Summary
白氨酸丰富的重复激酶2基因（LRRK2）的突变导致遗传性帕金森病。我们开发了一种简单可靠的方法，用于评估人类外周血中Rab10的LRRK2控制磷酸化。这可能有助于识别具有增加LRRK2激酶通路活性的个人。
Abstract
白细胞丰富的重复激酶2（LRRK2）是遗传性帕金森病（PD）中最常见的突变基因，所有致病性LRRK2突变导致其激酶功能过度活化。在这里，我们描述了一种简单而可靠的测定方法，通过测量其生理基质之一Rab10的生理基质之一Rab10，以量化人类外周血神经中粒体中的LRRK2激酶通路活性。所述的免疫印迹分析需要完全选择性和磷特异性抗体，能够识别LRRK2对Rab10 Thr73表皮磷酸酯，如MJFF-pRab10兔单克隆抗体。它使用人类外周血嗜中性粒细胞，因为外周血很容易获得，嗜中性粒细胞是丰富和同质的成分。重要的是，嗜中性粒细胞表示LRRK2和Rab10的较高水平。嗜中性粒细胞的潜在缺点是其高内在丝氨酸蛋白酶活性，这需要使用非常有效的蛋白酶抑制剂，如有机磷神经毒素二氟磷酸二磷酸二磷酸（DIFP）作为淋索缓冲液的一部分。然而，嗜中性粒细胞是研究LRRK2激酶在体内活性的宝贵资源，应考虑纳入PD生物库收集。
Introduction
减缓或阻止帕金森病（PD）的尝试迄今都失败了。在白细胞富重复激酶2（LRRK2）中发现超活化突变，导致和/或增加PD的风险，导致LRRK2激酶抑制剂11，2，32,3的发展。这些已经进入临床试验4。LRRK2的确切功能尚不清楚，但一个重大的进步是确定一个子集的Rab GTPase蛋白，包括Rab10，作为LRRK2激酶55，6，76,7的第一个真正的生理基质。在疾病改变治疗时代的主要挑战是LRRK2激酶激活状态的生化标记物和LRRK2激酶抑制剂的目标参与。
到目前为止，LRRK2抑制剂体内的主要药代动力学标记物是LRRK2的一组磷酸化血清残留物，特别是丝氨酸935，这些残留物因对不同的LRRK2抑制剂88、99而变得脱磷化。然而，丝氨酸935磷酸化与内在细胞LRRK2激酶活性无关，因为它不是LRRK2直接磷酸化，并且仍然磷酸化在激酶不活性LRRK210。LRRK2激酶活性与丝氨酸1292的自磷酸化密切相关，但实际来说，由于目前该站点10、11,11缺乏可靠和磷特异性抗体，因此，通过免疫blot分析整细胞提取物，它不是内源性LRRK2激酶活性的合适读出。
我们开发了一种强健且易于测定的测定方法，用于量化人类外周血细胞中的LRRK2激酶通路活性，测量其生理目标蛋白Rab10在threonine 7311的LRRK2控制磷酸化。外周血很容易通过单月切除，这是一个低风险和快速的程序，导致最小的不适。我们专注于人类外周血嗜中性粒细胞，因为它们构成丰富的（占所有白细胞的37-80%）和同质细胞群，表示相对较高的LRRK2和Rab1011水平。此外，外周血嗜中性粒细胞可以通过采用免疫磁阴性方法快速有效地分离。为了确保随后观察到的Rab10磷酸化由LRRK2介导，每批嗜中性粒细胞都孵育有或没有强效和选择性的LRRK2激酶抑制剂（我们使用并推荐MLi-2）2，12。2,12然后，在含有蛋白酶抑制剂二丙酸酯磷酸（DIFP）的缓冲液中细胞水解，这是抑制内生氨酸蛋白酶活性所必需的，已知在中性粒细胞中含量高13。对于定量免疫印迹的最终分析，我们建议使用MJFF-pRab10兔子单克隆抗体，专门检测Rab10 Thr73-磷脂蛋白，并且不与其他磷酸化的Rab蛋白14发生交叉反应。这种抗体的选择性和特异性已验证在不同的Rab蛋白和A549 Rab10敲出细胞系14的过度表达模型。因此，我们测量了使用和未经过强效和选择性LRRK2激酶抑制剂2治疗的中性粒细胞中Rab10磷酸化的差异。或者，也可以通过其他方法（如定量质谱法）分析样品。
最后，LRRK2控制的Rab10磷酸化是LRRK2激酶活性对935号丝氨酸LRRK2磷酸化的优越标志，人类外周血嗜中性粒细胞是PD研究LRRK2的宝贵资源。我们的协议提供了一个强大和容易的测定，以查询LRRK2途径活性在外周血神经中，并允许生物化学分层的人与增加LRRK2激酶活性15。重要的是，这些个体可能受益于未来的LRRK2激酶抑制剂治疗。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
根据英国当地法规，人类血液的所有操纵和移液都发生在第 2 类生物安全柜中。所有程序均符合当地道德审查委员会的规定，所有参与者均提供知情同意。
1. 准备
