Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

Protein katlanması, taşıma ve canlı hücreler radyoaktif darbe Chase tarafından bozulması Analizi

Published: February 12, 2019 doi: 10.3791/58952

Summary

Burada tarif biz katlama, taşıma ve yıkımı canlı hücrelerde takip edilecek proteinlerin kinetik analiz sağlar bir genel nabız-chase yöntemi için bir iletişim kuralı.

Abstract

Radyoaktif nabız-chase etiketleme eğitim konformasyon olgunlaşma, taşıma fonksiyonel hücresel konumlarını ve hedef proteinler canlı hücrelerde bozulma için güçlü bir araçtır. Kısa (darbe) radiolabeling kez kullanarak (< 30 dk) ve sıkı kontrol chase kere, toplam protein havuzu yalnızca küçük bir kısmını etiket ve onun katlama izleyin mümkündür. Nonreducing/azaltılması SDS-polyacrylamide jel elektroforez (SDS-sayfa) ve immunoprecipitation (özel biçimi) antikorları ile birleştirildiğinde, süreçleri katlama ayrıntılı olarak incelenebilir. Bu sistem özellikleri çözünür protein, tekli ve çoklu geçiş transmembran proteinler, ağır N ve O glikozile proteinler gibi büyük bir varyasyon ile protein ve protein ve geniş disülfür olmadan Katlama çözümlemek için kullanılan bağ. Nabız-chase yöntemleri co ve ardından değişiklikleri, Oligomerizasyonda ve polimerizasyonu, temelde analiz bir protein doğumdan ölüme izin dahil olmak üzere ek özellikleri bir dizi içine kinetik çalışmalar temelidir. Nabız-chase çalışmalar protein katlanması üzerinde çalışmak için proteinler vitro artan zamansal çözünürlük ve fizyolojik bilgi sağlayarak diğer Biyokimya ve biyofizik yöntemleri ile tamamlayıcı niteliktedir. Bu kağıt içinde açıklandığı gibi yöntemleri kolayca neredeyse memeli ya da böcek-hücre sistemlerinde ifade edilebilir herhangi bir protein katlama çalışmaya adapte.

Introduction

Hatta nispeten basit protein katlama birçok farklı katlama enzim, moleküler chaperones ve kovalent modifikasyon1içerir. Bu işlemler vitro tam bir sulandırma farklı bileşenleri dahil çok sayıda göz önüne alındığında pratik olarak mümkün değildir. Bu nedenle, in vivo, canlı hücrelerde katlama protein çalışmaya son derece arzu edilir. Radyoaktif nabız-chase teknikleri sentezi, katlama, taşıma ve proteinlerin kendi doğal ortamlarında bozulma çalışmak için güçlü bir araç kanıtlamak.

Metabolik 35S etiketli metiyonin/Sistein ile kısa bir darbe sırasında proteinlerin etiketleme, radyoaktif bir etiket yokluğunda bir kovalamaca ardından, daha geniş hücresel ortamında yeni sentezlenmiş protein bir nüfusun belirli izlenmesini sağlar. Sonra hedef proteinler ve üzerinden SDS-sayfası veya diğer tekniklerle analiz izole yolu ile immunoprecipitation olabilir. Çoğu protein için onların yolculuk boyunca hücre SDS-sayfa jel üzerinde görülebilen değişiklikler tarafından işaretlenir. Örneğin, taşıma glikozile proteinlerin endoplazmik retikulum (ER) üzerinden Golgi kompleksi kez glukanlardir N bağlı değişiklikler veya ek O bağlantılı glukanlardir2,3tarafından eşlik ediyor. Bu değişiklikler büyük artışlar SDS-sayfa hareketlilik değişiklikler görülebilir belirgin molekül ağırlığı neden. Olgunlaşma, sinyal peptid bölünme veya pro-peptidler, değişiklikleri kolayca SDS-sayfa jel4üzerinde takip edilmesi belirgin molekül ağırlığı sonuçlanan kaldırılması gibi proteolitik kesim tarafından da işaretlenebilir. Radyoaktivite vardır sikloheksimit çarpma gibi karşılaştırılabilir teknikleri üzerinde önemli avantajlar olarak daha uzun tedaviler hücrelere zehirlidir ve büyük, kararlı durum proteinler çoğunluğu dışlamayın nerede roman protein sentezi, engellenir Analizi, bazı proteinler yarım-gün canlıdır. Proteinler nonreducing her ikisi de altında karşılaştırılması ve koşulları azaltmak sağlar analiz disülfit bağı oluşumu, birçok salgı proteinler4,5,6, katlanır önemli bir adım 7.

Burada biz bir radyoaktif nabız-chase yaklaşım kullanarak protein katlanması ve sağlam olan hücrelerde taşıma analizi için genel bir yöntem açıklanmaktadır. Yöntemi olarak sağlamak amaçlanmıştır iken mümkün olduğunca ayrıntılı protokol adaptasyon için neredeyse sınırsız bir potansiyele sahiptir ve optimizasyon her okuyucunun spesifik proteinlerin çalışmaya izin verir.

İki alternatif darbe-chase protokol, bir yapışık hücreleri (adım 1.1 burada sunulan Protokolü) ve süspansiyon hücreleri (adım 1.2 burada sunulan Protokolü) için sağlanır. Koşulun sağlanması halinde burada orta-yüksek ifade düzeyleri ile ifade edilen bir protein görselleştirmek yeterli vardır. Eğer okuyucu kötü ifade proteinler veya birden çok immunoprecipitations gibi çeşitli posttreatment koşulları ile çalışma çanak boyutunu artırın veya uygun şekilde sayı hücre gereklidir.

