycline | Sigma | 87128-25G | toxic, irritant |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma | E10521-10G | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-100ML | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Sigma | 93595-50ML | |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Thermo Fisher | 16520050 | |
| hemocytometer or cell counter | any | ||
| stereomicroscope | any | ||
| table-top centrifuge | |||
| microwave | |||
| rotator wheel | |||
| heated shaking incubator | |||
| aquatics facilities | |||
| breeding tanks |
References
- Broz, P., Ohlson, M. B., Monack, D. M. Innate immune response to Salmonella Typhimurium, a model enteric pathogen. Gut Microbes. 3 (2), 62-70 (2012).
- Lickwar, C. R., et al. Genomic dissection of conserved transcriptional regulation in intestinal epithelial cells. PLoS Biology. 15 (8), e2002054 (2017).
- Stones, D. H., et al. Zebrafish (Danio rerio) as a Vertebrate Model Host To Study Colonization, Pathogenesis, and Transmission of Foodborne Escherichia coli O157. mSphere. 2 (5), (2017).
- Mitchell, K. C., Breen, P., Britton, S., Neely, M. N., Withey, J. H. Quantifying Vibrio cholerae enterotoxicity in a zebrafish infection model. Applied and Environmental Microbiology. , 00783 (2017).
- Logan, S. L., et al. The Vibrio cholerae type VI secretion system can modulate host intestinal mechanics to displace gut bacterial symbionts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (16), E3779-E3787 (2018).
- Howlader, D. R., et al. Zebrafish as a novel model for non-typhoidal Salmonella pathogenesis, transmission and vaccine efficacy. Vaccine. 34 (42), 5099-5106 (2016).
- Troll, J. V., et al. Microbiota promote secretory cell determination in the intestinal epithelium by modulating host Notch signaling. Development. 145 (4), (2018).
- Wiles, T. J., et al. Host Gut Motility Promotes Competitive Exclusion within a Model Intestinal Microbiota. PLoS Biology. 14 (7), e1002517 (2016).
- Rendueles, O., et al. A new zebrafish model of oro-intestinal pathogen colonization reveals a key role for adhesion in protection by probiotic bacteria. PLoS Pathogens. 8 (7), e1002815 (2012).
- Varas, M., et al. Salmonella Typhimurium induces cloacitis-like symptomsin zebrafish larvae. Microbial Pathogenesis. 107, 317-320 (2017).
- Runft, D. L., et al. Zebrafish as a natural host model for Vibrio cholerae colonization and transmission. Applied and Environmental Microbiology. 80 (5), 1710-1717 (2014).
- Meier, R., Wiessner, W. Infection of algae-free Paramecium bursaria with symbiotic Chlorella sp. Isolated from green paramecia: I. Effect of the incubation period. European Journal of Protistology. 24 (1), 69-74 (1988).
- Miura, T., Moriya, H., Iwai, S. Assessing phagotrophy in the mixotrophic ciliate Paramecium bursaria using GFP-expressing yeast cells. FEMS Microbiology Letters. 364 (12), (2017).
- Watanabe, K., et al. Ciliate Paramecium is a natural reservoir of Legionella pneumophila. Scientific Reports. 6, 24322 (2016).
- Bragg, A. N., Hulpieu, H. A Method of Demonstrating Acidity of Food Vacuoles in Paramecium. Science. 61 (1580), 392 (1925).
- Borla, M. A., Palecek, B., Budick, S., O'Malley, D. M. Prey capture by larval zebrafish: evidence for fine axial motor control. Brain, Behavior and Evolution. 60 (4), 207-229 (2002).
- Patterson, B. W., Abraham, A. O., MacIver, M. A., McLean, D. L. Visually guided gradation of prey capture movements in larval zebrafish. Journal of Experimental Biology. 216 (Pt 16), 3071-3083 (2013).
- Megraud, F. Transmission of Helicobacter pylori: faecal-oral versus oral-oral route. Alimentary Pharmacology & Therapeutics. 9 Suppl 2, 85-91 (1995).
- Spears, K. J., Roe, A. J., Gally, D. L. A comparison of enteropathogenic and enterohaemorrhagic Escherichia coli pathogenesis. FEMS Microbiology Letters. 255 (2), 187-202 (2006).
- Bianco, I. H., Kampff, A. R., Engert, F. Prey capture behavior evoked by simple visual stimuli in larval zebrafish. Frontiers in Systems Neuroscience. 5, 101 (2011).
- Gahtan, E., Tanger, P., Baier, H. Visual prey capture in larval zebrafish is controlled by identified reticulospinal neurons downstream of the tectum. Journal of Neuroscience. 25 (40), 9294-9303 (2005).
- Westphal, R. E., O'Malley, D. M. Fusion of locomotor maneuvers, and improving sensory capabilities, give rise to the flexible homing strikes of juvenile zebrafish. Frontiers in Neural Circuits. 7, 108 (2013).
