Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Ultra-lang Læs sekventering for hele genomisk DNA analyse

doi: 10.3791/58954 Published: March 15, 2019

Summary

Long-Læs sekvenser i høj grad lette samling af komplekse genomer og karakterisering af strukturel variation. Vi beskriver en metode til at generere ultra-lange sekvenser af nanopore-baseret sekventering platforme. Fremgangsmåde vedtager en optimeret DNA-ekstraktion efterfulgt af modificerede bibliotek forberedelser til at generere hundredvis af kilobase læser med moderat dækning fra menneskeceller.

Abstract

Tredje generation enkelt-molekyle DNA-sekventering teknologier tilbyder væsentligt længere læse længde, der kan lette forsamlingen af komplekse genomer og analyse af komplekse strukturelle varianter. Nanopore platforme udfører enkelt-molekyle sekventering ved direkte måling af de aktuelle ændringer medieret af DNA passage gennem porerne og kan generere hundredvis af kilobase (kb) læser med minimal kapitalomkostninger. Denne platform er blevet vedtaget af mange forskere for en bred vifte af applikationer. At opnå længere sekventering Læs længder er den mest kritiske faktor at udnytte værdien af nanopore sekventering platforme. For at generere ultralang læser, skal særligt hensyn undgå DNA beskadigelser og få effektivitet for at generere produktive sekventering skabeloner. Her, leverer vi detaljerede protokollen af ultra-lange DNA-sekventering herunder høj molekylvægt (HMW) DNA-ekstraktion fra friske eller frosne celler, bibliotek opførelse af mekaniske klipning eller transposase fragmentering, og sekventering på en nanopore enhed. Fra 20-25 µg HMW DNA, metoden kan opnå N50 læse længde på 50-70 kb med mekanisk klipning og N50 på 90-100 kb læst længde med transposase medieret fragmentering. Protokollen kan anvendes til DNA ekstraheret fra mammale celler til at udføre hele genome sequencing til påvisning af strukturelle varianter og genom forsamling. Yderligere forbedringer på DNA-ekstraktion og enzymatiske reaktioner vil yderligere øge Læs længden og udvide dens nytte.

Introduction

I det sidste årti, parallel massivt og meget præcise andengenerations høj overførselshastighed sekventering teknologier har drevet en eksplosion af biomedicinske opdagelse og teknologisk innovation1,2,3. Trods de tekniske fremskridt, de korte-læsning af data genereret af andengenerations-platforme er ineffektive i løsning af komplekse genomisk regioner og er begrænset til paavisning af genomisk strukturel varianter (SVs), som spiller en vigtig rolle i menneskelige Evolution og sygdomme4,5. Desuden kort-læse data er ikke i stand til at løse gentage variation og er uegnede til kræsne haplotype udfasning af genetiske varianter6.

De seneste fremskridt i enkelt-molekyle sekventering tilbyder væsentligt længere læse længde, som kan lette afsløringen af det fulde spektrum af SVs7,8,9, og tilbyder præcise og komplette samling af komplekse mikrobiel og pattedyr genomer6,10. Nanopore platform udfører enkelt-molekyle sekventering ved direkte måling af de aktuelle ændringer medieret af DNA passage gennem porerne11,12,13. I modsætning til eventuelle eksisterende DNA-sekventering kemi, nanopore sekvensering kan generere lange (TEN til tusindvis af kilobases) læser i realtid uden at påberåbe polymerase kinetik eller kunstige forstærkning af DNA-prøven. Derfor nanopore long-Læs sekventering (NLR-seq) holder meget lovende for at skabe ultra-lang Læs længder langt ud over 100 kb, som ønsker høj grad fremme genomisk og biomedicinske analyser14, især i lav kompleksitet eller repeat-rige regioner af genomer15.

Den enestående indslag i nanopore sekventering er dets potentiale til at generere lang læser uden en teoretisk længde begrænsning. Derfor, Læs længden er afhængige af den fysiske længde af DNA, der er direkte berørt af DNA integritet og sekventering skabelon kvaliteten. Desuden, afhængigt af omfanget af manipulation og antallet af trin involveret, såsom pipettering styrker og udvinding betingelser, kvaliteten af DNA er meget varierende. Derfor er det udfordrende at give lange læsninger af bare anvende DNA udvinding standardprotokoller og producentens medfølgende bibliotek byggemetoder. Mod dette formål har vi udviklet en robust metode til at generere ultra-lang læse (hundredvis af kilobases) sequencing data fra høstede celle pellets. Vi vedtog flere forbedringer i procedurerne for DNA udvinding og bibliotek forberedelse. Vi strømlinede protokol for at udelukke unødvendige procedurer, der forårsager DNA nedbrydning og skader. Denne protokol er sammensat af høj molekylvægt (HMW) DNA-ekstraktion, ultra-lang DNA bibliotek opbygning og sekventering på en nanopore platform. For en veluddannet molekylærbiolog tager det typisk 6 h fra celle høst til færdiggørelsen af HMW DNA udvinding, 90 min eller 8 h for biblioteket konstruktion afhængigt af metoden klipning, og op til en yderligere 48 h for DNA-sekventering. Brug af protokollen vil give genomforskning Fællesskabet til at forbedre vores forståelse af genom kompleksitet og få ny indsigt i genom variation i menneskelige sygdomme.

Protocol

Bemærk: NLR-seq-protokollen består af tre på hinanden følgende trin: 1) udvinding af høj-Molekylær vægt (HMW) genomisk DNA; 2) ultra-lang DNA bibliotek konstruktion, som omfatter fragmentering af HMW DNA ind i de ønskede størrelser og ligatur af sekventering adaptere til DNA ender; og 3) indlæsning af adapter-forbundet DNA på arrays af nanoporer (figur 1).