Süspansiyon darbe chase için her zaman noktada alınan chase örnekler tüm hücreleri tek bir tüp alınır. Darbe ihmal sonra yıkama adımları; Bunun yerine, daha fazla 35S birleşmesiyle etiketlenmemiş metionin ve sistein yüksek bir fazlalığı ile seyreltme tarafından engellenir.

Hücresel protein katlanması işlemlerini takip için radyoaktif 35S etiketli sistein ve metionin sunulan iletişim kurallarını kullanır. Radyoaktif reaktifleri ile tüm işlemleri herhangi bir operatör ve radyoaktif Radyasyon ortamına maruz en aza indirmek ve belirlenmiş bir laboratuarda gerçekleştirilen uygun koruyucu önlemleri kullanılarak gerçekleştirilmelidir. Nabız-chase teknik etiketleme kısa darbe zamanlarda nispeten verimsiz (< 15dk), radyoaktivite başlangıç miktarı % 1'i yeni sentezlenmiş protein dahil daha az. Üzerinden hedef protein immunoprecipitation zenginleştirme sonra radyoaktivite başlangıç miktarı daha az % 0.05 SDS-sayfa için örnek içerir.

35S metionin ve mix etiketleme sistein stabilize rağmen bazı ayrıştırma radyoaktif uçucu bileşikler, verimli, ortaya çıkar. Araştırmacı ve aparatı korumak için bazı önlemler alınmalıdır. Araştırmacı her zaman yerel radyasyon güvenlik kurallarına itaat etmelisin ve maske, önlük ve eldiven (Çift Kişilik) yanı sıra hemşirelik kömür olabilir. Hisse senedi şişeleri 35S metionin ve sistein ile her zaman bir duman başlıklı veya yerel aspirasyon noktası altında açılmalıdır. Bilinen laboratuvar kirlenme Santrifüjler Pipetler, su hamamlar, kuluçka ve shakers noktalardır. Bu alanların kirlenme pipet ipuçlarını kullanarak bir kömür filtre, pozitif-mühür microcentrifuge tüpler ( Tablo malzemelerigörmek), akvaryum kömür sünger nabız-chase yemekleri yapıştırılmış su banyoları, kömür filtre gazetelerde azalır, aspirasyon sistemi ve bulaşık kuluçka ve saklama kapları kömür tahıl içeren yerleşimini kömür muhafız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm radyoaktif reaktifler ve yordamlar yerel Utrecht Üniversitesi radyasyon kurallara ve düzenlemelere uygun şekilde ele.