- 制备 0.1 mL EDTA 库存溶液 1，在磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中含有 100 mM EDTA。
- 准备 60 mL EDTA 库存解决方案 2，在 PBS 中包含 1 mM EDTA。
- 准备含 50 mM Tris-HCl 的集石液缓冲液 （pH = 7.5）， 1% （v/v） Triton X-100， 1 mM EGTA，1 mM Na3VO4，50mM NaF，10 mM β-甘油磷酸盐，5 mM焦磷酸钠，0.27 M蔗糖，0.1%（v/v）β-甲醇，1x蛋白酶抑制剂鸡尾酒，1 μg/mL微囊素-LR，和0.5mm二甲丙丙酸酯（DIFP）。
注：作者经常使用不含EDTA的产品，但含有EDTA蛋白酶抑制剂的鸡尾酒也应该有效。溶酶缓冲液无需β-甲酮乙醇、蛋白酶抑制剂、微囊素-LR和DIFP即可提前制造，并储存在4°C下，直到使用。确保β-甲酮乙醇、蛋白酶抑制剂、微囊西蛋白-LR和DIFP仅在使用前立即添加。
注意：DIFP 是有毒的，应在当地健康和安全风险评估后，在烟雾罩中小心处理。DIFP 可以添加到集回液缓冲液中并立即使用。或者，包含所有其他组件（包括 DIFP）的完整水成缓冲液可以换载并储存在-80°C，以便随后使用至少 4 周。
2. 从全血中分离中性粒细胞
- 将10mL的血液收集到血液收集管中。通过反转管 7×8x 轻轻混合。
- 将10 mL的血液转移到50mL锥形管中。
- 将 100 μL 的 EDTA 库存溶液 1 添加到血液中。轻轻混合。
- 从中性粒细胞分离试剂盒（材料表）中加入500 μL的分离鸡尾酒（50 μL/mL）到整个血液样本中。
- 使用前将中性粒体分离套件中的磁珠旋涡30s，以重新悬浮非常精细的磁珠。
- 将500 μL的磁珠添加到血液样本中，并多次反转管子，轻轻混合。
- 在室温 （RT） 下孵育 5 分钟。
- 使用 EDTA 库存解决方案 2 将管填充到 50 mL。混合通过非常轻轻地移液向上和向下2~3倍。
- 将管放入磁铁并取下盖子，以避免随后的管部搅拌。
- 在RT孵育10分钟。
- 小心地将含有中性粒细胞的浓缩细胞悬浮液移入新的50mL锥形管中。
注：请勿触摸与磁铁接触的管侧，避免收集和干扰管底的红血球。将大约 10 mL 的红血球悬浮液留在管底。 - 在使用前将磁珠旋30s，并将0.5 mL的磁珠添加到含有富美嗜中性粒细胞的管子中。通过反转管轻轻混合。
- 在RT孵育5分钟。
- 将管子放入磁铁并取下盖子，以避免随后的搅拌。
- 在RT孵育5分钟。
- 小心地将含有中性粒细胞的浓缩细胞悬浮液移入新的50mL锥形管中。
注：请勿触摸与磁铁接触的管侧。将约 5 mL 的悬架留在管的底部。 - 为确保从细胞混合物中完全去除磁珠，将含有浓缩细胞的管子放入磁铁中。
- 在RT孵育10分钟。
- 小心地将现在含有纯中性粒细胞的浓缩细胞悬浮液移移成新的50mL锥形管。
注：请勿触摸与磁铁接触的管侧。将约 5 mL 的悬架留在管的底部。 - 将分离的电池与 1 mM EDTA 库存解决方案 2 混合到约 41 mL 的最终体积。上下移液混合。
- 将溶液平均分成两个管，每个管中约 20 mL。
- 将两个管在 335 x g下离心 5 分钟。
- 在此离心期间，从-80 °C冰柜中取出 MLi-2 抑制剂（200 μM/1，000x 浓度），然后留在 RT 中供后续使用。
- 离心步骤后，立即不搅拌管，倒入上清液，而不会干扰中性粒体。通过在RT处轻轻移液细胞上下4倍，在RT的10 mL细胞培养培养基中重新悬浮每个细胞颗粒（材料表）。
3. 纯中性粒细胞的LRRK2激酶抑制剂治疗
- 将一个管标记为"DMSO"，另一个管为"MLi-2"。
- 到标有"DMSO"标签的管中，加入10μL的DMSO，并通过上下移液2倍，用10 mL移液器轻轻混合。到"MLi-2"标记管中，加入10 μL 200 μM MLi-2库存溶液（最终浓度200 nM），并通过上下移液器上下2倍轻轻混合。
- 在RT中孵育样品30分钟，在孵育过程中每10分钟通过反转轻轻进行一次。
- 在孵育期间，从-80°C冰柜中取出0.5M DIFP库存，放入冰上烟气罩中。从-80°C冷冻机中取出1mg/mL微囊霉素-LR库存溶液，在RT解冻。从冰箱中取出除位（0.25 mL）的滑液缓冲液，使其在 RT 处解冻，然后将其放在冰上，以便随后使用。
- 准备1 mL的细胞培养基，含有1μL的DMSO，并调用此DMSO重新悬浮缓冲液。准备 1 mL 的 RPMI 介质，含有 1 μL 200 μM MLi-2，并调用此 MLi-2 重新悬架缓冲液。
- 在30分钟的潜伏期后，将两个管以335 x g的离心机5分钟。
- 小心地在每个管中丢弃上清液，而不会干扰中性粒体。
- 对于 DMSO 标记的样品，在 DMSO 重新悬浮液的 1 mL 中轻轻重新悬浮颗粒，对于 MLi-2 标记管，在 MLi-2 重新悬架缓冲液的 1 mL 中重新悬浮颗粒。
- 将重新悬浮的细胞颗粒转移到标有"DMSO"和"MLi-2"的相应离心管中，并在335 x g下将两个管离心3分钟。
- 在离心步骤中，准备压网缓冲液。在烟囊中，小心地将0.25 μL的0.5 M DIFP溶液以及0.25μL的1mg/mL微囊精-LR添加到0.25 mL溶质液缓冲液中。混合并留在冰上，直到使用。
注：在细胞轮变15分钟内将DIFP添加到轮回缓冲液中，因为DIFP在水溶液中相对不稳定。 - 离心后，立即小心地用移液器完全去除所有上清剂，而不会干扰嗜中性粒体，并将管子放在冰上。
- 立即在每个管中加入100μL的液化缓冲液，其中含有DIFP和微囊素-LR。使用 100×200 μL 移液器，通过上下移液（大约 5-10 倍）重新悬浮细胞颗粒。
- 将冰上的细胞切碎10分钟。
- 在 4 °C 下，在 20，000 x g下离心管 15 分钟，以清除细胞碎屑。
- 将含有中性粒细胞的"DMSO"和"MLi-2"超钠剂转移到新的离心管中。丢弃碎屑颗粒。
注：中性粒细胞质化液现已准备就绪，或可卡在液氮中，储存在-80°C，供将来分析。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
我们的测定允许用LRRK2依赖Rab10磷酸化作为读出，在人类外周血中查询PD相关的LRRK2激酶的激活。嗜中性粒细胞是一种同质和丰富的外周白细胞群，表示LRRK2和Rab10蛋白质的高水平（图1）。其余外周血单核细胞（PBMC）中唯一具有高拷贝数的两种蛋白质的细胞是单核细胞，但这些细胞只占白细胞的2-12%。这表明外周血嗜中性粒细胞是研究LRRK2控制的Rab10磷酸化的更合适的生物基质。
通过我们的程序，将外周血嗜中性粒细胞从10mL的血液中分离出，每个供体获得0.5-0.75毫克的总蛋白凝血量（图2A），这足以用于大量免疫血泡分析，每个凝胶通道只需要10μg。虽然检查细胞的纯度和生存能力不例行执行， 我们为三种健康捐赠者证明，分离的中性粒细胞的纯度在94~98%之间，细胞的生存能力在99%之间，根据使用CD66b_氟硫酸酶同质粒体标记和4'，6-二甲酰胺-2'-苯胺二氢氯化物（DAPI）染色的活性（图2A）确定。
虽然本出版物的重点是从外周血分离和处理中性粒细胞，而不是定量的西方印迹分析，但图2B表明，MJFF-pRab10单克隆抗体专门检测Rab10磷酸酸酯在threonine 73显示强信号在中性粒细胞样本中，在在这种情况下，通过治疗一种强效和特异性LRRK2激酶抑制剂，这些信号被明显抑制。
嗜中性粒细胞含有高水平的丝氨酸蛋白酶，可影响随后的西方斑点分析。虽然DIFP有效地抑制了嗜中性粒细胞中的高蛋白酶活性，但它是一种有效的有机磷神经毒素，最好用同样有效但毒性较低的蛋白酶抑制剂（如苯甲二硫芬基氟化物（PMSF）来取代它。我们发现，当DIFP在浓度为2.5mM时由PMSF取代时，Rab10磷酸化同样保存良好（图2C）。然而，与DIFP相比，使用PMSF时，LRRK2蛋白的完整性受到了损害，这表明较大的LRRK2蛋白更容易降解（图2C）。
我们之前已经表明，另一个PD引起基因突变VPS35 D620N导致LRRK2激酶通过一个未知的机制15超活化。从三个PD携带一种致病的异血症VPS35 D620N突变的人的嗜中性粒细胞被分离使用本文描述的方法（图3）。来自9个健康捐赠者的中性粒细胞样本被分离为对照15。使用MJFF-pRab10单克隆抗体的免疫布洛特分析表明，与对照组相比，帕金森氏症患者的嗜中性粒细胞在Thr 73中，在Thr 73中，使用VpS35 D620N突变的免疫布洛位分析表明，Rab10磷酸化显著增加3倍。在所有12个嗜中性粒细胞样本中，Rab10蛋白表达总量相似。
图1：利用在immprot数据库（http://www.immprot.org）16上公开提供的数据，将人类血液分离出的免疫细胞中的LRRK2和Rab10蛋白质的丰度。该图显示了LRRK2和Rab10在一系列外周血免疫细胞中每个细胞的蛋白质拷贝数量，包括T细胞、B细胞、单细胞、NK细胞、树突细胞和粒细胞中性粒细胞、嗜血杆菌和嗜酸性粒细胞的子集。这个数字是从范等人11号修改的。请点击此处查看此图形的较大版本。
图2：人类外周血嗜中性粒细胞的表征和分析，以及DIFP对预防嗜中性粒细胞降解的重要性。 （A）中性粒细胞从三个健康献血者（A、B和C）的整个血液中分离出来，显示细胞系统化后的纯度、活力和总蛋白质产量。（B） 中性粒细胞被治疗与或没有LRRK2激酶抑制剂（MLi-2），然后通过近红外 （NIR） 荧光成像，通过指示的抗体进行定量免疫斑点分析。（C） 嗜中性粒细胞从两个健康捐赠者中分离出来，用100 nM MLi-2治疗30分钟。 细胞在0.5m DIFP或2.5mPMSF的存在下被裂解，以阻止嗜中性粒细胞的血清蛋白酶活性。A和B从Mir等人15号修改，C从范等人11修改。请点击此处查看此图形的较大版本。
图3：帕金森氏症患者的LRRK2激酶通路活性增加，患者患有异质性VPS35 D620N突变。中性粒细胞从9个非年龄匹配的健康对照组和3名PD患者分离出来，患者患有致病性异血症VPS35 D620N突变。细胞在细胞功能解决前，无论是否使用 200 nM MLi-2 进行 30 分钟的治疗。（A） 通过近红外 （NIR） 荧光成像，对所述抗体进行定量免疫斑点分析的全细胞提取物共 10 μg。免疫泡被量化为磷-Thr73 Rab10：总拉布10比率（B）。通过单向ANOVA对数据进行分析，并进行了图基的多重比较测试。数据作为手段呈现 = SD;p < 0.0001.这个数字是从Mir等人15号修改的。请点击此处查看此图形的较大版本。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
令人信服的临床、遗传和生化证据表明LRRK2具有重要作用，尤其是其激酶在帕金森病中的作用7。LRRK2激酶抑制剂已经开发，并进入临床试验22，4，12。4,12因此，需要利用LRRK2作为生物标志物，用于目标参与和患者分层。我们的协议描述了一个强大和容易的测定，用于分析LRRK2激酶途径激活，其生理基质Rab10在人类外周血嗜中性粒细胞的同质池中所反映的磷化11，14。,14对于定量免疫印迹的分析，我们强烈建议使用高选择性磷特异性Rab10抗体（MJFF-pRab10单克隆抗体）14，17。,17
我们使用人类嗜中性粒细胞，因为它们构成构成主要白细胞种群17、18,18的外周血细胞的同质子集。更重要的是，嗜中性粒细胞也具有LRRK2及其亚状态Rab10的高蛋白表达水平（图1）1616。相反，构成PBPC池的白细胞的剩余子集是异质的，LRRK2和Rab10的可变且表达程度主要较低。单核细胞和树突状细胞的表达水平较高，但总体丰度低16。
虽然我们建议使用EDTA血管收集管，但可以使用EDTA以外的抗凝剂。然而，EDTA的存在对中性粒细胞分离试剂盒的性能非常重要。因此，我们建议在整个血液样本中添加EDTA，以便即使使用替代抗凝剂，也能达到1 mM EDTA的最终浓度。使用中性粒细胞分离试剂盒，通过免疫磁阴性选择，以相对快速和简单的方式直接从人类整个血液中纯化中性粒细胞。可用磁体的数量决定了可以并行处理多少血液样本。使用六个磁铁同时从多达六个血液样本中分离中性粒细胞很容易实现。一个潜在的缺点是商业中性粒细胞分离包和所需磁铁的相关成本。对从全血中分离中性粒细胞的替代方法进行了描述，并依赖于密度梯度分离或荧光活性细胞分拣（FACS），这些有显著缺陷。前者的时间和劳动密集型明显增多，至少在我们手中没有那么可靠和高效。后者需要一台FACS机器，需要引入额外的处理步骤，包括红血球的耗尽和细胞染色，为细胞分离过程增加时间。总体而言，免疫磁分离速度快，产生高度纯的样品，并避免过度处理细胞。关于样本处理，我们先前已经表明，采血和中性粒细胞分离之间的延迟至少可达24小时，不会导致我们测定结果的显著变化或变化，这为未来的临床开发提供了灵活性。
中性粒细胞分离程序本身是很容易的。我们建议在每次使用前对磁珠进行涡旋。同样重要的是，一旦磁体管在磁体内，不要干扰磁铁，以避免磁珠的湍流和脱落。通过几轮免疫磁去除所有不需要的细胞，中性粒细胞在悬浮液中被丰富。应注意不要接触与磁铁接触的管侧，并在第一轮隔离期间（步骤 2.11），以免干扰管底部的红血球。在最后一轮移液浓缩细胞悬浮液放入新的锥形管（步骤2.24）后，嗜中性粒细胞可立即继续加工。如果嗜中性粒细胞用于评估细胞中的LRRK2活性，嗜中性粒细胞将分成两批，在通过离心造粒后，在LRRK2激酶抑制剂（此处为MLi-2）或含有细胞培养基的DMSO中重新悬浮。由于在缺乏LRRK2激酶抑制的情况下存在的脱磷和再磷酸化是相对快速的事件，需要谨慎确保MLi-2治疗中粒细胞分仍然暴露于LRRK2激酶抑制剂（例如MLi-2）直到细胞水变（步骤3.8~3.10）。
该协议使用 15 和 50 mL 锥形管有几个离心步骤。虽然我们在协议中经常使用指示的离心速度，但有可能将离心速度提高到400 x g，而不会对细胞的生存能力产生不利影响。这导致一个稍微加强的中性粒细胞颗粒，这可能有助于减少任何潜在的中性粒细胞材料损失期间，在此协议期间，从上清步骤的去移和移液。这将可能提高获得的总蛋白乳酸的产量。一个潜在的问题是，更高的离心力可以激活嗜中性粒细胞，并可能影响随后的分析。我们的一般建议是尽可能轻柔地处理协议中的每一步中嗜中性粒细胞。
我们的协议使用强效丝氨酸蛋白酶抑制剂DIFP（0.5 mM）作为中性粒细胞细胞解缓冲液的一部分。DIFP是一种强效有机磷神经毒素，虽然我们已研究替代化合物，但加入赖塞缓冲液对于通过免疫膨胀分析人类中粒细胞中的LRRK2控制的Rab10磷酸化至关重要。例如，在19的其他研究中，用1%（w/v）SDS取代DIFP，使嗜中性粒细胞裂解，导致蛋白质显著降解，导致LRRK2、Rab10的免疫膨胀，甚至GAPDH加载控制没有产生信号，从而突出了在裂解缓冲液中加入一种强效蛋白酶抑制剂的重要性（图2C）。当用不太有效但毒性较低的丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF在2.5mM时，Rab10磷化物的保存完好，但较大的LRRK2蛋白经历了严重的降解（图2C）。为了尽量减少DIFP库存溶液的处理，含有DIFP的解机缓冲液可以分批制备，在-20°C或-80°C11下储存。11关于定量免疫印迹的分析，最重要的是使用一种磷酸特异性抗体，该抗体已被证明只对单个LRRK2磷酸化拉布蛋白具有选择性，例如用于我们研究的MJFF-pRab10抗体14。
该协议还可以使用最大体积的全血高达25 mL，这是一个隔离过程中可以使用一个磁铁处理的限制，它能够容纳50 mL锥形管。唯一需要调整的步骤是步骤2.4（每mL血液加50μL的隔离鸡尾酒），步骤2.6和2.12（每mL血液增加50μL的磁珠），以及步骤3.12中中性粒热性淋病淋病的压液缓冲量相应增加。所有其他步骤可以保持不变。
总之，我们的协议描述了一种从外周血液中分离人类嗜中性粒细胞的简便而可靠的方法。然后，神经质杆菌可以治疗，无需使用强效和特异性LRRK2激酶抑制剂，从而在体内定量LRRK2控制的Rab10磷酸化。这可用于根据LRRK2激酶途径活性对个体进行分层，并识别那些可能受益于未来LRRK2激酶抑制剂治疗的途径性超活化者。虽然对于大多数PD患者来说，这种情况不太可能发生，特别是特发性PD，我们的测定已经成功地部署在携带另一个PD相关基因VPS35 D620N的罕见异血突变的个人中，其中LRRK2激酶通路活性因未知机制15而显著增加。我们之前曾检查LRRK2控制的Rab 10磷酸化水平，在少数携带更常见的LRRK2 G2019S突变，已知激活LRRK2激酶活性只是适度约2倍，没有检测到显著的差异相比，对照组和特发性PD的患者与我们的测定11，14。11,这一点和未公布的进一步数据表明，LRRK2激酶活性可能需要增加 >3x 才能使用定量免疫印迹产生显著结果。然而，如果部署最先进的质谱技术，检测LRRK2激酶通路激活的灵敏度可能会增加。
我们建议，嗜中性粒细胞是帕金森病研究LRRK2激酶途径活性的宝贵资源，可能有助于识别可能受益于未来LRRK2激酶抑制剂治疗的个人。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢健康志愿者为本研究献血。我们感谢迈克尔·福克斯帕金森病研究基金会（MJFF）和福克斯生物网研究领导（FBN）对书面协议和视频的支持和投入。我们感谢奥地利维也纳大学的亚历山大·津普里奇教授测试我们的协议和合作。我们重视保罗·戴维斯对项目的贡献（MRC PPU总经理）。我们还认可MRC蛋白磷酸化和泛化单元（PPU）的出色技术支持，即化学合成（纳塔利娅·什皮罗合成MLi-2）、MRC PPU试剂和服务抗体净化团队（协调希拉里·麦克劳赫兰和詹姆斯·哈斯蒂）。我们感谢来自Vivomotion的MhairiTowler和弗雷泽·默多克在制作视频和动画方面的帮助。我们感谢来自81部电影的史蒂夫·索夫协助进行最后的编辑。埃丝特·萨姆勒由苏格兰高级临床学术奖学金资助，并接受了英国帕金森氏症（K-1706）的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Pipette tips | Sarstedt | 70.762 | or equivalent |
| 1.5 mL Micro tubes | Sarstedt | 72.690.001 | or equivalent |
| 10 mL Pipette tips | Sarstedt | 86.1254.025 | or equivalent |
| 10 μL Pipette tips | Sarstedt | 70.113 | or equivalent |
| 15 mL falcon tube | Cellstar | 188 271 | or equivalent |
| 200 μL Pipette tips | Sarstedt | 70.760.002 | or equivalent |
| 25 mL Pipette tips | Sarstedt | 86.1685.001 | or equivalent |
| 50 mL falcon tube | Cellstar | 227 261 | or equivalent |
| BD Vacutainer Hemogard Closure Plastic K2-EDTA Tube | BD | BD 367525 | or equivalent |
| Beckman Coulter Allegra X-15R centrifuge | Beckman | or equivalent centrifuge with swimging bucket rotator for 15 mL and 50 mL falcon tubes at speed 1000-1200 x g | |
| Category 2 biological safety cabinet. | |||
| cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
| DIFP (Diisopropylfluorophosphate) | Sigma | D0879 | Prepare 0.5M stock solution in isopropanol using special precautions |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | 6250 | |
| Dry ice or liquid nitrogene | |||
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | ThermoFisher | 14190094 | or equivalent |
| Easy 50 EasySep Magnet | Stemcell | 18002 | for holding 1 x 50ml conical tube |
| EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit | Stemcell | 19666 | This contains Solutions called “Isolation Cocktail” and “RapidSpheres magnetic beads |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Eppendorf centrifuge 5417R centrifuge | Eppendorf | ||
| Ethanol, in spray bottle | |||
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | E6758 | |
| Ice | |||
| Isopropanol (anhydrous grade) | Sigma | 278475 | |
| Lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1%(v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF, 10 mM β-glycerophosphate, 5 mM sodium pyrophosphate, 0.27 M sucrose, 0.1% (v/v) β-mercaptoethanol, 1x cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail (Roche), 1 μg/ml Microcystin-LR, 0.5 mM diisopropylfluorophosphate (DIFP). | alternatively frozen lysis buffer in aliquots without Microcystin-LR, DIFP available from MRC-PPU Reagents (http://mrcppureagents.dundee.ac.uk/) | ||
| Merck LRRK2 inhibitor II (MLi-2) | Merck | 438194-10MG | or equivalent (potent and selective LRRK2 inhinitor) |
| Microcystin-LR | Enzo Life Sciences | ALX-350-012-M001 | 1 mg/ml stock in DMSO and store at -80 oC. |
| Na3VO4 | Aldrich | 450243 | |
| NaF | Sigma | S7920 | |
| Odyssey CLx scan Western Blot imaging system | Odyssey | ||
| Permanent marker pen | |||
| Personal protection equipment | |||
| RPMI 1640 Medium | ThermoFisher | 21875034 | or equivalent |
| sodium pyrophosphate | Sigma | S22 | |
| sucrose | Sigma | S0389 | |
| β-glycerophosphate | Sigma | 50020 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| Suggested antibodies for Western blotting | |||
| Anti-RAB10 (phospho T73) antibody [MJF-R21] | abcam | ab230261 | |
| Anti-α-tubulin | Cell Signaling Technologies | 5174 | used at 1:2000 dilution |
| Goat anti-mouse IRDye 680LT | LI-COR | 926-68020 | used at 1:10,000 dilution |
| Goat anti-mouse IRDye 800CW | LI-COR | 926-32210 | used at 1:10,000 dilution |
| Goat anti-rabbit IRDye 800CW | LI-COR | 926-32211 | used at 1:10,000 dilution |
| MJFF-total Rab10 mouse antibody | generated by nanoTools (nanotools.de) | not applicable* | used at 2 μg/ml final concentration; * The MJFF-total Rab10 antibody generated by nanoTools (www.nanotools.de) [11] will be commercialised by the Michael J Fox Foundation in 2018 |
| Mouse anti-LRRK2 C-terminus antibody | Antibodies Incorporated | 75-253 | used at 1 μg/ml final concentration |
| pS935-LRRK2 | MRC PPU Reagents and Services | UDD2 | used at 1 μg/ml final concentration |
References
- Paisan-Ruiz, C., et al. Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson's disease. Neuron. 44 (4), 595-600 (2004).
- Fell, M. J., et al. MLi-2, a Potent, Selective, and Centrally Active Compound for Exploring the Therapeutic Potential and Safety of LRRK2 Kinase Inhibition. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 355 (3), 397-409 (2015).
- Zimprich, A., et al. Mutations in LRRK2 cause autosomal-dominant parkinsonism with pleomorphic pathology. Neuron. 44 (4), 601-607 (2004).
- Sardi, S. P., Cedarbaum, J. M., Brundin, P. Targeted Therapies for Parkinson's Disease: From Genetics to the Clinic. Journal of Movement Disorders. 33 (5), 684-696 (2018).
- Steger, M., et al. Phosphoproteomics reveals that Parkinson's disease kinase LRRK2 regulates a subset of Rab GTPases. Elife. 5, (2016).
- Ito, G., et al. Phos-tag analysis of Rab10 phosphorylation by LRRK2: a powerful assay for assessing kinase function and inhibitors. Biochemical Journal. 473 (17), 2671-2685 (2016).
- Alessi, D. R., SammLer, E. LRRK2 kinase in Parkinson's disease. Science. 360 (6384), 36-37 (2018).
- Yue, M., et al. Progressive dopaminergic alterations and mitochondrial abnormalities in LRRK2 G2019S knock-in mice. Neurobiology of Disease. 78, 172-195 (2015).
- Doggett, E. A., Zhao, J., Mork, C. N., Hu, D., Nichols, R. J. Phosphorylation of LRRK2 serines 955 and 973 is disrupted by Parkinson's disease mutations and LRRK2 pharmacological inhibition. Journal of Neurochemistry. 120 (1), 37-45 (2012).
- Sheng, Z., et al. Ser1292 autophosphorylation is an indicator of LRRK2 kinase activity and contributes to the cellular effects of PD mutations. Science Translational Medicine. 4 (164), (2012).
- Fan, Y., et al. Interrogating Parkinson's disease LRRK2 kinase pathway activity by assessing Rab10 phosphorylation in human neutrophils. Biochemical Journal. 475 (1), 23-44 (2018).
- Scott, J. D., et al. Discovery of a 3-(4-Pyrimidinyl) Indazole (MLi-2), an Orally Available and Selective Leucine-Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) Inhibitor that Reduces Brain Kinase Activity. Journal of Medicinal Chemistry. 60 (7), 2983-2992 (2017).
- Pham, C. T. Neutrophil serine proteases: specific regulators of inflammation. Nature Reviews Immunology. 6 (7), 541-550 (2006).
- Lis, P., et al. Development of phospho-specific Rab protein antibodies to monitor in vivo activity of the LRRK2 Parkinson's disease kinase. Biochemical Journal. 475 (1), 1-22 (2018).
- Mir, R., et al. The Parkinson's disease VPS35[D620N] mutation enhances LRRK2-mediated Rab protein phosphorylation in mouse and human. Biochemical Journal. 475 (11), 1861-1883 (2018).
- Rieckmann, J. C., et al. Social network architecture of human immune cells unveiled by quantitative proteomics. Nature Immunology. 18 (5), 583-593 (2017).
- Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
- Bain, B., Dean, A., Broom, G. The estimation of the lymphocyte percentage by the Coulter Counter Model S Plus III. Clinical & Laboratory Haematology. 6 (3), 273-285 (1984).
- Tomazella, G. G., et al. Proteomic analysis of total cellular proteins of human neutrophils. Proteome Science. 7, 32 (2009).
