Summary
Nous décrivons ici un protocole pour une méthode de chasse générale qui permet l’analyse cinétique de pliage, le transport et la dégradation des protéines qui doivent être suivies dans des cellules vivantes.
Abstract
Marquage radioactif pulse-chase est un outil puissant pour l’étude de la maturation conformationnelle, le transport vers leur localisation cellulaire fonctionnelle et la dégradation des protéines cibles dans des cellules vivantes. En utilisant les radiolabeling temps courts (impulsion) (< 30 min) et étroitement contrôlé fois chase, il est possible d’étiqueter seulement une petite fraction de la piscine de protéines totales et suivre son pliage. Lorsqu’il est combiné avec non-réducteurs/réduire l’électrophorèse sur gel SDS-polyacrylamide (SDS-PAGE) et immunoprécipitation avec des anticorps (conformation spécifique), processus de pliage peut être examiné en détail. Ce système a été utilisé pour analyser le repliement des protéines avec une énorme variation de propriétés telles que des protéines solubles, des protéines transmembranaires simples et multi-pass, fortement protéines N - et O-glycosylées et des protéines avec ou sans une vaste disulfure collage. Méthodes de chasse sont à la base des études cinétiques dans une gamme de fonctionnalités supplémentaires, notamment des co - et des modifications post-traductionnelles oligomérisation et polymérisation, essentiellement en permettant l’analyse d’une protéine de la naissance à la mort. Études de Pulse-chase sur le repliement des protéines sont complémentaires avec d’autres méthodes biochimiques et biophysiques pour l’étude des protéines in vitro en offrant une résolution temporelle accrue et des informations physiologiques. Les méthodes décrites dans cet article sont facilement adaptés pour étudier le repliement des presque toute protéine qui peut être exprimé dans les systèmes de mammifères ou des insectes-cellule.
Introduction
Le repliement des protéines de même relativement simple implique plusieurs différentes enzymes pliants, chaperons moléculaires et modifications covalentes1. Une reconstitution complète de ces processus in vitro est pratiquement impossible, étant donné le grand nombre de différents composants impliqués. Par conséquent, il est hautement souhaitable, pour étudier le repliement in vivo, dans des cellules vivantes des protéines. Techniques de chasse radioactifs s’avérer un outil puissant pour l’étude de la synthèse, pliage, transport et la dégradation des protéines dans leur environnement naturel.
Le métabolisme d’étiquetage de protéines au cours d’une brève impulsion avec 35S-labeled méthionine/cystéine, suivie d’une course-poursuite en l’absence d’un marqueur radioactif, permet un suivi spécifique d’une population de protéines nouvellement synthétisées dans le milieu cellulaire la plus large. Ensuite les protéines cibles peuvent être isolée par immunoprécipitation et analysés par SDS-PAGE ou autres techniques. Pour beaucoup de protéines, leur périple à travers la cellule est marquée par des modifications visibles sur gel SDS-PAGE. Par exemple, le transport des protéines glycosylées du réticulum endoplasmique (ER) à l’appareil de Golgi est souvent accompagné par des modifications de N-glycanes ou l’addition de O-glycanes2,3. Ces modifications provoquent des augmentations importantes dans la masse moléculaire apparente, qui peut être vu par les changements de mobilité en SDS-PAGE. Maturation peut également être marquée par des clivages protéolytiques, tels que le clivage du peptide signal ou l’enlèvement de pro-peptides, entraînant des changements dans la masse moléculaire apparente que l'on peut suivre facilement sur de gel SDS-PAGE4. La radioactivité a des avantages considérables sur des techniques comparables tels que les poursuites de cycloheximide, où elle empêche la synthèse de nouvelles protéines, comme les traitements plus longs sont toxiques pour les cellules et n’excluent pas la majorité des protéines âgées, équilibre de la analyse, que certaines protéines ont des demi-vies de jours. La comparaison des protéines sous les deux non réductrice et conditions réductrices permet l’analyse de formation de la liaison disulfure, une étape importante dans le pliage de nombreuses protéines sécrétoires4,5,6, 7.
Nous décrivons ici une méthode générale d’analyse de repliement des protéines et de transport dans les cellules intactes, en utilisant une approche radioactifs pulse-chase. Alors que nous avons visant à assurer l’application de la méthode détaillée que possible, le protocole a un potentiel presque illimité pour adaptabilité et permettra l’optimisation pour l’étude des protéines spécifiques de chaque lecteur.
Deux protocoles alternatifs pulse-chase, un pour les cellules adhérentes (étape 1.1 du protocole présenté ici) et l’autre pour les cellules en suspension (étape 1.2 du protocole présenté ici) sont fournis. Les conditions prévues ici suffisent visualiser une protéine exprimée avec moyen - à haut-niveau d’expression. Si le lecteur ne fonctionne pas avec les protéines mal exprimées ou diverses conditions après le traitement, comme plusieurs d’immunoprécipitation, il est nécessaire d’augmenter la taille du plat ou le nombre de cellules de façon appropriée.
Pour chase de suspension de pouls, les échantillons de chase prélevés à chaque instant sont tirées d’un seul tube de cellules. Les étapes de lavage après l’impulsion sont omises ; au lieu de cela, plus l’incorporation de 35S est empêchée par dilution avec un excès élevé de non étiqueté méthionine et la cystéine.
Les protocoles présentés utilisent radioactifs 35S-labeled cystéine et méthionine pour suivre le processus de repliement des protéines cellulaires. Toutes les opérations avec des réactifs radioactifs doivent être effectuées à l’aide de mesures de protection appropriées afin de minimiser toute exposition de l’opérateur et l’environnement aux rayonnements radioactifs et être effectuée dans un laboratoire désigné. Comme le pulse-chase étiquetage technique est relativement inefficace en temps de pulsation courte (< 15 min), moins de 1 % du montant de départ de la radioactivité est incorporé dans les protéines nouvellement synthétisées. Après l’enrichissement de la protéine par immunoprécipitation de la cible, l’échantillon pour SDS-PAGE contient moins de 0,05 % du montant de départ de la radioactivité.
Bien que le 35S méthionine et la cystéine étiquetage mix est stabilisé, une décomposition, produisant des composés radioactifs volatils, se produira. Pour protéger le chercheur et l’appareil, certaines précautions doivent être prises. Le chercheur doit toujours obéir aux règles de sécurité de rayonnement local et peut porter un charbon masque, outre une blouse et des gants (doubles) de soins infirmiers. Flacons stocks avec 35S méthionine et la cystéine devraient toujours être ouvert dans une hotte aspirante ou sous un point d’aspiration locale. Taches de contamination connue de laboratoire sont centrifugeuses, pipettes, bains-marie, incubateurs et dispositifs trembleurs. La contamination de ces zones est réduite à l’aide de pointes de pipette avec un filtre à charbon actif, positif-seal microtubes à centrifuger (voir Table des matières), éponges aquarium charbon de bois dans l’eau bains, charbon filtre papiers collés dans les plats de chasse, renfort en charbon de bois dans le système d’aspiration et le placement des plats contenant des grains de charbon de bois dans des incubateurs ou des récipients de stockage.
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Protocol
Tous les réactifs radioactifs et les procédures ont été traitées conformément aux règlements et les règles locales de rayonnement de l’Université d’Utrecht.
1. pulse Chase
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Pulse-Chase pour les cellules adhérentes
NOTE : Les volumes donnés ici sont basées sur les boîtes de culture cellulaire 60 mm. Pour 35 mm ou 100 mm plats, multiplier les volumes de 1/2 ou 2, respectivement. Ce protocole utilise un temps d’impulsion des temps 10 min et chase de 0, 15, 30, 60, 120 et 240 min. Ceux-ci peuvent varier selon les protéines spécifiques à l’étude (voir ci-dessous).- Semences de cellules adhérentes (p. ex., HEK 293, HeLa, CHO) dans six boîtes de culture cellulaire de 60 mm afin qu’ils soient subconfluent (80-90 %) le jour de la chasse de l’impulsion. Utilisez au moins un plat par point dans le temps et/ou condition.
- Si nécessaire, transfecter les cellules avec des réactifs disponibles dans le commerce de transfection selon les instructions du fabricant ; ou bien, virally transduce8 cellules 1 jour avant le pulse-chase expérimentent la construction appropriée pour l’expression.
- Laver la vaisselle avec 2 mL de tampon de lavage (Hank équilibré de solution saline [HBSS]), ajouter 2 mL de milieu (milieu normal de culture dépourvu de méthionine et de cystéine et de sérum de veau fœtal [BF], comme un milieu minimal essentiel [MEM] sans la méthionine et la cystéine de la famine mais avec 10 mM HEPES, pH 7,4) et placer les capsules dans une étuve à 37 ° C humidifié avec 5 % de CO2 pendant 15 min.
- Placer les boîtes dans les paniers dans un bain d’eau préchauffée 37 ° C, afin qu’elles soient en contact avec l’eau mais ne pas flotter. Démarrer un minuteur.
- À 40 s, aspirer le milieu de la famine, aspirer 600 µL de solution d’impulsion (médias de famine + 55 µCi/35 mm plat label, voir la note qui précède l’étape 1.1.1) dans la pipette et ajoutez-la délicatement au centre du plat à exactement 1 min. répéter cette étape à intervalles de 1 min pour t plats reste he. Commencez avec l’échantillon de chasse plus longue pour gagner du temps lors de votre expérience.
Remarque : Lors de la manipulation de matières radioactives, il est essentiel de suivre les précautions d’usage et règlements pour éviter toute exposition accidentelle et/ou de contamination locale. - À 11 min exactement et pour tous les plats suivants, à l’exception de l’échantillon de chase 0 min, ajouter 2 mL de milieu de chasse directement sur le plat, il aspirer et encore une fois, ajouter 2 mL de milieu de chase. Répétez cette opération à des intervalles de 1 min pour les autres plats. Placer toutes les boîtes dans un incubateur à 37 ° C.
- À exactement 16 minutes, ajouter 2 mL de milieu de chase (milieu de culture normal + 10 mM HEPES [pH 7,4], 5 mM cystéine et méthionine de 5 mM) directement dans le plat d’échantillon de 0 min sur le milieu de l’impulsion pour arrêter l’étiquetage ; Ensuite, aspirez immédiatement, placer la capsule à une plaque d’aluminium refroidi et ajouter 2 mL de tampon d’arrêt glacee (HBSS + 20 mM N- éthylmaléimide [NEM]).
NOTE : Ceci est l’échantillon de chase 0 min. Pour cet exemple, passez directement à l’étape 1.1.9. - Transférer chaque plat de chasse à l’eau du bain 2 min avant chaque fois que chase (p. ex., 24 min pour une poursuite de 15 min) et, au moment exact chase (p. ex., 26 min pour une poursuite de 15 min), aspirer les médias chase (ou les transférer dans un tube de microcentrifuge si pr la suite la sécrétion d’otein) et placer la capsule à une plaque d’aluminium refroidi. Ajouter 2 mL de tampon d’arrêt glacée.
- Incuber tous les plats sur la glace dans le tampon de butée pour ≥ 5 min ; Ensuite, aspirer la solution de l’arrêt et le laver avec 2 mL de solution d’arrêt glacée. Aspirer le lavage et la lyse des plats avec 600 µL de tampon de lyse (solution saline tamponnée au phosphate [PBS] + détergent non dénaturant [voir la Table des matières] + inhibiteurs de la protéase + 20 mM NEM). Utilisez un grattoir de cellules pour s’assurer que les plats sont lysées quantitativement.
- Transférer le lysat dans un tube de microtubes de 1,5 mL et centrifuger pendant 10 min à 15 000-20 000 x g et 4 ° C pour granuler les noyaux.
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Pulse-Chase pour cellules en Suspension
NOTE : Afin d’assurer un étiquetage efficace, les cellules doivent être pulsés à une concentration de 3 x 106 à 5 x 106 cellules/mL, et chase volumes devraient être 4 x le volume de l’impulsion. Dans l’exemple suivant, nous avons pulsé 5 x 106 cellules dans un volume de 1 mL pour 10 min, à céder cinq courir après le temps des points (0, 15, 30, 60 et 120 min) de 1 mL, contenant 1 x 106 cellules par point dans le temps. Toutes les solutions sont les mêmes qu’à l’article 1.1.- Culture les cellules en suspension (p. ex., 3 t 3, Jurkat) selon un protocole déjà publiées9 afin qu’il y a un nombre suffisant de cellules au moment de l’expérience, au moins 1 x 106 cellules / temps point et/ou conditionnent.
- Si nécessaire, transfecter de cellules avec des réactifs disponibles dans le commerce de transfection selon les instructions du fabricant, ou transduce virally8 cellules 1 jour avant le pulse-chase expérimentent la construction appropriée pour l’expression.
- 5 x 106 cellules / condition dans un tube de 50 mL pour 5 min à 250 g à la température ambiante de granule, lavez-les 1 x 5 ml des médias de la famine, pellets eux encore une fois et les remettre en suspension dans 1 mL de médias de famine.
- Transférer les cellules dans un bain-marie à 37 ° C et les incuber pendant 10-25 min. agiter les tubes chaque 10-15 min pour empêcher les cellules de se déposer au fond.
- Démarrer la minuterie. À exactement 1 min, ajouter 275 µCi (55 µCi/1 x 106 cellules) du label non dilué directement dans le tube contenant des cellules et agiter pour mélanger.
Remarque : Lors de la manipulation de matières radioactives, il est essentiel de suivre les précautions d’usage et règlements pour éviter toute exposition accidentelle et/ou de contamination locale. - À 11 min exactement, arrêter l’étiquetage par l’ajout de 4 mL de médias de chase. Mélanger l’échantillon et immédiatement transférer 1 mL dans un tube de 15 mL sur la glace, contenant 9 mL de solution d’arrêt glacée.
NOTE : Ceci est l’échantillon de chase 0 min. - Répétez ces étapes pour chaque point de temps successifs. Une fois que tous les points dans le temps sont collectés, granules des cellules pendant 5 min à 250 x g à 4 ° C. Aspirer le médium (ou transférer dans un nouveau tube de 15 mL si après la sécrétion de protéines). Laver les cellules avec 5 mL de solution d’arrêt et les granules des cellules pendant 5 min à 250 x g à 4 ° C.
- Aspirer la solution de l’arrêt, totalement lyser les cellules avec 300 µL de tampon de lyse glacée et les incuber pendant 20 min sur la glace pour s’assurer une lyse complète. Transférer le lysat dans un tube de microtubes de 1,5 mL et la centrifugation pendant 10 min à 15 000-20 000 x g à 4 ° C pour granuler les noyaux.
2. immunoprécipitation
- Combiner des anticorps (voir la discussion) et 50 µL de perles immunoprécipitation (par exemple, la protéine A-sépharose) (suspension à 10 % [v/v] dans le tampon de lyse + 0,25 % d’albumine sérique bovine [BSA]) dans une micro-centrifugeuse tube et les incuber à 4 ° C pendant environ 30 min dans un shaker.
- Les perles pendant 1 min à 12 000 x g à la température ambiante de granule et aspirer le surnageant. Ajouter 200 µL de lysat dans le mélange d’anticorps-perle et incuber à 4 ° C dans un agitateur pendant 1 h ou plus-chef-chef si l’immunoprécipitation nécessite > 1 h.
- Pellet les perles pendant 1 min à 12 000 x g à la température ambiante. Aspirer le surnageant et ajouter 1 mL de tampon de lavage d’immunoprécipitation. Placer l’échantillon dans un shaker à température ambiante pendant 5 min.
- Les perles de granule comme indiqué au point 2.3 et répéter le lavage 1 x. Ensuite, aspirer le surnageant et remettre en suspension les perles dans 20 µL de tampon de TE, pH 6,8 (10 mM Tris-HCl, EDTA 1 mM). Vortex de l’échantillon.
- Ajouter 20 µL de 2 x tampon échantillon sans l’agent réducteur, vortex, chauffez-la à nouveau pendant 5 min à 95 ° C et vortex.
Remarque : si une seule préparation d’échantillons réductrices, 2 µL de 500 mM TNT doivent être ajoutés à ce stade. Ensuite, passez à l’étape 2.7. - Les perles de granule comme indiqué au point 2.3. Transférer 19 µL du liquide surnageant étudiée dans un tube de microcentrifuge frais contenant 1 µL de 500 mM DTT, centrifuger l’échantillon et vortex avant il chauffer pendant 5 min à 95 ° C.
- Tournez en bas de l’échantillon pendant 1 min à 12 000 x g; Il s’agit de l’échantillon réduit. Refroidir à température ambiante et ajouter µL 1,1 mètre NEM à la fois la réduction et l’échantillon non. Vortex et la centrifuger les échantillons.
3. SDS-PAGE
- Tout d’abord, déterminer le SDS-PAGE resolving gel pourcentage approprié pour la protéine d’intérêt. Par exemple, les gp120 du VIH-1, quand déglycosylée, tourne à ~ 60 kDa et est analysé dans un gel de 7,5 %.
- Préparer un mélange de gel de résoudre sans TEMED selon les instructions du fabricant (x % d’acrylamide, 375 mM Tris-HCl [pH 8,8,] SDS 0,1 % [p/v] et le persulfate d’ammonium 0,05 % [APS] [w/v]) et dégazer sous vide pour > 15 min. Alors que le mélange de gel est dégazage, nettoyez les plaques de verre de gel avec l’éthanol à 70 % et tissus pelucheux et placez-les dans un appareil de coulage.
- Ajouter TEMED au mélange gel résolution (à une concentration finale de 0,005 % [v/v]), bien mélanger et pipette entre les plaques de verre, laissant ~1.5 cm d’espace pour le gel de concentration. Soigneusement le gel avec désionisée H2O ou isopropanol de superposition et laisser polymériser.
- Une fois le gel résolution a polymérisé, préparer le mélange de gel d’empilement (4 % d’acrylamide, 125 mM Tris-HCl [pH 6,8], SDS 0,1 % [p/v] et 0,025 % APS [w/v]).
- Vider la partie supérieure du gel résolution avec désionisée H2O et, ensuite, enlever toute l’eau.
Remarque : Utilisez du papier filtre pour éliminer les dernières gouttes. - Ajouter TEMED au gerbage mélange gel (0,005 % [v/v]), mélanger soigneusement et superposer le gel résolution avec gel de concentration et insérer un peigne 15 puits. Une fois que le gel de concentration a polymérisé, transférer dans une chambre en cours d’exécution et remplissez les compartiments supérieurs et inférieurs avec tampon (25 mM Tris-HCl, glycine 192 mM [pH 8,3] et 0,1 % SDS [w/v]).