1. darbe Chase

  1. Nabız Chase yapışık hücreleri için
    Not: burada verilen birimleri 60 mm hücre kültür yemekleri üzerinde temel alır. 35 mm veya 100 mm yemekleri için birimleri tarafından 1/2 ya da 2, sırasıyla çarpın. Bu iletişim kuralı 0, 15, 30, 60, 120 ve 240 min 10 dk ve chase kez darbe zamanı kullanır. Bunlar belirli proteinler (Aşağıda tartışılan) okudu bağlı olarak farklı olabilir.
    1. Böylece onlar olacak altı 60 mm hücre kültür yemekleri tohum yapışık hücreleri (Örneğin, HEK 293, HeLa, CHO) subconfluent (% 80-%90) nabız chase gününde. Zaman noktası ve/veya koşulu başına en az bir tabak kullanın.
    2. Gerekirse, üreticinin yönergelerine göre piyasada bulunan transfection reaktifler hücrelerle transfect; veya virally hücreleri ifade için uygun yapı ile nabız-chase önce 1 gün deneme8 transduce.
    3. Bulaşık yıkama arabelleği (Hank'in dengeli tuz solüsyonu [HBSS]) 2 mL ile açlık Orta (normal kültür metionin ve sistein ve fetal Sığır serum [FBS], metionin ve sistein olmadan en az gerekli orta [MEM] gibi eksik Orta 2 mL ekleyin Ama 10 mM HEPES, pH 7.4 ile) ve bulaşıkları bir 37 ° C oksijen kuluçka makinesi %5 CO2 ile 15 dakika yerleştirin.
    4. Böylece onlar su ile temas ancak değil float bulaşıkları raflar prewarmed 37 ° C su banyosu içinde aktarın. Bir sayacı başlatmak.
    5. 40 s, açlık orta Aspire edin, darbe çözüm (açlık medya + etiket, adım 1.1.1 önceki nota bakın 55 µCi/35 mm çanak) 600 µL kadar çizmek pipet içine ve yavaşça yemeğin ortasına doğru tam olarak 1 dakika tekrar bu adımı t için 1 dk aralıklarla ekleyin o kalan yemekleri. Denemeniz sırasında zaman kazanmak için en uzun kovalamaca örnek ile başlayın.
      Not: radyoaktif madde ele alırken, uygun önlemler ve yerel kurallar ve düzenlemeler kazayla maruz kalma ve/veya kontaminasyonu önlemek için takip için gerekli olduğunu.
    6. Tam olarak 11 dk ve 0 dk chase örnek dışında tüm aşağıdaki yemekleri için doğrudan yemek için chase Orta 2 mL ekleyin, bu Aspire edin ve tekrar, chase Orta 2 mL ekleyin. 1 dk aralıklarla kalan yemekler için bu adımı yineleyin. Tüm yemekler 37 ° C kuluçka aktarın.
    7. Tam olarak 16 dk chase Orta 2 mL ekleyin (normal kültür orta + 10 mM HEPES [pH 7.4], 5 mM sistein ve 5 mM metionin) 0 dk örnek yemek üstüne etiketleme; durdurmak için nabız orta için doğrudan o zaman, hemen Aspire edin, çanak için soğutmalı alüminyum plaka aktarmak ve buz gibi dur arabellek (HBSS + 20 mM N- ethylmaleimide [NEM]) 2 mL ekleyin.
      Not: 0 dk chase örnek bu. Bu örnek için doğrudan 1.1.9 adım geçin.
    8. Her chase yemeğin geri su banyosu için 2 dk önce her chase zaman (Örneğin, bir 15dk chase için 24 dk) aktarmak ve, tam chase zaman (Örneğin, bir 15dk chase için 26 dk), chase medya Aspire edin (veya pr takip microcentrifuge tüp aktarmak Otein salgılanması) ve bir soğutulmuş alüminyum tabak çanak transfer. Buz gibi dur arabellek 2 mL ekleyin.
    9. Tüm yemekler buz durağı arabellek ≥5 min için kuluçkaya; o zaman, durmak eriyik Aspire edin ve buz gibi durmak eriyik 2 mL ile yıkayın. Yıkama Aspire edin ve yemekleri ile lizis arabelleği 600 µL parçalayıcı (fosfat tamponlu tuz [PBS] + nondenaturing deterjan [bkz: Malzemeler tablo] + proteaz inhibitörleri + 20 mM NEM). Bulaşıkları kantitatif lysed emin olmak için bir hücre kazıyıcı kullanın.
    10. Transfer lysate 1.5 mL microcentrifuge tüp ve santrifüj 15.000-20.000 x g , 10 min ve 4 ° C çekirdekleri cips.
  2. Nabız Chase süspansiyon hücreler için
    Not: verimli etiketleme emin olmak için hücreleri bir konsantrasyon 3 x 106 5 x 106 hücre/ml, Geniş puls ve chase birimleri 4 x nabız cilt olmalıdır. Aşağıdaki örnekte, 5 x 106 hücre 10 dk 1 ml hacminde Geniş puls, verim için beş saat chase puan (0, 15, 30, 60 ve 120 dk) 1 ml 1 x 106 hücreler her zaman noktası içeren. Tüm çözümler Bölüm 1.1 ile aynıdır.
    1. Böylece hücreleri yeterli sayıda deneme, zaman zaman başına en az 1 x 106 hücre üzerine gelin ve/veya durumu (Örneğin, 3T3, Jurkat) daha önce yayımlanan Protokolü9 göre süspansiyon hücre kültür.
    2. Gerekirse, üreticinin yönergelerine göre piyasada bulunan transfection reaktifler hücrelerle transfect veya virally hücreleri ifade için uygun yapı ile nabız-chase önce 1 gün deneme8 transduce.
    3. 5 x 106 hücre başına 50 mL tüp durumda vasıl 250 x g oda sıcaklığında 5 min için cips, onları yıkamak ile açlık medya, 5 mL 1 x onları tekrar cips ve onları açlık medya 1 mL resuspend.
    4. Hücreleri 37 ° C su banyosu aktarmak ve alt kısmında yerleşme hücreleri önlemek için her 10-15 dk tüpler 10-25 dk. kışkırtmak için onları kuluçkaya.
    5. Sayacı başlatmak. Tam olarak 1 dk, hücreleri içeren tüp doğrudan 275 µCi (55 µCi/1 x 106 hücreler) su katılmamış etiket eklemek ve karıştırmak için girdap.
      Not: radyoaktif madde ele alırken, uygun önlemler ve yerel kurallar ve düzenlemeler kazayla maruz kalma ve/veya kontaminasyonu önlemek için takip için gerekli olduğunu.
    6. Tam olarak 11 dk chase medya 4 mL ekleyerek etiketleme durdurmak. Örnek karıştırın ve hemen 1 mL 15 mL tüp buz, buz gibi durmak eriyik 9 mL içeren transfer.
      Not: 0 dk chase örnek bu.
    7. Her bir her başarılı zaman nokta için bu adımları yineleyin. Bir kez tüm zaman puan topladı, 250 x g 4 ° C'de 5 dakika için hücreleri cips Orta Aspire edin (veya protein salgılanması takip için yeni bir 15 mL tüp aktarmak). 5 mL durak çözüm de hücrelerle yıkama ve 250 x g 4 ° C'de 5 dakika için hücreleri cips
    8. Durmak eriyik Aspire edin, tamamen buz gibi lizis arabelleği 300 µL içeren hücreleri parçalayıcı ve onları tam lizis sağlamak için buz üzerinde 20 dk için kuluçkaya. Transfer lysate 1.5 mL microcentrifuge tüp ve santrifüj 15.000-20.000 x g çekirdekleri cips için 4 ° c de 10 dakika.

2. Immunoprecipitation

  1. Antikor birleştirmek (konuya bakın) ve 50 µL immunoprecipitation boncuk (örneğin, protein A-Sepharose) (% 10 süspansiyon [v/v] lizis arabellek + %0.25 Sığır serum albümin [BSA]) bir microcentrifuge içinde tüp ve onları 4 ° c ~ 30 dk bir shaker için kuluçkaya.
  2. Boncuk, 12.000 x g oda sıcaklığında 1 dk. için cips ve süpernatant Aspire edin. Lysate, 200 µL antikor-boncuk karışıma ekleyin ve bir shaker 1s veya baş-over 4 ° C'de immunoprecipitation gerektiriyorsa, kuluçkaya > 1 h.
  3. Boncuk, 12.000 x g oda sıcaklığında 1 dk. için cips. Süpernatant Aspire edin ve immunoprecipitation yıkama arabellek 1 mL ekleyin. Bir shaker oda sıcaklığında 5 min için örnek bir yer.
  4. 2.3. adımda açıklandığı gibi boncuk cips ve yıkama tekrar 1 x. Daha sonra süpernatant Aspire edin ve boncuk TE arabellek, pH 6.8 (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA) 20 µL içinde resuspend. Girdap örnek.
  5. 2 örnek arabellek olmadan indirgeyici, x 20 µL eklemek girdap, 95 ° C ve girdap 5 min için tekrar ısı.
    Not: 500 mm DTT 2 µL azalan bakiyeli örnekleri hazırlama yalnızca, bu noktada eklenmelidir. O zaman, 2.7 adıma geçin.
  6. Boncuk 2.3 adımda anlatıldığı gibi cips. 500 mm DTT 1 µL içeren bir taze microcentrifuge tüp nonreduced süpernatant ile 19 µL aktarmak, örnek ve girdap santrifüj kapasitesi 95 ° C'de 5 min için tekrar ısıtma daha önce.
  7. Spin aşağı 12.000 x g, 1 dk. için örnek; azaltılmış örnek bu. Aşağı oda sıcaklığına kadar serin ve 1 m NEM 1.1 µL hem azalır ve nonreduced örnek ekleyin. Girdap ve örnekleri aşağı spin.

3. SDS-SAYFA

  1. Önce uygun SDS-sayfa çözme jel yüzdesini protein için faiz belirleyin. Örneğin, HIV-1 gp120, ne zaman deglycosylated, ~ 60 kDa çalışır ve % 7.5 jel içinde analiz edilir.
  2. Üreticinin yönergelerine göre TEMED olmadan çözme jel karışım hazırlamak (% akrilamid, 375 mM Tris-HCl [pH 8.8,] % 0,1 SDS [w/v], x ve % 0.05 amonyum Persülfat [APS] [w/v]) ve için vakum altında degas > 15 dak. Jel karışım gaz giderme iken, iyice jel cam plakanın % 70 etanol ve hav bırakmayan dokular ile temiz ve bir döküm aparatı koyun.
  3. TEMED (at %0,005 [v/v] son bir konsantrasyon) çözme jel karışımı ekleyin, iyice karıştırın ve cam plakanın istifleme jel için ~1.5 cm boşluk bırakarak arasında pipet. Dikkatle deiyonize H2O veya isopropanol ile jel kaplama ve polimerize için bırakın.
  4. Sonra çözme jel polimerli, yığın jel karışım hazırlamak (%4 akrilamid, 125 mM Tris-HCl [pH 6.8], % 0,1 SDS [w/v] ve % 0,025 APS [w/v]).
  5. Çözme jel deiyonize H2O ile üst floş ve tüm su kaldır.
    Not: filtre kağıdı son damla kaldırmak için kullanın.
  6. TEMED yığın jel karışımı (%0,005 [v/v]) ekleyin, iyice karıştırın ve yığın jel ile çözme jel kaplama ve bir 15-iyi tarak yerleştirin. Yığın jel polimerli bir kez çalışan bir odasına aktarmak ve tampon çalıştıran ile alt ve üst odaları doldurmak (25 mM Tris-HCl, 192 mM glisin [pH 8.3] ve % 0.1 SDS [w/v]).
  7. Örnek 15-lane minigel şeritte başına 10 µL yükleyin. İlk örnekleri ve jel son Lane'de yüklenmesini önlemek ve nonreducing örnek arabellek grup gülümseyen engellemek için tüm boş şerit yük. Boya açık jel alt kısmında olana jelleri bir 25 mA/jel sabiti çalıştırın.
  8. Jelleri cam plakanın kaldırmak için çözüm protein boyama ile jelleri leke (% 10 asetik asit ve % 30 metanol H2O + %0.25 parlak mavi R250 [w/v]) ile ajitasyon, 5 min için ve sonra 30 dk (boyama çözüm destaining ile destain çözüm olmadan parlak mavi R250).
  9. Jelleri aşağı dönük bir plastik wrap ve görüntülenmemesini 0.4 mm Kromatografi kağıt üstünde tepe-in onları düzenleyin. Jel sandviç Kromatografi kağıt tarafında bir jel kurutma makinesi yerleştirin. Üreticinin yönergeleri izleyerek, 80 ° C'de 2 h için jeller Kuru
  10. Kurutulmuş jelleri bir kaset için transfer ve onları autoradiography film ya da fosfor ekran yerleşimi. Autoradiography film kullanıyorsanız, bu adımı karanlık bir odada gerçekleştirilmelidir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Katlama ve HIV-1 gp120 bir yapisan darbe chase üzerinden salgılanmasını Şekil 2' de gösterildiği. Nonreducing jel (şekilde hücreleri NR) oksidatif gp120 katlama gösterir. Nabız hemen sonra 5 dk (0 dak chase) gp120 etiketleme diffüz grup jel içinde daha yüksek olarak görünür ve chase ilerledikçe grup jel ile aşağı daha da sıkı grup (NT) birikir kadar ara ürün (BT) katlanır yayılmış geçirir Yerel olarak katlanmış gp120 temsil eder. Disülfür bağları oluşumu tam olarak düşük protein daha hızlı geçirmek neden protein, kompakt arttıkça bu oluşur. Öyle ki her chase zaman, bunlar mobilite etkilemez, azalan bakiyeli jel (şekilde hücreleri R), tüm form disülfür bağları azaltılmıştır. Bu diğer değişiklikleri analiz sağlar. Rc Ru üzerinden zaman kayması gp120 ardından sinyal peptid bölünme temsil eder: daha fazla protein yerli kat ulaşmak ve onların sinyal peptid kaybetmek gibi büyük kovalamaca sırasında artar sinyal peptid kaybı nedeniyle hareketliliği artar. Her iki nonreducing ve azalan bakiyeli jel üzerinde sinyal ~ 1 h ileriye gp120 salgısı nedeniyle azalmaya başlar. Bu medya (orta şekilde) analiz ederek izlenebilir. Nonreducing ve azalan bakiyeli jelleri karşılaştırılması disülfür bağ değişiklikleri ve sinyal peptid kaldırma ortaya çıkarır. Bir başka değişiklik, N bağlı glikozilasyon ve glycan değişiklikler, gp120 (ve Analizi) sindirim endoglycosidase H hemen önce SDS-sayfa ile tarafından çıkarıldı çünkü bu mümkün oldu.

µ Ağır zincir immünglobulin M (IgM) bir süspansiyon darbe takip üzerinden ticareti Şekil 3' te gösterilmiştir. Bir vardiya zamanla HCER HCGolgi için acil servis salgı hücreden önce gelir Golgi ile µ zinciri ticareti temsil eder. Molekül ağırlığı bu değişikliği N bağlı glukanlardir Golgi içinde değiştirilmesi nedeniyle oluşur.

Figure 1
Resim 1 : Darbe chase, immunoprecipitation ve SDS-sayfa için protokol Şematik diyagramı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 : Katlanır ve HIV-1 gp120, yapisan darbe chase tarafından belirlenen salgılanmasını. Subconfluent 60 mm yemekleri HeLa hücre HIV-1 gp120 ifade edildi 10 dakikadır etiketli ve için belirtilen kovaladı darbe kez. Gp120 immunoprecipitation sonra örnekleri deglycosylated vardı ve % 7.5 SDS-sayfa jel kullanılarak analiz. Bu katlama intermediates; = NT yerel gp120; = Ru düşük sinyal peptid uncleaved gp120; = RC düşük sinyal peptid i ciddi gp120; = ND: nonreducing =; R = azaltılması. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. 

Figure 3
Şekil 3 : IgM ağır zinciri kaçakçılığı, süspansiyon darbe chase tarafından belirlenen. 5 x 106 I.29 µ+ B hücreleri vardı 5 min için etiketli ve için belirtilen kovaladı darbe kez. İmmunoprecipitation sonra % 10 SDS-sayfa jel kullanarak örnekleri analiz edildi. HC = immünglobulin µ ağır zinciri; LC = immünglobulin hafif zinciri. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Nabız-chase yöntemleri protein sağlam hücreleri katlama bilim adamlarının anlayış geliştirmek için gerekli olmuştur. Biz mümkün olduğu kadar genel bir yöntem sağlamak teşebbüs ederken, bu yaklaşım katlanır, taşıma ve yaşam proteinlerin hücre içinde sırasında oluşan çeşitli işlemleri incelemek neredeyse sınırsız varyasyonları için potansiyele sahiptir.

Yemekleri yapışık hücreleri kullanarak bir darbe takip gerçekleştirirken, aynı ayrı tabak olarak mümkün olduğu kadar her zaman noktası ve/veya koşulu bir deneyde kullanılan her yemeğin tedavi gereklidir. Özellikle kısa darbe ve chase süreleri için (< 5 dk), darbe ve chase kez üzerinde sıkı bir denetimi (bir dijital zamanlayıcı ile) korumak için önemlidir. Nabız kovalayan süspansiyon hücreleri ile tüm örnekleri tek bir tüp alınır gibi bu değişkenliği azaltmak için yardımcı olabilir. Bazı hücre tipleri kültür yemekleri daha az iyi diğerlerinden daha uygun gibi hücreleri uzak çeşitli Orta değişiklikleri sırasında yıkanır değil emin olmak için özen gösterilmelidir. Bu süspansiyon bu hücreler kullanarak veya kültür yemekleri hücrelere bağlı kalmak için yemekleri poli-L lizin veya jelatin, örneğin, ile kaplama üstesinden gelebilir. Yemekler arasında etiketleme tekrarlanabilirlik ölçmek için lysate örneği aynı toplam etiketleme ve protein deseni için tüm örneklerini denetlemek için SDS-sayfa tarafından incelenmesi gerekir. Alternatif olarak, lysates sıvı mercek sayma toplam dakika başına sayıları (BGBM) dahil ama bilgi etiketli protein nüfus sağlamak değil kuracak.

Eğer kötü bir hedef protein etiketleri, sinyal hücreleri (veya yemekleri) sayısını arttırmak yerine etiket miktarını artırarak artar. Kinetik okudu sürecinin bu sağlayacak darbe zamanı uzatma bir seçenek olacaktır. İdeal darbe zamanı ifade düzey, transkripsiyon hızı, methionines/katıldı sayısını ve protein katlama oranı gibi faktörler sayesinde her hedef ile değişir. Bu nedenle, deneme deneysel amacı göz önünde tutarak iken her denemede yukarıda belirtilen faktörler arasında en iyi dengeyi belirlemek için üstlenilen gerekir. Örneğin, katlama sırasında ara ürün incelendiği, için etiket olarak kısa bir süre başlangıç materyali bir gelişeceğini devlet gibi mümkün olduğunca yakın ifade düzeyleri dengeleme mümkün olduğunca darbe için arzu edilir. Taşıma veya bir protein yıkımı çalışmanın hedefi ise, alternatif olarak, darbe kez kinetik bilgi ödün vermeden sinyal olası en yüksek düzeyde sağlamak için uzatılmış. Genel olarak, darbe kez 2-15 dk ne zaman değişiklik yapmadan bu iletişim kuralını kullanan arasında olabilir. Önceki deneme5 ~ 10 gecikme süresini göstermiştir radyoaktivite toplam protein havuza; birleşme önce nabız sonra s Bu darbe-chase deneyler kinetik bilgilerden kaynaklanan akılda tutmak önemlidir. Kısaca nabız (< 2 dk), su banyosu üzerinde tüm yemekler sırasında tüm darbe zamanı tutmak. Eğer nabız zaman (> 1 h) vardır kullanılan, nabız sesi tarafından 1.5 kat artırmak ve bulaşıkları kurumasını önlemek için darbe sırasında bir rocker 37 ° C kuluçka yemekleri yerleştirmek için tavsiye edilir. Etiketleme çözümleri bireysel 35S-metiyonin/sistein ya da bir karışımı içeren mevcut olmakla birlikte, her ikisi de genel protein sentezi korumak için gerektiğinde bile yalnızca metiyonin veya sistein içerir protein etiketli olmak zaman karışımı tercih edilir hücrede. Deneysel koşullar belirli metiyonin/sistein etiketleme gerektiriyorsa, darbe sırasında nonradioactive metiyonin/sistein düzeyi buna göre ayarlanması gerekir.

Chase kez (ve zaman puan sayısı) benzer bir şekilde belirlenir. Chase ilk (sonra 0 dk chase) darbe zamanı eşit olarak ayarlayın ve sonra her her başarılı zaman noktası süreyi iki katına için iyi bir başlangıç yeri olan (Örneğin, 5, 10, 20 ve 40 dk). Ancak, bu her belirli protein ve soru için optimize edilmiş olması gerekir.

Stres Yanıt-e doğru harekete geçirmek (etkileyebilecek protein sentezi ve katlama) açlık tarafından ideal olarak önlemek için bazı etiketsiz metionin ve sistein açlık ve radiolabeling çözümler eklenmelidir. Miktar hücre, etiketleme zaman, kullanılan radiolabel miktarı ve medya birimler üzerinde bağlıdır ve test gerekir. İyi bir başlangıç noktası sistein ve metionin giderek artan bir darbe kez artmış hücre kültür orta mevcut miktarı % 1 ' dir. Açlık dönemleri, ile veya olmadan etiketlenmemiş amino asitler, yeterli etiket birleşme sağlamak ve stres yanıt aktivasyonu önlemek için 15-30 dakika aralığında tutulmalıdır. Genişletilmiş bir darbe (≥1 h) kullanırken, açlık gerekli değildir.

Burada açıklanan lizis arabellek çoğu amaç için uygun olacak, ama prensip olarak, HEPES, Tris veya MES, gibi herhangi bir tampon sistemi işe yarayacaktır. Hücreleri parçalayıcı için gerekli deterjan konsantrasyon hücreleri ve deterjan birim sayısına bağlı olacaktır. Konsantrasyonu her zaman kritik micelle konsantrasyonu (CMC) ve deterjan hücreleri parçalayıcı için yeterli miktarı olmalıdır. Ampirik bir kural olduğunu 200 µL % 0.5 nondenaturing deterjan ( Tablo malzemelerigörmek) ~ 1 mg protein (~ 1 x 106 hücreler) hücre denk koşullar için yeterli. Tuz konsantrasyonu ve deterjanlar da uygulamaya göre değişik, ama genel olarak, çekirdek kırmak koşulları açık (yüksek tuz, > % 0,1 SDS) ücretsiz DNA varlığı ile immunoprecipitation engel olacaktır kaçınılmalıdır. Eğer çekirdek ya da pelleted proteinler de dahil olmak üzere tam hücre lysates çözümlenmesi gerektiğinde, bu, örneğin, kaçınamayız DNA küçük gauge iğne immunoprecipitation önce hücreleri geçerek güdülmesini. Bu aşırı köpük önlemek için sonication ve radyoaktif aerosoller üretimi üzerinden tercih edilir.

İmmunoprecipitation için her antikor-antijen birleşimi için en iyi yıkama arabellek ve antikorlar optimal miktarı iyice istenen antijen sinyal ve arka plan arasında bir denge elde etmek için test edilmelidir. Antikorlar her zaman mevcut olmalıdır fazla antijenleri nicel immunoprecipitation; emin olmak için üzerinde iyi bir başlangıç noktası antikor immunoprecipitation bir 35 mm çanak/1 x 106 hücre başına 1 µg var. Arka plan deterjan veya tuz konsantrasyonları artırarak Azaltılabilecek. Özellikle, ≤0.1% SDS ek arka plan büyük ölçüde azaltmaya yardımcı olabilir ama ayrıca antikor-antijen etkileşim bozabilir. Antikorlar özgüllük için immunoprecipitation sırasında denetlemek için aynı hücreleri hedef protein eksik kullanılabilir olduğunda kullanılmalıdır. Bu basit, ne zaman endojen proteinler çözümlenmekte gibi değilse, overexpression veya antijen tükenmesi çalışır. Arka plan (ve özgüllük) için her iki preimmune sera (mümkünse) kontrol etmek için veya izotip denetimleri kullanılması gerekir. Doğrudan immunoprecipitation boncuk için bağlama antijenleri için denetlemek için boncuk antikor olmadan da kullanılmalıdır. Her antikor-antijen çifti bir optimizasyon yıkama arabellek ve yıkama koşulları gerektirir gibi burada sağlanan koşulları bir başlangıç noktası olarak düşünülmelidir. Çok fazla arka plan durumunda sayısı yıkar, ancak oldukça çamaşır süre ve/veya yıkama arabellek bileşimi artırmayın. Özellikle hassas etkileşimlerde coimmunoprecipitations gibi ele alınması gerekiyorsa, buz gibi arabellekleri kullanarak 4 ° C'de yıkama adımların tümünü gerçekleştirmek için daha uygun olabilir.

Süspansiyon hücre yapışık hücreleri bir avantajı tedavi hemen hemen herhangi bir noktada darbe kovalamaca sırasında gerçekleştirilen bu ilaçtır. Örneğin, refakatçi işlemcimiz kullandıysanız, co - karşı ardından aşamaları katlama işlemi üzerindeki etkileri ayırt etmek mümkündür. Bu (coimmunoprecipitation izin vermek için yukarıda açıklanan) lizis ve immunoprecipitation yıkama arabellekleri adapte tarafından protein-refakatçi kompleksleri katlama10,11,12sırasında genişletilebilir.

Örnekleri postlysis tedavisinde ele alınabileceği sorular kapsamını genişletecektir. Sınırlı proteaz sindirim immunoprecipitation ek konformasyon bilgi verecek ve başarıyla özellikle disülfür bağları13eksik proteinlerin katlama izlemek için kullanılan önce hedef proteinlerin 14. Protein toplama ve karmaşık oluşumu sükroz yoğunluğu-gradient Santrifüjü immunoprecipitation15,16önce tarafından izlenebilir.

Nabız kovalayan tam olarak yararlanmak için yüksek kaliteli reaktifler durumu immunoprecipitations için gerekli olduğunu. Katlama ara ürün incelerken, protein analizi altında her türlü aşağı çekerek özelliği olan antikorlar olması esastır. Hedef protein için özel antikorlar mevcut değildir, bu benzeşme Etiketler kullanarak yerine. Ancak, bu ciddi gibi sadece tagged parçaları elde edilebilir gibi protein uyum doğrudan soruşturma için sınırlı proteolizis, postlysis yöntemleri, kullanışlılığı sınırlar.

Nabız kovalayan duyarlılığını metionin ve sistein kalıntıları söz konusu protein sayısı ile sınırlıdır. Nabız-chase deneylerde proteinler ile az sayıda düşük ifade düzey ile birleştiğinde metiyonin/sistein kalıntıları vardır. Sınırlı proteolizis gibi postlysis değişiklikler yapmadan, sadece metiyonin/sistein-içeren parçaları tespit olacaktır.

Verilen sonuç olarak kovalayan nabız kinetik ayrıntı sağlar, diğer birçok teknikleri ve moleküler hücre biyolojisi yükseliyor-devlet düzeyinde eğitim için kullanılan araçlar için tamamlayıcı niteliktedir. Bu nedenle, çok değerli bir bileşeni moleküler biyolog araç olmaya devam etmektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Yazarlar geçmiş Braakman Lab, tüm üye teşekkür ve, onların verimli tartışmalar için mevcut ve bu makalede sunulan yöntemleri geliştirmede yardımcı. Bu proje Avrupa Araştırma Konseyi Avrupa Birliği'nin yedinci çerçeve programı (FP7/2007-2013) N ° 235649 altında ve Hollanda organizasyon, bilimsel araştırma (NWO) ECHO programı N ° 711.012.008 altında fon aldı.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL safeseal microcentrifuge tubes Sarstedt 72.706.400
Acetic Acid Sigma A6283 glacial acetic acid
BAS Storage phosphor screen 20x25 cm GE Life Sciences 28956475
Bromophenol Blue Sigma B8026 Molecular biology grade
Carestream Biomax MR films Kodak Z350370-50EA
Cell-culture media Various N/A Normal cell culture media for specific cell-lines used
Cell-culture media, no methionine/cysteine Various N/A Same media formulation as normal culture media e.g DMEM/MEM/RPMI, lacking methionine and cysteine
Charcoal filter paper Whatman 1872047
Charcoal filtered pipette tips Molecular bioproducts 5069B
Charcoal vacu-guard Whatman 67221001
Coomassie Brilliant Blue R250 Sigma 112,553 for electrophoresis
Cysteine Sigma C7352 Molecular biology grade, Make 500 mM stock, store at -20 
Dithiothreitol (DTT) Sigma 10197777001 Molecular biology grade
EasyTag Express35S Protein Labeling Mix Perkin Elmer NEG772014MC Other size batches of label are available depending on useage
EDTA Sigma E1644 Molecular biology grade
Gel-drying equipment Various N/A
Glycerol Sigma G5516 Molecular biology grade
Grade 3 chromatography paper GE Life Sciences 3003-917
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Gibco 24020117
Kimwipes delicate task wipes VWR 21905-026
MES Sigma  M3671 Molecular biology grade
Methanol Sigma MX0490 
Methionine Sigma M5308 Molecular biology grade, Make 250 mM stock, store at -20
Minigel casting/running equipment Various N/A
NaCl Sigma S7653 Molecular biology grade
N-ethylmaleimide Sigma E3876 Molecular biology grade, Make 1M stock in 100% ethanol, store at -20
PBS Sigma P5368 Molecular biology grade
Protein-A Sepharose fastflow beads GE health-care 17-5280-04
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Sigma L3771 Molecular biology grade
Triton X-100 Sigma T8787 Molecular biology grade
Trizma base (Tris) Sigma T6066 Molecular biology grade
Typhoon IP Biomolecular imager Amersham 29187194
Unwire Test Tube Rack 20 mm for waterbath Nalgene 5970-0320PK

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ellgaard, L., McCaul, N., Chatsisvili, A., Braakman, I. Co- and Post-Translational Protein Folding in the ER. Traffic. 17 (6), 615-638 (2016).
  2. Pisoni, G. B., Molinari, M. Five Questions (with their Answers) on ER-Associated Degradation. Traffic. 17 (4), 341-350 (2016).
  3. Lamriben, L., Graham, J. B., Adams, B. M., Hebert, D. N. N-Glycan-based ER Molecular Chaperone and Protein Quality Control System: The Calnexin Binding Cycle. Traffic. 17 (4), 308-326 (2016).
  4. Snapp, E. L., et al. Structure and topology around the cleavage site regulate post-translational cleavage of the HIV-1 gp160 signal peptide. Elife. 6, 26067 (2017).
  5. Braakman, I., Hoover-Litty, H., Wagner, K. R., Helenius, A. Folding of influenza hemagglutinin in the endoplasmic reticulum. Journal of Cell Biology. 114 (3), 401-411 (1991).
  6. Jansens, A., van Duijn, E., Braakman, I. Coordinated nonvectorial folding in a newly synthesized multidomain protein. Science. 298 (5602), 2401-2403 (2002).
  7. Land, A., Braakman, I. Folding of the human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein in the endoplasmic reticulum. Biochimie. 83 (8), 783-790 (2001).
  8. Singh, Y., Garden, O. A., Lang, F., Cobb, B. S. Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function. Journal of Visualized Experiments. (117), e54698 (2016).
  9. Das, A. T., Land, A., Braakman, I., Klaver, B., Berkhout, B. HIV-1 evolves into a nonsyncytium-inducing virus upon prolonged culture in vitro. Virology. 263 (1), 55-69 (1999).
  10. Chen, W., Helenius, J., Braakman, I., Helenius, A. Cotranslational folding and calnexin binding during glycoprotein synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (14), 6229-6233 (1995).
  11. Daniels, R., Kurowski, B., Johnson, A. E., Hebert, D. N. N-linked glycans direct the cotranslational folding pathway of influenza hemagglutinin. Molecular Cell. 11 (1), 79-90 (2003).
  12. Ferreira, L. R., Norris, K., Smith, T., Hebert, C., Sauk, J. J. Association of Hsp47, Grp78, and Grp94 with procollagen supports the successive or coupled action of molecular chaperones. Journal of Cellular Biochemistry. 56 (4), 518-526 (1994).
  13. Hoelen, H., et al. The primary folding defect and rescue of DeltaF508 CFTR emerge during translation of the mutant domain. PLoS One. 5 (11), 15458 (2010).
  14. Kleizen, B., van Vlijmen, T., de Jonge, H. R., Braakman, I. Folding of CFTR is predominantly cotranslational. Molecular Cell. 20 (2), 277-287 (2005).
  15. Hagiwara, M., Ling, J., Koenig, P. A., Ploegh, H. L. Posttranscriptional Regulation of Glycoprotein Quality Control in the Endoplasmic Reticulum Is Controlled by the E2 Ub-Conjugating Enzyme UBC6e. Molecular Cell. 63 (5), 753-767 (2016).
  16. Copeland, C. S., Doms, R. W., Bolzau, E. M., Webster, R. G., Helenius, A. Assembly of influenza hemagglutinin trimers and its role in intracellular transport. Journal of Cell Biology. 103 (4), 1179-1191 (1986).

Tags

Katlama radiolabeling SDS-sayfa immunoprecipitation biyokimya sayı: 144 Protein darbe kovalamak konformasyon analizi kinetik
Protein katlanması, taşıma ve canlı hücreler radyoaktif darbe Chase tarafından bozulması Analizi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McCaul, N., Yeoh, H. Y., vanMore

McCaul, N., Yeoh, H. Y., van Zadelhoff, G., Lodder, N., Kleizen, B., Braakman, I. Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase. J. Vis. Exp. (144), e58952, doi:10.3791/58952 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter