Summary
여기는 접는, 전송 및 라이브 셀에 따라 단백질의 저하의 운동 분석을 허용 하는 일반적인 펄스-체이스 메서드에 대 한 프로토콜에 설명 합니다.
Abstract
방사성 펄스-체이스 라벨 구조적 성숙, 그들의 기능 세포 위치와 라이브 셀에 대상 단백질의 저하를 전송 위한 강력한 도구입니다. 짧은 (펄스) radiolabeling 시간을 사용 하 여 (< 30 분) 체이스 시간을 엄격 하 게 제어 하 고 총 단백질 풀의 극히 일부에 고의 접는 따라 수. Nonreducing/감소 SDS polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (SDS 페이지) 및 immunoprecipitation (나 란 특정) 항 체와 결합 될 때 프로세스를 접는 훌륭한 세부 사항에서 시험 될 수 있다. 이 시스템 단백질 용 해 단백질, 단일 및 멀티 패스 막 횡단 단백질, 무 겁 게 N 및 O 당화 단백질, 속성에 거 대 한 변화 및 광범위 한 이황화 없이 단백질의 폴딩 분석 하는 데 사용 되었습니다. 결합. 펄스 추적 방법 등 공동 및 posttranslational 수정, oligomerization, 중 합, 근본적으로 죽음에 출생에서 단백질의 분석을 수 있도록 추가 기능의 범위에 활동적인 연구의 기초입니다. 단백질 폴딩에 펄스 체이스 학문은 증가 시간적 해상도 생리 적인 정보를 제공 하 여 단백질에서 생체 외에서 공부에 대 한 생화학 및 생물 다른 방법으로 보완. 이 문서에서 설명 된 대로 메서드는 포유류 나 곤충 세포 시스템에서 표현할 수 있는 거의 모든 단백질 폴딩 공부를 쉽게 적응 됩니다.
Introduction
심지어 상대적으로 간단한 단백질의 폴딩 포함 많은 다른 접는 효소, 분자 보호자, 화학식 수정1. 이러한 프로세스에서 생체 외에서 의 완전 한 재구성 실질적으로 불가능 하다, 관련 된 다른 구성 요소의 광대 한 번호. 그것은 매우 바람직한, 그러므로, 라이브 셀에서 vivo에서, 접히는 단백질을 공부 하입니다. 방사성 펄스-체이스 기술을 증명 합성, 접는, 전송, 그리고 그들의 자연적인 환경에 있는 단백질의 공부를 위한 강력한 도구.
대사 35S 표시 된 메티오닌 시스테인과 짧은 펄스 동안 단백질의 라벨, 방사성 라벨의 부재에 체이스 뒤, 넓은 셀룰러 환경에서 새로 합성된 단백질의 인구의 특정 추적을 수 있습니다. 그리고 대상 단백질 격리 를 통해 immunoprecipitation 수 분석을 통해 SDS 페이지 또는 다른 기술. 많은 단백질에 대 한 셀을 통해 그들의 여행은 SDS 페이지 젤에 표시 되는 수정에 의해 표시 됩니다. 예를 들어 골 복잡 한 당화 단백질 바인딩과 그물 (응급실)에서 교통은 종종 함께 N 연결 된 glycans의 수정 또는 O 연결 glycans2,3의 추가 합니다. 이러한 수정 이동성 변화 SDS 페이지에 의해 볼 수 있는 명백한 분자 질량에 있는 큰 증가 일으킬. 성숙 신호 펩 티 드 분열 등 프로-펩 티 드, SDS 페이지 젤4에 쉽게 따라 할 수 있는 명백한 분자 질량에 있는 변화 결과로 제거 분해 분열에 의해 표시할 수 있습니다. 방사능 어디 소설 단백질 합성 방지, 긴 치료 세포에 독성 그리고 더 오래 된, 안정 상태에서 단백질의 대부분을 제외 하지 마십시오 cycloheximide 추격전 같은 유사한 기술에 비해 상당한 장점을 있는 분석, 일부 단백질 일의 반감기를가지고. 모두 nonreducing에서 단백질의 비교 조건 감소 고 이황화 결합 형성, 많은 분 비 단백질4,,56, 의 폴딩에 중요 한 단계 분석 7.
여기 우리가 방사성 펄스-체이스 방식을 사용 하 여 단백질 폴딩과 그대로 셀에 수송의 분석에 대 한 일반적인 방법을 설명 합니다. 우리로 방법을 제공 하는 목적으로 하는 동안, 가능한 상세한 프로토콜 적응성에 대 한 거의 무한 한 잠재력이 고 각 독자의 특정 단백질 공부를 최적화 하면.
두 개의 다른 펄스-체이스 프로토콜, 부착 셀 (여기에 제시 된 프로토콜의 단계 1.1)와 현 탁 액 셀 (여기에 제시 된 프로토콜의 단계 1.2) 제공 됩니다. 조건을 제공 여기 중간-높은 식 수준으로 표현 되는 단백질을 시각화 하기에 충분. 독자가 제대로 표현한 단백질 또는 여러 immunoprecipitations 등의 다양 한 posttreatment 조건으로 작동 하는 경우 그것이 접시 크기를 늘리거나 셀 번호를 적절 하 게 필요 합니다.
서 스 펜 션 펄스 체이스, 체이스 샘플 각 시간 지점에서 찍은 모두에서 가져옵니다 셀의 단일 튜브. 세척 단계 후 펄스는 생략; 대신, 추가 35S의 레이블이 메티오닌과 시스테인의 높은 과잉을 가진 희석에 의해 방지 된다.
제시 프로토콜 세포질 단백질 접히는 과정에 따라 방사성 35S 표시 된 시스테인 그리고 메티오닌을 사용 합니다. 연산자와 환경 방사능 방사선에의 한 노출을 최소화 하 여 지정 된 실험실에서 수행 될 적절 한 보호 조치를 사용 하 여 방사성 시 약으로 모든 작업을 수행 되어야 합니다. 펄스-체이스로 기술 라벨은 상대적으로 효율적인 짧은 펄스 시간에 (< 15 분), 방사능의 시작 금액의 1%는 새로 합성된 단백질에 포함 하는 보다는 더 적은. Immunoprecipitation 통해 대상 단백질의 농축 후 방사능의 시작 금액의 0.05% 미만 SDS 페이지에 대 한 샘플에 포함 되어 있습니다.
35S 메티오닌과 시스테인 믹스 라벨 안정화는, 비록 일부 분해, 휘발성 방사성 화합물, 저조한 발생 합니다. 연구원 및 기구를 보호 하기 위해 몇 가지 예방 조치는 취해야 한다. 연구원 항상 로컬 방사선 안전 규칙을 순종 해야 하 고 숯 마스크 실험실 외 투와 (더블) 장갑 외에 간호를 입을 수 있습니다. 증기 두건에서 또는 로컬 포부 지점에서 35S 메티오닌과 시스테인 재고 튜브 항상 열 수 있습니다. 알려진된 실험실 오염 명소 원심 분리기, 펫, 물 욕, 인큐베이터 및 동영상 있습니다. 차콜 필터, 긍정적인 물개 microcentrifuge 튜브 ( 재료의 표참조), 펄스-체이스 요리에 붙어 물 목욕, 숯 필터 종이에 목탄 수족관 스폰지 피 펫 팁을 사용 하 여이 분야의 오염 감소 목탄 가드 포부 시스템 및 요리 incubators 및 스토리지 컨테이너에 숯 곡물의 배치.
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Protocol
모든 방사성 시 약 및 절차는 로컬 위트레흐트 대학 방사선 규칙 및 규정에 따라 처리 합니다.
1. 펄스 체이스
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부착 세포에 대 한 펄스 체이스
참고: 여기에서 주어진 볼륨 기반으로 60 mm 셀 문화 요리 합니다. 35 m m 또는 100mm 요리, 곱합니다 볼륨 1/2 또는 2, 각각. 이 프로토콜은 0, 15, 30, 60, 120, 및 240 분의 10 분와 체이스의 펄스 시간을 사용합니다. 이러한 (아래 설명) 공부 되 고 특정 단백질에 따라 변화 될 수 있습니다.- 그렇게 그들은 있을 것입니다 부착 세포 (예를 들어, HEK 293, 헬러, 조) 6 60mm 셀 문화 요리에서 씨앗 펄스 체이스의 날 subconfluent (80%-90%). 시간 포인트 또는 조건 당 적어도 1 개의 접시를 사용 합니다.
- 필요한 경우 transfect 셀 제조업체의 지침;에 따라 상용 transfection 시 약을 또는 virally transduce8 셀 1 일전 펄스-체이스 실험 식에 대 한 적절 한 구성.
- 워시 버퍼 (행 크의 균형 소금 솔루션 [HBSS])의 2 개 mL와 설거지, 기아 매체 (일반 문화 매체 메티오닌과 시스테인 없이 최소 필수 매체 [가상 메모리] 같은 메티오닌과 시스테인 및 소 태아 혈 청 [FBS] 부족의 2 개 mL를 추가 하지만 10 mM HEPES, pH 7.4), 15 분 동안 5% CO2 와 37 ° C 습도 인큐베이터에서 요리를 놓습니다.
- 그들은 물과 접촉 하지만 떠 있 하지 않습니다 prewarmed 37 ° C 물 욕조에 선반에 요리를 전송. 타이머를 시작 합니다.
- 40에 s, 기아 중간 발음, 펄스 솔루션 (기아 미디어 + 55 µCi/35 m m 접시, 앞 단계 1.1.1 참고)의 600 µ L를 세우는 피 펫에 추가 부드럽게 접시의 중앙에 정확 하 게 1 분 반복에서이 단계 t에 대 일 분 간격 그 나머지 요리입니다. 실험 하는 동안 시간을 절약할 수 긴 체이스 샘플으로 시작 합니다.
참고: 방사성 물질을 처리 하는 경우 필수적입니다 적절 한 예방 조치 및 로컬 규칙 및 우발적인 노출 및 오염 방지를 규정에 따라. - 정확 하 게 11 분 및 0 분 체이스 샘플 제외한 모든 다음 요리 접시에 직접 체이스 중간의 2 개 mL를 추가 하 고, 발음 한 다시, 체이스 매체의 2 개 mL를 추가. 1 분 간격으로 나머지 요리에 대 한이 단계를 반복 합니다. 37 ° C 배양 기에 모든 요리를 전송.
- 정확히 16 분 체이스 중간의 2 개 mL를 추가 (일반 배양 + 10 mM HEPES [pH 7.4] 5mm 시스테인 그리고 메티오닌 5mm) 라벨; 막으려고 펄스 매체 위에 0 분 샘플 접시에 직접 즉시 발음, 냉각된 알루미늄 접시에 접시를 전송 그리고 얼음 정지 버퍼 (HBSS + 20mm N-ethylmaleimide [NEM])의 2 개 mL를 추가 합니다.
참고: 이것은 0 분 체이스 샘플입니다. 이 샘플에 대 한 직접 1.1.9 단계를 진행 합니다. - 다시 물 목욕 2 분 전에 각 체이스 (예를 들어, 15 분 체이스 24 분) 각 체이스 접시를 전송, 정확한 체이스에 (예를 들어, 15 분 체이스 26 분), 체이스 미디어 발음 (또는 microcentrifuge 튜브에 전송 하는 경우 다음과 같은 홍보 otein 분 비)와 냉각된 알루미늄 접시에 접시를 전송. 얼음 처럼 차가운 중지 버퍼의 2 개 mL를 추가 합니다.
- ≥5 분;에 대 한 중지 버퍼에 얼음에 모든 요리를 품 어 그리고, 그만 솔루션 발음 얼음 정지 솔루션의 2 mL와 함께 그것을 씻어. 세척을 발음 하 고 요리 세포의 용 해 버퍼의 600 µ L lyse (인산 염 버퍼 염 [PBS] + nondenaturing 세제 [참조 테이블의 자료] protease 억제제 + 20mm NEM). 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 요리 양적 lysed 되도록.
- 1.5 mL microcentrifuge 튜브 및 15000-20000 x g 에서 10 분 및 작은 핵을 4 ° C 원심 분리기는 lysate 전송.
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현 탁 액 셀에 대 한 펄스 체이스
참고: 효율적인 라벨 되도록 3 x 106 5 x 106 셀/mL의 농도에서 세포를 펄스와 체이스 볼륨 4 펄스 볼륨 배 이어야 한다. 다음 예제에서 우리는 5 x 106 셀 10 분 1 mL의 볼륨에 펄스, 항복에 5 시간 추적 (0, 15, 30, 60, 및 120 분)을 포함 하는 시간 포인트 당 1 x 106 셀 1 mL의 포인트. 모든 솔루션은 섹션 1.1에서와 같이.- 세포의 충분 한 수는 실험의 시간에 시간 당 적어도 1 x 106 셀 포인트 및 조건 (예를 들어, 3T3, Jurkat)9 이전 게시 된 프로토콜 따라 서 스 펜 션 셀 문화.
- 필요한 경우 셀 제조업체의 지침에 따라 상용 transfection 시 약 transfect 또는 virally transduce8 셀 1 일전 펄스-체이스 실험 식에 대 한 적절 한 구성.
- 250 x g 실 온에서 5 분 동안 50 mL 튜브에 조건 당 5 x 106 세포 pellet, 그들을 씻어 기아 미디어의 5 mL을 1 x 그들을 다시, 펠 렛 및 기아 미디어의 1 mL에 그들을 resuspend.
- 37 ° C 물 목욕을 셀 전송 및 10-25 분 선동 튜브 하단에 정착에서 세포를 방지 하기 위해 모든 10-15 분에 대 한 그들을 품 어.
- 타이머를 시작 합니다. 정확 하 게 1 분에 세포를 포함 하는 튜브에 직접 undiluted 라벨의 275 µCi (55 µCi/1 x 106 셀)을 추가 하 고 혼합 소용돌이.
참고: 방사성 물질을 처리 하는 경우 필수적입니다 적절 한 예방 조치 및 로컬 규칙 및 우발적인 노출 및 오염 방지를 규정에 따라. - 정확 하 게 11 분 체이스 미디어의 4 mL를 추가 하 여 레이블 중지 합니다. 샘플을 혼합 하 고 즉시 차가운 정지 솔루션의 9 mL를 포함 하는 얼음에 1 mL 15 mL 튜브에 전송.
참고: 이것은 0 분 체이스 샘플입니다. - 각 연속 시간 지점에 대해이 단계를 반복 합니다. 일단 모든 시간 포인트를 수집 작은 250 x g 4 ° c.에 5 분에 대 한 셀 발음 매체 (또는 단백질 분 비를 다음과 같은 경우 새로운 15 mL 튜브에 전송). 정지 솔루션의 5 mL로 세포 세척 하 고 250 x g 4 ° c.에 5 분에 대 한 셀을 펠 렛
- 발음 그만 솔루션, 완전히 얼음 세포의 용 해 버퍼의 300 µ L로 세포를 lyse 하 고 완전 한 세포의 용 해 되도록 얼음에 20 분 동안 그들을 품 어. 1.5 mL microcentrifuge 튜브 및 작은 핵을 4 ° C에서 15000-20000 x g 에서 10 분 원심 분리기는 lysate 전송.
2입니다. Immunoprecipitation
- 항 체를 결합 (토론 참조) 및 immunoprecipitation 구슬 (예를 들어, 단백질 A-Sepharose)의 50 µ L (10% 중지 [v] 세포의 용 해 버퍼 + 0.25% 소 혈 청 알 부 민 [BSA])는 microcentrifuge에서 튜브 및 ~ 30 분 통에 4 ° C에서 그들을 품 어.
- 실 온에서 12000 x g 에서 1 분 동안 구슬 펠 렛 하 고는 상쾌한 발음. 항 체-비드 혼합물에 lysate의 200 µ L을 추가 하 고는 immunoprecipitation 요구 하는 경우 1 시간 또는 머리 오버 헤드에 대 한 통에 4 ° C에서 품 어 > 1 h.
- 실 온에서 12000 x g 에서 1 분 동안 구슬 작은 발음은 상쾌한 고 immunoprecipitation 워시 버퍼의 1 mL를 추가 합니다. 5 분 동안 실 온에서 통에 샘플을 놓습니다.
- 2.3 단계에서 설명한 대로 구슬 작은 고 반복 세척 1 x. 그리고, 발음은 상쾌한 테 버퍼, pH 6.8 (10 mM Tris HCl, 1 mM EDTA) 20 µ L에 구슬 resuspend. 소용돌이 샘플입니다.
- 감소 시키는 대리인 없이 샘플 버퍼 x 2의 20 µ L 추가 소용돌이, 95 ° C, 그리고 소용돌이에 5 분 동안 그것을 다시 열.
참고: 경우에 감소 샘플 준비, 500mm DTT의 2 µ L 추가 되어야 합니다이 시점에서. 그런 다음, 2.7 단계로 진행 합니다. - 작은 구슬 2.3 단계에서 설명한 대로. 500 mM DTT의 1 µ L을 포함 하는 신선한 microcentrifuge 튜브에 nonreduced 상쾌한의 19 µ L를 전송, 샘플 및 소용돌이 원심 95 ° C에서 5 분 동안 그것을 다시 열 전에.
- 12000 x g;에 1 분 샘플 다운 스핀 이것은 감소 된 샘플 이다. 실 온까지 냉각 하 고는 감소 및 nonreduced 샘플을 1 M NEM의 1.1 µ L를 추가 합니다. 소용돌이 스핀 다운 샘플.
3입니다. SDS 페이지
- 첫째, 적절 한 SDS 페이지 해결 젤 비율 단백질에 대 한 관심의 결정 합니다. 예를 들어 에이즈-1 gp120, deglycosylated, ~ 60 kDa에 실행 하 고 7.5% 젤에서 분석 된다.
- 제조업체의 지침에 따라 TEMED 없이 해결 젤 혼합물 준비 (% 아크릴, 375 mM Tris HCl [pH 8.8,] 0.1 %SDS [w/v], x 그리고 0.05% 암모늄 persulfate [APS] [w/v]) 및 진공에 대 한 아래 드 > 15 분. 젤 혼합 기체 제거 동안 철저 하 게 70% 에탄올과 보풀 조직 젤 유리 접시를 청소 하 고 주조 장치에 그들을 배치.
- TEMED (0.005% [v]의 최종 농도)에서 해결 젤 혼합물에 추가 하 고 혼합 철저 하 게, 유리 접시, 겹쳐 쌓이는 젤에 대 한 ~1.5 cm 공간 사이 플라스틱. 신중 하 게 이온된 H2O 또는 소 프로 파 놀 젤 오버레이 그리고 유해를 두고.
- 일단 해결 젤은 생산 준비 스태킹 젤 혼합물 (4% 아크릴, 125 mM Tris HCl [pH 6.8], 0.1 %SDS [w/v], 0.025 %APS [w/v]).
- 이온 H2O 해결 젤의 상단을 플러시 하 고, 다음, 모든 물을 제거.
참고: 필터 종이 사용 하 여 마지막 방울을 제거. - TEMED 스태킹 젤 혼합물 (0.005% [v])를 추가, 철저 하 게, 혼합 고 겹쳐 쌓이는 젤과 해결 젤 오버레이 15 잘 빗을 삽입. 겹쳐 쌓이는 젤 생산은 일단 실행 약 실에 그것을 전송 하 고 위와 더 낮은 약 실 버퍼를 실행 하는 것을 채워 (25mm Tris HCl, 글리신 192 m m [pH 8.3], 그리고 0.1 %SDS [w/v]).
- 15-레인 minigel에서 차선 당 샘플의 10 µ L을 로드 합니다. 처음에 샘플 및 젤에 마지막 차선을 로드 하지 않도록 고 밴드의 미소를 방지 하기 위해 모든 빈 차선에서 nonreducing 샘플 버퍼를 로드 합니다. 젤에서 실행 상수 25 mA/젤 염료 전면 젤의 아래쪽에 때까지.
- 유리 접시에서 제거 하는 젤, 단백질 얼룩 솔루션 젤 얼룩 (10% 초 산 및 H2O + 화려한 0.25%에서 30% 메탄올 블루 R250 [w/v]) 동요와 함께 5 분, 30 분에 대 한 솔루션 (얼룩을 destaining와 destain 그리고 화려한 블루 R250 없이 솔루션).
- 정렬 젤 플라스틱에 얼굴 다운 포장 하 고, 다음, 0.4 m m 착 색 인쇄기 종이 그들의 위에 장소. 젤 샌드위치 크로마토그래피 종이 쪽 아래로 장소를 젤에 건조 합니다. 제조업체의 지침에 따라 건조 2 h 80 ° c.에 대 한 젤
- 카세트에 말린된 젤 전송 및 autoradiography 영화 또는 인광 체 스크린 오버레이. Autoradiography 필름을 사용 하는 경우는 어두운 방에이 단계를 수행 해야 합니다.
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Representative Results
접는 에이즈-1 gp120 부착 펄스 체이스에서의 분 비는 그림 2에 표시 됩니다. (그림에서 셀 NR) nonreducing 젤 gp120의 산화 접는 보여줍니다. 체이스 진행 되는 동안, 밴드 마이그레이션합니다 통해 젤 다운 더욱 확산 꽉 밴드 (NT)에 축적 될 때까지 (그것) 중간체를 접는 펄스 직후 확산 밴드, 젤 높은 나타납니다 5 분 (0 분 체이스) gp120의 라벨 기본적으로 접힌된 gp120을 나타내는입니다. 이 이황화 결합의 형성 증가 완전히 감소 단백질 보다 더 빨리 이동 하는 단백질의 압축 발생 합니다. 줄이는 젤 (그림에서 셀 R)에 모든 형태에 이황화 결합 되도록, 체이스 항상, 그들은 영향을 주지 않습니다 이동성 감소 되었습니다. 다른 수정 분석 수 있습니다. Ru에서 Rc 시간 동안 근무 나타냅니다의 gp120 posttranslational 신호 펩 티 드 분열: 신호 펩 티 드, 더 많은 단백질 네이티브 배를 달성 하 고 그들의 신호 펩 티 드를 잃고 추격 중 증가의 손실 때문에 이동성 증가. 모두 nonreducing 및 줄이는 젤에 신호 gp120의 분 비로 인해 이후 ~ 1 h에서 감소 하기 시작 합니다. 이 미디어 (중간 그림에서)를 분석 하 여 모니터링할 수 있습니다. Nonreducing 및 줄이는 젤의 비교 이황화 결합 변화 및 신호 펩 티 드 제거 도요. 이것은 가능 하기 때문에 다른 수정, glycosylation N 연결 및 glycan 수정, SDS 페이지의 바로 전에 endoglycosidase H와 소화에 의해 gp120 (및 분석)에서 제거 되었습니다.
면역 글로불린 M (IgM) 서 스 펜 션 펄스 체이스에서의 μ 무거운 사슬의 매매는 그림 3에 표시 됩니다. HCGolgi HC응급실 에서 시간이 지남에 따라 변화는 세포에서 분 비 앞 골에는 응급실에서 µ 체인의 인신 매매를 나타냅니다. 분자 질량에 있는이 변화는 골에서 glycans N 연결의 수정에 의해 발생 합니다.
그림 1 : 펄스 체이스, immunoprecipitation, 및 SDS 페이지에 대 한 프로토콜의 회로도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 폴딩 및 에이즈-1 gp120, 부착 펄스 체이스에 의해 결정의 분 비. 에이즈-1 gp120 표현 HeLa 세포의 subconfluent 60mm 요리 펄스 10 분에 대 한 표시는 표시에 대 한 추격 했다 시간. Gp120 immunoprecipitation 후 샘플 deglycosylated 되었고 7.5 %SDS 페이지 젤을 사용 하 여 분석. 그것은 접는 중간체; = NT = 네이티브 gp120; Ru = 감소 신호 펩 티 드 uncleaved gp120; Rc = 감소 신호 펩 티 드 죽 습 gp120; NR: = nonreducing; R = 감소. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 서 스 펜 션 펄스 체이스 정한 IgM의 무거운 체인의 매매. 5 x 106 I.29+ µ B 세포 펄스 5 분에 대 한 표시는 표시에 대 한 추격 했다 시간. Immunoprecipitation, 후 샘플 10 %SDS-PAGE 젤을 사용 하 여 분석 되었다. HC = 면역 글로불린 μ 무거운 사슬; LC = 면역 글로불린 경 쇄. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
펄스 추적 방법 그대로 셀에 접히는 단백질의 과학자 들의 이해를 개발 하기 위한 필수 되었습니다. 우리가 가능한 일반적인 방법을 제공 하기 위해 시도 하 고,이 이렇게 공부 접는, 전송, 그리고 단백질의 인생 셀 내부를 하는 동안 발생 하는 다양 한 프로세스를 거의 무한 한 변이 위한 잠재력이 있다.
요리에 부착 세포를 사용 하 여 펄스 체이스를 수행할 때 각 접시 같은 별도 찬으로 가능한 만큼 각 시간 포인트 및 실험에서 조건에 대 한 사용은 치료를 필수적 이다. 특히 짧은 펄스와 체이스 시간에 대 한 (< 5 분), (디지털 타이머)와 펄스와 체이스 번 이상 꽉 컨트롤을 유지 하는 것이 필수적입니다. 현 탁 액 셀과 펄스 따라가는 모든 샘플은 단일 튜브에서 찍은이 다양성을 줄이기 위해 도울 수 있다. 일부 세포 유형 다른 사람 보다 문화 요리 덜 잘 준수로 셀 다양 한 중간 변경 시 멀리 세척 하지는 수 있도록 배려를가지고 한다. 이에이 셀을 사용 하거나 또는 준수 문화 요리 셀 폴 리-L 리 진 또는 젤라틴, 예를 들어 요리를 코팅 하 여 극복할 수 있습니다. 측정 하려면 요리 사이 라벨의 재현성, lysate의 샘플 SDS 페이지 동일한 총 라벨 및 단백질 패턴에 대 한 모든 샘플을 확인 하 여 시험 되어야 한다. 또는, 액체 섬광 lysates의 세 총 수-당-분 (cpm) 통합 하지만 표시 된 단백질 인구에 정보를 제공 하지 것입니다 설정 합니다.
대상 단백질 제대로 레이블, 셀 (또는 요리)의 수를 증가 시켜 보다 라벨의 양을 증가 시켜 신호 증가 합니다. 펄스 시간이 길어 공부 과정의 활동이 수 하는 경우 옵션입니다. 이상적인 펄스 시간 식 수준, 전송 속도, methionines/시스테인, 수 및 단백질의 접히는 속도 등의 요인으로 인하여 각 대상으로 달라 집니다. 실험 실험 목표 염두에 유지 하면서 각 실험에서 위에서 언급 한 요소 사이의 최고의 균형을 결정 하기 위해 착수 해야 하는 등, 중간체 접는 동안 공부 되 고 있다, 예를 들어 경우 펄스에 대 한 레이블을 짧은으로 가능한, 펼친된 상태에 가까운 식 수준 균형 동안 시작 물자를 가능한 한 번 하는 것이 좋습니다. 또는, 전송 또는 단백질의 연구의 대상인 경우, 펄스 시간 운동 정보를 타협 하지 않고 신호 가능한의 높은 수준을 제공 길어 수 있습니다. 수정 하지 않고이 프로토콜을 사용할 때 일반적으로, 펄스 시간 2 15 분에서 배열할 수 있다. 이전 실험5 ~ 10의 지연 시간을 증명 하고있다; 총 단백질 수영장으로 방사능의 설립 전에 펄스 후 s 이것은 펄스-체이스 실험에서 운동 정보를 파생 하는 경우 염두에 두어야 하는 것이 중요입니다. 짧은 펄스 (< 2 분) 시간, 전체 펄스 시간 동안 물 목욕에 모든 요리를 유지. 펄스 시간을 확장 하는 경우 (> 1 h)가 사용 되 고, 그것은 1.5 배 펄스 볼륨을 증가 하 고 밖으로 건조에서 요리를 방지 하기 위해 펄스 동안 37 ° C 배양 기에서 로커에 요리를 배치 하는 것이 좋습니다. 믹스는 선호 또는 시스테인 메티오닌 포함 단백질 둘 다 일반적인 단백질 합성을 유지 하는 데 필요한 대로 표시 되는 경우에 개별 35S-메티오닌/시스테인 또는 혼합을 포함 하는 라벨 솔루션 사용할 수 있지만, 에 셀입니다. 실험 조건 필요 특정 메티오닌/시스테인 라벨, 펄스 동안 nonradioactive 메티오닌/시스테인의 수준은 적절 하 게 조정 해야 합니다.
체이스 (시간과 시간 점 개수)는 비슷한 방법으로 결정 됩니다. 체이스 처음 (후 0 분 체이스) 동등한 펄스 시간으로 설정 하 고, 다음, 각 연속 시간 지점에 대 한 시간의 길이 두 번 하는 것입니다 좋은 시작 하는 곳 (예를 들어, 5, 10, 20, 및 40 분). 그러나,이 각 특정 단백질 및 질문에 대 한 낙관 되어야 한다.
기아 (이 단백질 합성 및 접는 영향을 미칠 수)에 의해 스트레스 반응의 활성화를 이상적으로 방지 하기 위해 일부 레이블이 메티오닌과 시스테인 기아와 radiolabeling 솔루션에 추가 되어야 합니다. 수량 셀 라인, 표시 시간, 사용, radiolabel의 수량 및 미디어 볼륨에 따라 달라 집니다 그리고 테스트 하는 것 필요 합니다. 좋은 출발점은 시스테인과 메티오닌 펄스 시간 증가 함께 증가 될 수 있는 세포 배양에의 한 금액의 1% 이다. 기아 기간 여부 또는 레이블 없는 아미노산, 하지 않고 적절 한 레이블 설립을 보장 하 고 스트레스 반응의 활성화 되지 않도록 15-30 분의 범위에 보관 한다. 확장된 펄스 (≥1 h)을 사용 하 여, 기아 필요 하지 않습니다.
여기에 설명 된 세포의 용 해 버퍼 대부분의 목적에 적합 하 게 될 것입니다 하지만 원칙적으로, HEPES, 트리 스, MES, 등 모든 버퍼 시스템 작동 합니다. 세포를 lyse 필요가 세제 농도 세포와 세제 볼륨의 수에 따라 달라 집니다. 농도 항상 임계 micelle 농도 (CMC)와 세제 lyse 세포에 충분 한 수량 이상 이어야 한다. 엄지손가락의 경험적 규칙은 0.5 %nondenaturing 세제의 200 µ L ~ 1 mg의 단백질 (1 ~ 106 셀 x)에 해당 하는 셀을 lyse 충분 하다 ( 재료의 표참조). 소금 농도 세제는 응용 프로그램에 따라 변화 될 수 있습니다 하지만 일반적으로, 휴식 조건 열 핵 (높은 소금 > 0.1 %SDS) 무료 DNA의 존재는 immunoprecipitation 방해가 됩니다 피해 야 한다. 이 피할 수 없는 경우, 예를 들어, 완전 한 세포 lysates 핵 또는 수송과 단백질을 포함 하 여 분석 될 필요가 있을 때 DNA immunoprecipitation 전에 작은 게이지 바늘을 통해 셀을 전달 하 여 전단 수 있습니다. 이것은 과도 한 거품 막기 쥡니다 및 방사성에 어로 졸의 생산 선호 이다.
Immunoprecipitation에 대 한 항 체의 최적의 수량 및 각 항 체-항 원 결합에 대 한 최고의 워시 버퍼 테스트 되어야 한다 철저 하 게 원하는 항 신호 및 배경 사이의 균형을 달성 하기 위해. 항 체는 항상 존재 해야 양적 immunoprecipitation; 되도록 항 이상 초과 좋은 출발점은 당 106 셀 x 35 mm 접시/1에서 immunoprecipitation 항 체의 1 µ g 이다. 배경 세제 또는 소금 농도 증가 하 여 감소 될 수 있습니다. 특히, ≤ %SDS 추가 크게 백그라운드를 줄이기 위해 도울 수 있지만 또한 항 체 항 원 상호 작용을 중단 될 수 있습니다. Immunoprecipitation 중 항 체의 특이성에 대 한 제어, 사용 가능한 경우 대상 단백질 부족 동일한 세포를 사용 해야 합니다. 이 때 생 단백질 분석 되는 등 간단한 경우, overexpression 또는 항 원의 고갈 작동 합니다. (여기서 가능한) 배경 (및 특이성), 어느 preimmune 세라 제어 또는 isotype 컨트롤을 사용 해야 합니다. Immunoprecipitation 구슬에 직접 바인딩 하는 항 원에 대 한 제어, 항 체 없이 구슬 사용 해야 합니다. 여기 제공 하는 조건으로 각 항 체-항 원 쌍 워시 버퍼와 세척 조건의 최적화가 필요 합니다 시작 지점으로 고려 되어야 한다. 너무 많은 배경 경우 늘리지 마십시오 세척 수 하지만 오히려 세척 시간 및/또는 세척 버퍼의 구성. Coimmunoprecipitations와 같은 특히 중요 한 상호 작용 처리 될 경우, 그것은 4 ° c, 차가운 버퍼를 사용 하 여 모든 세 단계를 수행 하는 것이 좋습니다 있을 수 있습니다.
현 탁 액 셀에 부착 세포의 장점 중 하나입니다 그 약물 치료 펄스 체이스 동안 거의 모든 지점에서 수행할 수 있습니다. 보호자 억제제를 사용한 경우 예를 들어 공동 대 posttranslational 단계 접는 과정에 미치는 영향을 차별화 하는 가능 하다. 이 확장할 수 있다 세포 및 immunoprecipitation 워시 버퍼 (위에서 설명한)는 coimmunoprecipitation 수 있도록 적응 하 여 단백질 보호자 단지의 접이식10,,1112동안.
샘플의 postlysis 치료 해결 될 수 있는 질문의 범위를 넓히다 것입니다. Immunoprecipitation 추가적인 구조적 정보를 제공 하 고 특히 그 이황화 채권13, 부족 한 단백질의 폴딩 모니터링 하 성공적으로 사용 하기 전에 대상 단백질의 제한 효소 소화 14. Immunoprecipitation15,16이전 자당 밀도 기울기 원심 분리에 의해 단백질 집합 및 복잡 한 형성을 모니터링할 수 있습니다.
펄스 추격전의 전체 활용, 높은-품질의 시 약의 가용성은 immunoprecipitations 필요 합니다. 접이식 중간체를 검사 하는 경우 분석 중인 단백질의 모든 형태를 잡아당기는 수 있는 항 체를 필수적입니다. 대상 단백질에 특정 항 체를 사용할 수 없는 경우,이 선호도 태그를 사용 하 여 대체 될 수 있습니다. 그러나,이 심각 하 게 postlysis 메서드를 직접 태그 파편만을 복구할 수로 단백질 구조를 조사 하는 제한 된 베이스의 유용성을 제한 합니다.
펄스 추격전의 감도 문제의 단백질 메티오닌과 시스테인 잔류물의 수에 의해 제한 됩니다. 낮은 수가 낮은 식 수준 함께 메티오닌/시스테인 잔류물 단백질 펄스-체이스 실험에서 감지 되지 않습니다. Postlysis 수정 제한 된 베이스 등을 수행할 때 메티오닌/시스테인-포함 된 파편만 감지 됩니다.
결론, 주어진 따라가는 펄스 운동 세부 제공, 그들은 다른 많은 기술과 정상 수준에서 분자 세포 생물학을 공부 하는 데 사용 하는 도구를 보완 합니다. 이와 같이, 그들은 분자 생물학의 도구 상자에서 귀중 한 구성 요소를 계속.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자 및 그들의 유익한 토론에 대 한 제시 고이 문서에서 제공 하는 방법 개발에 도움이 과거 Braakman 연구소의 모든 구성원을 감사 합니다. 이 프로젝트는 유럽 연합의 7 차 프레임 워크 프로그램 (FP7 2007-2013 년) N ° 235649 아래 유럽 연구 위원회와 네덜란드 조직의 과학적 연구 (NWO) 에코 프로그램 N ° 711.012.008 아래에서 자금을 받았다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL safeseal microcentrifuge tubes | Sarstedt | 72.706.400 | |
| Acetic Acid | Sigma | A6283 | glacial acetic acid |
| BAS Storage phosphor screen 20x25 cm | GE Life Sciences | 28956475 | |
| Bromophenol Blue | Sigma | B8026 | Molecular biology grade |
| Carestream Biomax MR films | Kodak | Z350370-50EA | |
| Cell-culture media | Various | N/A | Normal cell culture media for specific cell-lines used |
| Cell-culture media, no methionine/cysteine | Various | N/A | Same media formulation as normal culture media e.g DMEM/MEM/RPMI, lacking methionine and cysteine |
| Charcoal filter paper | Whatman | 1872047 | |
| Charcoal filtered pipette tips | Molecular bioproducts | 5069B | |
| Charcoal vacu-guard | Whatman | 67221001 | |
| Coomassie Brilliant Blue R250 | Sigma | 112,553 | for electrophoresis |
| Cysteine | Sigma | C7352 | Molecular biology grade, Make 500 mM stock, store at -20 |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 10197777001 | Molecular biology grade |
| EasyTag Express35S Protein Labeling Mix | Perkin Elmer | NEG772014MC | Other size batches of label are available depending on useage |
| EDTA | Sigma | E1644 | Molecular biology grade |
| Gel-drying equipment | Various | N/A | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | Molecular biology grade |
| Grade 3 chromatography paper | GE Life Sciences | 3003-917 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 24020117 | |
| Kimwipes delicate task wipes | VWR | 21905-026 | |
| MES | Sigma | M3671 | Molecular biology grade |
| Methanol | Sigma | MX0490 | |
| Methionine | Sigma | M5308 | Molecular biology grade, Make 250 mM stock, store at -20 |
| Minigel casting/running equipment | Various | N/A | |
| NaCl | Sigma | S7653 | Molecular biology grade |
| N-ethylmaleimide | Sigma | E3876 | Molecular biology grade, Make 1M stock in 100% ethanol, store at -20 |
| PBS | Sigma | P5368 | Molecular biology grade |
| Protein-A Sepharose fastflow beads | GE health-care | 17-5280-04 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma | L3771 | Molecular biology grade |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Molecular biology grade |
| Trizma base (Tris) | Sigma | T6066 | Molecular biology grade |
| Typhoon IP Biomolecular imager | Amersham | 29187194 | |
| Unwire Test Tube Rack 20 mm for waterbath | Nalgene | 5970-0320PK |
References
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