- Charger de 10 µL de l’échantillon par voie dans un minigel 15 voies. Éviter de charger les échantillons dans la première et la dernière voie sur le gel et charger le tampon échantillon non réductrices dans toutes les voies vides afin d’empêcher le sourire des bandes. Exécuter les gels à température constante un mA/gel 25 jusqu'à ce que l’avant de la teinture se trouve au bas du gel.
- Enlevez les gels les plaques de verre, détachant les gels avec solution de coloration protéine (acide acétique à 10 % et 30 % de méthanol en H2O + 0,25 % brillant bleu R250 [w/v]) pendant 5 min en agitant et ensuite, décolorer pendant 30 min avec solution (taches de décoloration solution sans R250 bleu brillant).
- Organiser les gels face vers le bas sur un plastique enveloppent et, ensuite, placent le papier pour chromatographie 0,4 mm au-dessus d’eux. Placer le gel "sandwich" chromatographie sur papier-côté vers le bas sur un gel sèche. Suivant les instructions du fabricant, sécher les gels pendant 2 h à 80 ° C.
- Transférer les gels séchées dans une cassette et tu les couvriras d’écran de film ou de phosphore autoradiographie. Si l’utilisation du film autoradiographie, cette étape doit être exécutée dans une pièce sombre.
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Representative Results
Le repliement et la sécrétion de la gp120 du VIH-1 d’un chase impulsion adhérentes est illustré à la Figure 2. Le gel non réductrice (NR de cellules dans la figure) montre le repliement oxydatif de gp120. Immédiatement après la pulsion d’étiquetage de gp120 5 min (0 min chase) apparaît comme une bande diffuse plus élevée dans le gel, et à mesure que progresse la chase, la bande migre vers le bas le gel grâce à encore plus diffus pliage intermédiaires (IT) jusqu'à ce qu’il s’accumule dans la bande étroite (NT) qui représente gp120 nativement plié. Cela se produit lorsque la formation de ponts disulfures augmente la compacité de la protéine, amenant à migrer plus vite que la protéine entièrement réduite. Sur le gel réducteur (cellules R dans la figure), les ponts disulfures sur toutes les formes ont été réduites telles que, en tout temps de chase, elles n’affectent pas la mobilité. Cela permet l’analyse d’autres modifications. Le passage au fil du temps du Ru au Rc représente le clivage peptide signal post-traductionnelle de gp120 : la mobilité augmente en raison de la perte du peptide signal, ce qui augmente au cours de la chasse comme protéines plus atteignent le pli natif et perdent leur peptide signal. Sur le gel non réductrice et réducteur, le signal commence à décroître de ~ 1 h à partir en raison de la sécrétion de gp120. Ceci peut être surveillé par l’analyse des médias (support sur la figure). Une comparaison des gels non réductrices et réducteurs dévoile les changements de liaison disulfure et suppression du peptide signal. Cela a été possible seulement parce qu’une autre modification, N-lié glycosylation et la modification de glycan, ont été retirées de la gp120 (et l’analyse) par digestion avec l’endoglycosidase H juste avant SDS-PAGE.
Le trafic de la chaîne lourde d’immunoglobuline M (IgM) d’une poursuite d’impulsion de suspension de µ est illustré Figure 3. Un changement au fil du temps de HCER à HCGolgi représente le trafic de la chaîne de µ de l’ER de l’appareil de Golgi, qui précède la sécrétion de la cellule. Ce changement de masse moléculaire est causé par la modification des N-glycanes dans l’appareil de Golgi.
Figure 1 : Diagramme schématique du protocole pour pulse chase, immunoprécipitation et SDS-PAGE. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Pliantes et sécrétion de gp120 du VIH-1, déterminé par chase impulsion adhérentes. Les plats sont 60 mm des cellules HeLa exprimant la gp120 du VIH-1 étaient impulsion marqué pendant 10 min et chassé de l’indiqués fois. Après l’immunoprécipitation de la gp120, les échantillons ont été déglycosylée et analysées à l’aide d’un gel SDS-PAGE de 7,5 %. Il = pliantes intermédiaires ; NT = gp120 natif ; Ru = gp120 de signal-peptide-clivées réduite ; RC = réduit signal peptide-clivée gp120 ; NR : = non réductrices ; R = réduction. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Traite de la chaîne lourde d’IgM, déterminé par chase impulsion suspension. 5 x 106 I.29 µ+ B cellules étaient impulsion marqué pendant 5 min et chassé de l’indiqués fois. Après immunoprécipitation, les échantillons ont été analysés à l’aide d’un gel SDS-PAGE de 10 %. HC = chaîne lourde d’immunoglobuline µ ; LC = chaîne légère d’immunoglobuline. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Les méthodes Pulse-chase ont été essentiels pour développer la compréhension des scientifiques de protéine pliage dans les cellules intactes. Alors que nous avons tenté de fournir une méthode qui est aussi générale que possible, cette approche a le potentiel pour des variations presque infinies étudier les divers processus qui se produisent pendant le pliage, le transport et la vie des protéines à l’intérieur de la cellule.
Lors d’une poursuite de l’impulsion à l’aide de cellules adhérentes dans les plats, il est essentiel de traiter chaque plat le même autant que possible, comme un plat séparé est utilisé pour chaque point dans le temps et/ou la condition dans une expérience. Surtout pour les courtes durées d’impulsion et chase (< 5 min), il est essentiel de maintenir un contrôle serré sur les temps d’impulsion et chase (avec une minuterie numérique). Poursuites d’impulsion avec des cellules en suspension peuvent contribuer à réduire cette variabilité que tous les échantillons sont prélevés dans un seul tube. Comme certains types de cellules adhèrent moins bien aux plats de culture que d’autres, il faut pour s’assurer que les cellules ne sont pas lavés pendant les divers changements de moyenne. Cela peut être surmonté en utilisant ces cellules en suspension ou en enduisant les plats avec la poly-L lysine ou de la gélatine, par exemple, qu’elle respecte les cellules pour les récipients de culture. Pour mesurer la reproductibilité du marquage entre les plats, un échantillon de lysat devrait être examiné par SDS-PAGE à vérifier tous les échantillons identiques modèle d’étiquetage et de la protéine totale. Par ailleurs, scintillation liquide de lysats établira la compte total par minute (cpm) constituée mais ne fournira pas de renseignements sur la population de protéines marquée.
Si une protéine cible étiquettes mal, le signal est augmenté en augmentant le nombre de cellules (ou plats), plutôt qu’en augmentant la quantité d’étiquette. Allonger le temps de pulsation est une option lorsque la cinétique du processus étudié permettra cela. Le temps d’impulsion idéale varie avec chaque cible en raison de facteurs comme le niveau d’expression, le taux de transcription, le nombre de méthionine/cystéines et le taux de pliage de la protéine. Par conséquent, expérimentation doit être entreprise pour déterminer le meilleur équilibre entre les facteurs susmentionnés dans chaque expérience tout en gardant le but expérimental à l’esprit. Si intermédiaires durant le plissement sont étudiées, par exemple, il est souhaitable de l’étiquette pour que courte d’impulsion un temps possible d’avoir le matériel de départ aussi proche d’un état non plié que possible, tout en équilibrant les niveaux d’expression. Alternativement, si le transport ou la dégradation d’une protéine est la cible de l’étude, temps d’impulsion peuvent être rallongés pour fournir les plus hauts niveaux de signal possible sans compromettre les informations cinétiques. En général, temps d’impulsion peuvent varier de 2-15 min lors de l’utilisation de ce protocole sans modification. L’expérimentation précédente5 a montré un décalage d’environ 10 s après le pouls avant l’incorporation de la radioactivité dans la piscine de protéine totale ; C’est important de garder à l’esprit lors de la dérivation des informations cinétiques des expériences de chasse. Pour faire court impulsion times (< 2 min), de garder tous les plats sur le bain d’eau pendant la durée de l’impulsion entière. Si étendu fois pouls (> 1 h) sont utilisés, il est conseillé d’augmenter le volume de l’impulsion de 1,5 fois et placer les plats sur un rocker dans un incubateur à 37 ° C durant l’impulsion pour éviter les plats ne se dessèchent pas. Bien qu’il existent des solutions d’étiquetage contenant individuel 35S-méthionine/cystéine ou un mélange, le mélange est préféré, même lorsque les protéines contenant uniquement la méthionine ou la cystéine sont étant étiquetés comme les deux sont nécessaires pour maintenir la synthèse des protéines générales dans la cellule. Si les conditions expérimentales nécessitent l’étiquetage spécifique méthionine/cystéine, les niveaux de la méthionine/cystéine non radioactif durant l’impulsion doivent être ajustés en conséquence.
Chase fois (et le nombre de points dans le temps) sont déterminés de manière similaire. Un bon point de départ est de mettre la première fois de chase (après la chasse 0 min) comme égale à la durée de l’impulsion et, ensuite, doubler la durée pour chaque point de temps successifs (p. ex., 5, 10, 20 et 40 min). Cependant, cela doit être optimisé pour chaque protéine spécifique et de la question.
Pour empêcher l’activation des réactions au stress par la famine (ce qui peut affecter la synthèse des protéines et pliage), idéalement, certains sans étiquette méthionine et la cystéine s’ajouteront aux solutions famine et radiolabeling ; La quantité dépendra de la lignée cellulaire, le temps d’étiquetage, la quantité de l’élément de l’utilisé et volumes des médias et aura besoin de tests. Un bon point de départ est de 1 % du montant de cystéine et méthionine présent dans le milieu de culture cellulaire, qui peut être augmenté avec l’augmentation des temps d’impulsion. Les périodes de famine, que ce soit avec ou sans les acides aminés non étiquetées, devrait être maintenu dans l’ordre de 15-30 min pour garantir l’incorporation étiquette adéquate et éviter l’activation des réactions au stress. Lorsque vous utilisez une impulsion prolongée (≥ 1 h), la famine n’est pas nécessaire.
Le tampon de lyse décrite ici sera adapté pour la plupart des cas, mais en principe, n’importe quel système de tampon, HEPES, Tris ou MES, fonctionnera. La concentration du détergent pour lyser les cellules dépendra du nombre de cellules et de volume de détergent. La concentration doit toujours être au-dessus de la concentration micellaire critique (CMC) et la quantité de détergent suffit à lyser les cellules. Une règle empirique est que 200 µL de 0,5 % de détergent non dénaturantes (voir Table des matières) est suffisante pour la lyse de l’équivalent de la cellule d’environ 1 mg de protéine (~ 1 x 106 cellules). La concentration en sel et détergents peuvent également varier selon l’application, mais en général, les conditions qui cassent ouvert noyaux (sel élevé, > SDS 0,1 %) doit être évitée car la présence d’ADN libre n’interférera avec l’immunoprécipitation. Si cela ne peut être évitée, par exemple, lorsque des lysats de cellules complètes incluant des noyaux ou des granulés de protéines doivent être analysées, l’ADN peut être cisaillé en passant les cellules par une aiguille de petit calibre avant l’immunoprécipitation. C’est préférable à sonication afin d’empêcher la formation de mousse excessive et la production d’aérosols radioactifs.
Pour l’immunoprécipitation, tant la quantité optimale d’anticorps et le meilleur tampon de lavage pour chaque combinaison anticorps-antigène doivent être testés à fond pour parvenir à un équilibre entre le signal désiré de l’antigène et l’arrière-plan. Anticorps devraient toujours être présents en excédent par rapport aux antigènes pour assurer l’immunoprécipitation quantitative ; un bon point de départ est de 1 µg d’anticorps par immunoprécipitation d’un plat de 35 mm/1 x 106 cellules. L’arrière-plan peut être diminuée en augmentant le détergent ou concentrations salines. En particulier, l’ajout de ≤ 0,1 % SDS peut contribuer à réduire considérablement l’arrière-plan mais peut également perturber les interactions anticorps-antigène. Pour contrôler la spécificité des anticorps au cours de l’immunoprécipitation, identiques cellules dépourvues de la protéine cible doivent être utilisés lorsqu’il est disponible. Si ce n’est pas simple, par exemple lorsque des protéines endogènes sont analysés, la surexpression ou l’appauvrissement de la couche de l’antigène fonctionnera. À Séra pour le fond (et spécificité), soit preimmune (si possible) ou isotype contrôles devraient être utilisés. Pour contrôler des antigènes liant directement aux perles d’immunoprécipitation, perles sans anticorps devraient également être utilisés. Les conditions prévues ici considérer comme point de départ que chaque paire d’anticorps-antigène exigera une optimisation de tampon de lavage et des conditions de lavage. En cas de trop d’arrière-plan, n’augmentent pas le nombre de lavages, mais plutôt le temps de lavage et/ou de la composition de la mémoire tampon de lavage. Si les interactions particulièrement sensibles comme dans coimmunoprecipitations doivent être traitées, il peut être préférable de réaliser toutes les étapes de lavage à 4 ° C, à l’aide de tampons glacées.
Un avantage des cellules adhérentes sur les cellules en suspension est que le médicament traitements peuvent être effectuées à pratiquement n’importe quel moment au cours de la poursuite de l’impulsion. Si utilisé avec inhibiteurs de chaperon, par exemple, il est possible de différencier ses effets sur les co - et post-traductionnelles phases d’un processus de pliage. Ceci peut être étendu en adaptant les tampons de lavage de lyse et immunoprécipitation (évoquées plus haut) pour permettre à la co-immunoprécipitation des complexes protéine-chaperon pendant pliant10,11,12.
Le traitement postlysis des échantillons s’élargira la portée des questions qui peuvent être abordées. La digestion de la protéase limitée de protéines cibles avant d’immunoprécipitation fournira des précisions conformationnelles et a été utilisée avec succès pour surveiller le repliement des protéines, en particulier qui ne possèdent pas de liaisons disulfure13, 14. Agrégation des protéines et la formation de complexes peuvent être surveillés par centrifugation en gradient de densité de sucrose avant immunoprécipitation15,16.
Pour profiter pleinement des poursuites de l’impulsion, la disponibilité des réactifs de qualité est nécessaire pour l’immunoprécipitation. Lors de l’examen pliants intermédiaires, il est essentiel d’avoir des anticorps qui sont capables de tirer vers le bas de toutes les formes de la protéine pour l’analyse. Si des anticorps spécifiques à la protéine cible ne sont pas disponibles, cela peut être substitué en utilisant les balises de l’affinité. Toutefois, cela limite sérieusement l’utilité des méthodes postlysis, telles que la protéolyse limitée, pour sonder directement la conformation de la protéine, comme seulement les fragments marqués peuvent être récupérés.
La sensibilité des poursuites de l’impulsion est limitée par le nombre de résidus méthionine et la cystéine dans la protéine en question. Les protéines avec un faible nombre de résidus méthionine/cystéine, couplées à un niveau faible expression sont indétectables dans les expériences de chasse. Lorsque vous effectuez des modifications postlysis, comme une protéolyse limitée, seulement des fragments contenant méthionine/cystéine puissent être détectés.
Pour conclure, donné le détail cinétique qui pulse chases fournissent, ils sont complémentaires à beaucoup d’autres techniques et outils utilisés pour étudier la biologie cellulaire et moléculaire au niveau de l’état d’équilibre. À ce titre, ils continuent d’être une composante indispensable dans la boîte à outils de la biologiste moléculaire.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs remercient tous les membres du laboratoire Braakman, passés et présent, pour leurs discussions fructueuses et aident à développer les méthodes présentées dans cet article. Ce projet a été financé par le Conseil européen de la recherche au titre septième Programme-cadre (7e PC/2007-2013) N ° de l’Union européenne 235649 tant l’organisation pays-bas de la recherche scientifique (NWO) en vertu de l’ECHO-programme N ° 711.012.008.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL safeseal microcentrifuge tubes | Sarstedt | 72.706.400 | |
| Acetic Acid | Sigma | A6283 | glacial acetic acid |
| BAS Storage phosphor screen 20x25 cm | GE Life Sciences | 28956475 | |
| Bromophenol Blue | Sigma | B8026 | Molecular biology grade |
| Carestream Biomax MR films | Kodak | Z350370-50EA | |
| Cell-culture media | Various | N/A | Normal cell culture media for specific cell-lines used |
| Cell-culture media, no methionine/cysteine | Various | N/A | Same media formulation as normal culture media e.g DMEM/MEM/RPMI, lacking methionine and cysteine |
| Charcoal filter paper | Whatman | 1872047 | |
| Charcoal filtered pipette tips | Molecular bioproducts | 5069B | |
| Charcoal vacu-guard | Whatman | 67221001 | |
| Coomassie Brilliant Blue R250 | Sigma | 112,553 | for electrophoresis |
| Cysteine | Sigma | C7352 | Molecular biology grade, Make 500 mM stock, store at -20 |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 10197777001 | Molecular biology grade |
| EasyTag Express35S Protein Labeling Mix | Perkin Elmer | NEG772014MC | Other size batches of label are available depending on useage |
| EDTA | Sigma | E1644 | Molecular biology grade |
| Gel-drying equipment | Various | N/A | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | Molecular biology grade |
| Grade 3 chromatography paper | GE Life Sciences | 3003-917 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 24020117 | |
| Kimwipes delicate task wipes | VWR | 21905-026 | |
| MES | Sigma | M3671 | Molecular biology grade |
| Methanol | Sigma | MX0490 | |
| Methionine | Sigma | M5308 | Molecular biology grade, Make 250 mM stock, store at -20 |
| Minigel casting/running equipment | Various | N/A | |
| NaCl | Sigma | S7653 | Molecular biology grade |
| N-ethylmaleimide | Sigma | E3876 | Molecular biology grade, Make 1M stock in 100% ethanol, store at -20 |
| PBS | Sigma | P5368 | Molecular biology grade |
| Protein-A Sepharose fastflow beads | GE health-care | 17-5280-04 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma | L3771 | Molecular biology grade |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Molecular biology grade |
| Trizma base (Tris) | Sigma | T6066 | Molecular biology grade |
| Typhoon IP Biomolecular imager | Amersham | 29187194 | |
| Unwire Test Tube Rack 20 mm for waterbath | Nalgene | 5970-0320PK |
References
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