1. HMW DNA-ekstraktion

  1. Reagens setup. Gøre 1 x phosphat bufferet saltvand (PBS) buffer (1000 mL) ved tilsætning af 100 mL PBS (10 x) til 900 mL vand og blandes godt. Gøre lysisbuffer (50 mL) ved at tilføje 43,5 mL vand til en 50 mL tube. Tilsæt 500 μL af Tris (1 M, pH 8,0), 1 mL natriumklorid (NaCl) (5 M), 2,5 mL af ethylendiamintetra syre (EDTA) (0,5 M, pH 8,0) og 2,5 mL af sodium dodecyl sulfat (SDS) (10%, wt/vol.) til røret og bland godt.
    Bemærk: Denne PBS buffer kan opbevares ved 4 ° C i op til 6 måneder. Premade lysisbuffer kan gemmes på RT for op til 2 måneder.
  2. Kontrollere celle dødelighed og tælle cellerne. Sikre, at levende forholdet er > 85% og den samlede celle nummer er 30 x 106.
    Bemærk: De celler, der bruges i denne protokol er fra HG00733 cellelinje, en menneskelig lymphoblastoid cellelinje af puertoricanske oprindelse udbredt i 1000 genom konsortium for strukturel variation analyse (se tabel af materialer til bestilling oplysninger), som tilhører til internationale genom prøve ressource.
  3. Indsamle cellerne ved centrifugering ved 200 x g i 5 min på RT. udsmid medium og resuspenderes celle (30 x 106 celler) med 5 mL af 1 x PBS buffer. Centrifugeres igen ved 200 x g i 5 min på RT og supernatanten.
    Bemærk: 25-35 x 106 celler er acceptabel for denne tilgang. Yderligere variation i mængden af celler, der bruges, skal yderligere optimering. Celle pellet kan opbevares ved −80 ° C i op til 6 måneder.
  4. Resuspenderes celle i 200 μl 1 x PBS buffer. Hvis bruger en frossen celle pellet, skylles med 5 mL af 1 x PBS buffer. Centrifugeres løsning på 200 x g i 5 min på RT, supernatanten og resuspend celler i 200 μl 1 x PBS buffer.
  5. Forberede 10 mL af lysisbuffer i en 50 mL tube. Tilføje 200 μl cellesuspension til lysisbuffer og vortex med den højeste hastighed for 3 s. Incubate løsning ved 37 ° C i 1 time.
  6. Tilføje 2 μl af RNase A (100 mg/mL) til den lysate. Forsigtigt rotere 50 mL rør for at blande prøven. Inkuber løsning ved 37 ° C i 1 time.
  7. Tilføje 50 μL proteinase K (20 mg/mL) til den lysate. Forsigtigt rotere 50 mL rør for at blande prøven. Inkuber løsning ved 50 ° C i 2 timer. Under inkubationen blandes forsigtigt stikprøven hvert 30 min.
  8. Fjern 50 mL tube fra 50 ° C og lad det stå på RT i 5 min.
  9. Der tilsættes 10 mL af phenol lag af phenol: chloroform: isoamyl alkohol (25:24:1, vol/vol/vol) til de lysate og rotere røret på en rotator mixer (Se Tabel af materialer) på RT i et stinkskab på 20 rpm i 10 min. Wrap rør cap med parafilm at forhindre lækage under rotation.
  10. Forbered to 50 mL gel rør (Se Tabel af materialer) ved centrifugering ved 1.500 x g i 2 min på RT.
    Bemærk: Gel udgør en stabil barriere mellem nukleinsyre-holdige vandig fase og den organisk opløsningsmiddel.
  11. Hæld prøve/phenol løsning i en af den forberedte 50 mL gel rør fra trin 1.10. Centrifugeres løsning ved 3.000 x g i 10 min. ved RT.
  12. Hæld supernatanten i en ny 50 mL tube. Der tilsættes 10 mL af phenol lag af phenol: chloroform: isoamyl alkohol (25:24:1, vol/vol/vol) og rotere røret på en rotator mixer på RT i et stinkskab på 20 rpm i 10 min.
  13. Gentag trin 1.11 én gang med andet forberedt gel tube.
  14. Hæld supernatanten i en ny 50 mL tube. Tilsættes 25 mL iskold 100% ethanol og forsigtigt dreje røret i hånden indtil DNA udfældes (figur 2).
    Bemærk: Nedbør tilgang hjælper med at stabilisere HMW DNA.
  15. Bøje en 20 μL tip til at gøre en krog. Omhyggeligt tage ud HMW DNA med krog og lad den flydende drop off.
  16. Placere HMW DNA i en 50 mL tube indeholder 40 mL af 70% ethanol. Vask DNA af forsigtigt invertere røret 3 gange.
  17. Gentag trin 1.15 når at indsamle DNA fra 70% ethanol tube.
  18. Sted HMW DNA ind i et 2 mL rør indeholdende 1,8 mL af 70% ethanol.
  19. Centrifugeres vasket HMW DNA på 10.000 x g til 3 s på RT. Fjern så meget af den resterende ethanol som muligt af pipettering.
    Bemærk: Forstyr ikke DNA pellet, når pipettering den resterende ethanol.
  20. Inkuber 2 mL tube ved 37 ° C i 10 min med låget åbent tørre prøven.
    1. Hvis fortsætte med trin 2.1 (med mekanisk klipning og 1 D ligatur sekventering Kit), der tilsættes 1 mL af TE (10 mM Tris og 1 mM EDTA, pH 8,0) til 2 mL tube.
    2. Hvis fortsætte med trin 2.2 (med transposase-baserede fragmentering og hurtige sekventering Kit), tilføje 200 μl af 10 mM Tris (pH 8,0) med 0,02% Triton X-100.
      Bemærk: Forstyr ikke DNA pellet. At lade glasset stå ved 4 ° C i mørke for 48 h vil hjælpe prøve fuldt resuspend. HMW DNA kan opbevares ved 4 ° C i op til 2 uger. Længere opbevaringstid eller andre opbevaringsforhold kan indføre flere korte fragmenter.

