Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Ultra lång Läs sekvensering för hela genomiskt DNA analys

doi: 10.3791/58954 Published: March 15, 2019

Summary

Lång-Läs sekvenser i hög grad underlätta monteringen av komplexa genomen och karakterisering av strukturell variation. Vi beskriver en metod för att generera ultralång sekvenser av nanopore-baserade sekvensering plattformar. Metoden antar en optimerad DNA-extraktion som följt av modifierade bibliotek preparat att generera hundratals kilobase läsningar med måttlig täckning från mänskliga celler.

Abstract

Tredje generationen singel-molekylen DNA sekvensering teknik erbjuda betydligt längre Läs längd som kan underlätta monteringen av komplexa genomen och analys av komplexa strukturella varianter. Nanopore plattformar utföra singel-molekyl sekvensering genom att direkt mäta de aktuella ändringarna medieras av DNA passage genom porerna och kan generera hundratals kilobase (kb) läser med minimal kapitalkostnad. Denna plattform har antagits av många forskare för en mängd tillämpningar. Att uppnå längre sekvensering Läs längder är den mest kritiska faktorn att utnyttja värdet av nanopore sekvensering plattformar. Generera ultralång läsningar, krävs särskild hänsyn att undvika DNA brytskador och ökar effektiviteten för att generera produktiva sekvensering mallar. Här, tillhandahåller vi detaljerade protokollet av extremt lång DNA-sekvensering inklusive hög molekylvikt (HMW) DNA-extraktion från färska eller frysta celler, bibliotek konstruktion av mekaniska klippning eller transposase fragmentering, och sekvensering på en nanopore enhet. Från 20-25 µg HMW DNA, metoden kan uppnå N50 Läs längd 50-70 kB med mekanisk klippning och N50 90-100 kb Läs längd med transposase medierad fragmentering. Protokollet kan tillämpas på DNA extraheras från däggdjursceller att utföra hela Genomsekvensering för att upptäcka strukturella varianter och genomet montering. Ytterligare förbättringar på DNA-extraktion och enzymatiska reaktioner kommer att ytterligare öka Läs längden och expandera sin verktyg.

Introduction

Under det senaste årtiondet, parallella massivt och noggranna andra generationens hög genomströmning sekvensering teknik har drivit en explosion av biomedicinska upptäckten och teknisk innovation1,2,3. Trots de tekniska framstegen, de kort-Läs data som genereras av de andra generationens plattformarna är ineffektiva i att lösa komplexa genomisk regioner och är begränsade för detektion av genomisk strukturella varianter (SVs), som spelar viktiga roller i mänskliga evolution och sjukdomar4,5. Dessutom kort-läsa data inte kan lösa återkommande variation och är olämpliga för kräsna haplotyp utfasning av genetiska varianter6.

Senaste framsteg i singel-molekyl sekvensering erbjuder betydligt längre Läs längd, som kan underlätta upptäckt av hela spektrumet av SVs7,8,9, och erbjuder korrekt och komplett montering av komplex mikrobiell och däggdjur genom6,10. Nanopore plattformen utför singel-molekyl sekvensering genom att direkt mäta de aktuella ändringarna medieras av DNA passage genom porer11,12,13. Till skillnad från någon befintlig DNA sekvensering kemi, nanopore sekvensering kan generera långa (TEN till tusentals kilobases) läser i realtid utan att förlita sig på polymeras kinetik eller konstgjorda amplifiering av DNA-provet. Därför nanopore lång-Läs sekvensering (NLR-seq) rymmer mycket lovande för att generera ultralång Läs längder långt utöver 100 kb, som skulle kraftigt förväg genomisk och biomedicinska analyser14, särskilt i låg-komplexitet eller repeat-rika regioner av genomen15.

Det unika med nanopore sekvensering är dess potential att generera långa läser utan en teoretisk längd begränsning. Läs längd är därför beroende av den fysiska längden av DNA som påverkas direkt av DNA integritet och sekvensering mall kvaliteten. Dessutom, beroende på omfattningen av manipulation och antalet steg inblandade, såsom pipettering styrkor och utvinning, kvaliteten på DNA är mycket varierande. Därför är det svårt för en att ge lång läser genom att bara tillämpa standardprotokollen DNA extraktion och tillverkarens medföljande bibliotek byggmetoder. Mot detta har vi utvecklat en robust metod att generera extremt lång läsa (hundratals kilobases) sekvensering data från skördade cell pellets. Vi antog flera förbättringar i DNA extraktion och bibliotek förberedelse. Vi effektiviserat protokollet för att utesluta onödiga förfaranden som orsakar DNA nedbrytning och skador. Detta protokoll är sammansatt av hög molekylvikt (HMW) DNA-extraktion, ultralång DNA bibliotek konstruktion och sekvensering på en nanopore plattform. För välutbildade molekylärbiolog tar det vanligtvis 6 h från cellen skörd till avslutningen av HMW DNA extraktion, 90 min eller 8 h för bibliotek konstruktion beroende på metoden klippning, och upp till en ytterligare 48 h för DNA-sekvensering. Användning av protokollet kommer att ge genomik gemenskapen att förbättra vår förståelse av genomet komplexitet och få nya insikter i genomet variation i mänskliga sjukdomar.

Protocol

Obs: NLR-seq protokollet består av tre på varandra följande steg: 1) utvinning av högmolekylära vikt (HMW) genomisk DNA; (2) ultralång DNA bibliotek konstruktion, som inkluderar fragmentering av HMW DNA in i önskad storlek och ligering av sekvensering adaptrar till DNA slutar; och 3) lastning av adapter-sammanskrivna DNA på arrayer av nanopores (figur 1).

1. HMW DNA-extraktion

  1. Reagens setup. Gör 1 x buffrad saltlösning (PBS) fosfatbuffert (1000 mL) genom att tillsätta 100 mL PBS (10 x) till 900 mL vatten och blanda väl. Gör lyseringsbuffert (50 mL) genom att lägga till 43,5 mL vatten i en 50 mL tub. Tillsätt 500 μl av Tris (1 M, pH 8,0), 1 mL natriumklorid (NaCl) (5 M), 2,5 mL av etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA) (0,5 M, pH 8,0) och 2,5 mL av sodium dodecyl sulfate (SDS) (10%, wt/vol) till röret och blanda väl.
    Obs: Detta PBS-bufferten kan lagras vid 4 ° C i upp till 6 månader. Den premade lysisbuffert kan lagras på RT för upp till 2 månader.
  2. Kontrollera cellen dödligheten och räkna cellerna. Säkerställa att levande förhållandet är > 85% och den totala mobilnummer är 30 x 106.
    Obs: Cellerna som används i detta protokoll är från HG00733 cell-linjen, en mänsklig lymfoblastoida cellinje av puertoricanska ursprung ofta används i 1000 genomet konsortiet för strukturell variation analys (se tabell av material för beställningsinformation), som tillhör till internationella genomet prov resurs.
  3. Samla cellerna genom centrifugering vid 200 x g i 5 min på RT. Kassera medium och resuspendera cellpelleten (30 x 106 celler) med 5 mL 1 x PBS-bufferten. Centrifugera igen vid 200 x g i 5 min på RT och kasta bort supernatanten.
    Obs: 25-35 x 106 celler är godtagbara för detta tillvägagångssätt. Ytterligare kommer att variation av mängden celler som används behöva ytterligare optimering. Cellpelleten kan lagras vid −80 ° C i upp till 6 månader.
  4. Återsuspendera cellpelleten i 200 μL 1 x PBS-bufferten. Om du använder en fryst cellpelleten, tvätta med 5 mL av 1 x PBS-bufferten. Centrifugera lösningen vid 200 x g i 5 min på RT, avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna i 200 μL 1 x PBS-bufferten.
  5. Förbereda 10 mL lyseringsbuffert i en 50 mL tub. Tillsätt 200 μl cellsuspension till lyseringsbuffert och vortex på högsta hastighet för 3 s. Inkubera lösningen vid 37 ° C i 1 h.
  6. Tillsätt 2 μL av RNase A (100 mg/mL) till den lysate. Rotera försiktigt 50 mL röret för att blanda provet. Inkubera lösningen vid 37 ° C i 1 h.
  7. Tillsätt 50 μL proteinas K (20 mg/mL) till den lysate. Rotera försiktigt 50 mL röret för att blanda provet. Inkubera lösningen vid 50 ° C i 2 h. Under ruvningen, blanda försiktigt provet varje 30 min.
  8. Ta 50 mL röret från 50 ° C och låt stå i RT för 5 min.
  9. Tillsätt 10 mL av fenol lagret av fenol: kloroform: isopentanol (25:24:1, vol-/ vol-/ vol) till den lysate och vrid röret på en rotator mixer (se Tabell för material) på RT i dragskåp vid 20 rpm för 10 min. Wrap tube locket med parafilm att förhindra läckage under rotation.
  10. Förbered två 50 mL gel rör (se Tabell för material) genom centrifugering vid 1500 x g under 2 minuter vid RT.
    Obs: Gelen bildar en stabil barriär mellan nukleinsyra-innehållande vattenfasen och det organiska lösningsmedlet.
  11. Häll över provet/fenol lösningen i en av de beredda 50 mL gel rör från steg 1.10. Centrifugera lösningen vid 3 000 x g i 10 min vid RT.
  12. Häll supernatanten i en ny 50 mL tub. Tillsätt 10 mL av fenol lagret av fenol: kloroform: isopentanol (25:24:1, vol-/ vol-/ vol) och vrid röret på en rotator mixer på RT i dragskåp vid 20 rpm i 10 min.
  13. Upprepa steg 1.11 en gång med andra beredda gel tube.
  14. Häll supernatanten i en ny 50 mL tub. Tillsätt 25 mL iskallt 100% etanol och rotera försiktigt röret för hand tills DNA påskyndar (figur 2).
    Obs: Den nederbörd strategin hjälper till att stabilisera HMW DNA.
  15. Böj ett 20 μL tips att göra en krok. Försiktigt ta ut HMW DNA med kroken och låt vätska droppa.
  16. Placera HMW DNA i en 50 mL tub som innehåller 40 mL 70% etanol. Tvätta DNA genom att försiktigt vända röret 3 gånger.
  17. Upprepa steg 1.15 en gång för att samla in DNA från 70% etanol röret.
  18. Placera HMW DNA i en 2 mL tub som innehåller 1,8 mL 70% etanol.
  19. Centrifugera tvättade HMW DNA vid 10 000 x g för 3 s vid RT. ta bort så mycket av återstående etanolen som möjligt genom pipettering.
    Obs: Stör inte DNA pelleten när pipettering återstående etanolen.
  20. Inkubera 2 mL röret vid 37 ° C i ca 10 min med locket öppet torka provet.
    1. Om fortsätter med steg 2.1 (med mekanisk klippning och 1 D Ligation sekvensering Kit), tillsätt 1 mL av TE (10 mM Tris och 1 mM EDTA, pH 8,0) till 2 mL-röret.
    2. Om du fortsätter med steg 2.2 (med transposase-baserade fragmentering och snabba sekvensering Kit), tillsätt 200 μl 10 mm Tris (pH 8,0) med 0,02% Triton x-100.
      Obs: Stör inte DNA pelleten. Att låta röret stå vid 4 ° C i mörker för 48 h hjälper provet fullt omsuspendera. HMW DNA kan lagras vid 4 ° C i upp till 2 veckor. Längre lagringstid eller andra lagringsförhållanden kan införa fler korta fragment.

2. extremt lång DNA bibliotek konstruktion

Obs: Det finns två sätt att konstruera extremt lång DNA biblioteken utifrån två olika klippning metoder tillsammans med nanopore sekvensering kit. En mekanisk klippning-baserat bibliotek producerar uppgifter med en N50 50-70 KB, tar ca 8 h för bibliotek byggande. En transposase fragmentering-baserat bibliotek producerar en N50 90-100 kb data, tar bara 90 min för bibliotek byggande. Mekanisk klippning protokollet ger högre avkastning från samma DNA ingång med identiska versioner av sekvensering adapter och kvaliteten på nanopore flödesceller.

  1. Mekanisk klippning-baserat bibliotek konstruktion
    1. Blidväder och blanda reagenserna från ligering kit (se Tabell för material). Blidvädret FFPE DNA reparation buffert och slutet reparation/dA-tailing buffert på isen, sedan vortex och snurra ner till mix. Tina adapter mix (AMX) och adapter pärla bindande buffert (ABB) på isen, sedan pipetten och spinn ner för att blanda. Blidvädret kör buffert med bränsle blandning (RBF) och eluering buffert (ELB) på RT, sedan vortex och spinn för att blanda. Tina bibliotek laddar pärlor (LLB) på RT och pipett för att blanda före användning.
      1. När Tinas, hålla alla paketkomponenterna på is. Ta ut enzymerna endast när det behövs. Ta de magnetiska pärlorna till RT använda.
        Obs: För rekommendationer på magnetiska pärlor att använda se tabellen av material.
    2. Kontrollera kvaliteten och kvantiteten av HMW DNA från steg 1.21.1. Pipett ut 20 μL av DNA i nya 1,5 mL rör från tre olika platser i HMW DNA röret med P200 brett bar tips. Ta 1 μL från de tre delprover att upptäcka koncentrationen använder en fluorometer och kvalitet med hjälp av en UV läsning. Kontrollera flera gånger för att bekräfta resultaten.
      Obs: De förväntade resultaten visas i figur 3A. OD260/280 värdet är ca 1,9 och OD260/230 värdet är cirka 2,3.
    3. Överföra de återstående 940 μL av HMW DNA i en 50 mL tub mössa med ett brett P1000 bore tip.
    4. Sug upp alla DNA i en 1 mL spruta utan nålen.
    5. Stick in 27 G nålen på sprutan och mata ut alla DNA i locket försiktigt och långsamt (~ 10 s). Ta bort 27 G nålen från sprutan.
    6. Upprepa steg 2.1.4 och 2.1.5 för 29 gånger för totalt 30 passerar genom nålen.
      Obs: Klippt HMW DNA kan lagras vid 4 ° C i mörker i upp till 24 h. kvalitetskontroll (QC) rekommenderas av pulsade fält gelelektrofores, men det är dyrt och tidskrävande. Om utför QC på en automatiserad pulse field gel electrophoresis maskin Använd en 5-150 kb-protokollet för en 20 h kör. De förväntade resultaten visas i figur 4.
    7. Förbereda DNA reparation reaktionen i en 0,2 mL tub genom att tillsätta 100 μL av klippt HMW DNA (20 μg), 15 μL av FFPE DNA reparation buffert, 12 μL av FFPE DNA reparation mix och 16 μl nuclease-gratis vatten. Blanda reaktionen genom att svepa försiktigt 6 gånger och snurra ner till ta bort bubblor.
    8. Inkubera reaktionen vid 20 ° C i 60 min. överför provet till en ny 1,5 mL tub med P200 brett bore spets.
    9. Återsuspendera magnetiska pärlor av pipettering eller vortexa. Lägg till 143 μL pärlor (1 x) i DNA reparation reaktion och blanda försiktigt genom att snärta röret 6 gånger. Vrid röret på en rotator mixer på RT vid 20 rpm i 30 min.
    10. Snurra ner provet vid 1 000 x g för 2 s på RT. plats röret på en magnetisk rack för 10 min. Håll röret på magnetiska racket och kasta bort supernatanten.
    11. Att hålla röret på magnetiska racket, tillsätt 400 μL av nylagade 70% etanol utan att störa pelleten. Ta bort 70% etanol efter 30 s.
    12. Upprepa steg 2.1.11 en gång.
    13. Snurra ner provet vid 1 000 x g för 2 s på RT. Ställ röret igen på det magnetiska racket. Ta bort eventuella kvarvarande etanol och lufttorka för 30 s. Torka inte över pelleten.
    14. Ta bort röret från magnetiska rack och tillsätt 103 μL av TE (10 mM Tris och 1 mM EDTA, pH 8,0). Flick röret så att pärlor är täckta i bufferten, och inkubera i en rotator mixer på RT för 30 min. försiktigt Knacka försiktigt röret varje 5 min stöd resuspension av pelleten.
    15. Pellet pärlorna på det magnetiska racket för minst 10 min. överföra 100 μL av eluatet med ett brett P200 bore tip till en 0,2 mL rör.
    16. Förbereda slutet reparation och dA-tailing reaktion på 0,2 mL tub genom att tillsätta 100 μL av reparerade HMW DNA, 14 μL av slutet reparation/dA-tailing buffert och 7 μL av slutet reparation/dA-tailing mix. Blanda reaktionen genom att svepa försiktigt 6 gånger och snurra ner till ta bort bubblor.
    17. Inkubera reaktionen vid 20 ° C i 60 min följt av 65 ° C i 20 min och håller sedan på 22° C. Överför provet till en ny 1,5 mL tub med en bred P200 bore tips.
    18. Återsuspendera magnetiska pärlor av pipettering eller vortexa. Tillsätt 48 μl av pärlor (0,4 x) till slutet reparation/dA-tailing reaktion och blanda försiktigt genom att snärta röret 6 gånger. Vrid röret på en rotator mixer på RT vid 20 rpm i 30 min.
    19. Upprepa steg 2.1.10-2.1.13 en gång.
    20. Ta bort röret från magnetiska rack och tillsätt 33 μL av TE (10 mM Tris och 1 mM EDTA, pH 8,0). Flick röret så att pärlor är täckta i bufferten, och inkubera i en rotator mixer på RT för 30 min. försiktigt Knacka försiktigt röret varje 5 min stöd resuspension av pelleten.
    21. Pellet pärlorna på det magnetiska racket för minst 10 min. överföra 30 μL av eluatet med ett brett P200 bore spets in i en ny 1,5 mL tub. Ta den extra 1-2 μL att upptäcka koncentrationen använder en fluorometer.
      Obs: Väntas återhämtning på 5-6 μg i detta steg.
    22. Förbereda ligering reaktionen i 1,5 mL prov röret genom att lägga till 30 μL av slut-repareras HMW DNA, 20 μL av adapter mix (AMX 1D), och 50 μL av blunt/TA ligering master mix. Blanda reaktionen genom att svepa försiktigt 6 gånger mellan varje sekventiella tillägg och spinn ner till ta bort bubblor.
    23. Inkubera reaktionen vid RT för 60 min.
    24. Återsuspendera magnetiska pärlor av pipettering eller vortexa. Lägga till 40 μl pärlor (0,4 x) till ligatur reaktion och blanda försiktigt genom att snärta röret 6 gånger. Vrid röret på en rotator mixer på RT vid 20 rpm i 30 min.
    25. Upprepa steg 2.1.10 en gång.
    26. Tillsätt 400 μL av adapter pärla bindande (ABB) buffert i röret. Sveper du röret försiktigt 6 gånger för att resuspendera pärlorna. Placera röret tillbaka på det magnetiska racket att separera pärlorna från bufferten och Kassera supernatanten.
    27. Upprepa steg 2.1.26 en gång.
    28. Snurra ner provet vid 1 000 x g för 2 s på RT. Ställ röret igen på det magnetiska racket. Ta bort eventuella kvarvarande buffert och lufttorka för 30 s. Torka inte över pelleten.
    29. Ta bort röret från magnetiska rack och återsuspendera pelleten i 43 μL av eluering buffert. Flick röret så att pärlor är täckta i bufferten och inkubera i en rotator mixer på RT för 30 min. försiktigt Knacka försiktigt röret varje 5 min stöd resuspension av pelleten.
    30. Pellet pärlorna på det magnetiska racket för minst 10 min. överföra 40 μl av eluatet med ett brett P200 bore spets in i en ny 1,5 mL tub. Ta den extra 1-2 μL att upptäcka koncentrationen använder en fluorometer.
      Obs: Väntas återhämtning i 1-2 μg i detta steg. Mekanisk klippning-baserade bibliotek är redo för lastning. Biblioteket kan förvaras på is för upp till 2 h tills lastning för sekvensering vid behov.
  2. Transposase fragmentering-baserat bibliotek konstruktion
    1. Blidvädret reagenser från transposase kit (se Tabell för material). Tina fragmentering mix (FRA) och snabb adapter (RAP) på is och pipetten att blanda. Tina sekvensering buffert (SQB), lastning pärlor (LB), spola buffert (FLB) och spola tjuder (FLT) på RT och pipett för att blanda. Tina lastning pärlor (LB) på RT och pipett för att blanda före användning. När Tinas, hålla alla paketkomponenterna på is. Ta ut enzymerna endast när det behövs.
    2. Kontrollera kvaliteten och kvantiteten av HMW DNA från steg 1.21.2. Pipett ut 20 μL av DNA i nya 1,5 mL rör från tre olika platser i HMW DNA röret med P200 brett bar tips. Ta 1 μL från de tre delprover att upptäcka koncentrationen använder en fluorometer och kvalitet med hjälp av en UV läsning. Kontrollera flera gånger för att bekräfta resultaten.
      Obs: De förväntade resultaten visas i figur 3B. OD260/280 värdet är ca 1,9 och OD260/230 värdet är cirka 2,3.
    3. Förbereda DNA tagmentation reaktionen i en 0,2 mL tub genom att lägga till 22 μL av HMW DNA, 1 μL 10 mm Tris (pH 8,0) med 0,02% Triton X-100 och 1 μL av fragmentering blanda (FRA). Mix av pipettering med ett brett P200 bar tips så långsamt som möjligt 6 gånger, noga med att inte införa bubblor.
    4. Inkubera reaktionen vid 30 ° C i 1 min följt av 80 ° C i 1 min och håll sedan vid 4 ° C. Överföring blandningen in i en ny 1,5 mL tub med en bred P200 bore spets och gå till nästa steg omedelbart.
    5. Tillsätt 1 μL av snabb adapter (RAP) till 1,5 mL prov röret. Mix av pipettering med ett brett P200 bar tips så långsamt som möjligt 6 gånger, noga med att inte införa bubblor.
    6. Inkubera reaktionen vid RT för 60 min.
      Obs: Transposase fragmentering-baserade biblioteket är redo för lastning. Biblioteket kan förvaras på is för upp till 2 h tills lastning för sekvensering vid behov.

3. sekvensering på nanopore enheten

  1. Kontrollera enhetens nanopore sekvensering (se Tabell för material). Kontrollera att både den programvara och maskinvara fungerar och det finns tillräckligt med lagringsutrymme.
  2. Kontrollera cellen flöde. Öppna ett nytt flöde cell och infoga cellen flöde i nanopore enheten. Kontrollera rutan platsen cellen flöde infogades i (X1-X5). Välj vilken rätt flöde cell. Klicka på Kontrollera flöde celler arbetsflödet. Klicka på knappen Starta Test att starta cellen flöde QC analys.
    Obs: Om antalet rapporterade totala aktiva porerna är mindre än 800, använda en annan ny flöde cell för sekvensering.
  3. Förbereda priming bufferten. För en mekanisk klippning-baserat bibliotek, tillsätt 576 μL kör buffert med bränsle blandning (RBF) och 624 μL nuclease-fritt vatten i en 1,5 mL tub. Vortex och snurra ner till mix priming bufferten. För ett transposase fragmentering-baserade bibliotek, tillsätt 30 μL av flush tjuder (FLT) till röret spola buffert (FLB). Vortex och snurra ner till mix priming bufferten.
  4. På flöde cell, flytta priming port locket medurs för att exponera port grundning.
  5. Ange P1000 pipett till 100 μL och för in i port grundning. Dra tillbaka en liten volym av buffert (mindre än 30 μL) ta bort alla bubblor från cellen flöde. Stoppa pipettering när en liten mängd gul vätska går in i spetsen.
  6. Använda P1000 pipett för att läsa in 800 μL av priming mixen i cellen flöde via port grundning. Undvik att införa bubblor, tillsätt 30 μL av priming mixen täcker toppen av port grundning först, sedan infoga spetsen i port grundning och sakta lägga resten av priming mixen. Ta ut tipset när det finns ca 50 μL vänster. Tillsätt resten av priming mix på toppen av port grundning. Vätskan kommer gå in av sig själv.
  7. Lämna setup till Inkubera i 5 min. Under tiden förbereda bibliotek mixen i 1,5 mL röret som innehåller biblioteket.
    Obs: För en mekanisk klippning-baserat bibliotek tillsätt 35 µL kör buffert med bränslemixen (RBF) till 40 µL av DNA biblioteket. För en transposase fragmentering-baserat bibliotek lägga till 34 µL av sekvensering buffert (SQB) och 16 µL nuclease-fritt vatten till 25 µL av DNA biblioteket.
  8. Öppna luckan flöde cell provet port försiktigt för att exponera den prov-porten. Använda P1000 pipett för att lägga 200 μL av priming mixen genom port grundning i cellen flöde som beskrivs i steg 3.5. Kontrollera att priming mixen inte läses in i cellen flöde genom uttaget prov.
  9. Ange P200 pipett till 80 μl. Blanda biblioteket försiktigt med ett brett bore tips genom pipettering upp och ner 6 gånger precis före lastning.
  10. Ladda biblioteket mixen droppvis genom uttaget prov i cellen flöde. Lägg varje droppe först efter den föregående droppe är helt laddad i porten.
  11. Sätt tillbaka provet port locket försiktigt och se till att uttaget prov är helt täckt. Flytta priming port locket moturs för att omfatta priming hamnen. Stäng locket för enheten.
  12. Klicka på Nytt Experiment arbetsflödet. Ange biblioteksnamnet, Välj rätt kit enligt förfaranden som används och kontrollera att inställningarna är korrekta (48 h kör, realtid base-calling ON).
  13. Klicka på Start Kör. Efter 10 min, registrera flöde cell ID och active nanopore nummer (totalt antal och varje fyra gruppernas nummer) från den kör informationen.
  14. Analys av data. Kopiera data till en lokal dator eller ett kluster när som helst av sekvensering eller när körningen är klar. Använd Minimap216 (https://github.com/lh3/minimap2) för att justera sekvensdata till referens genomet. Sammanfatta den sekvensering prestandan från råsekvensdata och anpassningar av NanoPlot17 (https://github.com/wdecoster/NanoPlot).

Representative Results

Ultra lång DNA sekvensering protokollet gäller HMW DNA för bibliotek konstruktion. Därför är det kritiskt att välja väl odlade celler med levande förhållandet > 85% vid cellen skörd steg. Mängden celler som används för DNA-extraktion påverkar kvaliteten och kvantiteten av HMW DNA. Cellys fungerar inte bra om börjar med alltför många celler. Med för få celler genererar inte tillräckligt med DNA för bibliotek konstruktion eftersom HMW DNA nederbörden utförs med varsam rotering för hand i stället för höghastighetståg centrifugering. Ett exempel på HMW DNA efter lägga till iskall 100% etanol och roterande visas som vita bomullsliknande fällningen i figur 2.

Det är viktigt att kontrollera kvaliteten på indata DNA innan du börjar bibliotek byggandet. Nedbrytning, felaktiga kvantifiering, förorening (t.ex. proteiner, RNAs, rengöringsmedel, surfaktant, och kvarvarande fenol eller etanol) och låg molekylvikt DNA kan ha en betydande inverkan på de efterföljande förfaranden och finalen Läs längd. Vi rekommederar QC analysen med DNA från tre olika platser i röret som innehåller HMW DNA. Från UV avläsning resultaten för HMW DNA, OD260/OD280 värdet är ca 1,9 och OD260/OD230 värdet är cirka 2,3 (figur 3AB). Baserat på värdena är konsekvent mellan de tre testerna för en bra HMW DNA-provet. Olika metoder för klippning kräver olika volymer av ingående DNA. Koncentrationen av HMW DNA måste vara > 200 ng/µL för mekanisk klippning medan det måste vara > 1 µg/µL för transposase fragmentering. Den koncentration som upptäcks av en fluorometer är lite lägre än UV läsning. Variationskoefficienten av koncentrationen av samma HMW DNA prov krävs dock att vara mindre än 15% med både fluorometer och UV läsa analyser. Mekanisk klippning gäller en spruta med en nål att bryta HMW DNA så att antalet passeringar genom nålen kommer att påverka storleken på klippt DNA och finalen Läs längd. Det rekommenderas att utföra storlek QC efter nålen klippning för att säkerställa att majoriteten av HMW DNA är större än 50 kb som illustreras i figur 4. I metoden mekanisk klippning genererade 30 passerar bästa sekvensering resultat med tanke på både längd och utdata.

N50 av en mekanisk klippning-baserat bibliotek är 50-70 kb medan en transposase fragmentering-baserat bibliotek är 90-100 kb. Resultaten av fyra löprundor med raden HG00733 cell visas i tabell 1. Alla fyra körningar har över 2 300 läser med längd som är längre än 100 kb. Maxlängden är längre i transposase fragmentering-baserade bibliotek (455 kb och 489 kb) jämfört med mekanisk klippning-baserade bibliotek (348 kb och 387 kb) medan den senare produceras mer totalt läser, vilket indikerar en högre avkastning. Transposase fragmentering-baserat bibliotek byggandet har färre steg och kortare förberedelsetid så att det kommer att medföra färre korta fragment. De två löprundor med transposase har en längre Genomsnittlig längd (> 30 kb) och median längd (> 10 kb). Dessutom visar data konsekvent hög kvalitet i alla körningar (genomsnittlig kvalitetsresultat är cirka 10,0, ~ 90% bas noggrannhet). Mer än 97% av de totala baserna anpassades till mänsklig referens genomet (hg19) med Minimap216 med standardinställningarna. De beräknade storlek distributionerna av raw läser visas i figur 5. Alla körningar har en stor andel av data över 50 kb och transposase fragmentering-baserade bibliotek har en högre andel av ultralång läsningar (t.ex. > 100 kb). Detta protokoll har tillämpats framgångsrikt i flera mänskliga cellinjer (kompletterande Tabell1).

Figure 1
Figur 1: Schematisk översikt över arbetsflödet nanopore lång-Läs sekvensering (NLR-seq). Orange, den komplexa transposase. Gul-grön, nanopore adaptern. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: representativa DNA nederbörd från fenol-kloroform extraktionen metod. Den vita pilen anger HMW DNA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: exempel QC-resultat av HMW DNA från UV behandlingen. (A) HMW DNA från steg 1.21.1 redo för mekanisk klippning-baserat bibliotek konstruktion. (B) HMW DNA från steg 1.21.2 för transposase fragmentering-baserat bibliotek konstruktion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: QC-resultat av nålen klippt HMW DNA med pulsade fält gelelektrofores. L1: Quick-load 1 kb DNA stege; L2: Quick-load 1 kb förlänga DNA stege. 1-8: DNA med olika passerar tider genom den nål klippning. 1-3, ingen klippning; 4, 10 gånger; 5, 20 gånger; 6, 30 gånger; 7, 40 gånger; 8, 50 gånger. Detta QC steg är valfritt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: förväntade storlek distributioner av nanopore Ultra lång DNA biblioteken. MS, mekanisk klippning-baserade bibliotek. TF, transposase fragmentering-baserade bibliotek. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Mekaniska shearing_rep1 Mekaniska shearing_rep2 Transposase fragmentation_rep1 Transposase fragmentation_rep2
Cellinje HG00733 HG00733 HG00733 HG00733
N50 av läser 55,180 63,007 98 237 95,629
Antal läsningar längre än 100 Kb 2 500 3 082 2 386 2 355
Antal totalt läser 97,859 80,465 24,166 21 032
Maxlängd (bp) 348,482 387,113 454,660 489,426
Genomsnittlig längd (bp) 17,861 20,395 33,528 38,175
Median längd (bp) 5,335 5,894 10,249 15,656
Betyder kvalitet av läser 10,0 10.1 9,9 10,0
Totala baserna av raw-läsningar 1,747,849,822 1,641,058,932 810,229,733 802,886,304
Totala baser av arrangera i rak linje läser 1,693,300,832 1,607,975,925 791,422,077 778,417,627
Mappade förhållandet mellan totala baser (hg19, Minimap2) 96,9% 98,0% 97,7% 97,0%
Antal aktiva porer 1225: 480, 402, 254, 89 1058: 480, 356, 176, 46 958: 452, 328, 148, 30 1092: 487, 367, 195, 43

Tabell 1: Sammanfattning från-prestandamätningar körs med olika klippning protokoll.

Bibliotek 1 Bibliotek 2
Cellinje K562 GM19240
Cell beställningsinformation ATCC, katt. Nej. CCL-243 Coriell Institute, cat. Nej. GM19240
Protokollet mekanisk klippning mekanisk klippning
N50 av läser 60,063 55,295
Antal totalt läser 193,783 120,807
Median längd (bp) 1 843 4 688
Genomsnittlig längd (bp) 9,825 17,408
Maxlängd (bp) 548,780 212,338
Totala baserna av raw-läsningar 1,903,989,686 2,103,015,331
Totala baser av arrangera i rak linje läser 1,837,350,047 1,997,419,761
Mappade förhållandet mellan totala baser (hg19, Minimap2) 96,6% 95,0%
Antal aktiva porer 1111: 482, 371, 203, 55 1032: 447, 333, 196, 56

Kompletterande tabell 1: Sammanfattning av två NLR-seq löprundor med andra cellinjer med mekanisk klippning protokollet.

Discussion

Nanopore-sekvensering är i princip kunna generera 100 kb megabase lydelse i längd11,12,13. Fyra viktiga faktorer kommer att påverka prestanda av sekvensering kör och data kvalitet: 1) aktiv pore siffror och aktiviteten av porerna; (2) motor protein, som styr hastigheten av DNA som passerar genom nanopore; (3) DNA mall (längd, renhet, kvalitet, massa); (4) sekvensering adapter ligering effektivitet, som bestämmer den användbara DNA från ingång provet. De två första faktorerna beror på vilken version av cellen flöde och sekvensering kit som tillhandahålls av tillverkaren. De andra två faktorerna är viktiga steg i detta protokoll (HMW DNA-extraktion, klippning och ligatur).

Detta protokoll kräver tålamod och öva. Kvaliteten på HMW DNA är viktigt för ultralång DNA bibliotek6. Protokollet börjar med celler som samlas in med hög lönsamhet (> 85% livskraftiga cell program), begränsa försämrat DNA från döda celler. Alla hårda process som kan införa skador i DNA (t.ex. stark störande, skakar, vortex, flera pipettering, upprepad frysning och upptining) bör undvikas. I utformningen av protokollet utelämnar vi pipettering i hela processen för DNA-extraktion. Brett bore tips behöver användas när pipettering är nödvändigt efter mekanisk klippning under bibliotek konstruktion och sekvensering. Som nanopores är känsliga för de kemiska sammansättningar i kammaren buffert12, bör det finnas så få kvarvarande föroreningar (t.ex. rengöringsmedel, ytaktiva ämnen, fenol, etanol, proteiner RNAs, etc.) som möjligt i DNA. Med tanke på längden och avkastning visar fenol utvinning metoden de bästa och mest reproducerbara resultat jämfört med flera olika extraktionsmetoder testat hittills.

Trots detta protokoll förmåga att producera långa-Läs sekvenser, kvar flera begränsningar fortfarande. Först, detta protokoll var optimerad utifrån nanopore sekvensering enheten tillgänglig vid tidpunkten för offentliggörandet. Således, den är begränsad till selektiv nanopore-baserade sekvensering kemi och kan vara suboptimal när de utförs i andra typer av lång-Läs sekvensering enheter. Det andra är resultatet starkt beroende av kvaliteten på DNA extraheras från utgångsmaterialet (vävnader eller celler). Läs längd kommer att äventyras om start DNA är redan förstörd eller skadad. För det tredje, även om flera QC steg ingår i protokollet att kontrollera DNA kvaliteten, den slutliga avkastning och längd av läser kan påverkas av cellen flöde och pore aktivitet, vilket kunde vara variabel i detta tidiga skede av nanopore sekvensering plattform utveckling.

Protokollet beskrivs använder här mänskliga suspension cell linje prover för DNA-extraktion. Vi har optimerat de förbigående gånger i nålen klippning, förhållandet mellan HMW DNA till transposase och ligatur tid att producera beskrivs resultaten. Protokollet kan byggas på fyra sätt. Först, förbrukaren kanna börja med andra odlade däggdjursceller och med olika mängd celler, vävnader, kliniska prover eller andra organismer. Att kommer behövas ytterligare optimering på LYS inkubationstiden, reaktionsvolym och centrifugering. Andra, det är svårt att förutsäga målstorleken för ultralång Läs sekvensering. Om Läs längderna är kortare än väntat, kan användarna justera de förbigående gånger i mekanisk klippning-baserade metoden eller ändra förhållandet mellan HMW DNA till transposase i metoden transposase fragmentering-baserade. Bindande och eluering längre under rensning steg är användbara eftersom HMW DNA är mycket trögflytande. För det tredje, med olika nanopore sekvensering enheter, man kan justera mängden och mängden DNA att uppfylla kriterierna i sequencer. För det fjärde kommer endast de DNA sammanskrivna till sekvensering adaptrar sekvenseras. För att ytterligare effektivisera ligatur, kan man försöka titrera adapter och ligase koncentrationerna. Modifierade ligering tid och molekylär trängsel medel såsom PEG18 kan tillämpas i framtiden. Ultra lång DNA sekvensering protokollet kombinerat med CRISPR19,20 kan erbjuda ett effektivt verktyg för målet anrikning sekvensering.

Disclosures

Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.

Acknowledgments

Författarna vill tacka Y. Zhu för hennes synpunkter på manuskriptet. Forskning som redovisas i denna publikation var delvis stöds av National Cancer Institute av det nationella Institutes of Health under Award nummer P30CA034196. Innehållet ansvarar enbart för författarna och representerar inte nödvändigtvis officiella ståndpunkter av National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Absolute ethanol Sigma-Aldrich E7023
Agencourt AMPure XPbeads Beckman A63881 magnetic beads for cleanup
BD conventional needles Becton Dickinson 305136 27G, for mechanical shearing
BD Luer-Lok syringe Becton Dickinson 309628 for mechanical shearing
Blunt/TA Ligase Master Mix NEB M0367S
Countess Cell Counting Chamber Slides Invitrogen C10228 for cell counting
EDTA Invitrogen AM9261 pH 8.0, 0.5 M, 500 mL
Flow Cell Oxford Nanopore Technologies FLO-MIN106 R9.4.1
HG00773 cells Coriell Institute HG00733 cells used in this protocol
Ligation Sequencing Kit 1D Oxford Nanopore Technologies SQK-LSK108 nanopore ligation kit
MaXtract High Density tubes Qiagen 129073 gel tubes
NEBNext FFPE DNA Repair Mix NEB M6630S
NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing Module NEB M7546S
Nuclease-free water Invitrogen AM9937
Phosphate-Buffered Saline, PBS Gibco 70011044 10X, pH 7.4
Phenol:chloroform:IAA Invitrogen AM9730
Proteinase K Qiagen 19131 20 mg/mL
Qubit dsDNA BR Assay Kit Invitrogen Q32850 fluorometer assays for DNA quantification
Rapid Sequencing Kit Oxford Nanopore Technologies SQK-RAD004 nanopore transposase kit
RNase A Qiagen 19101 100 mg/mL
SDS Invitrogen AM9822 10% (wt/vol)
Sodium chloride solution Invitrogen AM9759 5.0 M
TE buffer Invitrogen AM9849 pH 8.0
Tris Invitrogen AM9856 pH 8.0, 1 M
Triton X-100 solution Sigma-Aldrich 93443 ~10%
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Bio-Rad C1000 Thermal Cycler Bio-Rad 1851196EDU
Centrifuge 5810R Eppendorf 22628180
Countess II FL Automated Cell Counter Life Technologies AMQAF1000 for cell counting
DynaMag-2 Magnet Life Technologies 12321D magnetic rack
Eppendorf ThermoMixer Eppendorf 5382000023 for incubation
Freezer LabRepCo LHP-5-UFMB
GridION Oxford Nanopore Technologies GridION X5 nanopore device used in this protocol
HulaMixer Sample Mixer Thermo Fisher Scientific 15920D rotator mixer
MicroCentrifuge Benchmark Scientific C1012
NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific ND-1000 for UV reading
Pippin Pulse Sage Science PPI0200 pulsed-field gel electrophoresis instrument
Qubit 3.0 Fluorometer Invitrogen Q33216 fluorometer
Refrigerator LabRepCo LABHP-5-URBSS
Vortex-Genie 2 Scientific Industries SI-A236
Water bath VWR 89501-464

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mardis, E. R. Next-generation sequencing platforms. Annual Review of Analytical Chemistry. 6, 287-303 (2013).
  2. Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nature Reviews Genetics. 17, (6), 333-351 (2016).
  3. Shendure, J., et al. DNA sequencing at 40: past, present and future. Nature. 550, (7676), 345-353 (2017).
  4. Alkan, C., Coe, B. P., Eichler, E. E. Genome structural variation discovery and genotyping. Nature Reviews Genetics. 12, (5), 363-376 (2011).
  5. Weischenfeldt, J., Symmons, O., Spitz, F., Korbel, J. O. Phenotypic impact of genomic structural variation: insights from and for human disease. Nature Reviews Genetics. 14, (2), 125-138 (2013).
  6. Pollard, M. O., Gurdasani, D., Mentzer, A. J., Porter, T., Sandhu, M. S. Long reads: their purpose and place. Human Molecular Genetics. 27, (R2), R234-R241 (2018).
  7. Cretu Stancu, M., et al. Mapping and phasing of structural variation in patient genomes using nanopore sequencing. Nature Communications. 8, (1), 1326 (2017).
  8. Gong, L., et al. Picky comprehensively detects high-resolution structural variants in nanopore long reads. Nature Methods. 15, (6), 455-460 (2018).
  9. Sedlazeck, F. J., et al. Accurate detection of complex structural variations using single-molecule sequencing. Nature Methods. 15, (6), 461-468 (2018).
  10. Jain, M., et al. Nanopore sequencing and assembly of a human genome with ultra-long reads. Nature Biotechnology. 36, (4), 338-345 (2018).
  11. Jain, M., et al. Improved data analysis for the MinION nanopore sequencer. Nature Methods. 12, (4), 351-356 (2015).
  12. Deamer, D., Akeson, M., Branton, D. Three decades of nanopore sequencing. Nature Biotechnology. 34, (5), 518-524 (2016).
  13. Jain, M., Olsen, H. E., Paten, B., Akeson, M. The Oxford Nanopore MinION: delivery of nanopore sequencing to the genomics community. Genome Biology. 17, (1), 239 (2016).
  14. Editorial, The long view on sequencing. Nature Biotechnology. 36, (4), 287 (2018).
  15. Jain, M., et al. Linear assembly of a human centromere on the Y chromosome. Nature Biotechnology. 36, (4), 321-323 (2018).
  16. Li, H. Minimap2: pairwise alignment for nucleotide sequences. Bioinformatics. 34, 3094-3100 (2018).
  17. De Coster, W., D'Hert, S., Schultz, D. T., Cruts, M., Van Broeckhoven, C. NanoPack: visualizing and processing long-read sequencing data. Bioinformatics. 34, 2666-2669 (2018).
  18. Akabayov, B., Akabayov, S. R., Lee, S. J., Wagner, G., Richardson, C. C. Impact of macromolecular crowding on DNA replication. Nature Communications. 4, 1615 (2013).
  19. Gabrieli, T., Sharim, H., Michaeli, Y., Ebenstein, Y. Cas9-Assisted Targeting of CHromosome segments (CATCH) for targeted nanopore sequencing and optical genome mapping. bioRxiv. (2017).
  20. Gabrieli, T., et al. Selective nanopore sequencing of human BRCA1 by Cas9-assisted targeting of chromosome segments (CATCH). Nucleic Acids Research. (2018).
Ultra lång Läs sekvensering för hela genomiskt DNA analys
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gong, L., Wong, C. H., Idol, J., Ngan, C. Y., Wei, C. L. Ultra-long Read Sequencing for Whole Genomic DNA Analysis. J. Vis. Exp. (145), e58954, doi:10.3791/58954 (2019).More

Gong, L., Wong, C. H., Idol, J., Ngan, C. Y., Wei, C. L. Ultra-long Read Sequencing for Whole Genomic DNA Analysis. J. Vis. Exp. (145), e58954, doi:10.3791/58954 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter