Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

पूरे जीनोमिक डीएनए विश्लेषण के लिए अल्ट्रा लंबे पढ़ें अनुक्रमण

Published: March 15, 2019 doi: 10.3791/58954
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Genome Technologies, Jackson Laboratory for Genomic Medicine

Summary

लंबे समय तक पढ़ा दृश्यों बहुत जटिल जीनोम की विधानसभा और संरचनात्मक परिवर्तन के लक्षण वर्णन की सुविधा । हम नैनोपोर आधारित अनुक्रमण प्लेटफार्मों द्वारा अल्ट्रा लंबे अनुक्रम उत्पन्न करने के लिए एक विधि का वर्णन । दृष्टिकोण एक अनुकूलित डीएनए निष्कर्षण के बाद संशोधित पुस्तकालय की तैयारी के सैकड़ों किलोबाइट उत्पंन करने के लिए मानव कोशिकाओं से मध्यम कवरेज के साथ पढ़ता है adopts ।

Abstract

तीसरी पीढ़ी के एकल अणु डीएनए अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों काफी लंबे समय तक पढ़ने की लंबाई है कि जटिल जीनोम और जटिल संरचनात्मक वेरिएंट के विश्लेषण के विधानसभा की सुविधा कर सकते है प्रदान करते हैं । नैनोपोर प्लेटफार्मों सीधे वर्तमान के माध्यम से डीएनए पारित द्वारा मध्यस्थता परिवर्तनों को मापने के द्वारा एकल अणु अनुक्रमण प्रदर्शन pores और किलोबाइट (केबी) के सैकड़ों उत्पंन कर सकते है ंयूनतम पूंजी लागत के साथ पढ़ता है । कई शोधकर्ताओं द्वारा इस मंच अपनाया गया है अनुप्रयोगों की एक किस्म के लिए । अब अनुक्रमण पढ़ने लंबाई को प्राप्त करने के ट्विटर अनुक्रमण प्लेटफार्मों के मूल्य का लाभ उठाने के लिए सबसे महत्वपूर्ण कारक है । अल्ट्रा लंबे पढ़ता उत्पन्न करने के लिए, विशेष विचार डीएनए टूटना से बचने और उत्पादक अनुक्रमण टेम्पलेट्स उत्पन्न करने के लिए दक्षता हासिल करने के लिए आवश्यक है । यहां, हम उच्च आणविक वजन (hmw) डीएनए निष्कर्षण सहित अल्ट्रा लंबे डीएनए अनुक्रमण का विस्तृत प्रोटोकॉल ताजा या जमे हुए कोशिकाओं से, यांत्रिक कर्तन या transposase विखंडन द्वारा पुस्तकालय निर्माण, और एक नैनोपोर डिवाइस पर अनुक्रमण प्रदान करते हैं । hmw डीएनए के 20-25 μg से, विधि यांत्रिक कर्तन और 90-100 kb transposase मध्यस्थता विखंडन के साथ पढ़ने की लंबाई के N50 के साथ 50-70 केबी की N50 पढ़ने की लंबाई को प्राप्त कर सकते हैं । प्रोटोकॉल को स्तनधारी कोशिकाओं से निकाले गए डीएनए पर लागू किया जा सकता है ताकि संरचनात्मक वेरिएंट और जीनोम असेंबली का पता लगाने के लिए पूरी जीनोम अनुक्रमण की जा सके । डीएनए निष्कर्षण और एंजाइमी प्रतिक्रियाओं पर अतिरिक्त सुधार आगे पढ़ने की लंबाई में वृद्धि और इसकी उपयोगिता का विस्तार होगा ।

Introduction

पिछले एक दशक से अधिक, व्यापक समानांतर और अत्यधिक सटीक दूसरी पीढ़ी के उच्च थ्रौपुट अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों जैव चिकित्सा खोज और तकनीकी नवाचार1,2,3के एक विस्फोट प्रेरित किया है । तकनीकी अग्रिमों के बावजूद, दूसरी पीढ़ी के प्लेटफार्मों द्वारा सृजित अल्प-पठन आंकड़े जटिल जीनोमिक क्षेत्रों के समाधान में अप्रभावी हैं और जीनोमिक संरचनात्मक वेरिएंट (SVs) का पता लगाने में सीमित हैं, जो मानव में महत्वपूर्ण भूमिकाएं निभाते हैं । विकास और रोग4,5. इसके अलावा, लघु पढ़ने के डेटा दोहराने भिंनता को हल करने में असमर्थ है और समझदार अगुणन प्रकार के आनुवंशिक वेरिएंट6के लिए अनुपयुक्त हैं ।

एकल-अणु अनुक्रमण में हाल की प्रगति काफी लंबे समय तक पढ़ने की लंबाई प्रदान करता है, जो7,8,9svs की पूर्ण स्पेक्ट्रम का पता लगाने की सुविधा कर सकते हैं, और जटिल के सटीक और पूर्ण विधानसभा प्रदान करता है माइक्रोबियल और स्तनधारी जीनोम6,10. ट्विटर मंच सीधे वर्तमान के माध्यम से डीएनए पारित द्वारा मध्यस्थता परिवर्तनों को मापने के द्वारा एकल अणु अनुक्रमण करता है pores11,12,13। किसी भी मौजूदा डीएनए अनुक्रमण रसायन विज्ञान के विपरीत, ट्विटर अनुक्रमण लंबे समय उत्पंन कर सकते है (किलोबाइट के हजारों दसियों) पोलीमरेज़ कैनेटीक्स या डीएनए नमूने के कृत्रिम प्रवर्धन पर भरोसा किए बिना रीयल-टाइम में पढ़ता है । इसलिए, ट्विटर लंबे समय से पढ़ें अनुक्रमण (nlr-seq) अल्ट्रा लंबे पढ़ने के लिए महान वादा रखती है लंबाई अच्छी तरह से परे १०० केबी, जो बहुत जीनोमिक और जैव चिकित्सा विश्लेषण14अग्रिम, कम जटिलता या दोहराने में विशेष रूप से होगा अमीर जीनोम के क्षेत्र15.

नैनोपोर अनुक्रमण की अनूठी विशेषता अपने लंबे समय एक सैद्धांतिक लंबाई सीमा के बिना पढ़ता उत्पंन करने की क्षमता है । इसलिए, पठन लंबाई डीएनए की भौतिक लंबाई पर निर्भर है जो सीधे डीएनए अखंडता और अनुक्रमण टेंपलेट गुणवत्ता से प्रभावित है । इसके अलावा, हेरफेर की सीमा पर और शामिल कदम की संख्या पर निर्भर करता है, जैसे पिख्ता बलों और निष्कर्षण की स्थिति, डीएनए की गुणवत्ता उच्च चर है । इसलिए, यह एक के लिए चुनौतीपूर्ण है लंबे समय तक सिर्फ मानक डीएनए निष्कर्षण प्रोटोकॉल और निर्माता की आपूर्ति की पुस्तकालय निर्माण विधियों आवेदन द्वारा पढ़ता है । इस अंत की ओर, हम एक मजबूत विधि को अल्ट्रा लंबे (किलोलोसेस के सैकड़ों) अनुक्रमण डेटा काटा सेल छर्रों से शुरू पढ़ने उत्पंन विकसित किया है । हमने डीएनए निष्कर्षण और पुस्तकालय तैयारी प्रक्रियाओं में कई सुधार अपनाए । हम प्रोटोकॉल को सुव्यवस्थित करने के लिए अनावश्यक प्रक्रियाओं है कि डीएनए क्षरण और नुकसान का कारण बाहर । इस प्रोटोकॉल उच्च आणविक वजन (hmw) डीएनए निष्कर्षण, अल्ट्रा लंबे डीएनए पुस्तकालय निर्माण, और एक नैनोपोर मंच पर अनुक्रमण से बना है । एक अच्छी तरह से प्रशिक्षित आणविक जीवविज्ञानी के लिए, यह आम तौर पर hmw डीएनए निष्कर्षण के पूरा होने के लिए सेल संचयन से 6 एच लेता है, ९० मिनट या 8 h कर्तन विधि के आधार पर पुस्तकालय निर्माण के लिए, और डीएनए अनुक्रमण के लिए एक आगे ४८ h करने के लिए । प्रोटोकॉल का उपयोग जीनोमिक्स समुदाय को सशक्त करने के लिए जीनोम जटिलता की हमारी समझ में सुधार होगा और मानव रोगों में जीनोम भिन्नता में नई अंतर्दृष्टि हासिल ।

Protocol

नोट: NLR-seq प्रोटोकॉल में लगातार तीन कदम हैं: 1) उच्च आणविक भार (HMW) जीनोमिक डीएनए का निष्कर्षण; 2) अल्ट्रा लंबे डीएनए पुस्तकालय निर्माण, जो वांछित आकार में hmw डीएनए के विखंडन और डीएनए के लिए अनुक्रमण एडाप्टर के बंधाव समाप्त होता है शामिल है; और 3) नैनोपार्स की सरणियों पर एडाप्टर-ligated डीएनए की लोडिंग (चित्रा 1) ।

1. एचएमडब्ल्यू डीएनए निष्कर्षण

  1. अभिकर्मक सेटअप । 1x फॉस्फेट buffered खारा (PBS) बफर (१,००० मिलीलीटर) PBS के १०० मिलीलीटर (10x) को ९०० मिलीलीटर पानी में जोड़कर अच्छी तरह मिक्स कर लें । lysis बफर (५० मिलीलीटर) एक ५० मिलीलीटर ट्यूब के लिए पानी की ४३.५ मिलीलीटर जोड़कर बनाते हैं । Tris के ५०० μl जोड़ें (1 एम, पीएच ८.०), 1 मिलीलीटर सोडियम क्लोराइड (nacl) (5 मीटर), २.५ मिलीलीटर की एथिल लेनेडिएमीनेटेट्राएसिटिक एसिड (edta) (०.५ मीटर, पीएच ८.०) और २.५ मिलीलीटर सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस) (10%, wt/vol) के लिए ट्यूब और अच्छी तरह से मिश्रण ।
    नोट: यह PBS बफर 4 ° c पर 6 महीने के लिए संग्रहीत किया जा सकता है । premade lysis बफर आर टी पर अप करने के लिए 2 महीने के लिए संग्रहीत किया जा सकता है ।
  2. सेल मृत्यु दर की जांच करें और कोशिकाओं की गिनती । सुनिश्चित करें कि लाइव अनुपात ८५% > है और कुल सेल संख्या 30 x 106है ।
    नोट: इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया कोशिकाओं HG00733 सेल लाइन से कर रहे हैं, प्यूर्टो Rican मूल के एक मानव lymphoblastoid कोशिका लाइन व्यापक रूप से संरचनात्मक भिंनता विश्लेषण के लिए १००० जीनोम कंसोर्टियम में इस्तेमाल किया (जानकारी आदेश के लिए सामग्री की मेज देखें), जो संबंधित अंतरराष्ट्रीय जीनोम नमूना संसाधन के लिए ।
  3. आरटी में 5 मिनट के लिए २०० x g पर केंद्रापसारक द्वारा कोशिकाओं को ले लीजिए । मध्यम छोड़ें और सेल गोली (30 x 106 कोशिकाओं) 1x Pbs बफर के 5 मिलीलीटर के साथ resuspend । सेंट्रीफ्यूज फिर से २०० x g पर 5 मिनट के लिए आरटी में और supernatant त्यागें ।
    नोट: 25-35 x 106 कोशिकाओं के इस दृष्टिकोण के लिए स्वीकार्य हैं । उपयोग की जाने वाली कोशिकाओं की मात्रा में और अधिक भिन्नता के आगे अनुकूलन की आवश्यकता होगी. सेल गोली को 6 महीने तक − ८० डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है ।
  4. 1x PBS बफर के २०० μL में सेल गोली Resuspend । यदि एक जमे हुए सेल गोली का उपयोग कर, 1x PBS बफर के 5 मिलीलीटर के साथ धो लें । २०० x g पर समाधान अपकेंद्रित्र भ में 5 मिनट के लिए, supernatant छोड़ें और 1X pbs बफ़र की २०० μl में कक्षों resuspend ।
  5. एक ५० मिलीलीटर ट्यूब में lysis बफर की 10 मिलीलीटर तैयार करें । २०० μL सेल निलंबन के लिए lysis बफर और भंवर 3 एस के लिए उच्चतम गति पर 1 एच के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर समाधान सेते ।
  6. lysate करने के लिए RNase ए (१०० मिलीग्राम/एमएल) के 2 μL जोड़ें । धीरे से नमूना मिश्रण करने के लिए ५० मिलीलीटर ट्यूब घुमाएं । 1 ज के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर समाधान सेटे ।
  7. lysate करने के लिए ५० μL proteinase कश्मीर (20 मिलीग्राम/ धीरे से नमूना मिश्रण करने के लिए ५० मिलीलीटर ट्यूब घुमाएं । 2 ज के लिए ५० डिग्री सेल्सियस पर समाधान सेटे । ऊष्मायन के दौरान, धीरे नमूना हर 30 मिनट मिश्रण ।
  8. ५० डिग्री सेल्सियस से ५० मिलीलीटर ट्यूब निकालें और 5 मिनट के लिए आर टी पर खड़े हो जाओ ।
  9. phenol की phenol परत के 10 मिलीलीटर जोड़ें: क्लोरोफॉर्म: आइसोएमिल एल्कोहल (25:24:1, vol/vol/vol) करने के लिए और एक रोटेटर मिक्सर पर ट्यूब घुमाएँ ( सामग्री की मेजदेखें) 10 मिनट के लिए 20 rpm पर एक धूआं हुड में आरटी में. रिसाव रोकने के लिए ट्यूब कैप को पैराफ़िल् ट से लपेटें रोटेशन के दौरान ।
  10. तैयार २ ५० मिलीलीटर जेल ट्यूबों ( सामग्री की मेजदेखें) १,५०० एक्स जी पर केंद्रापसारक द्वारा आरटी में 2 मिनट के लिए ।
    नोट: जेल नाभिक एसिड युक्त जलीय चरण और कार्बनिक विलायक के बीच एक स्थिर बाधा रूपों.
  11. चरण १.१० से तैयार ५० मिलीलीटर जेल ट्यूबों में से एक में नमूना डालो/ ३,००० x g पर 10 मिनट के लिए RT पर समाधान सेंट्रीफ्यूज ।
  12. एक नया ५० मिलीलीटर ट्यूब में supernatant डालो । phenol की phenol परत के 10 मिलीलीटर जोड़ें: क्लोरोफॉर्म: आइसोएमिल अल्कोहल (25:24:1, vol/vol/vol) और 10 मिनट के लिए 20 rpm पर एक धूआं हुड में आरटी पर एक रोटेटर मिक्सर पर ट्यूब घुमाएँ.
  13. दूसरा तैयार जेल ट्यूब के साथ एक बार १.११ कदम दोहराएं ।
  14. एक नया ५० मिलीलीटर ट्यूब में supernatant डालो । 25 मिलीलीटर बर्फ ठंडा १००% इथेनॉल जोड़ें और धीरे से हाथ से ट्यूब घुमाएं जब तक डीएनए precipitates (चित्रा 2) ।
    नोट: वर्षण दृष्टिकोण HMW डीएनए को स्थिर करने में मदद करता है ।
  15. एक 20 μL टिप मोड़ एक हुक बनाने के लिए । ध्यान से बाहर हुक के साथ HMW डीएनए ले और तरल छोड़ दो ।
  16. HMW डीएनए को ७०% एथेनॉल के ४० मिलीलीटर युक्त ५० मिलीलीटर ट्यूब में रखें । धीरे से ट्यूब 3 बार उलटा द्वारा डीएनए धो लो ।
  17. ७०% इथेनॉल ट्यूब से डीएनए इकट्ठा करने के लिए एक बार १.१५ कदम दोहराएं ।
  18. HMW डीएनए को 2 मिलीलीटर ट्यूब में रखें जिसमें ७०% एथेनॉल की १.८ मिली है ।
  19. सेंट्रीफ्यूज १०,००० x g पर धोया HMW डीएनए पर 3 एस के लिए RT. के रूप में अधिक से अधिक अवशिष्ट इथेनॉल के रूप में संभव के रूप में पिख्ता निकालें ।
    नोट: अवशिष्ट एथेनॉल को पिख्ता करते समय डीएनए पेलेट को परेशान न करें ।
  20. नमूना सूखी करने के लिए खुला ढक्कन के साथ 10 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर 2 मिलीलीटर ट्यूब इनसेबेट ।
    1. चरण २.१ (यांत्रिक कर्तन और 1d ligation अनुक्रमण किट के साथ) के साथ जारी रखते हैं, तो 2 मिलीलीटर ट्यूब के लिए (10 मिमी Tris और 1 मिमी edta, पीएच ८.०) के 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
    2. चरण २.२ (transposase-आधारित फ़्रेग्मेंटेशन और तीव्र अनुक्रमण किट के साथ) के साथ जारी रखते हैं, तो ०.०२% Triton X-१०० के साथ 10 मिमी Tris (pH ८.०) की २०० μL जोड़ें ।
      नोट: डीएनए गोली को परेशान न करें । ट्यूब ४८ ज के लिए अंधेरे में 4 ° c पर खड़े दे नमूना पूरी तरह से resuspend मदद मिलेगी । HMW डीएनए 2 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है । अब भंडारण समय या अंय भंडारण की स्थिति और अधिक छोटे टुकड़े शुरू कर सकते हैं ।

2. अल्ट्रा लंबे डीएनए पुस्तकालय निर्माण

नोट: दो तरीके ट्विटर अनुक्रमण किट के साथ युग्मित अलग कर्तन विधियों के आधार पर अल्ट्रा लंबे डीएनए पुस्तकालयों का निर्माण कर रहे हैं । एक यांत्रिक shearing आधारित पुस्तकालय 50-70 kb के एक N50 के साथ डेटा का उत्पादन, पुस्तकालय निर्माण के लिए के बारे में 8 एच ले । एक transposase फ़्रेग्मेंटेशन-आधारित लायब्रेरी 90-100 kb डेटा का एक N50 का उत्पादन, केवल ९० मिनट लायब्रेरी निर्माण के लिए ले रहा है । यांत्रिक बाल काटना प्रोटोकॉल अनुक्रमण एडाप्टर और ट्विटर प्रवाह कोशिकाओं की गुणवत्ता के समान संस्करणों का उपयोग कर एक ही डीएनए इनपुट से अधिक उपज देता है ।

  1. यांत्रिक shearing आधारित पुस्तकालय निर्माण
    1. गल और लिजेशन किट से अभिकर्मकों मिश्रण ( सामग्री की मेजदेखें) । बर्फ पर FFPE डीएनए मरंमत बफर और अंत मरंमत/मंहगाई-टेलिंग बफर, तो भंवर और मिश्रण करने के लिए नीचे स्पिन । पिघलना एडाप्टर मिक्स (AMX) और एडाप्टर मनका बाध्यकारी बफर (एबीबी) बर्फ पर, तो पिपेट और मिश्रण करने के लिए नीचे स्पिन । ईंधन मिश्रण (rbf) और रेफरेंस बफर (रेफरेंस) RT पर, तो भंवर और मिश्रण करने के लिए नीचे स्पिन के साथ बफर चल गल । गल पुस्तकालय लोड मोती (एलएलबी) आरटी और पिपेट पर उपयोग करने से पहले मिश्रण करने के लिए ।
      1. एक बार thawed, बर्फ पर सभी किट घटकों रखो । जरूरत पड़ने पर एंजाइमों को बाहर निकाल लें । उपयोग के लिए RT करने के लिए चुंबकीय मोती लाओ ।
        नोट: चुंबकीय मोतियों पर सिफारिशों के लिए सामग्री की मेज देखने का उपयोग करें ।
    2. चरण 1.21.1 से HMW डीएनए की गुणवत्ता और मात्रा की जांच करें । P200 चौड़े बोर युक्तियों का उपयोग करते हुए HMW डीएनए ट्यूब में तीन विभिन्न स्थानों से नई १.५ मिलीलीटर ट्यूबों में डीएनए के 20 μL बाहर पिपेट । एक फ्लोरोमीटर और एक यूवी पढ़ने का उपयोग कर गुणवत्ता का उपयोग कर एकाग्रता का पता लगाने के लिए तीन aliquots से 1 μL ले लो । परिणामों की पुष्टि करने के लिए कई बार जांचें ।
      नोट: अपेक्षित परिणाम चित्र 3Aमें दिखाए जाते हैं । OD260/280 मान लगभग १.९ है और od260/230 मान लगभग २.३ है ।
    3. HMW डीएनए के शेष ९४० μL एक P1000 विस्तृत बोर टिप के साथ एक ५० मिलीलीटर ट्यूब टोपी में स्थानांतरण ।
    4. सुई के बिना एक 1 मिलीलीटर सिरिंज में सभी डीएनए महाप्राण ।
    5. सिरिंज पर 27 ग्राम सुई रखो और टोपी में सभी डीएनए धीरे और धीरे से बाहर निकालें (~ 10 एस). सिरिंज से 27 ग्राम सुई निकाल लें ।
    6. सुई के माध्यम से 30 गुजरता की कुल के लिए 29 बार के लिए कदम 2.1.4 और 2.1.5 दोहराएं ।
      नोट: अपरूपित एचएमडब्ल्यू डीएनए 24 एच तक के लिए अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है । गुणवत्ता नियंत्रण (QC) अत्यधिक स्पंदित क्षेत्र जेल electrophoresis द्वारा सिफारिश की है, लेकिन यह महंगा है और समय लगता है । यदि एक स्वचालित पल्स क्षेत्र जेल ट्रो मशीन पर QC प्रदर्शन एक 20 एच चलाने के लिए एक 5-150 kb प्रोटोकॉल का उपयोग करें । अपेक्षित परिणाम चित्र 4में दर्शाए गए हैं ।
    7. एक ०.२ मिलीलीटर ट्यूब में डीएनए मरंमत प्रतिक्रिया तैयार अपरूपित hmw डीएनए के १०० μl (20 μg), ffpe डीएनए मरंमत बफर के 15 μl, ffpe डीएनए मरंमत मिश्रण के 12 μl, और nuclease मुक्त पानी के 16 μl जोड़कर । धीरे से 6 बार flicking और बुलबुले को दूर करने के लिए नीचे स्पिन द्वारा प्रतिक्रिया मिलाएं ।
    8. ६० मिनट के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया सेते. एक P200 चौड़े बोर टिप के साथ एक नया १.५ मिलीलीटर ट्यूब में नमूना स्थानांतरण ।
    9. चुंबकीय मोतियों को पिख्ता या vortexing द्वारा Resuspend । डीएनए की मरंमत की प्रतिक्रिया के लिए १४३ μL मोती (1x) जोड़ें और ट्यूब 6 बार flicking द्वारा धीरे मिश्रण । 30 मिनट के लिए 20 rpm पर आरटी पर एक रोटेटर मिक्सर पर ट्यूब घुमाएं ।
    10. आर टी पर 2 एस के लिए १,००० एक्स जी पर नमूना नीचे स्पिन. 10 मिनट के लिए एक चुंबकीय रैक पर ट्यूब प्लेस । चुंबकीय रैक पर ट्यूब रखें और supernatant त्यागने ।
    11. चुंबकीय रैक पर ट्यूब रखते हुए, गोली से परेशान बिना हौसले से तैयार ७०% इथेनॉल के ४०० μL जोड़ें । 30 s के बाद ७०% इथेनॉल निकालें ।
    12. दोहराएं चरण 2.1.11 एक बार ।
    13. आर टी पर 2 एस के लिए १,००० एक्स जी पर नमूना नीचे स्पिन. ट्यूब वापस चुंबकीय रैक पर रखें । 30 एस के लिए किसी भी अवशिष्ट इथेनॉल और हवा सूखी निकालें । गोली सूखी खत्म मत करो ।
    14. चुंबकीय रैक से ट्यूब निकालें और जोड़ने के १०३ μL ते (10 मिमी Tris और 1 मिमी EDTA, पीएच ८.०) । धीरे से यह सुनिश्चित करने के लिए कि मोती बफर में कवर कर रहे हैं ट्यूब झटका, और आरटी पर 30 मिनट के लिए एक रोटेटर मिक्सर पर सेते. धीरे से ट्यूब हर 5 मिनट के लिए गोली के resuspension सहायता झटका ।
    15. पेलेट को चुंबकीय रैक पर मोतियों को कम से 10 मिनट के लिए, एक ०.२ मिलीलीटर ट्यूब में एक P200 चौड़े बोर टिप के साथ eluate के १०० μL हस्तांतरण ।
    16. एक ०.२ मिलीलीटर ट्यूब में अंतिम मरम्मत और डीए-टेलिंग प्रतिक्रिया तैयार HMW डीएनए की १०० μL जोड़कर, अंत मरंमत के 14 μL/दा-टेलिंग बफर और 7 μL अंत मरंमत/डीए-टेलिंग मिक्स । धीरे से 6 बार flicking द्वारा प्रतिक्रिया मिश्रण है, और बुलबुले को दूर करने के लिए नीचे स्पिन ।
    17. 20 ° c पर ६० मिनट के लिए और उसके बाद 20 मिनट के लिए ६५ डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया सेते, और फिर 22 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ । एक नया १.५ मिलीलीटर एक P200 चौड़े बोर टिप का उपयोग कर ट्यूब में नमूना स्थानांतरण ।