2. ultralang DNA bibliotek opbygning

Bemærk: Der er to måder at konstruere de ultra-lang DNA biblioteker baseret på to forskellige klipning metoder kombineret med nanopore sekventering kits. En mekanisk klipning-baseret bibliotek producerer data med en N50 på 50-70 kb, tager omkring 8 h for bibliotek opbygningen. En transposase fragmentering-baserede bibliotek producerer en N50 af 90-100 kb data, tager kun 90 min for bibliotek opbygningen. Den mekaniske klipning protokol giver højere udbytte fra samme DNA input ved hjælp af identiske versioner af sekventering adapter og kvaliteten af nanopore flow celler.

  1. Mekanisk klipning-baseret bibliotek opbygning
    1. Tøvejr og mix reagenser fra ligation kit (Se Tabel af materialer). Tø FFPE DNA reparation buffer og slutningen reparation/dA-hale buffer på is, derefter vortex og spin-ned til mix. Tø adapter mix (AMX) og adapter perle binding buffer (ABB) på is, så pipette og spin-ned til mix. Tø kører buffer med brændstofblanding (RBF) og eluering buffer (ELB) på RT, derefter vortex og spin til mix. Tø indlæsning perler (LLB) bibliotek på RT og pipette til blandes inden brug.
      1. Når optøet, holde alle kit komponenter på is. Tegne enzymer, når det behøves. Bringe de magnetiske perler til RT til brug.
        Bemærk: For anbefalinger på de magnetiske perler til at bruge i tabellen af materialer.
    2. Kontrollere kvaliteten og kvantiteten af HMW DNA fra skridt 1.21.1. Pipette ud af 20 μL af DNA i nye 1,5 mL rør fra tre forskellige steder i HMW DNA røret ved hjælp af P200 bred bore tips. Tage 1 μL fra de tre delprøver til at opdage koncentrationen ved hjælp af en fluorometer og kvalitet ved hjælp af en UV læsning. Tjek gange flere for at bekræfte resultaterne.
      Bemærk: De forventede resultater er vist i figur 3A. OD260/280 -værdi er ca 1,9 og OD260/230 -værdi er ca 2,3.
    3. Overføre de resterende 940 μL af HMW DNA i en 50 mL tube kasket med en lang P1000 bore spidsen.
    4. Opsug alle DNA i en 1 mL sprøjte uden nålen.
    5. Sætte 27 G kanyle på sprøjten og skubbe alle DNA i fælles landbrugspolitik, blidt og langsomt (~ 10 s). Afgang 27 G nål fra sprøjten.
    6. Gentag trin 2.1.4 og 2.1.5 for 29 gange i alt 30 passerer gennem nålen.
      Bemærk: Afrevne HMW DNA kan opbevares ved 4 ° C i mørke, for op til 24 h. kvalitetskontrol (QC) er stærkt anbefalet af pulserende-field gelelektroforese, men det er dyrt og tidskrævende. Hvis udføre QC på en automatiseret puls field gel elektroforese maskinen bruger en 5-150 kb protokol for en 20 h køre. De forventede resultater er vist i figur 4.
    7. Forbered DNA reparation reaktion i en 0,2 mL tube ved at tilsætte 100 μL af afrevne HMW DNA (20 μg), 15 μl af FFPE DNA reparation buffer, 12 μl af FFPE DNA reparation mix og 16 μL nukleasen-gratis vand. Bland reaktionen ved at bladre forsigtigt 6 gange og spin-ned til fjern bobler.
    8. Inkuber reaktion ved 20 ° C til 60 min. overførsel prøven ind i en ny 1,5 mL rør med P200 bred bore spids.
    9. Resuspend de magnetiske perler af pipettering eller vortexing. Tilføje 143 μL perler (1 x) til DNA reparation reaktion og bland forsigtigt ved at bladre røret 6 gange. Rotere røret på en rotator mixer på RT på 20 rpm i 30 min.
    10. Spin ned prøve på 1.000 x g for 2 s på RT. sted røret på en magnetisk rack i 10 min. holde røret på den magnetiske rack og supernatanten.
    11. At holde røret på den magnetiske rack, tilføje 400 μL af frisklavede 70% ethanol uden at forstyrre pelleten. Fjerne 70% ethanol efter 30 s.
    12. Gentag trin 2.1.11 én gang.
    13. Spin ned prøve på 1.000 x g for 2 s på RT. sted røret tilbage på den magnetiske rack. Fjern eventuelle resterende ethanol og lufttørre for 30 s. Over tør ikke pellet.
    14. Fjerne røret fra den magnetiske rack og tilføje 103 μL TE (10 mM Tris og 1 mM EDTA, pH 8,0). Forsigtigt flick rør til at sikre, at perlerne er dækket i bufferen og Ruger på en rotator mixer på RT for 30 min. forsigtigt svirp tube hvert 5 min støtte ophvirvling af toerstoffet.
    15. Pellet perler på den magnetiske rack for mindst 10 min. Overfør 100 μL af eluatet med en bred P200 bore spidsen ind i en 0,2 mL rør.
    16. Forbered ende reparation og dA-hale reaktion i en 0,2 mL rør ved at tilføje 100 μL af reparerede HMW DNA, 14 μL ende reparation/dA-hale buffer og 7 μL af slutningen reparation/dA-hale mix. Bland reaktion ved at bladre forsigtigt 6 gange, og spin-ned til fjern bobler.
    17. Inkuber reaktion ved 20 ° C i 60 min. efterfulgt af 65 ° C i 20 min., og derefter holde på 22° C. Overførsel prøve ind i en ny 1,5 mL rør ved hjælp af en bred P200 bore tip.
    18. Resuspend de magnetiske perler af pipettering eller vortexing. Tilføje 48 μL af perler (0,4 x) til ende reparation/dA-hale reaktion og bland forsigtigt ved at bladre røret 6 gange. Rotere røret på en rotator mixer på RT på 20 rpm i 30 min.
    19. Gentag trin 2.1.10-2.1.13 en gang.
    20. Fjerne røret fra den magnetiske rack og tilføje 33 μL TE (10 mM Tris og 1 mM EDTA, pH 8,0). Forsigtigt flick rør til at sikre, at perlerne er dækket i bufferen og Ruger på en rotator mixer på RT for 30 min. forsigtigt svirp tube hvert 5 min støtte ophvirvling af toerstoffet.
    21. Pellet perler på den magnetiske rack for mindst 10 min. Transfer 30 μL af eluatet med en bred P200 bore spidsen ind i en ny 1,5 mL rør. Tage ekstra 1-2 μl til at opdage koncentrationen ved hjælp af en fluorometer.
      Bemærk: Inddrivelse af 5-6 μg på dette trin er forventet.
    22. Forberede ligatur reaktion i 1,5 mL prøveglas af tilføjer 30 μL af ende-repareret HMW DNA, 20 μL af adapter mix (AMX 1D), og 50 μL af stump/TA ligatur master mix. Bland reaktionen ved at bladre forsigtigt 6 gange mellem hver sekventielle tilsætning og spin-ned til fjern bobler.
    23. Inkuber reaktion på RT for 60 min.
    24. Resuspend de magnetiske perler af pipettering eller vortexing. Tilføje 40 μL perler (0,4 x) til ligatur reaktion og bland forsigtigt ved at bladre røret 6 gange. Rotere røret på en rotator mixer på RT på 20 rpm i 30 min.
    25. Gentag trin 2.1.10 én gang.
    26. Tilsæt 400 μL af adapter perle bindende (ABB) buffer ind i røret. Svip røret forsigtigt 6 gange til resuspend perlerne. Placer røret tilbage på den magnetiske rack til at adskille perler fra bufferen og kassér supernatanten.
    27. Gentag trin 2.1.26 én gang.
    28. Spin ned prøve på 1.000 x g for 2 s på RT. sted røret tilbage på den magnetiske rack. Fjern eventuelle resterende buffer og lufttørre for 30 s. Over tør ikke pellet.
    29. Fjerne røret fra den magnetiske rack og resuspenderes i 43 μL eluering buffer. Forsigtigt flick rør til at sikre, at perlerne er dækket i bufferen og Ruger på en rotator mixer på RT for 30 min. forsigtigt svirp tube hvert 5 min støtte ophvirvling af toerstoffet.
    30. Pellet perler på den magnetiske rack for mindst 10 min. overføre 40 μL af eluatet med en bred P200 bore spidsen ind i en ny 1,5 mL rør. Tage ekstra 1-2 μl til at opdage koncentrationen ved hjælp af en fluorometer.
      Bemærk: Inddrivelse af 1-2 μg på dette trin er forventet. Den mekaniske klipning-baserede bibliotek er klar til læsning. Biblioteket kan opbevares på is i op til 2 timer indtil læsning til sekvensering, hvis nødvendigt.
  2. Transposase opsplitning-baserede bibliotek opbygning
    1. Tø reagenser fra transposase kit (Se Tabel af materialer). Tø fragmentering mix (FRA) og hurtig adapter (RAP) på is og pipette til at blande. Tø sekventering buffer (SQB) indlæsning perler (LB), flush buffer (FLB) og skylle tether (FLT) på RT og afpipetteres for at blande. Tø lastning perler (LB) på RT og pipette til blandes inden brug. Når optøet, holde alle kit komponenter på is. Tegne enzymer, når det behøves.
    2. Kontrollere kvaliteten og kvantiteten af HMW DNA fra skridt 1.21.2. Pipette ud af 20 μL af DNA i nye 1,5 mL rør fra tre forskellige steder i HMW DNA røret ved hjælp af P200 bred bore tips. Tage 1 μL fra de tre delprøver til at opdage koncentrationen ved hjælp af en fluorometer og kvalitet ved hjælp af en UV læsning. Tjek gange flere for at bekræfte resultaterne.
      Bemærk: De forventede resultater er vist i figur 3B. OD260/280 -værdi er ca 1,9 og OD260/230 -værdi er ca 2,3.
    3. Forbered DNA tagmentation reaktion i en 0,2 mL rør ved at tilføje 22 μL af HMW DNA, 1 μl af 10 mM Tris (pH 8,0) med 0,02% Triton X-100 og 1 μL af fragmentering mix (FRA). Mix af pipettering med en bred P200 bore tip så langsomt som muligt 6 gange, pas på ikke for at indføre bobler.
    4. Inkuber reaktion ved 30 ° C i 1 min. efterfulgt af 80 ° C i 1 min., og hold derefter ved 4 ° C. Overførsel blandingen ind i en ny 1,5 mL rør med en bred P200 bore spidsen og gå til næste trin straks.
    5. Tilsæt 1 μL af hurtige adapter (RAP) til 1,5 mL prøveglas. Mix af pipettering med en bred P200 bore tip så langsomt som muligt 6 gange, pas på ikke for at indføre bobler.
    6. Inkuber reaktion på RT for 60 min.
      Bemærk: Transposase fragmentering-baserede bibliotek er klar til læsning. Biblioteket kan opbevares på is i op til 2 timer indtil læsning til sekvensering, hvis nødvendigt.

3. sekvensering på nanopore enhed

  1. Check nanopore sekventering enhed (Se Tabel af materialer). Sørg for både software og hardware er i orden og der er nok lagerplads.
  2. Kontrollere flow-cellen. Åbn en ny flow-celle og indsætte cellen flow i nanopore enheden. Kontroller boksen placering flow-cellen blev indsat i (X1-X5). Vælg den korrekte flow celletype. Klik på Tjek flyde celler arbejdsproces. Klik på knappen Start Test at starte flow celle QC analyse.
    Bemærk: Hvis den rapporterede samlede aktive pore tal er mindre end 800, bruge en anden ny flow celle til sekvensering.
  3. Forberede priming buffer. For en mekanisk klipning-baseret bibliotek, tilføje 576 μL af bufferen med brændstofblanding (RBF) og 624 μL nukleasen-gratis vand til en 1,5 mL tube. Vortex og spin-ned til mix priming buffer. For en transposase fragmentering-baserede bibliotek, skal du tilføje 30 μL af flush tether (FLT) til tube flush buffer (FLB). Vortex og spin-ned til mix priming buffer.
  4. På cellen flow flytte priming port dækslet med uret for at udsætte priming port.
  5. Indstil P1000 pipette til 100 μL og Indsæt spidsen i priming-porten. Trække tilbage en lille mængde af buffer (mindre end 30 μL) til at fjerne eventuelle bobler fra cellen flow. Stop pipettering når en lille mængde af gul væske træder spidsen.
  6. Bruge P1000 pipette til at indlæse 800 μL af priming mix i cellen flow via priming port. For at undgå at indføre bobler, tilsættes 30 μL priming mix dækker toppen af havnens priming først, og derefter indsætte spidsen i priming porten og langsomt tilføje resten af priming mix. Tegne spidsen, når der er ca. 50 μL venstre. Tilsæt resten af priming blanding på toppen af havnens priming. Væsken vil gå ind i sig selv.
  7. Forlade setup hen til inkuberes i 5 min. I mellemtiden Forbered bibliotek mix i 1,5 mL tube indeholder biblioteket.
    Bemærk: For et mekanisk klipning-baseret bibliotek tilføje 35 µL af kører buffer med brændstofblanding (RBF) til 40 µL DNA bibliotek. For en transposase fragmentering-baserede bibliotek tilføje 34 µL af sekventering buffer (SQB) og 16 µL nukleasen-gratis vand til 25 µL DNA bibliotek.
  8. Åbn dækslet flow celle prøven port forsigtigt for at udsætte prøven port. Bruge P1000 pipette til at tilføje 200 μl af priming mix gennem priming port ind i flow-cellen som beskrevet i trin 3.5. Kontroller, at priming mix ikke er lagt ind i cellen flow gennem prøven port.
  9. Angiv en P200 pipette til 80 μl. Bland biblioteket forsigtigt med en bred bore spidsen af pipettering op og ned ad 6 gange lige før pålæsningen.
  10. Indlæse biblioteket mix dråbevis gennem prøven port i cellen flow. Tilføje hver dråbe, kun efter den tidligere slip er helt indlæst i porten.
  11. Sæt tilbage prøven port dækslet forsigtigt og sørg for prøven port er fuldt dækket. Flytte priming port dækslet mod uret til at dække priming port. Luk enhed låget.
  12. Klik på Nyt eksperiment arbejdsproces. Skriv biblioteksnavnet på, Vælg den korrekte kit ifølge procedurer, der anvendes, og kontrollere, at indstillingerne er korrekte (48 h køre, real-time base-kalde ON).
  13. Klik på Start Kør. Efter 10 min, registrere flow celle-ID og aktive nanopore tal (samlede tal og hver fire grupper numre) fra den køre oplysninger.
  14. Dataanalyse. Kopiere data til en lokal computer eller en klynge til enhver tid af Sekventeringen, eller når flugt er fuldført. Bruge Minimap216 (https://github.com/lh3/minimap2) til at justere sekvens data til reference genom. Opsummere sekventering ydeevne fra rå sekvens data og tilpasninger af NanoPlot17 (https://github.com/wdecoster/NanoPlot).

Representative Results

Ultra-lang DNA-sekventering protokollen gælder HMW DNA for biblioteket konstruktion. Det er derfor kritisk at vælge godt kulturperler celler med live-forhold > 85% på cellen høst trin. Mængden af celler, der bruges til DNA-ekstraktion vil påvirke kvaliteten og mængden af HMW DNA. Celle lysis virker ikke godt hvis starter med for mange celler. Ved hjælp af for få celler generere ikke nok DNA for biblioteket konstruktion fordi HMW DNA nedbør udføres ved hjælp af blide rotation i hånden i stedet for højhastighedstog centrifugering. Et eksempel på HMW DNA efter tilføjer iskold 100% ethanol og roterende er vist som hvid bomuld-lignende bundfaldet i figur 2.

Det er vigtigt at tjekke kvaliteten af input DNA før du begynder bibliotek opbygningen. Nedbrydning, forkert kvantificering, forurening (fx proteiner, RNA'er, vaske-og rengøringsmidler, overfladeaktive stoffer, og resterende phenol eller ethanol) og lav molekylvægt DNA kan have en betydelig indvirkning på de efterfølgende procedurer og finalen Læs længde. Vi anbefaler, at udføre QC analyse ved hjælp af DNA fra tre forskellige steder i rør indeholdende HMW DNA. Fra UV læsning resultater for HMW DNA, OD260/OD280 værdi er ca 1,9 og OD260/OD230 værdi er ca 2,3 (figur 3AB). Disse ratio værdierne er konsekvent blandt de tre test for en god HMW DNA-prøve. Forskellige klipning metoder kræver forskellige mængder af input DNA. Koncentrationen af HMW DNA skal være > 200 ng/µL for mekaniske klipning, mens det skal være > 1 µg/µL til transposase fragmentering. Den koncentration, opdaget af en fluorometer er lidt lavere end UV læsning. Dog er variationskoefficienten for koncentrationen af samme HMW DNA-prøven skal være mindre end 15% med både fluorometer og UV læsning assays. Mekanisk klipning gælder en sprøjte med en nål til at bryde HMW DNA, så antallet af passerer gennem nålen vil påvirke størrelsen af den afrevne DNA og finalen Læs længde. Det anbefales at udføre størrelse QC efter nålen klipning for at sikre, at størstedelen af HMW DNA er større end 50 kb som illustreret i figur 4. I metoden mekaniske klipning genereret 30 passerer de bedste sekventering resultater i betragtning af både længde og output.

N50 af en mekanisk klipning-baserede bibliotek er 50-70 kb, mens en transposase fragmentering-baserede bibliotek er 90-100 kb. Resultaterne af fire kører ved hjælp af linjen HG00733 celle er vist i tabel 1. Alle fire kører har over 2.300 læser med længde længere end 100 kb. Den maksimale længde er længere i transposase fragmentering-baserede biblioteker (455 kb og 489 kb) sammenlignet med de mekaniske klipning-baserede biblioteker (348 kb og 387 kb) mens sidstnævnte produceres flere samlede læsninger, der angiver et højere udbytte. Transposase opsplitning-baserede bibliotek konstruktion har færre trin og kortere tid til forberedelse, så det vil indføre færre kort fragmenter. De to kører ved hjælp af transposase have en længere gennemsnitlig længde (> 30 kb) og median længde (> 10 kb). Derudover viser dataene ensartet høj kvalitet i alle kørsler (gennemsnitlig kvalitetsresultat er omkring 10,0, ~ 90% base nøjagtighed). Mere end 97% af det samlede grundlag blev justeret til den menneskelige reference genom (hg19) bruger Minimap216 med standardindstillingerne. De forventede størrelse distributioner af de rå læsninger er vist i figur 5. Alle kørsler har en stor del af data over 50 kb, mens transposase fragmentering-baserede biblioteker har en højere ratio af ultra-lang læser (f.eks. > 100 kb). Denne protokol har været anvendt med succes i flere menneskelige cellelinjer (supplerende tabel 1).

Figure 1
Figur 1: skematisk oversigt over arbejdsprocessen nanopore long-Læs sekventering (NLR-seq). Appelsin, komplekse transposase. Gul-grøn, nanopore adapter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: repræsentative DNA nedbør fra phenol-chloroform ekstraktion metode. Den hvide pil angiver HMW DNA. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: eksempel QC resultater af HMW DNA fra UV læsning. (A) HMW DNA fra trin 1.21.1 klar til mekanisk klipning-baseret bibliotek konstruktion. (B) HMW DNA fra trin 1.21.2 for transposase fragmentering-baserede bibliotek konstruktion. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: QC resultater af nålen forskydes HMW DNA af pulserende-field gelelektroforese. L1: Quick-belastning 1 kb DNA ladder; L2: Quick-belastning 1 kb udvide DNA ladder. 1-8: DNA med forskellige passerer gange gennem nålen klipning. 1-3, ingen klipning; 4, 10 gange; 5, 20 gange; 6, 30 gange; 7, 40 gange; 8, 50 gange. Denne QC trin er valgfrit. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: forventet størrelse fordelinger af nanopore ultra-lang DNA biblioteker. MS, mekanisk klipning-baserede biblioteker. TF, transposase fragmentering-baserede biblioteker. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Mekanisk shearing_rep1 Mekanisk shearing_rep2 Transposase fragmentation_rep1 Transposase fragmentation_rep2
Cellelinie HG00733 HG00733 HG00733 HG00733
N50 af læst 55,180 63,007 98,237 95,629
Antal læsninger længere end 100 Kb 2.500 3,082 2,386 2,355
Antallet af samlede læser 97,859 80,465 24,166 21,032
Maksimal længde (bp) 348,482 387,113 454,660 489,426
Gennemsnitlig længde (bp) 17,861 20,395 33,528 38,175
Median længde (bp) 5,335 5,894 10,249 15,656
Gennemsnitlige kvalitet af læst 10,0 10.1 9,9 10,0
Samlede baser af rå læsninger 1,747,849,822 1,641,058,932 810,229,733 802,886,304
Samlede baser af justeret læser 1,693,300,832 1,607,975,925 791,422,077 778,417,627
Tilknyttet forholdet mellem total baser (hg19, Minimap2) 96,9% 98,0% 97,7% 97.0%
Antallet af aktive porer 1225: 480, 402, 254, 89 1058: 480, 356, 176, 46 958: 452, 328, 148, 30 1092: 487, 367, 195, 43

Tabel 1: Effektivitetsdata sammendrag fra kører med forskellige klipning protokoller.

Bibliotek 1 Bibliotek 2
Cellelinie K562 GM19240
Celle bestillingsoplysninger ATCC, kat. Lol CCL-243 Coriell Institute, kat. Lol GM19240
Protokol mekanisk klipning mekanisk klipning
N50 af læst 60,063 55,295
Antallet af samlede læser 193,783 120,807
Median længde (bp) 1,843 4,688
Gennemsnitlig længde (bp) 9,825 17,408
Maksimal længde (bp) 548,780 212,338
Samlede baser af rå læsninger 1,903,989,686 2,103,015,331
Samlede baser af justeret læser 1,837,350,047 1,997,419,761
Tilknyttet forholdet mellem total baser (hg19, Minimap2) 96,6% 95.0%
Antallet af aktive porer 1111: 482, 371, 203, 55 1032: 447, 333, 196, 56

Supplerende tabel 1: Oversigt over to NLR-seq kører ved hjælp af andre cellelinjer med den mekaniske klipning protokol.

Discussion

I princippet er nanopore sekventering i stand til at generere 100 kb til megabase læser i længde11,12,13. Fire vigtigste faktorer vil påvirke ydeevnen af sekventering run og data kvalitet: 1) aktive pore numre og aktivitet af porer; 2) motor protein, som styrer hastigheden af DNA passerer gennem nanopore; 3) DNA skabelon (længde, renhed, kvalitet, masse); 4) sekventering adapter ligatur effektivitet, som bestemmer det brugbart DNA fra input prøven. De første to faktorer afhænger af versionen af cellen flow og sekventering kit fra producenten. De næste to faktorer er vigtige skridt i denne protokol (HMW DNA-ekstraktion, klipning og ligatur).

Denne protokol kræver tålmodighed og praksis. Kvaliteten af HMW DNA er vigtigt for ultra-lang DNA biblioteker6. Protokollen starter med celler, der opsamlet med høj rentabilitet (> 85% levedygtige celle foretrækkes), begrænse den forringede DNA fra døde celler. Enhver barske proces, som kan indføre skader DNA (fx, stærkt foruroligende, ryster, vortex, flere pipettering, gentagen nedfrysning og optøning) bør undgås. I udformningen af protokollen udelader vi pipettering i hele processen med DNA-ekstraktion. Bred bore tips skal bruges, når pipettering er nødvendigt efter mekanisk klipning under bibliotek opbygning og sekventering. Som nanoporer er følsomme overfor kemi i salen buffer12, bør der være så få resterende forurenende stoffer (fx vaske-og rengøringsmidler, overfladeaktive stoffer, phenol, ethanol, proteiner RNA'er, osv) som muligt i DNA. I betragtning af længden og udbytte viser phenol ekstraktion metode de bedste og mest reproducerbare resultater sammenlignet med flere forskellige udvindingsmetoder testet indtil videre.

Trods denne protokol evne til at producere lange-Læs sekvenser, stadig flere begrænsninger. Første, denne protokol blev optimeret baseret på nanopore sekventering enheden tilgængelig på tidspunktet for offentliggørelse; således, det er begrænset til den selektive nanopore-baserede sekventering kemi og kunne være suboptimal når de udføres i andre typer af lang-Læs sekventering enheder. Andet, resultatet er meget afhængig af kvaliteten af DNA ekstraheret fra råvare (væv eller celler). Læs længde vil blive kompromitteret, hvis start DNA er allerede nedbrudt eller beskadiget. Tredje, selv om flere QC trin indgår i protokollen at kontrollere DNA-kvaliteten, endelige udbytte og længden af læst kan blive påvirket af cellen flow og pore aktivitet, som kunne være variabel på dette tidlige stadium af nanopore sekventering platform udvikling.

Protokollen beskrevet bruger her menneskelige suspension celle linje prøver til DNA-ekstraktion. Vi har optimeret passerer gange i nål klipning, forholdet mellem HMW DNA til transposase og ligatur tid at opnå de beskrevne resultater. Protokollen kan udvides på fire måder. Først, brugere kan starte med andre kulturperler pattedyrceller og med forskellige mængde af celler, væv, kliniske prøver eller andre organismer. Yderligere optimering på lysis inkubationstiden, reaktion volumen og centrifugering vil være nødvendig. For det andet, det er svært at forudsige Målstørrelse til ultra-lang Læs sekvensering. Hvis de Læs længder er kortere end forventet, kan brugerne justere passerer gange i den mekaniske klipning-baseret metode eller ændre forholdet mellem HMW DNA til transposase i transposase fragmentering-baserede metode. Længere bindende og eluering tid under oprydning trin er nyttigt, fordi HMW DNA er meget tyktflydende. Tredje, med forskellige nanopore sekventering enheder, kan man justere mængden og omfanget af DNA til at opfylde kriterierne i sequencer. For det fjerde vil kun disse DNA forbundet til sekvensering adaptere blive sekventeret. Yderligere at forbedre ligatur effektivitet, kan man forsøge at titrere adapter og ligase koncentrationerne. Modificerede ligatur tid og molekylær crowding agenter såsom PLØK18 kan anvendes i fremtiden. Ultra-lang DNA-sekventering protokollen kombineret med CRISPR19,20 kan tilbyde et effektivt redskab til target berigelse sekvensering.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Forfatterne takke Y. Zhu for hendes kommentarer til manuskriptet. Forskning rapporteret i denne publikation blev delvist støttet af National Cancer Institute af National Institutes of Health under Award nummer P30CA034196. Indholdet er udelukkende ansvarlig for forfattere og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter af National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Absolute ethanol Sigma-Aldrich E7023
Agencourt AMPure XPbeads Beckman A63881 magnetic beads for cleanup
BD conventional needles Becton Dickinson 305136 27G, for mechanical shearing
BD Luer-Lok syringe Becton Dickinson 309628 for mechanical shearing
Blunt/TA Ligase Master Mix NEB M0367S
Countess Cell Counting Chamber Slides Invitrogen C10228 for cell counting
EDTA Invitrogen AM9261 pH 8.0, 0.5 M, 500 mL
Flow Cell Oxford Nanopore Technologies FLO-MIN106 R9.4.1
HG00773 cells Coriell Institute HG00733 cells used in this protocol
Ligation Sequencing Kit 1D Oxford Nanopore Technologies SQK-LSK108 nanopore ligation kit
MaXtract High Density tubes Qiagen 129073 gel tubes
NEBNext FFPE DNA Repair Mix NEB M6630S
NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module NEB M7546S
Nuclease-free water Invitrogen AM9937
Phosphate-Buffered Saline, PBS Gibco 70011044 10X, pH 7.4
Phenol:chloroform:IAA Invitrogen AM9730
Proteinase K Qiagen 19131 20 mg/mL
Qubit dsDNA BR Assay Kit Invitrogen Q32850 fluorometer assays for DNA quantification
Rapid Sequencing Kit Oxford Nanopore Technologies SQK-RAD004 nanopore transposase kit
RNase A Qiagen 19101 100 mg/mL
SDS Invitrogen AM9822 10% (wt/vol)
Sodium chloride solution Invitrogen AM9759 5.0 M
TE buffer Invitrogen AM9849 pH 8.0
Tris Invitrogen AM9856 pH 8.0, 1 M
Triton X-100 solution Sigma-Aldrich 93443 ~10%
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Bio-Rad C1000 Thermal Cycler Bio-Rad 1851196EDU
Centrifuge 5810R Eppendorf 22628180
Countess II FL Automated Cell Counter Life Technologies AMQAF1000 for cell counting
DynaMag-2 Magnet Life Technologies 12321D magnetic rack
Eppendorf ThermoMixer Eppendorf 5382000023 for incubation
Freezer LabRepCo LHP-5-UFMB
GridION Oxford Nanopore Technologies GridION X5 nanopore device used in this protocol
HulaMixer Sample Mixer Thermo Fisher Scientific 15920D rotator mixer
MicroCentrifuge Benchmark Scientific C1012
NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific ND-1000 for UV reading
Pippin Pulse Sage Science PPI0200 pulsed-field gel electrophoresis instrument
Qubit 3.0 Fluorometer Invitrogen Q33216 fluorometer
Refrigerator LabRepCo LABHP-5-URBSS
Vortex-Genie 2 Scientific Industries SI-A236
Water bath VWR 89501-464

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mardis, E. R. Next-generation sequencing platforms. Annual Review of Analytical Chemistry. 6, 287-303 (2013).
  2. Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nature Reviews Genetics. 17, (6), 333-351 (2016).
  3. Shendure, J., et al. DNA sequencing at 40: past, present and future. Nature. 550, (7676), 345-353 (2017).
  4. Alkan, C., Coe, B. P., Eichler, E. E. Genome structural variation discovery and genotyping. Nature Reviews Genetics. 12, (5), 363-376 (2011).
  5. Weischenfeldt, J., Symmons, O., Spitz, F., Korbel, J. O. Phenotypic impact of genomic structural variation: insights from and for human disease. Nature Reviews Genetics. 14, (2), 125-138 (2013).
  6. Pollard, M. O., Gurdasani, D., Mentzer, A. J., Porter, T., Sandhu, M. S. Long reads: their purpose and place. Human Molecular Genetics. 27, (R2), R234-R241 (2018).
  7. Cretu Stancu, M., et al. Mapping and phasing of structural variation in patient genomes using nanopore sequencing. Nature Communications. 8, (1), 1326 (2017).
  8. Gong, L., et al. Picky comprehensively detects high-resolution structural variants in nanopore long reads. Nature Methods. 15, (6), 455-460 (2018).
  9. Sedlazeck, F. J., et al. Accurate detection of complex structural variations using single-molecule sequencing. Nature Methods. 15, (6), 461-468 (2018).
  10. Jain, M., et al. Nanopore sequencing and assembly of a human genome with ultra-long reads. Nature Biotechnology. 36, (4), 338-345 (2018).
  11. Jain, M., et al. Improved data analysis for the MinION nanopore sequencer. Nature Methods. 12, (4), 351-356 (2015).
  12. Deamer, D., Akeson, M., Branton, D. Three decades of nanopore sequencing. Nature Biotechnology. 34, (5), 518-524 (2016).
  13. Jain, M., Olsen, H. E., Paten, B., Akeson, M. The Oxford Nanopore MinION: delivery of nanopore sequencing to the genomics community. Genome Biology. 17, (1), 239 (2016).
  14. Editorial, The long view on sequencing. Nature Biotechnology. 36, (4), 287 (2018).
  15. Jain, M., et al. Linear assembly of a human centromere on the Y chromosome. Nature Biotechnology. 36, (4), 321-323 (2018).
  16. Li, H. Minimap2: pairwise alignment for nucleotide sequences. Bioinformatics. 34, 3094-3100 (2018).
  17. De Coster, W., D'Hert, S., Schultz, D. T., Cruts, M., Van Broeckhoven, C. NanoPack: visualizing and processing long-read sequencing data. Bioinformatics. 34, 2666-2669 (2018).
  18. Akabayov, B., Akabayov, S. R., Lee, S. J., Wagner, G., Richardson, C. C. Impact of macromolecular crowding on DNA replication. Nature Communications. 4, 1615 (2013).
  19. Gabrieli, T., Sharim, H., Michaeli, Y., Ebenstein, Y. Cas9-Assisted Targeting of CHromosome segments (CATCH) for targeted nanopore sequencing and optical genome mapping. bioRxiv. (2017).
  20. Gabrieli, T., et al. Selective nanopore sequencing of human BRCA1 by Cas9-assisted targeting of chromosome segments (CATCH). Nucleic Acids Research. (2018).
Ultra-lang Læs sekventering for hele genomisk DNA analyse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gong, L., Wong, C. H., Idol, J., Ngan, C. Y., Wei, C. L. Ultra-long Read Sequencing for Whole Genomic DNA Analysis. J. Vis. Exp. (145), e58954, doi:10.3791/58954 (2019).More

Gong, L., Wong, C. H., Idol, J., Ngan, C. Y., Wei, C. L. Ultra-long Read Sequencing for Whole Genomic DNA Analysis. J. Vis. Exp. (145), e58954, doi:10.3791/58954 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter