Summary
Här beskriver vi ett protokoll för en allmän puls-chase-metod som tillåter den kinetiska analysen av vikning, transport och nedbrytning av proteiner som skall följas i levande celler.
Abstract
Radioaktiva puls-chase märkning är ett kraftfullt verktyg för att studera den konfirmerande mognaden, transport till deras funktionella cellulära plats och nedbrytningen av målet proteiner i levande celler. Genom att använda kort (puls) radiolabeling gånger (< 30 min) och hårt kontrollerad chase gånger, det är möjligt att märka endast en bråkdel av den totala protein poolen och följa dess vikning. Kombination med nonreducing eller minska SDS-polyakrylamid gelelektrofores (SDS-PAGE) och immunoprecipitation med (konformation-specifik) antikroppar, kan fällbara processer undersökas i detalj. Detta system har använts för att analysera den vikningen av proteiner med en stor variation i egenskaper såsom lösliga proteiner, enkel- och multi-pass transmembrana proteiner, tungt N - och O-glykosylerad proteiner och proteiner med och utan omfattande disulfid limning. Puls-chase metoder är grunden för kinetiska studier i en rad ytterligare funktioner, inklusive co - och posttranslationalen modifieringar, oligomerisering och polymerisation, i huvudsak tillåter analys av ett protein från födseln till döden. Puls-chase studier på proteinveckning kompletterar med andra biokemiska och biofysikaliska metoder för att studera proteiner i vitro genom att ge ökad temporal upplösning och fysiologisk information. Metoderna som beskrivs i detta dokument anpassas lätt för att studera den vikningen av nästan något protein som kan uttryckas i däggdjur eller insekt-cell system.
Introduction
Vikningen av även relativt enkla proteiner innebär många olika fällbara enzymer, molekylär chaperones och kovalenta modifieringar1. En komplett beredning av dessa processer i vitro är praktiskt taget omöjligt, med tanke på det stora antalet olika komponenter inblandade. Det är därför önskvärt, att studera protein vikning i vivo, i levande celler. Radioaktiva puls-chase tekniker bevisa ett kraftfullt verktyg för att studera den syntes, vikning, transport och nedbrytning av proteiner i deras naturliga miljö.
Den metabola märkning av proteiner under en kort puls med 35S-märkt metionin/cystein, följt av en jakt i avsaknad av en radioaktiv märkning, tillåter spårning av antalet nyligen syntetiserade proteiner i den breda cellulära miljön. Sedan målproteiner kan vara isolerade via immunoprecipitation och analyseras via SDS-PAGE eller andra tekniker. För många proteiner präglas deras resa genom cellen av ändringar som är synliga på SDS-PAGE gel. Exempelvis åtföljs transport av glykosylerat proteiner från endoplasmatiska retiklet (ER) till Golgi komplexet ofta av ändringar av N-länkade glycans eller tillägg av O-länkade glycans2,3. Dessa ändringar orsaka stora ökningar i det uppenbara molekylära samlas, som kan ses av rörlighet förändringar i SDS-PAGE. Mognaden kan också markeras genom proteolytisk klyvning, såsom signal-peptid klyvning eller avlägsnande av pro-peptider, vilket resulterar i förändringar i den uppenbara molekylära massa som enkelt kan följas på SDS-PAGE gel4. Radioaktiviteten har betydande fördelar jämfört med jämförbara tekniker såsom Kungliga Automobilklubben jakter, där romanen proteinsyntesen förhindras, som längre behandlingar är giftiga för celler och utesluter inte majoriteten av äldre, steady state proteiner från den analys, som vissa proteiner har halveringstider dagar. Jämförelse av proteiner under både nonreducing och minska villkor tillåter analys av disulfide bond bildandet, ett viktigt steg i vikningen av många sekretoriska proteiner4,5,6, 7.
Här beskrivs en allmän metod för analys av proteinveckning och transport i intakta celler, med hjälp av radioaktiva puls-chase tillvägagångssättet. Medan vi har syftar till att ge metoden som detaljerat som möjligt, protokollet har en nästan obegränsad potential för anpassningsförmåga och tillåter optimering att studera varje läsarens specifika proteiner.
Två alternativa puls-chase protokoll, en för vidhäftande celler (steg 1.1 av protokollet presenteras här) och en för suspension celler (steg 1.2 i protokollet presenteras här) tillhandahålls. Villkor som anges här är tillräckliga för att visualisera ett protein som uttrycks med medelhög - till hög-uttryck nivåer. Om läsaren arbetar med dåligt uttryckta proteiner eller olika posttreatment villkor, såsom flera immunoprecipitations, är det nödvändigt att öka storleken på skålen eller mobiltelefonnummer på lämpligt sätt.
För suspension puls chase tas chase proverna vid varje tidpunkt från en enda slang av celler. Tvätta stegen efter pulsen är utelämnade; i stället ytterligare förhindras inkorporering av 35S genom utspädning med en hög överskott av omärkta metionin och cystein.
De presenteras protokoll använder radioaktiva 35S-märkt cystein och metionin följa cellulära proteinveckning processer. All verksamhet med radioaktiv reagenserna bör utföras med lämpliga skyddsåtgärder för att minimera all exponering av operatören och miljön för radioaktiv strålning och utföras i ett laboratorium som utsetts. Som puls-chase märkning teknik är relativt ineffektiv kort puls tider (< 15 min), mindre än 1% av grundbelopp för radioaktivitet är införlivad i de nyligen syntetiserade proteinerna. Efter anrikningen av den mål protein via immunoprecipitation innehåller provet för SDS-PAGE mindre än 0,05% av grundbelopp för radioaktivitet.
Även om de 35S metionin och cystein märkning mix stabiliseras, kommer att vissa nedbrytning, framställning av flyktiga radioaktiva föreningar, uppstå. För att skydda forskaren och apparaten, bör vissa försiktighetsåtgärder vidtas. Forskaren bör alltid följa säkerhetsbestämmelser som lokal strålning och kan bära en kolteckning som omvårdnad mask, förutom en labbrock och (dubbel) handskar. Beståndet injektionsflaskor med 35S metionin och cystein bör alltid öppnas i dragskåp eller i en lokal aspiration punkt. Kända laboratorium kontaminering fläckar är centrifuger, pipetter, vattenbad, inkubatorer och shakers. Kontaminering av dessa områden minskas med pipettspetsar med ett kolfilter, positiv-seal mikrocentrifugrör (se Tabell för material), akvarium träkol svampar i vatten bad, träkol filtrerpapper limmade i puls-chase maträtter, träkol vakt i systemets aspiration och placeringen av rätter som innehåller träkol spannmål i inkubatorer och förvaringskärl.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla radioaktiva reagenser och förfaranden har hanterats i enlighet med lokala Utrecht universitet strålning regler och föreskrifter.
1. pulse Chase
-
Pulse Chase för vidhäftande celler
Obs: De volymer som ges här är baserade på 60 mm cell kultur rätter. För 35 mm eller 100 mm rätter, multiplicera volymerna med 1/2 eller 2, respektive. Detta protokoll används en puls tid 10 min och chase gånger 0, 15, 30, 60, 120 och 240 min. Dessa kan varieras beroende på de specifika proteiner som studeras (diskuteras nedan).- Utsäde vidhäftande celler (t.ex., HEK 293, HeLa, CHO) i sex 60 mm cell kultur rätter så att de blir subconfluent (80% - 90%) på dagen för puls jakten. Använd minst en maträtt per tidpunkt och/eller villkor.
- Om så krävs, transfect cellerna med kommersiellt tillgängliga transfection reagenser enligt tillverkarens anvisningar; eller viralt transduce8 celler 1 dag innan puls-chase experimentera med den lämpliga konstruktionen för uttryck.
- Diska med 2 mL av tvättbuffert (Hanks balanserad saltlösning [HBSS]), tillsätt 2 mL av svält medium (normalt odlingsmedium saknar metionin och cystein och fetalt bovint serum [FBS], såsom minsta viktigt medium [MEM] utan metionin och cystein men med 10 mM HEPES, pH 7,4), och placera rätterna i en 37 ° C befuktade inkubator med 5% CO2 för 15 min.
- Överföra rätterna till rack i en förvärmd 37 ° C vattenbad så att de är i kontakt med vatten men inte flyta. Starta en timer.
- Vid 40 s, aspirera svält medium, utarbeta 600 µL puls lösning (svält media + 55 µCi/35 mm maträtt label, se anmärkning före steg 1.1.1) in i pipetten, och lägga till den försiktigt i mitten av skålen på exakt 1 min. Upprepa detta steg 1 min intervall för t Han resterande rätter. Börja med längsta chase provet att spara tid under experimentet.
Obs: Vid hantering av radioaktivt material, det är viktigt att följa lämpliga försiktighetsåtgärder och lokala regler och förordningar för att förhindra oavsiktlig exponering och/eller kontaminering. - Exakt 11 min och för alla följande rätter, med undantag av 0 min chase provet, tillsätt 2 mL av chase medium direkt till skålen, sug ut det och igen, tillsätt 2 mL av chase medium. Upprepa detta steg 1 min intervall för återstående rätter. Överföra alla rätter till en 37 ° C inkubator.
- På exakt 16 min, tillsätt 2 mL av chase medium (normalt odlingsmedium + 10 mM HEPES [pH 7,4], 5 mM cystein och metionin 5 mM) direkt till 0 min prov skålen ovanpå puls mediet att stoppa märkning; sedan, aspirera omedelbart överföra skålen till en kyld aluminium plattan och tillsätt 2 mL iskallt stop buffert (HBSS + 20 mM N- ethylmaleimide [NEM]).
Obs: Detta är 0 min chase provet. För detta prov, gå direkt till steg 1.1.9. - Överföra varje chase rätt tillbaka till vattenbadet 2 min innan varje chase-tid (t.ex., 24 min för en 15 min chase) och, då exakta chase (t.ex., 26 min för en 15 min chase) aspirera chase media (eller överföra den till en mikrocentrifug rör om efter pr otein sekretion) och överföra skålen till ett kylt aluminiumplåt. Tillsätt 2 mL iskallt stop buffert.
- Inkubera alla rätter på is i stop bufferten för ≥5 min; sedan aspirera stopplösningen och tvätta det med 2 mL iskallt stopplösning. Aspirera tvätten och lysera rätter med 600 μl lyseringsbuffert (fosfatbuffrad saltlösning [PBS] + nondenaturing tvättmedel [se Tabell för material] + proteashämmare + 20 mM NEM). Använda en cell-skrapa för att säkerställa att rätterna är lyserat kvantitativt.
- Överföra den lysate i en 1,5 mL mikrocentrifug rör och Centrifugera i 10 min vid 15 000-20 000 x g och 4 ° C till pellet atomkärnor.
-
Pulse Chase för Suspension celler
Obs: För att säkerställa effektiv märkning, celler bör pulseras vid en koncentration på 3 x 106 5 x 106 celler/ml, och chase volymer ska vara 4 x puls volymen. I följande exempel pulsade vi 5 x 106 celler i en volym om 1 mL i 10 min, för att ge fem jaga tid pekar (0, 15, 30, 60 och 120 min) med 1 mL, 1 x 106 celler per tidpunkt. Alla lösningar är densamma som i avsnitt 1.1.- Kultur suspension cellerna (t.ex., 3T3, Jurkat) enligt en tidigare publicerade protokoll9 så det finns ett tillräckligt antal celler vid tidpunkten för experimentet, minst 1 x 106 celler per tid pekar eller skick.
- Om så krävs, transfect celler med kommersiellt tillgängliga transfection reagenser enligt tillverkarens instruktioner, eller viralt transduce8 celler 1 dag innan puls-chase experimentera med den lämpliga konstruktionen för uttryck.
- Pellets 5 x 106 celler per tillstånd i en 50 mL tub för 5 min på 250 x g rumstempererat, tvätta dem 1 x 5 ml svält media, pellet dem igen, och återsuspendera dem i 1 mL av svält media.
- Överföra cellerna till 37 ° C vattenbad och inkubera dem för 10-25 min. agitera rören varje 10-15 min att förhindra celler från avgörande längst ned.
- Starta timern. På exakt 1 min, tillsätt 275 µCi (55 µCi/1 x 106 celler) av outspädd etikett direkt till röret som innehåller celler och snurra för att blanda.
Obs: Vid hantering av radioaktivt material, det är viktigt att följa lämpliga försiktighetsåtgärder och lokala regler och förordningar för att förhindra oavsiktlig exponering och/eller kontaminering. - På exakt 11 min, stoppa märkning genom att lägga till 4 mL chase media. Blanda provet och omedelbart överför 1 mL till en 15 mL tub på isen, som innehåller 9 mL iskallt stopplösning.
Obs: Detta är 0 min chase provet. - Upprepa dessa steg för varje efterföljande tidpunkt. När alla tidpunkter är samlat, pellet cellerna för 5 min på 250 x g vid 4 ° C. Aspirera medium (eller överföra den till en ny 15 mL tub om följande protein sekretion). Tvätta cellerna med 5 mL stopplösning och pellet cellerna för 5 min på 250 x g vid 4 ° C.
- Aspirera stopplösningen, helt lysera celler med 300 µL iskall lyseringsbuffert och inkubera dem i 20 min på is för att säkerställa en komplett lysis. Överföra den lysate i en 1,5 mL mikrocentrifug rör och Centrifugera i 10 min vid 15 000-20 000 x g vid 4 ° C till pellet atomkärnor.
2. Immunoprecipitation
- Kombinera antikropp (se diskussionen) och 50 µL av immunoprecipitation pärlor (t.ex. protein A-Sepharose) (10% suspension [v/v] i lyseringsbuffert + 0,25% bovint serumalbumin [BSA]) i en mikrocentrifug rör och inkubera dem vid 4 ° C för ~ 30 min i en shaker.
- Pellet pärlorna för 1 min på 12 000 x g i rumstemperatur och Aspirera supernatanten. Tillsätt 200 µL lysate antikropp-pärla blandningen och inkubera vid 4 ° C i en shaker för 1 h eller huvud-över-huvud om immunoprecipitation kräver > 1 h.
- Pellet pärlorna för 1 min på 12 000 x g vid rumstemperatur. Aspirera supernatanten och tillsätt 1 mL immunoprecipitation tvättbuffert. Placera provet i en shaker i rumstemperatur i 5 min.
- Pellet pärlorna som beskrivs i steg 2,3 och upprepa tvätten 1 x. Sedan Aspirera supernatanten och återsuspendera pärlorna i 20 µL av TE buffert, pH 6,8 (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA). Vortex provet.
- Tillsätt 20 µL av 2 x provet buffert utan reduktionsmedel, vortex, värma den för 5 min vid 95 ° C, och vortex igen.
Obs: om bara förbereda reducerande prover, 2 µL 500 mM DTT bör läggas på denna punkt. Fortsätt sedan till steg 2,7. - Pellet pärlorna som beskrivs i steg 2,3. Överföra 19 µL av nonreduced supernatanten till ett färskt mikrocentrifug rör innehållande 1 µL 500 mM DTT, Centrifugera provet, och vortex det innan uppvärmning det för 5 min vid 95 ° C igen.
- Snurra ner prov för 1 min på 12 000 x g; Detta är det reducerat provet. Kyl det ner till rumstemperatur och tillsätt 1,1 µL av 1 M NEM både reducerade och nonreduced provet. Vortex och snurra ner proverna.
3. SDS-PAGE
- Först bestämma lämpliga SDS-PAGE lösa gel procentandelen för protein av intresse. Till exempel HIV-1 gp120, när deglycosylated, körs på ~ 60 kDa och analyseras i en 7,5% gel.
- Förbered att lösa gel blandningen utan TEMED enligt tillverkarens anvisningar (x % akrylamid, 375 mM Tris-HCl [pH 8,8,] 0,1% SDS [volymvikt], och 0,05% ammonium persulfatoxidation [APS] [volymvikt]) och lufta under vakuum för > 15 min. Medan gel blandningen avgasning, grundligt rengöra gel glasplattorna med 70% etanol och luddfri vävnader och placera dem i en casting-apparat.
- Tillsätt TEMED lösa gel blandningen (med en slutlig koncentration på 0,005% [volym]), blanda och Pipettera mellan glasskivor, lämnar ~1.5 cm utrymme för stapling gelen. Noggrant overlay gelen med avjoniserat H2O eller isopropanol och lämna den att polymerisera.
- När den lösa gel har polymeriserat, förbereda stapling gel blandningen (4% akrylamid, 125 mM Tris-HCl [pH 6,8], 0,1% SDS [volymvikt], och 0.025% APS [volymvikt]).
- Spola upp i den lösa gel med avjoniserat H2O och ta sedan bort allt vatten.
Obs: Använd filterpapper att ta bort de sista dropparna. - Tillsätt TEMED stapling gel blandningen (0,005% [v/v]), blanda noga, och overlay lösa gelen med stapling gel och infoga en 15-bra kam. När stapling gelen har polymeriserat, överföra den till en rinnande kammare och fylla de övre och nedre kamrarna med rinnande buffert (25 mM Tris-HCl, 192 mM glycin [pH 8,3] och 0,1% SDS [volymvikt]).
- Ladda 10 µL prov per körfält i en 15-lane minigel. Undvika att ladda proverna i först och den sista lanen på gel och ladda nonreducing prov bufferten i alla tomma körfält att förhindra den leende av band. Kör gelen vid konstant en 25 mA/gel tills dye framsidan är på botten av gelen.
- Ta bort gelen från glasplattorna, färga gelerna med protein-färgning lösning (10% ättiksyra och 30% metanol i H2O + 0,25% lysande blå R250 [volymvikt]) för 5 min med agitation, och sedan, Avfärga i 30 min med avfärgningslösning (färgning lösning utan lysande blå R250).
- Ordna gelerna nedåt på en plast wrap och, sedan placera 0,4 mm kromatografipapper ovanpå dem. Placera gel smörgås kromatografi papper-sidan nedåt på en gel torktumlare. Efter tillverkarens instruktioner, torka gelerna för 2 h vid 80 ° C.
- Överföra de torkade gelerna till en kassett och täcka över dem med autoradiografi film eller fosfor skärmen. Om du använder autoradiografi film, måste detta steg utföras i ett mörkt rum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den fällbara och utsöndringen av HIV-1 gp120 från en vidhäftande puls chase visas i figur 2. Nonreducing gelen (celler NR i figuren) visar den oxidativa vikningen av gp120. Omedelbart efter pulsen märkning av 5 min (0 min chase) gp120 visas som ett diffust band som är högre i gel och som chase fortskrider, bandet migrerar ner gelen genom ännu mer diffust fällbara intermediärer (IT) tills det ackumuleras i trånga bandet (NT) som representerar inföding vikta gp120. Detta inträffar eftersom bildandet av disulfide obligationer ökar kompakt av proteinet, orsakar det att migrera snabbare än fullt reducerat proteinet. På reducerande gel (celler R i figuren), har disulfide obligationer på alla former minskat så att chase alltid, de inte påverkar rörligheten. Detta tillåter analys av andra ändringar. Övergången över tid från Ru till Rc representerar posttranslationell signal-peptid klyvning av gp120: rörlighet ökar på grund av förlust av signal peptiden, vilket ökar under jakten som mer proteiner uppnå infödd luckan och förlora sin signal peptid. På båda nonreducing och reducerande gel börjar signalen minska från ~ 1 h framåt på grund av utsöndringen av gp120. Detta kan övervakas genom att analysera media (Medium i figuren). En jämförelse av nonreducing och minska gelerna avslöjar disulfide bond förändringar och signal-peptid borttagning. Detta var bara möjligt eftersom en annan modifiering, N-länkade glycosylation och glycan ändringar, togs bort från gp120 (och analys) av matsmältning med endoglycosidase H precis innan SDS-PAGE.
Handel med µ tung kedja av immunglobulin M (IgM) från en suspension puls chase visas i figur 3. En förändring över tid från HCER till HCGolgi representerar människohandel µ kedjan från ER till den Golgi, som föregår utsöndringen från cellen. Denna förändring i molekylmassa orsakas av modifieringen av N-länkade glycans i Golgi.
Figur 1 : Schematiskt diagram för protokollet för puls chase, immunoprecipitation och SDS-PAGE. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Folding och utsöndring av HIV-1 gp120, bestäms av vidhäftande puls chase. Subconfluent 60 mm rätter av HeLa celler uttrycker HIV-1 gp120 var puls märkt i 10 min och jagade för den angivna tider. Efter immunoprecipitation av gp120, proverna var deglycosylated och analyseras med en 7,5% SDS-PAGE gel. DET = fällbara intermediärer. NT = infödda gp120; Ru = minskad signal-peptid-uncleaved gp120; RC = minskad signal-peptid-avspjälkar gp120; NR: = nonreducing; R = minska. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Handel med den tunga kedjan av IgM, bestäms av suspension puls chase. 5 x 106 I.29 µ+ B-celler var puls märkt för 5 min och jagade för den angivna tider. Efter immunoprecipitation analyserades proverna med en 10% SDS-PAGE gel. HC = immunglobulin µ tung kedja; LC = immunglobulin ljusslinga. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Puls-chase metoder har varit avgörande för utvecklingen av forskarnas förståelse av protein vikning i intakta celler. Medan vi har försökt att ge en metod som är lika allmän som möjligt, har detta tillvägagångssätt potentialen för nästan obegränsade variationer att studera olika processer som inträffar under vikningen, transport, och livet av proteiner inuti cellen.
När du utför en puls chase med vidhäftande celler i rätter, är det viktigt att behandla varje maträtt som detsamma som möjligt, som en separat skålen används för varje tidpunkt eller villkor i ett experiment. Speciellt för kort puls och chase gånger (< 5 min), det är viktigt att upprätthålla en stram kontroll över tidens puls och chase (med en digital timer). Pulse jakter med fjädring celler kan bidra till att minska denna variation eftersom alla prover tas från en enda slang. Som vissa celltyper följa sämre till kultur rätter än andra, bör försiktighet iakttas så att cellerna inte tvättas bort under de olika medium förändringarna. Detta kan lösas genom att antingen använda dessa celler i suspension eller genom beläggning rätter med poly-L-lysin eller gelatin, exempelvis för att följa cellerna till kultur rätter. För att mäta reproducerbarhet märkning mellan rätter, bör ett urval av lysat undersökas av SDS-PAGE att kontrollera alla prover för identiska totala märkning och protein mönster. Alternativt, liquid scintillation räkna av lysates upprättar den totala räknas per minuten (cpm) införlivas men inte ger information om protein befolkningen märkt.
Om ett målprotein etiketter dåligt, ökas signalen genom att öka antalet celler (eller rätter) i stället för genom att öka mängden av etikett. Förlänga puls tid är ett alternativ när kineticsen av studerade processen tillåter detta. Idealiska puls tid varierar med varje mål på grund av faktorer såsom nivån uttryck, andelen transkription, antalet methionines/cysteines och fällbara andelen protein. Som sådan, göras experimenterande att bestämma den bästa balansen mellan ovan nämnda faktorer i varje experiment samtidigt i experimentellt syfte i åtanke. Om intermediärer under fällbara studeras, exempelvis är det önskvärt att puls etiketten för så kort tid som möjligt att ha utgångsmaterialet så nära en ovikt skick som möjligt, samtidigt balansera uttrycksnivåerna. Alternativt, om transport eller nedbrytning av ett protein är målet för studien, puls tider kan förlängas för att tillhandahålla de högsta nivåerna av signalen som möjligt utan att kompromissa med kinetic information. I allmänhet kan puls tider variera från 2-15 min när du använder detta protokoll utan modifiering. Tidigare experiment5 har visat en fördröjning på ~ 10 s efter pulsen före införlivandet av radioaktivitet i totalprotein poolen; Detta är viktigt att komma ihåg vid härledning av kinetiska information från puls-chase experiment. Kort puls tider (< 2 min), hålla alla rätter på vattenbadet under hela puls. Om utökade puls tider (> 1 h) är används, är det tillrådligt att öka volymen puls med 1,5 gånger och placera rätter på en rocker i en inkubator i 37 ° C under den puls för att förhindra maten från att torka ut. Medan det finns märkning lösningar som innehåller enskilda 35S-metionin/cystein eller en blandning, är mixen att föredra även när proteiner som endast innehåller metionin och cystein är att stämplas som båda behövs för att upprätthålla allmänna proteinsyntesen i cellen. Om experimentella förhållanden kräver särskilda metionin/cystein märkning, måste nivåerna av nonradioactive metionin/cystein under pulsen justeras.
Chase gånger (och antalet tidpunkter) bestäms på ett liknande sätt. En bra startpunkt är att ställa den första chase tiden (efter 0 min chase) som lika med puls-tiden och, sedan, dubbla längden av tid för varje efterföljande tidpunkt (t.ex., 5, 10, 20 och 40 min). Detta måste dock optimeras för varje specifikt protein och fråga.
För att förhindra aktivering av stressreaktioner av svält (vilket kan påverka proteinsyntesen och vikning), idealiskt, bör vissa omärkta metionin och cystein läggas till de svält och radiolabeling lösningarna. Kvantiteten beror på cellinje, märkning tiden, kvantitet den radiomärkas används och medie volymer och måste testa. En bra utgångspunkt är 1% av mängden cystein och metionin i cellodlingsmedium, som kan ökas med ökande puls tider. Svält perioder, med eller utan omärkt aminosyror, bör hållas i mellan 15-30 min att säkerställa adekvat etikett införlivande och förhindra aktivering av stressreaktioner. När du använder en utökad puls (≥1 h), krävs inte svält.
Den lyseringsbuffert som beskrivs här kommer att vara lämpliga för de flesta ändamål, men i princip alla buffertsystem, såsom HEPES, Tris eller MES, fungerar. De tvättmedel koncentration som behövs för att lysera celler beror på antalet celler och tvättmedel volym. Koncentrationen bör alltid ovanför den kritiska micelle koncentrationen (CMC) och mängden tvättmedel som är tillräcklig för att lysera celler. En empirisk tumregel är att 200 µL 0,5% nondenaturing rengöringsmedel (se Tabell för material) räcker det att lysera cell motsvarar ~ 1 mg protein (~ 1 x 106 celler). Salt koncentration och rengöringsmedel kan också varieras enligt ansökan, men i allmänhet, förutsättningar att bryta öppna atomkärnor (hög salthalt, > 0,1% SDS) bör undvikas eftersom förekomst av gratis DNA kommer att störa immunoprecipitation. Om detta inte kan undvikas, till exempel när komplett cell lysates inklusive kärnor eller pelleterat proteiner behöver analyseras, kan DNA vara klippt av passerar en liten gauge nål före immunoprecipitation cellerna. Detta är att föredra framför ultraljudsbehandling för att förhindra överdriven skumbildning och produktion av radioaktiva aerosoler.
För immunoprecipitation, måste både den optimala mängden antikroppar och bästa tvättlösning för varje antikropp-antigen kombination testas noggrant för att uppnå en balans mellan önskad antigen signal och bakgrund. Antikroppar bör alltid vara närvarande i överskott över antigener att säkerställa kvantitativa immunoprecipitation; en bra utgångspunkt är 1 µg av antikroppar per immunoprecipitation från en 35 mm maträtt/1 x 106 celler. Bakgrunden kan minskas genom att öka den tvättmedel eller salt koncentrationerna. Särskilt tillägg av ≤0.1% SDS kan bidra till att kraftigt minska bakgrunden men kan också störa antikropp-antigen interaktioner. För att kontrollera för specificiteten av antikroppar under immunoprecipitation, bör identiska celler saknar målproteinet användas när det är tillgängligt. Om detta inte är okomplicerad, såsom när endogena proteiner analyseras, fungerar den överuttryck eller utarmning av antigenet. Styra för bakgrund (och specificitet), antingen preimmune sera (om möjligt) eller isotypen kontroller bör användas. För att styra för antigener binder direkt till immunoprecipitation pärlor, bör pärlor utan antikroppar också användas. De villkor som anges här bör betraktas som en utgångspunkt som varje antikropp-antigen par kommer att kräva en optimering av både tvättbuffert och tvätta villkor. Vid för mycket bakgrund, inte öka antalet tvättar men snarare tiden för tvätt och/eller sammansättningen av tvättbuffert. Om särskilt känsliga interaktioner såsom i coimmunoprecipitations måste behandlas, kan det att föredra att bära ut alla tvätta stegen vid 4 ° C, med iskall buffertar.
En fördel med vidhäftande celler över suspension celler är att läkemedel behandlingar kan utföras på nästan varje punkt under puls jakten. Om den används med förkläde-hämmare, exempelvis är det möjligt att skilja dess effekter på de co - kontra posttranslationell faserna i en vikning process. Detta kan utökas genom att anpassa lysis och immunoprecipitation tvätta buffertar (ovan) att coimmunoprecipitation av protein-förkläde komplex under fällbara10,11,12.
Postlysis behandling av prover kommer att utvidga tillämpningsområdet för de frågor som kan lösas. Målproteiner innan immunoprecipitation kommer att ge ytterligare konfirmerande information och har framgångsrikt används för att övervaka den vikningen av proteiner, särskilt de som saknar disulfide obligationer13, begränsad proteas matsmältningen 14. Protein aggregering och komplexa bildande kan övervakas av sackaros täthetlutning centrifugering före immunoprecipitation15,16.
För att dra full nytta av puls jakter, krävs tillgången på högkvalitativa reagenser för immunoprecipitations. När undersöker fällbara intermediärer, är det viktigt att ha antikroppar som klarar av att dra ner alla former av protein under analys. Om specifika antikroppar mot målproteinet inte är tillgängliga, kan detta ersättas med hjälp av affinitet taggar. Dock begränsar detta allvarligt nyttan av postlysis metoder, såsom den begränsade proteolys, direkt sond protein konformation, som endast märkta fragment kan återvinnas.
Känsligheten hos puls jakter begränsas av antalet metionin och cystein rester i proteinet i fråga. Proteiner med lågt antal metionin/cystein rester i kombination med en låg uttryck nivå är omätbara i puls-chase experiment. När du utför postlysis ändringar, till exempel begränsad proteolys, kan bara metionin/cystein-innehållande fragment kommer att upptäckas.
Avslutningsvis, givet den kinetiska detalj som puls jakter ge, de är komplement till många andra tekniker och verktyg som används för att studera molekylär cellbiologi på steady-state-nivå. Som sådan, fortsätter de att vara ett ovärderligt inslag i den molekylära biologen verktygslåda.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna tackar alla medlemmar för Braakman lab, förbi och närvarande för deras fruktbara diskussioner och hjälp i att utveckla de metoder som presenteras i denna artikel. Detta projekt har beviljats medel från både Europeiska forskningsrådet under EU: s sjunde ramprogram (FP7/2007-2013) N ° 235649 och Nederländerna organisation av vetenskaplig forskning (NWO) under den ECHO-programmet N ° 711.012.008.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL safeseal microcentrifuge tubes | Sarstedt | 72.706.400 | |
| Acetic Acid | Sigma | A6283 | glacial acetic acid |
| BAS Storage phosphor screen 20x25 cm | GE Life Sciences | 28956475 | |
| Bromophenol Blue | Sigma | B8026 | Molecular biology grade |
| Carestream Biomax MR films | Kodak | Z350370-50EA | |
| Cell-culture media | Various | N/A | Normal cell culture media for specific cell-lines used |
| Cell-culture media, no methionine/cysteine | Various | N/A | Same media formulation as normal culture media e.g DMEM/MEM/RPMI, lacking methionine and cysteine |
| Charcoal filter paper | Whatman | 1872047 | |
| Charcoal filtered pipette tips | Molecular bioproducts | 5069B | |
| Charcoal vacu-guard | Whatman | 67221001 | |
| Coomassie Brilliant Blue R250 | Sigma | 112,553 | for electrophoresis |
| Cysteine | Sigma | C7352 | Molecular biology grade, Make 500 mM stock, store at -20 |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 10197777001 | Molecular biology grade |
| EasyTag Express35S Protein Labeling Mix | Perkin Elmer | NEG772014MC | Other size batches of label are available depending on useage |
| EDTA | Sigma | E1644 | Molecular biology grade |
| Gel-drying equipment | Various | N/A | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | Molecular biology grade |
| Grade 3 chromatography paper | GE Life Sciences | 3003-917 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 24020117 | |
| Kimwipes delicate task wipes | VWR | 21905-026 | |
| MES | Sigma | M3671 | Molecular biology grade |
| Methanol | Sigma | MX0490 | |
| Methionine | Sigma | M5308 | Molecular biology grade, Make 250 mM stock, store at -20 |
| Minigel casting/running equipment | Various | N/A | |
| NaCl | Sigma | S7653 | Molecular biology grade |
| N-ethylmaleimide | Sigma | E3876 | Molecular biology grade, Make 1M stock in 100% ethanol, store at -20 |
| PBS | Sigma | P5368 | Molecular biology grade |
| Protein-A Sepharose fastflow beads | GE health-care | 17-5280-04 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma | L3771 | Molecular biology grade |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Molecular biology grade |
| Trizma base (Tris) | Sigma | T6066 | Molecular biology grade |
| Typhoon IP Biomolecular imager | Amersham | 29187194 | |
| Unwire Test Tube Rack 20 mm for waterbath | Nalgene | 5970-0320PK |
References
- Ellgaard, L., McCaul, N., Chatsisvili, A., Braakman, I. Co- and Post-Translational Protein Folding in the ER. Traffic. 17 (6), 615-638 (2016).
- Pisoni, G. B., Molinari, M. Five Questions (with their Answers) on ER-Associated Degradation. Traffic. 17 (4), 341-350 (2016).
- Lamriben, L., Graham, J. B., Adams, B. M., Hebert, D. N. N-Glycan-based ER Molecular Chaperone and Protein Quality Control System: The Calnexin Binding Cycle. Traffic. 17 (4), 308-326 (2016).
- Snapp, E. L., et al. Structure and topology around the cleavage site regulate post-translational cleavage of the HIV-1 gp160 signal peptide. Elife. 6, 26067 (2017).
- Braakman, I., Hoover-Litty, H., Wagner, K. R., Helenius, A. Folding of influenza hemagglutinin in the endoplasmic reticulum. Journal of Cell Biology. 114 (3), 401-411 (1991).
- Jansens, A., van Duijn, E., Braakman, I. Coordinated nonvectorial folding in a newly synthesized multidomain protein. Science. 298 (5602), 2401-2403 (2002).
- Land, A., Braakman, I. Folding of the human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein in the endoplasmic reticulum. Biochimie. 83 (8), 783-790 (2001).
- Singh, Y., Garden, O. A., Lang, F., Cobb, B. S. Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function. Journal of Visualized Experiments. (117), e54698 (2016).
- Das, A. T., Land, A., Braakman, I., Klaver, B., Berkhout, B. HIV-1 evolves into a nonsyncytium-inducing virus upon prolonged culture in vitro. Virology. 263 (1), 55-69 (1999).
- Chen, W., Helenius, J., Braakman, I., Helenius, A. Cotranslational folding and calnexin binding during glycoprotein synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (14), 6229-6233 (1995).
- Daniels, R., Kurowski, B., Johnson, A. E., Hebert, D. N. N-linked glycans direct the cotranslational folding pathway of influenza hemagglutinin. Molecular Cell. 11 (1), 79-90 (2003).
- Ferreira, L. R., Norris, K., Smith, T., Hebert, C., Sauk, J. J. Association of Hsp47, Grp78, and Grp94 with procollagen supports the successive or coupled action of molecular chaperones. Journal of Cellular Biochemistry. 56 (4), 518-526 (1994).
- Hoelen, H., et al. The primary folding defect and rescue of DeltaF508 CFTR emerge during translation of the mutant domain. PLoS One. 5 (11), 15458 (2010).
- Kleizen, B., van Vlijmen, T., de Jonge, H. R., Braakman, I. Folding of CFTR is predominantly cotranslational. Molecular Cell. 20 (2), 277-287 (2005).
- Hagiwara, M., Ling, J., Koenig, P. A., Ploegh, H. L. Posttranscriptional Regulation of Glycoprotein Quality Control in the Endoplasmic Reticulum Is Controlled by the E2 Ub-Conjugating Enzyme UBC6e. Molecular Cell. 63 (5), 753-767 (2016).
- Copeland, C. S., Doms, R. W., Bolzau, E. M., Webster, R. G., Helenius, A. Assembly of influenza hemagglutinin trimers and its role in intracellular transport. Journal of Cell Biology. 103 (4), 1179-1191 (1986).