    18. चुंबकीय मोतियों को पिख्ता या vortexing द्वारा Resuspend । मोतियों की ४८ μL जोड़ें (0.4 x) अंत में मरंमत के लिए/डीए-टेलिंग प्रतिक्रिया और मिश्रण धीरे से flicking द्वारा ट्यूब 6 बार । 30 मिनट के लिए 20 rpm पर आरटी पर एक रोटेटर मिक्सर पर ट्यूब घुमाएं ।
    19. चरण 2.1.10-2.1.13 एक बार दोहराएं ।
    20. चुंबकीय रैक से ट्यूब निकालें और जोड़ने के ३३ μL ते (10 मिमी Tris और 1 मिमी EDTA, पीएच ८.०) । धीरे से यह सुनिश्चित करने के लिए कि मोती बफर में कवर कर रहे हैं ट्यूब झटका, और आरटी पर 30 मिनट के लिए एक रोटेटर मिक्सर पर सेते. धीरे से ट्यूब हर 5 मिनट के लिए गोली के resuspension सहायता झटका ।
    21. पेलेट चुंबकीय रैक पर मोती कम से 10 मिनट के लिए. एक नया १.५ मिलीलीटर ट्यूब में एक P200 चौड़े बोर टिप के साथ eluate के 30 μL स्थानांतरण । एक फ्लोरोमीटर का उपयोग कर एकाग्रता का पता लगाने के लिए अतिरिक्त 1-2 μL ले लो ।
      नोट: इस चरण में 5-6 μg की वसूली की उंमीद है ।
    22. अंत की मरंमत hmw डीएनए, 20 μl एडाप्टर मिश्रण (amx 1d) के 30 μl जोड़कर १.५ मिलीलीटर नमूना ट्यूब में बंधाव प्रतिक्रिया तैयार है, और कुंद के ५० μl/ प्रत्येक अनुक्रमिक इसके अलावा के बीच धीरे से 6 बार flicking और बुलबुले को दूर करने के लिए नीचे स्पिन द्वारा प्रतिक्रिया मिलाएं ।
    23. ६० मिनट के लिए आर टी पर प्रतिक्रिया इनसेबेट ।
    24. चुंबकीय मोतियों को पिख्ता या vortexing द्वारा Resuspend । बंधाव प्रतिक्रिया करने के लिए ४० μl मोती (0.4 x) जोड़ें और ट्यूब 6 बार flicking द्वारा धीरे मिश्रण । 30 मिनट के लिए 20 rpm पर आरटी पर एक रोटेटर मिक्सर पर ट्यूब घुमाएं ।
    25. दोहराएं चरण 2.1.10 एक बार ।
    26. ट्यूब में एडाप्टर मनका बाइंडिंग (एबीबी) बफर के ४०० μL जोड़ें । इस नली को धीरे से 6 बार झाड़ लें । ट्यूब वापस चुंबकीय रैक पर जगह मोती बफर से अलग और supernatant त्यागने के लिए ।
    27. दोहराएं चरण 2.1.26 एक बार ।
    28. आर टी पर 2 एस के लिए १,००० एक्स जी पर नमूना नीचे स्पिन. ट्यूब वापस चुंबकीय रैक पर रखें । 30 एस के लिए किसी भी अवशिष्ट बफर और हवा सूखी निकालें । गोली सूखी खत्म मत करो ।
    29. चुंबकीय रैक से ट्यूब निकालें और रेफरेंस बफर के ४३ μL में गोली resuspend । धीरे से यह सुनिश्चित करने के लिए कि मोती बफर में कवर कर रहे हैं और 30 मिनट के लिए आरटी पर एक रोटेटर मिक्सर पर सेने के लिए ट्यूब झटका. धीरे ट्यूब हर 5 मिनट के लिए गोली के resuspension सहायता करने के लिए झटका ।
    30. एक नई १.५ मिलीलीटर ट्यूब में एक P200 चौड़ी बोर टिप के साथ eluate के स्थानांतरण ४० μL-गोली के लिए चुंबकीय रैक पर मोती । एक फ्लोरोमीटर का उपयोग कर एकाग्रता का पता लगाने के लिए अतिरिक्त 1-2 μL ले लो ।
      नोट: इस चरण में 1-2 μg की वसूली की उंमीद है । यांत्रिक shearing आधारित पुस्तकालय लोड करने के लिए तैयार है । पुस्तकालय बर्फ पर 2 एच के लिए संग्रहीत किया जा सकता अनुक्रमण के लिए लोड हो रहा है जब तक अगर जरूरत है ।
  2. Transposase फ़्रेग्मेंटेशन-आधारित पुस्तकालय निर्माण
    1. transposase किट से अभिकर्मकों गल ( सामग्री की मेजदेखें) । पिघलना विखंडन मिश्रण (एफआरए) और बर्फ और पिपेट पर रैपिड एडाप्टर (रैप) मिश्रण करने के लिए । गल अनुक्रमण बफर (sqb), लोड मोती (पौंड), फ्लश बफर (flb) और फ्लश तार (flb) RT और पिपेट पर मिश्रण करने के लिए । गल लोड मोती (LB) पर RT और पिपेट में उपयोग करने से पहले मिश्रण करने के लिए । एक बार thawed, बर्फ पर सभी किट घटकों रखो । जरूरत पड़ने पर एंजाइमों को बाहर निकाल लें ।
    2. चरण 1.21.2 से HMW डीएनए की गुणवत्ता और मात्रा की जांच करें । P200 चौड़े बोर युक्तियों का उपयोग करते हुए HMW डीएनए ट्यूब में तीन विभिन्न स्थानों से नई १.५ मिलीलीटर ट्यूबों में डीएनए के 20 μL बाहर पिपेट । एक फ्लोरोमीटर और एक यूवी पढ़ने का उपयोग कर गुणवत्ता का उपयोग कर एकाग्रता का पता लगाने के लिए तीन aliquots से 1 μL ले लो । परिणामों की पुष्टि करने के लिए कई बार जांचें ।
      नोट: अपेक्षित परिणाम चित्र 3Bमें दिखाए जाते हैं । OD260/280 मान लगभग १.९ है और od260/230 मान लगभग २.३ है ।
    3. HMW डीएनए के 22 μL, 10 मिमी Tris के 1 μL (पीएच ८.०) के साथ ०.०२% Triton X-१०० और 1 μL विखंडन मिश्रण (एफआरए) जोड़कर एक ०.२ मिलीलीटर ट्यूब में डीएनए टैगमेंटेशन प्रतिक्रिया तैयार करें । एक P200 चौड़े बोर टिप के साथ धीरे से संभव के रूप में 6 बार, के साथ पिख्ता द्वारा मिक्स बुलबुले परिचय करने के लिए नहीं ध्यान ले ।
    4. 1 मिनट के लिए ८० डिग्री सेल्सियस के बाद एक मिनट के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया सेते, और फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ । एक P200 चौड़े बोर टिप के साथ एक नया १.५ मिलीलीटर ट्यूब में मिश्रण स्थानांतरण और तुरंत अगले कदम के लिए जाना ।
    5. १.५ मिलीलीटर नमूना ट्यूब के लिए रैपिड एडाप्टर (रैप) के 1 μL जोड़ें । एक P200 चौड़े बोर टिप के साथ धीरे से संभव के रूप में 6 बार, के साथ पिख्ता द्वारा मिक्स बुलबुले परिचय करने के लिए नहीं ध्यान ले ।
    6. ६० मिनट के लिए आर टी पर प्रतिक्रिया इनसेबेट ।
      नोट: transposase फ़्रेग्मेंटेशन-आधारित लायब्रेरी लोड करने के लिए तैयार है । पुस्तकालय बर्फ पर 2 एच के लिए संग्रहीत किया जा सकता अनुक्रमण के लिए लोड हो रहा है जब तक अगर जरूरत है ।

3. नैनोपोर डिवाइस पर अनुक्रमण

  1. नैनोपोर अनुक्रमण युक्ति की जांच करें ( सामग्री की तालिकादेखें) । सुनिश्चित करें कि सॉफ़्टवेयर और हार्डवेयर दोनों कार्य कर रहे है और पर्याप्त संग्रहण स्थान है ।
  2. फ्लो सेल की जांच करें । एक नया फ्लो सेल खोलें और नैनोपोर डिवाइस में फ्लो सेल डालें । स्थान के बॉक्स की जांच करें प्रवाह सेल (X1-X5) में डाला गया था । सही प्रवाह कक्ष प्रकार का चयन करें । प्रवाह कक्ष जांचें वर्कफ़्लो पर क्लिक करें । प्रारंभ परीक्षण बटन पर क्लिक करें फ्लो सेल QC विश्लेषण शुरू करने के लिए ।
    नोट: यदि रिपोर्ट की गई कुल सक्रिय रंध्र संख्या ८०० से कम है, तो sequencing के लिए कोई भिंन नए प्रवाह कक्ष का उपयोग करें ।
  3. भड़काना बफर तैयार करें । एक यांत्रिक shearing आधारित पुस्तकालय के लिए, एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में ईंधन मिश्रण (RBF) और ६२४ μL के nuclease मुक्त पानी के साथ चल बफर के ५७६ μL जोड़ें । भंवर और नीचे स्पिन के लिए भड़काना बफर मिश्रण । transposase फ़्रेग्मेंटेशन-आधारित लायब्रेरी के लिए, फ्लश बफ़र (FLT) की ट्यूब के लिए फ्लश टेथर (FLT) के 30 μL जोड़ें । भंवर और नीचे स्पिन के लिए भड़काना बफर मिश्रण ।
  4. प्रवाह सेल पर, भड़काना पोर्ट कवर करने के लिए भड़काना पोर्ट का पर्दाफाश करने के लिए दक्षिणावर्त ले जाएं ।
  5. एक P1000 पिपेट सेट करने के लिए १०० μl और टिप भड़काना बंदरगाह में डालें । फ्लो सेल से किसी भी बुलबुले को हटाने के लिए बफर की एक छोटी सी मात्रा वापस ड्रा (30 μL से कम) । एक बार पीले द्रव की एक छोटी राशि के टिप में प्रवेश करती है पिख्ता बंद करो ।
  6. एक P1000 पिपेट का उपयोग करने के लिए भड़काना बंदरगाह के माध्यम से प्रवाह सेल में भड़काना मिश्रण के ८०० μl लोड । बुलबुले शुरू करने से बचने के लिए, पहले भड़काना बंदरगाह के शीर्ष को कवर करने के लिए भड़काना मिश्रण के 30 μl जोड़ें, तो भड़काना बंदरगाह में टिप डालने के लिए और धीरे से भड़काना मिश्रण के बाकी जोड़ने । बाहर टिप ले जब वहां के बारे में ५० μL छोड़ दिया है । भड़काना बंदरगाह के शीर्ष पर भड़काना मिश्रण के बाकी जोड़ें । द्रव अपने आप अंदर चला जाएगा ।
  7. 5 मिनट के लिए सेते के लिए सेटअप छोड़ दें । इस बीच लाइब्रेरी में १.५ मिलीलीटर ट्यूब युक्त लाइब्रेरी मिक्स तैयार करें ।
    नोट: एक यांत्रिक shearing आधारित पुस्तकालय के लिए ईंधन मिश्रण के साथ चल बफर के ३५ μL जोड़ें (RBF) डीएनए पुस्तकालय के ४० μL के लिए । transposase फ़्रेग्मेंटेशन-आधारित लायब्रेरी के लिए ३४ μl अनुक्रमण बफ़र (sqb) और 16 μl के nuclease-मुक्त पानी डीएनए लाइब्रेरी के 25 μl के लिए जोड़ें ।
  8. नमूना पोर्ट का पर्दाफाश करने के लिए धीरे प्रवाह सेल नमूना पोर्ट कवर खोलें । चरण ३.५ में वर्णित के रूप में प्रवाह कक्ष में भड़काना बंदरगाह के माध्यम से भड़काना मिश्रण के २०० μl जोड़ने के लिए एक P1000 पिपेट का प्रयोग करें । सुनिश्चित करें कि भड़काना मिश्रण नमूना पोर्ट के माध्यम से प्रवाह कक्ष में लोड नहीं है ।
  9. एक P200 पिपेट सेट करने के लिए ८० μL. पुस्तकालय धीरे से एक व्यापक बोर टिप के साथ मिश्रण और नीचे से 6 बार बस लदान से पहले ।
  10. फ्लो सेल में नमूना बंदरगाह के माध्यम से पुस्तकालय मिश्रण बिंदुश: लोड । पिछले ड्रॉप पूरी तरह से पोर्ट में लोड होने के बाद ही प्रत्येक ड्रॉप जोड़ें ।
  11. वापस नमूना बंदरगाह कवर धीरे से रखो और सुनिश्चित करें कि नमूना बंदरगाह पूरी तरह से कवर किया है । भड़काना बंदरगाह आवरण को स्थानांतरित करने के लिए भड़काना बंदरगाह कवर वामावर्त । डिवाइस ढक्कन बंद करें ।
  12. नए प्रयोग वर्कफ़्लो पर क्लिक करें. लायब्रेरी का नाम लिखें, उपयोग की गई कार्यविधियों के अनुसार सही किट का चयन करें, और जांचें कि सेटिंग्स सही है (४८ h चलाने, रीयल-टाइम आधार-पर कॉलिंग) ।
  13. चलाएं प्रारंभक्लिक करें । 10 मिनट के बाद, रन जानकारी से फ्लो सेल आईडी और सक्रिय नैनोपोर नंबर (कुल संख्या और प्रत्येक चार समूहों की संख्या) रिकॉर्ड करें ।
  14. डेटा विश्लेषण । किसी स्थानीय कंप्यूटर या किसी क्लस्टर अनुक्रमण के किसी भी समय या जब चलाएं पूर्ण होने पर डेटा की प्रतिलिपि बनाएं । अनुक्रम डेटा को संदर्भ जीनोम में संरेखित करने के लिए Minimap216 (https://github.com/lh3/minimap2) का उपयोग करें । अनुक्रमण प्रदर्शन raw अनुक्रम डेटा और प्रियपात्र द्वारा nanoplot17 (https://github.com/wdecoster/NanoPlot) से सारांशित करें ।

Representative Results

अल्ट्रा लंबे डीएनए अनुक्रमण प्रोटोकॉल पुस्तकालय निर्माण के लिए HMW डीएनए पर लागू होता है । इसलिए, यह सेल संचयन कदम पर 85% > जीवित अनुपात के साथ अच्छी तरह से सुसंस्कृत कोशिकाओं का चयन करने के लिए महत्वपूर्ण है । डीएनए निष्कर्षण के लिए प्रयुक्त कोशिकाओं की मात्रा गुणवत्ता और HMW डीएनए की मात्रा को प्रभावित करेगा । सेल lysis अच्छी तरह से काम नहीं करता है अगर बहुत अधिक कोशिकाओं के साथ शुरू । बहुत कुछ कोशिकाओं का उपयोग पुस्तकालय निर्माण के लिए पर्याप्त डीएनए उत्पंन नहीं है क्योंकि HMW डीएनए अवक्षेपण हाथ से कोमल रोटेशन के बजाय उच्च गति केंद्रापसारक का उपयोग किया जाता है । एचएमडब्ल्यू डीएनए का एक उदाहरण आइस-कोल्ड १००% एथेनोल और घूर्णन को जोड़ने के बाद, चित्रा 2में सफेद सूती जैसा हाला दिखाया गया है ।

यह पुस्तकालय निर्माण शुरू करने से पहले इनपुट डीएनए की गुणवत्ता की जांच करने के लिए महत्वपूर्ण है । गिरावट, गलत मात्रा, संदूषण (जैसे, प्रोटीन, RNAs, डिटर्जेंट, सर्फेक्टेंट, और अवशिष्ट phenol या इथेनॉल) और कम आणविक वजन डीएनए बाद की प्रक्रियाओं पर और अंतिम पढ़ने की लंबाई पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव हो सकता है. हम HMW डीएनए युक्त ट्यूब में तीन विभिन्न स्थानों से डीएनए का उपयोग कर QC विश्लेषण प्रदर्शन करने की सलाह देते हैं । एचएमडब्ल्यू डीएनए के लिए यूवी रीडिंग परिणामों से, आयुध डिपो२६०/ओडी२८० मूल्य लगभग १.९ है और आयुध डिपो२६०/ओडी२३० मूल्य लगभग २.३ (चित्र 3 क, ख) है । ये अनुपात मान एक अच्छा HMW डीएनए नमूने के लिए तीन परीक्षणों के बीच संगत कर रहे हैं । विभिंन कर्तन विधियों इनपुट डीएनए के विभिंन संस्करणों की आवश्यकता है । एचएमडब्ल्यू डीएनए की सांद्रता को यांत्रिक बाल बनाने के लिए 200 एनजी/μL > की आवश्यकता होती है जबकि ट्रांसपोसेज़ विखंडन के लिए 1 μg/μL > की आवश्यकता होती है । एक फ्लोरोमीटर द्वारा पता लगाया एकाग्रता यूवी पढ़ने से थोड़ा कम है । हालांकि, एक ही HMW डीएनए नमूने की एकाग्रता के परिवर्तन के गुणांक के लिए फ्लोरोमीटर और यूवी रीडिंग assays दोनों के साथ 15% से कम होना आवश्यक है । यांत्रिक बाल काटना hmw डीएनए को तोड़ने के लिए एक सुई के साथ एक सिरिंज लागू होता है ताकि सुई के माध्यम से गुजरता की संख्या कर्तन डीएनए और अंतिम पढ़ने की लंबाई के आकार को प्रभावित करेगा. यह HMW डीएनए के बहुमत सुनिश्चित करने के लिए सुई के बाद आकार QC प्रदर्शन करने के लिए सिफारिश की है ५० kb से बड़ा है के रूप में चित्रा 4में सचित्र । यांत्रिक बाल काटना विधि में, 30 गुजरता सबसे अच्छा अनुक्रमण दोनों लंबाई और उत्पादन पर विचार परिणाम उत्पंन ।

N50 kb एक यांत्रिक shearing-आधारित लायब्रेरी का एक transposase फ़्रेग्मेंटेशन-आधारित लायब्रेरी 90-100 kb है । HG00733 कक्ष पंक्ति का उपयोग करते हुए चार रन के परिणाम तालिका 1में दिखाए जाते हैं । सभी चार रन २,३०० से अधिक लंबाई के साथ पढ़ता है १०० kb से अधिक है । अधिकतम लंबाई transposase फ़्रेग्मेंटेशन-आधारित लायब्रेरीज़ (४५५ kb और ४८९ kb) में यांत्रिक shearing आधारित लायब्रेरीज़ (३४८ kb और ३८७ kb) के साथ तुलना में लंबा है, जबकि उत्तरार्द्ध अधिक कुल पढ़ता, एक उच्च उपज का संकेत । transposase फ़्रेग्मेंटेशन-आधारित पुस्तकालय निर्माण कम कदम है और कम तैयारी समय इतना है कि यह कम छोटे टुकड़ों का परिचय होगा । transposase का उपयोग कर दो रन एक लंबा माध्य लंबाई (> 30 kb) और माध्य लंबाई (> 10 kb) है । इसके अलावा, डेटा सभी रन में लगातार उच्च गुणवत्ता से पता चलता है (औसत गुणवत्ता स्कोर लगभग १०.०, ~ ९०% आधार सटीकता) है । कुल अड्डों के ९७% से अधिक मानव संदर्भ जीनोम (hg19) डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स के साथ Minimap216 का उपयोग करने के लिए गठबंधन किया गया । कच्चे reads की अपेक्षित आकार वितरण आरेख 5में दिखाए जाते हैं । सभी रन ५० kb के ऊपर डेटा का एक बड़ा अनुपात है, जबकि transposase फ़्रेग्मेंटेशन आधारित पुस्तकालयों अल्ट्रा की एक उच्च अनुपात लंबी पढ़ता है (जैसे > १०० kb) । यह प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक एकाधिक मानव कक्ष रेखाओं (अनुपूरक तालिका 1) में लागू किया गया है ।

Figure 1
चित्रा 1: ट्विटर लंबे समय से पढ़ें अनुक्रमण (nlr-seq) कार्यप्रवाह के योजनाबद्ध सिंहावलोकन । नारंगी, transposase परिसर । पीला-हरा, नैनोपोर अनुकूलक । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: phenol-क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण विधि से प्रतिनिधि डीएनए वर्षण. सफेद तीर HMW डीएनए इंगित करता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: उदाहरण QC यूवी पढ़ने से HMW डीएनए के परिणाम । (क) एचएमडब्ल्यू के डीएनए को स्टेप 1.21.1 से मैकेनिकल शेअरिंग आधारित पुस्तकालय निर्माण के लिए तैयार करना । (ख) ट्रांपोसेज़ विखंडन आधारित पुस्तकालय निर्माण के लिए चरण 1.21.2 से एचएमडब्ल्यू डीएनए । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: QC सुई के परिणाम pulsed क्षेत्र जेल electrophoresis द्वारा hmw डीएनए अपरूपित । L1: त्वरित लोड 1 केबी डीएनए सीढ़ी; L2: त्वरित लोड 1 केबी डीएनए सीढ़ी का विस्तार । 1-8: सुई shearing के माध्यम से अलग गुजर बार के साथ डीएनए । 1-3, कोई shearing; 4, 10 बार; 5, 20 बार; 6, 30 बार; 7, ४० बार; 8, ५० बार । यह QC चरण वैकल्पिक है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: ट्विटर अल्ट्रा लंबे डीएनए पुस्तकालयों की अनुमानित आकार वितरण । MS, यांत्रिक shearing आधारित पुस्तकालयों । TF, transposase फ़्रेग्मेंटेशन-आधारित लायब्रेरीज़ । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

यांत्रिक shearing_rep1 यांत्रिक shearing_rep2 Transposase fragmentation_rep1 Transposase fragmentation_rep2
कोशिका रेखा HG00733 HG00733 HG00733 HG00733
N50 के पढ़ता ५५,१८० ६३,००७ ९८,२३७ ९५,६२९
१०० Kb से अधिक reads की संख्या २,५०० ३,०८२ २,३८६ २,३५५
कुल पढ़ता की संख्या ९७,८५९ ८०,४६५ २४,१६६ २१,०३२
अधिकतम लंबाई (बीपी) ३४८,४८२ ३८७,११३ ४५४,६६० ४८९,४२६
माध्य लंबाई (bp) १७,८६१ २०,३९५ ३३,५२८ ३८,१७५
माध्य लंबाई (bp) ५,३३५ ५,८९४ १०,२४९ १५,६५६
पढ़ता का माध्य गुणवत्ता १०.० १०.१ ९.९ १०.०
कच्चे पढ़ता की कुल कुर्सियां १,७४७,८४९,८२२ १,६४१,०५८,९३२ ८१०,२२९,७३३ ८०२,८८६,३०४
संरेखित reads के कुल आधार १,६९३,३००,८३२ १,६०७,९७५,९२५ ७९१,४२२,०७७ ७७८,४१७,६२७
कुल आधारों का प्रतिचित्रित अनुपात (hg19, Minimap2) ९६.९% ९८.०% ९७.७% ९७.०%
सक्रिय रंध्र की संख्या १२२५:४८०, ४०२, २५४, ८९ १०५८:४८०, ३५६, १७६, ४६ ९५८:४५२, ३२८, १४८, 30 १०९२:४८७, ३६७, १९५, ४३

तालिका 1: विभिन्न कर्तन प्रोटोकॉल के साथ रन से प्रदर्शन मैट्रिक्स सारांश ।

लाइब्रेरी 1 लाइब्रेरी 2
कोशिका रेखा K562 GM19240
सेल ऑर्डरिंग जानकारी ATCC, बिल्ली । नहीं. सीसीएल-२४३ कोरिएल संस्थान, बिल्ली । नहीं. GM19240
प्रोटोकॉल यांत्रिक शेअरिंग यांत्रिक शेअरिंग
N50 के पढ़ता ६०,०६३ ५५,२९५
कुल पढ़ता की संख्या १९३,७८३ १२०,८०७
माध्य लंबाई (bp) १,८४३ ४,६८८
माध्य लंबाई (bp) ९,८२५ १७,४०८
अधिकतम लंबाई (बीपी) ५४८,७८० २१२,३३८
कच्चे पढ़ता की कुल कुर्सियां १,९०३,९८९,६८६ २,१०३,०१५,३३१
संरेखित reads के कुल आधार १,८३७,३५०,०४७ १,९९७,४१९,७६१
कुल आधारों का प्रतिचित्रित अनुपात (hg19, Minimap2) ९६.६% ९५.०%
सक्रिय रंध्र की संख्या ११११:४८२, ३७१, २०३, ५५ १०३२:४४७, ३३३, १९६, ५६

अनुपूरक सारणी 1: दो NLR-seq का सारांश यांत्रिक बाल काटना प्रोटोकॉल के साथ अन्य सेल लाइनों का उपयोग कर चलाता है ।

Discussion

सिद्धांत रूप में, ट्विटर अनुक्रमण करने के लिए १०० kb megabase उत्पंन करने में सक्षम है लंबाई में पढ़ता है11,12,13। चार प्रमुख कारकों अनुक्रमण भागो और डेटा की गुणवत्ता के प्रदर्शन को प्रभावित करेगा: 1) सक्रिय रंध्र संख्या और pores की गतिविधि; 2) मोटर प्रोटीन, जो नानोपोर के माध्यम से गुजर डीएनए की गति को नियंत्रित करता है; 3) डीएनए टेम्पलेट (लंबाई, शुद्धता, गुणवत्ता, द्रव्यमान); 4) अनुक्रमण अनुकूलक बंधाव दक्षता, जो इनपुट नमूना से useable डीएनए निर्धारित करता है । पहले दो कारकों प्रवाह सेल के संस्करण और अनुक्रमण किट निर्माता द्वारा प्रदान पर निर्भर करते हैं । दूसरे दो कारकों इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम है (hmw डीएनए निष्कर्षण, कर्तन और ligation) ।

इस प्रोटोकॉल के लिए धैर्य और अभ्यास की आवश्यकता है । HMW डीएनए की गुणवत्ता अल्ट्रा लंबे डीएनए पुस्तकालयों के लिए महत्वपूर्ण है6। प्रोटोकॉल उच्च व्यवहार्यता (> 85% व्यवहार्य सेल पसंदीदा) के साथ एकत्र कोशिकाओं के साथ शुरू होता है, मृत कोशिकाओं से नीचा डीएनए सीमित । किसी भी कठोर प्रक्रिया जो डीएनए को नुकसान (जैसे, मजबूत परेशान, मिलाते हुए, भंवर, एकाधिक पिख्ता, दोहराया ठंड और गल) का परिचय हो सकता है से बचना चाहिए । प्रोटोकॉल के डिजाइन में, हम डीएनए निष्कर्षण की पूरी प्रक्रिया में पिख्ता चूकना । विस्तृत बोर युक्तियों का उपयोग करने की आवश्यकता है जब पाइपलाइन पुस्तकालय निर्माण और अनुक्रमण के दौरान यांत्रिक कर्तन के बाद आवश्यक है । के रूप में nanopores चैंबर बफर12में chemistries के प्रति संवेदनशील हैं, वहां के रूप में कुछ अवशिष्ट contaminants होना चाहिए (जैसे, डिटर्जेंट, surfactants, phenol, इथेनॉल, प्रोटीन rnas, आदि) के रूप में डीएनए में संभव है । लंबाई और उपज को ध्यान में रखते हुए, phenol निष्कर्षण विधि से पता चलता है सबसे अच्छा और सबसे reproducible कई अलग निष्कर्षण तरीकों का परीक्षण अब तक के साथ तुलना में परिणाम ।

लंबे समय तक पढ़ने के दृश्यों का उत्पादन करने के लिए इस प्रोटोकॉल की क्षमता के बावजूद, कई सीमाएं अभी भी बनी हुई हैं । सबसे पहले, इस प्रोटोकॉल के प्रकाशन के समय में उपलब्ध नैनोपोर अनुक्रमण उपकरण के आधार पर अनुकूलित किया गया था; इस प्रकार, यह चयनात्मक नैनोपोर आधारित अनुक्रमण रसायन विज्ञान तक ही सीमित है और लंबे समय से पढ़ने अनुक्रमण उपकरणों के अंय प्रकार में किया जब सबऑप्टिमल हो सकता है । दूसरा, परिणाम शुरू सामग्री (ऊतकों या कोशिकाओं) से निकाले गए डीएनए की गुणवत्ता पर अत्यधिक निर्भर है । यदि प्रारंभिक डीएनए पहले से ही नीचा या क्षतिग्रस्त है तो पठन लंबाई समझौता किया जाएगा । तीसरा, हालांकि कई QC कदम प्रोटोकॉल में डीएनए की गुणवत्ता की जांच करने के लिए शामिल कर रहे हैं, अंतिम उपज और पढ़ता की लंबाई प्रवाह कोशिका और ताकना गतिविधि है, जो नैनोपोर अनुक्रमण मंच के इस प्रारंभिक चरण में चर सकता है द्वारा प्रभावित किया जा सकता है विकास.

प्रोटोकॉल यहां वर्णित डीएनए निष्कर्षण के लिए मानव निलंबन सेल लाइन के नमूनों का उपयोग करता है । हम सुई shearing में गुजर बार अनुकूलित किया है, hmw डीएनए के transposase करने के लिए अनुपात और बंधाव समय वर्णित परिणामों के उत्पादन के लिए । प्रोटोकॉल को चार तरीकों से विस्तारित किया जा सकता है । सबसे पहले, उपयोगकर्ताओं को अंय सभ्य स्तनधारी कोशिकाओं के साथ और कोशिकाओं, ऊतकों, नैदानिक नमूनों, या अंय जीवों के विभिंन राशि के साथ शुरू कर सकते हैं । इसके अलावा lysis ऊष्मायन समय पर अनुकूलन, प्रतिक्रिया मात्रा और केंद्रापसारक की जरूरत होगी । दूसरा, यह अल्ट्रा के लिए लक्ष्य आकार की भविष्यवाणी करने के लिए कठिन है लंबे समय sequencing पढ़ें । यदि पठन लंबाई अपेक्षा से कम है, तो उपयोगकर्ता कर सकते है पासिंग समय में यांत्रिक shearing-आधारित पद्धति को समायोजित करें या transposase फ़्रेग्मेंटेशन-आधारित पद्धति में करने के लिए HMW डीएनए का अनुपात बदलें । क्लीनअप स्टेप के दौरान लंबे समय तक बाइंडिंग और वेफरेंस टाइम मददगार होते हैं क्योंकि एचएमडब्ल्यू डीएनए बेहद चिपचिपा होता है । तीसरा, अलग ट्विटर अनुक्रमण उपकरणों के साथ, एक मात्रा और डीएनए की मात्रा को समायोजित करने के लिए sequencer के मापदंड को पूरा कर सकते हैं. चौथा, केवल उन डीएनए अनुक्रमण एडाप्टर के लिए ligated अनुक्रम किया जाएगा । आगे बंधाव दक्षता में सुधार करने के लिए, एक एडाप्टर और बंधाव सांद्रता titrate करने का प्रयास कर सकते हैं । संशोधित बंधाव समय और आणविक भीड़ एजेंटों जैसे खूंटी18 भविष्य में लागू किया जा सकता है । अल्ट्रा लंबे डीएनए अनुक्रमण प्रोटोकॉल crispr19के साथ संयुक्त,20 लक्ष्य संवर्धन अनुक्रमण के लिए एक प्रभावी उपकरण की पेशकश कर सकते हैं ।

Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

लेखक पांडुलिपि पर अपनी टिप्पणी के लिए Y. Zhu धंयवाद । इस प्रकाशन में सूचित अनुसंधान आंशिक रूप से राष्ट्रीय कैंसर संस्थान के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों द्वारा पुरस्कार संख्या P30CA034196 के तहत समर्थन किया गया था । सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिंमेदारी है और जरूरी नहीं कि स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Absolute ethanol Sigma-Aldrich E7023
Agencourt AMPure XPbeads Beckman A63881 magnetic beads for cleanup
BD conventional needles Becton Dickinson 305136 27G, for mechanical shearing
BD Luer-Lok syringe Becton Dickinson 309628 for mechanical shearing
Blunt/TA Ligase Master Mix NEB M0367S
Countess Cell Counting Chamber Slides Invitrogen C10228 for cell counting
EDTA Invitrogen AM9261 pH 8.0, 0.5 M, 500 mL
Flow Cell Oxford Nanopore Technologies FLO-MIN106 R9.4.1
HG00773 cells Coriell Institute HG00733 cells used in this protocol
Ligation Sequencing Kit 1D Oxford Nanopore Technologies SQK-LSK108 nanopore ligation kit
MaXtract High Density tubes Qiagen 129073 gel tubes
NEBNext FFPE DNA Repair Mix NEB M6630S
NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module NEB M7546S
Nuclease-free water Invitrogen AM9937
Phosphate-Buffered Saline, PBS Gibco 70011044 10X, pH 7.4
Phenol:chloroform:IAA Invitrogen AM9730
Proteinase K Qiagen 19131 20 mg/mL
Qubit dsDNA BR Assay Kit Invitrogen Q32850 fluorometer assays for DNA quantification
Rapid Sequencing Kit Oxford Nanopore Technologies SQK-RAD004 nanopore transposase kit
RNase A Qiagen 19101 100 mg/mL
SDS Invitrogen AM9822 10% (wt/vol)
Sodium chloride solution Invitrogen AM9759 5.0 M
TE buffer Invitrogen AM9849 pH 8.0
Tris Invitrogen AM9856 pH 8.0, 1 M
Triton X-100 solution Sigma-Aldrich 93443 ~10%
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Bio-Rad C1000 Thermal Cycler Bio-Rad 1851196EDU
Centrifuge 5810R Eppendorf 22628180
Countess II FL Automated Cell Counter Life Technologies AMQAF1000 for cell counting
DynaMag-2 Magnet Life Technologies 12321D magnetic rack
Eppendorf ThermoMixer Eppendorf 5382000023 for incubation
Freezer LabRepCo LHP-5-UFMB
GridION Oxford Nanopore Technologies GridION X5 nanopore device used in this protocol
HulaMixer Sample Mixer Thermo Fisher Scientific 15920D rotator mixer
MicroCentrifuge Benchmark Scientific C1012
NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific ND-1000 for UV reading
Pippin Pulse Sage Science PPI0200 pulsed-field gel electrophoresis instrument
Qubit 3.0 Fluorometer Invitrogen Q33216 fluorometer
Refrigerator LabRepCo LABHP-5-URBSS
Vortex-Genie 2 Scientific Industries SI-A236
Water bath VWR 89501-464

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mardis, E. R. Next-generation sequencing platforms. Annual Review of Analytical Chemistry. 6, 287-303 (2013).
  2. Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nature Reviews Genetics. 17 (6), 333-351 (2016).
  3. Shendure, J., et al. DNA sequencing at 40: past, present and future. Nature. 550 (7676), 345-353 (2017).
  4. Alkan, C., Coe, B. P., Eichler, E. E. Genome structural variation discovery and genotyping. Nature Reviews Genetics. 12 (5), 363-376 (2011).
  5. Weischenfeldt, J., Symmons, O., Spitz, F., Korbel, J. O. Phenotypic impact of genomic structural variation: insights from and for human disease. Nature Reviews Genetics. 14 (2), 125-138 (2013).
  6. Pollard, M. O., Gurdasani, D., Mentzer, A. J., Porter, T., Sandhu, M. S. Long reads: their purpose and place. Human Molecular Genetics. 27 (R2), R234-R241 (2018).
  7. Cretu Stancu, M., et al. Mapping and phasing of structural variation in patient genomes using nanopore sequencing. Nature Communications. 8 (1), 1326 (2017).
  8. Gong, L., et al. Picky comprehensively detects high-resolution structural variants in nanopore long reads. Nature Methods. 15 (6), 455-460 (2018).
  9. Sedlazeck, F. J., et al. Accurate detection of complex structural variations using single-molecule sequencing. Nature Methods. 15 (6), 461-468 (2018).
  10. Jain, M., et al. Nanopore sequencing and assembly of a human genome with ultra-long reads. Nature Biotechnology. 36 (4), 338-345 (2018).
  11. Jain, M., et al. Improved data analysis for the MinION nanopore sequencer. Nature Methods. 12 (4), 351-356 (2015).
  12. Deamer, D., Akeson, M., Branton, D. Three decades of nanopore sequencing. Nature Biotechnology. 34 (5), 518-524 (2016).
  13. Jain, M., Olsen, H. E., Paten, B., Akeson, M. The Oxford Nanopore MinION: delivery of nanopore sequencing to the genomics community. Genome Biology. 17 (1), 239 (2016).
  14. Editorial, The long view on sequencing. Nature Biotechnology. 36 (4), 287 (2018).
  15. Jain, M., et al. Linear assembly of a human centromere on the Y chromosome. Nature Biotechnology. 36 (4), 321-323 (2018).
  16. Li, H. Minimap2: pairwise alignment for nucleotide sequences. Bioinformatics. 34, 3094-3100 (2018).
  17. De Coster, W., D'Hert, S., Schultz, D. T., Cruts, M., Van Broeckhoven, C. NanoPack: visualizing and processing long-read sequencing data. Bioinformatics. 34, 2666-2669 (2018).
  18. Akabayov, B., Akabayov, S. R., Lee, S. J., Wagner, G., Richardson, C. C. Impact of macromolecular crowding on DNA replication. Nature Communications. 4, 1615 (2013).
  19. Gabrieli, T., Sharim, H., Michaeli, Y., Ebenstein, Y. Cas9-Assisted Targeting of CHromosome segments (CATCH) for targeted nanopore sequencing and optical genome mapping. bioRxiv. , (2017).
  20. Gabrieli, T., et al. Selective nanopore sequencing of human BRCA1 by Cas9-assisted targeting of chromosome segments (CATCH). Nucleic Acids Research. , (2018).

Tags

Bioengineering मुद्दा १४५ नैनो डीएनए अनुक्रमण अल्ट्रा लंबी पढ़ता है तीसरी पीढ़ी के डीएनए अनुक्रमण पूरे जीनोम अनुक्रम विश्लेषण उच्च आणविक वजन डीएनए निष्कर्षण tagmentation आधारित डीएनए पुस्तकालय निर्माण
पूरे जीनोमिक डीएनए विश्लेषण के लिए अल्ट्रा लंबे पढ़ें अनुक्रमण
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gong, L., Wong, C. H., Idol, J.,… More

Gong, L., Wong, C. H., Idol, J., Ngan, C. Y., Wei, C. L. Ultra-long Read Sequencing for Whole Genomic DNA Analysis. J. Vis. Exp. (145), e58954, doi:10.3791/58954 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter