Summary
Mutationer i leucin rige gentage kinase 2 gen (LRRK2) forårsage arvelig Parkinsons sygdom. Vi har udviklet en nem og robust metode til vurdering af LRRK2-kontrolleret fosforylering af Rab10 hos menneskers perifere blodneutrofiler. Dette kan hjælpe med at identificere personer med øget LRRK2 kinase pathway aktivitet.
Abstract
Den leucinrige gentagelseskinase 2 (LRRK2) er det hyppigst muterede gen i arvelig Parkinsons sygdom (PD), og alle patogene LRRK2 mutationer resulterer i hyperaktivering af dets kinasefunktion. Her beskriver vi en nem og robust analyse til at kvantificere LRRK2 kinase pathway aktivitet i humane perifere blod neutrofiler ved at måle LRRK2-kontrollerede fosforylering af en af dens fysiologiske substrater, Rab10 på threonin 73. Den beskrevne immunblottinganalyse kræver et fuldt selektivt og fosforspecifikt antistof, der genkender Rab10 Thr73 epitop phosphoryrylated af LRRK2, såsom MJFF-pRab10 kanin monoklonal antistof. Det bruger menneskelige perifere blod neutrofiler, fordi perifert blod er let tilgængeligt og neutrofiler er en rigelig og homogen bestanddel. Det er vigtigt, at neutrofiler udtrykker relativt høje niveauer af både LRRK2 og Rab10. En potentiel ulempe ved neutrofiler er deres høje iboende serin protease aktivitet, som kræver brug af meget potente protease hæmmere såsom organophosphorus neurotoksin diisopropylfluorophosphat (DIFP) som en del af lysis buffer. Ikke desto mindre er neutrofiler en værdifuld ressource for forskning i LRRK2 kinase pathway activity in vivo og bør overvejes med henblik på optagelse i PD biorepository samlinger.
Introduction
Forsøg på at bremse eller stoppe Parkinsons sygdom (PD) har hidtil slået fejl. Opdagelsen af hyperaktiverende mutationer i leucinrige repeat kinase 2 (LRRK2), der forårsager og/eller øger risikoen for PD, har ført til udvikling af LRRK2 kinasehæmmere1,2,3. Disse er nu gået ind i kliniske forsøg4. Lrrk2's nøjagtige funktion er uklar, men et stort fremskridt har været identifikationen af en delmængde af Rab GTPase-proteiner, herunder Rab10, som de første ægte fysiologiske substrater af LRRK2 kinase5,6,7. De vigtigste udfordringer i en tid med sygdomsmodificerende behandlingsformer er biokemiske markører for LRRK2 kinase aktiveringsstatus og målengagement af LRRK2 kinasehæmmere.
Hidtil har den vigtigste farmakokinetiske markør for LRRK2-hæmmere in vivo været en klynge af konstituerende fosforylerede serinrester af LRRK2, navnlig serin 935, der bliver afphosphatieret som reaktion på forskellige LRRK2-hæmmere8,9. Men, serin 935 fosforylering korrelerer ikke med iboende cellulære LRRK2 kinase aktivitet, fordi det ikke er direkte fosforyleret af LRRK2 og er stadig fosforyleret i kinase-inaktive LRRK210. LRRK2 kinase aktivitet korrelerer godt med autophosphorylation af serin 1292, men det er i praksis ikke en egnet udlæsning for endogenLRRK2 kinase aktivitet ved immunblot analyse af hele celleekstrakter på grund af den nuværende mangel på pålidelige og fosforspecifikke antistoffer for dette websted10,11.
Vi har udviklet en robust og nem analyse til at kvantificere LRRK2 kinase pathway aktivitet i humane perifere blodlegemer, der måler LRRK2-kontrollerede fosforylering af dens fysiologiske mål protein Rab10 på threonin 7311. Perifert blod er let tilgængeligt med venesection, hvilket er en lav risiko og hurtig procedure, der forårsager minimal ubehag. Vi fokuserer på menneskers perifere blodneutrofiler, fordi de udgør en rigelig (37-80% af alle hvide blodlegemer) og homogen cellepopulation, der udtrykker relativt høje niveauer af både LRRK2 og Rab1011. Desuden kan perifere blodneutrofiler isoleres hurtigt og effektivt ved at anvende en immunmagnetisk negativ tilgang. For at sikre, at den efterfølgende observerede Rab10 fosforylering formidles af LRRK2, inkuberes hvert parti neutrofiler med eller uden en potent og selektiv LRRK2 kinasehæmmer (vi bruger og anbefaler MLi-2)2,12. Dette efterfølges derefter af cellelyse i en buffer, der indeholder proteaseinhibitor diisopropylfluorophosphat (DIFP), som er nødvendig for at undertrykke den iboende serinproteaseaktivitet, der vides at være høj hos neutrofiler13. Til den endelige analyse ved kvantitativ immunblotting anbefaler vi at bruge MJFF-pRab10 kaninmonoklonale antistoffer, der specifikt påviser Rab10 Thr73-phoepitope og ikke krydsreagerer med andre fosforylerede Rab-proteiner14. Selektiviteten og specificiteten af dette antistof er blevet valideret i overekspressionsmodeller af forskellige Rab-proteiner og en A549 Rab10 knock-out cellelinje14. Således måler vi forskellen i Rab10 fosforylering hos neutrofile lysater, der er blevet behandlet med og uden en potent og selektiv LRRK2 kinase hæmmer2. Alternativt kan prøverne også analyseres ved andre metoder, f.eks.
Afslutningsvis, LRRK2-kontrollerede Rab10 fosforylering er en overlegen markør for LRRK2 kinase aktivitet til LRRK2 fosforylering på serin 935 og menneskelige perifere blod neutrofiler er en værdifuld ressource for PD forskning i LRRK2. Vores protokol giver en robust og nem analyse til at afhøre LRRK2 vej aktivitet i perifere blod neutrofiler og giver mulighed for biokemisk eskalering af personer med øget LRRK2 kinase aktivitet15. Vigtigere, sådanne personer kan drage fordel af fremtidige LRRK2 kinase hæmmer behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ifølge lokal britisk lovgivning foretages alle manipulationer og pipettering af humant blod i et biologisk sikkerhedsskab i kategori 2. Alle procedurer blev udført i overensstemmelse med det lokale etiske undersøgelsesudvalg, og alle deltagere har givet informeret samtykke.
1. Forberedelse
- 0,1 ml EDTA-stamopløsning 1, der indeholder 100 mM EDTA i fosfatbufferet saltvand (PBS).
- Der fremstilles 60 ml EDTA Stock Solution 2 indeholdende 1 mM EDTA i PBS.
- Klargør lysisbufferen indeholdende 50 mM Tris-HCl (pH = 7,5), 1% (v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF, 10 mM β-glycerophosphate, 5 mM natriumpyrofosfat, 0,27 M saccharose, 0,1% (v/v) β-mercaptoethanol, 1x proteasehæmmercocktail, 1 μg/ml microcystin-LR og 0,5 mM diisoylprop fluorophosphat (DIFP).
BEMÆRK: Forfatterne rutinemæssigt bruge en EDTA-fri produkt, men en EDTA-holdige protease hæmmer cocktail bør også arbejde. Lysisbufferen kan foretages på forhånd uden β-mercaptoethanol, proteasehæmmere, mikrocystin-LR og DIFP og opbevares ved 4 °C indtil brug. Det skal sikres, at β-mercaptoethanol, proteasehæmmere, microcystin-LR og DIFP kun tilsættes umiddelbart før brug.
FORSIGTIG: DIFP er giftigt og bør håndteres med forsigtighed i en røghætte efter lokal sundheds- og sikkerhedsrisikovurdering. DIFP kan føjes til lysisbufferen og bruges med det samme. Alternativt kan den komplette lysisbuffer, der indeholder alle andre komponenter, herunder DIFP, aliciteres og opbevares ved -80 °C til efterfølgende brug i mindst 4 uger.
2. Neutrofile isolation fra fuldblod
- Saml 10 ml blod ind i et blodprøvetagningsrør. Bland forsigtigt ved at vende rør 7−8x.
- 10 ml blod overføres til et konisk 50 ml rør.
- Der tilsættes 100 μL EDTA-stamopløsning 1 til blodet. Bland forsigtigt.
- Der tilsættes 500 μL af isolationscocktailen (50 μL/ml) fra det neutrofileisolationssæt ( Materialetabel)til hele blodprøven.
- Vortex de magnetiske perler fra neutrofile isolation kit til 30 s før brug for at resuspendere de meget fine magnetiske perler.
- 500 μL af de magnetiske perler til blodprøven og bland forsigtigt ved at vende røret flere gange.
- Inkuber ved stuetemperatur (RT) i 5 min.
- Fyld røret til 50 ml med EDTA Stock Solution 2. Bland ved meget forsigtigt pipettering op og ned 2-3x.
- Anbring røret i magneten, og fjern låget for at undgå efterfølgende omrøring af røret.
- Inkuber i 10 min på RT.
- Forsigtigt pipette den berigede celle suspension, der indeholder neutrofiler i en ny 50 ml konisk rør.
BEMÆRK: Rør ikke ved den side af røret, der er i kontakt med magneten, og undgå opsamling og forstyrrelser af de røde blodlegemer i bunden af røret. Lad ca. 10 ml af suspensionen af røde blodlegemer være bag i bunden af røret. - Vortex de magnetiske perler til 30 s før brug og tilsæt 0,5 ml af de magnetiske perler til røret, der indeholder de berigede neutrofiler. Bland forsigtigt ved at vende røret.
- Inkuber på RT i 5 min.
- Anbring røret i magneten, og fjern låget for at undgå efterfølgende omrøring.
- Inkuber på RT i 5 min.
- Forsigtigt pipette den berigede celle suspension, der indeholder neutrofiler i en ny 50 ml konisk rør.
BEMÆRK: Rør ikke ved den side af røret, der er i kontakt med magneten. Lad ca. 5 ml af suspensionen stå i bunden af røret. - For at sikre fuldstændig fjernelse af magnetiske perler fra celleblandingen skal røret, der indeholder de berigede celler, placeres i magneten.
- Inkuber i 10 min på RT.
- Forsigtigt pipette den berigede celle suspension, der nu indeholder rene neutrofiler i en ny 50 ml konisk rør.
BEMÆRK: Rør ikke ved den side af røret, der er i kontakt med magneten. Lad ca. 5 ml af suspensionen stå i bunden af røret. - De isolerede celler blandes med 1 mM EDTA Stock Solution 2 til et endeligt volumen på ca. 41 ml. Pipette op og ned for at blande.
- Opløsningen fordeles ligeligt i to rør med ca. 20 ml i hvert rør.
- Begge rør centrifugeres ved 335 x g i 5 min.
- Under denne centrifugering skal MLi-2-inhibitorlageret (200 μM/1.000x) ud af fryseren -80 °C og hengå til RT til senere brug.
- Umiddelbart efter centrifugeringstrinnet og uden omrøring af rørene hældes supernatanten af uden at forstyrre de neutrofile pellets. Resuspender hver cellepellet i 10 ml cellekulturmedier (Materialetabel) på RT ved forsigtigt at pibe celler op og ned 4x.
3. LRRK2 kinase hæmmer behandling af rene neutrofiler
- Mærk det ene rør "DMSO" og det andet rør "MLi-2".
- Til det "DMSO"-mærkede rør tilsættes 10 μL DMSO og blandes forsigtigt ved pipettering op og ned 2x med en 10 ml pipette. Til det mærket "MLi-2"-rør tilsættes 10 μL 200 μM MLi-2 stamopløsning (endelig koncentration 200 nM) og blandes forsigtigt ved pipettering op og ned 2x med en 10 ml pipette.
- Prøverne inkuberes i 30 min. Bland forsigtigt ved inversion hvert 10.
- I inkubationstiden fjernes 0,5 M DIFP-lageret fra fryseren -80 °C og anbringes i en røghætte på is. 1 mg/ml mikrocystin-LR-stamopløsning en der affryseren -80 °C fjernes fra fryseren -80 °C, og der afstås for at tø op ved RT. Tag en aliquot (0,25 ml) af lysisbufferen ud af fryseren, lad den optøe ved RT og derefter placere den på is til senere brug.
- Der fremstilles 1 ml cellekulturmedium, der indeholder 1 μL DMSO, og kald denne DMSO resuspensionsbuffer. Der fremstilles 1 ml RPMI-medier, der indeholder 1 μL på 200 μM MLi-2, og kald denne MLi-2 resuspensionsbuffer.
- Efter inkubationstiden på 30 minutter centrifugeres begge rør ved 335 x g i 5 min.
- Kassér forsigtigt supernatanten i hvert rør uden at forstyrre den neutrofile pellet.
- For dmso-mærket prøve suspenderes forsigtigt pellet'en i 1 ml DMSO-resuspensionsbufferen og for mli-2-mærket rør, og pelletsen suspenderes i 1 ml MLi-2 resuspensionsbuffer.
- De resuspenderede cellepiller overføres til tilsvarende centrifugationrør med mærket "DMSO" og "MLi-2" og centrifugeres begge rør ved 335 x g i 3 min.
- Under centrifugeringstrinnet forberedes lysisbufferen. I røgemhætten tilsættes der forsigtigt 0,25 μL 0,5 M DIFP-opløsning samt 0,25 μL 1 mg/ml microcystin-LR til 0,25 ml lysisbufferen. Bland og lad på is, indtil det bruges.
BEMÆRK: Tilsæt DIFP til lysisbufferen inden for 15 min cellelysis, da DIFP er relativt ustabilt i en vandig opløsning. - Umiddelbart efter centrifugering, omhyggeligt og helt fjerne alle supernatant med en pipette uden at forstyrre neutrofile pellet og læg rørene på is.
- Der tilsættes straks 100 μL lysisbuffer indeholdende DIFP og microcystin-LR til hvert rør. Ved hjælp af en 100-200 μL pipette, resuspendere cellepillerne ved pipettering op og ned omkring 5-10x.
- Lyse cellerne på is i 10 min.
- Rør centrifugeres ved 20.000 x g i 15 minutter ved 4 °C for at fjerne celleaffald.
- Supernatanter ,der indeholder neutrofile lysater, overføres til nye centrifugationsrør. Kassér snavs pellet.
BEMÆRK: De neutrofile lysater er nu klar til brug eller kan snapfryses i flydende nitrogen og opbevares ved -80 °C til fremtidig analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vores analyse tillader afhøre aktivering af PD-associerede LRRK2 kinase i humane perifere blod neutrofiler med LRRK2-afhængige Rab10 fosforylering som en udlæsning. Neutrofiler er en homogen og rigelig perifer hvid blodcellepopulation, der udtrykker høje niveauer af både LRRK2- og Rab10-proteinerne (Figur 1). Den eneste anden cellepopulation blandt de resterende perifere blodmononukleare celler (PBMC'er) med et højt antal kopier af begge proteiner er monocytter, men disse udgør kun 2-12% af de hvide blodlegemer. Dette indikerer, at perifere blodneutrofiler er en mere egnet biomatrix til undersøgelse af LRRK2-kontrolleret Rab10 fosforylering.
Ved isolering af perifere blodneutrofiler fra 10 ml blod med vores procedure blev der opnået mellem 0,5-0,75 mg det samlede proteinlysat pr. donor (figur 2A), hvilket er tilstrækkeligt til et betydeligt antal immunblot-analyser, for hvilken der kun kræves 10 μg pr. gelbane. Mens kontrol renhed og levedygtighed af celler ikke udføres rutinemæssigt, vi viste for tre raske donorer, at renheden af isolerede neutrofiler er mellem 94-98% og levedygtigheden af celler ~ 99% som bestemt af flow cytometri analyse ved hjælp af CD66b−Fluorescein isothiocyanat neutrofile markør og 4',6-Diamidin-2'-phenylindole dihydroid (DAPI) farvning for levedygtighed (Figur 2A).
Mens fokus for denne publikation er isolering og behandling af neutrofiler fra perifert blod og ikke analysen ved kvantitativ vestlig blotting, Figur 2B viser, at mjff-pRab10 monoklonale antistof, der specifikt detekterer Rab10 fosforyleret ved threonin 73, afslørede robuste signaler i de neutrofile prøver, som blev markant undertrykt ved behandling med en potent og specifik LRRK2 kinasehæmmer, i dette tilfælde MLi-2.
Neutrofiler indeholder høje niveauer af serinproteaser, der kan påvirke efterfølgende vestlige blot analyse. Mens DIFP effektivt undertrykker den høje protease aktivitet i neutrofiler, det er en potent organfohosphons neurotoksin, og det ville være ønskeligt at erstatte det med en lige så effektiv, men mindre giftige protease hæmmer, såsom phenylmethylsulfonyl fluorid (PMSF). Vi konstaterede, at Rab10 fosforylering var lige så velbevaret, da DIFP blev erstattet af PMSF i en koncentration på 2,5 mM (figur 2C). LRRK2-proteinets integritet blev imidlertid kompromitteret ved brug af PMSF sammenlignet med DIFP, hvilket tyder på, at det større LRRK2-protein er mere modtageligt for nedbrydning (figur 2C).
Vi har tidligere vist, at en anden PD-forårsager genmutation VPS35 D620N resulterer i hyperaktivering af LRRK2 kinase af en endnu ukendt mekanisme15. Neutrofiler fra tre personer med PD, der huser en sygdomsfremkaldende heterozygot VPS35 D620N-mutation, blev isoleret ved hjælp af den metode, der er beskrevet i denne artikel (Figur 3). Neutrofile prøver fra ni raske donorer blev isoleret som kontrol15. Immunoblot-analyse ved hjælp af MJFF-pRab10 monoklonalt antistof viser en signifikant, ~3x stigning i Rab10 fosforylering ved Thr 73 hos neutrofiler fra Parkinsons patienter med en VPS35 D620N-mutation sammenlignet med kontrollerne. Det samlede Rab10-proteinudtryk er det samme i alle 12 neutrofile prøver.
Figur 1: Overflod af LRRK2- og Rab10-proteiner i immunceller isoleret fra humant blod ved hjælp af data, der er offentligt tilgængelige i immprotdatabasen (http://www.immprot.org)16. Grafen viser antallet af proteinkopier pr. celle for LRRK2 og Rab10 i en række perifere immunceller i blodet, herunder delmængder af T-celler, B-celler, monocytter, NK-celler, dendritiske celler og granulocytter neutrofiler, basophils og eosinofile. Dette tal er blevet ændret fra Fan et al.11. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Karakterisering og analyse af humane perifere blodneutrofiler og betydningen af DIFP til forebyggelse af proteolytisk nedbrydning hos neutrofiler. A (B) Neutrofiler blev behandlet med eller uden LRRK2 kinasehæmmer (MLi-2), derefter lysed og underkastet kvantitativ immunblot analyse med de angivne antistoffer via nær-infrarød (NIR) fluorescensscanning. (C) Neutrofiler blev isoleret fra to raske donorer og behandlet med 100 nM MLi-2 i 30 min. Celler blev lysed i nærvær af enten 0,5 mM DIFP eller 2,5 mM PMSF til at blokere serinprotease aktivitet hos neutrofiler. A og B er blevet ændret fra Mir et al.15, mens C er blevet ændret fra Fan et al.11. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Øget LRRK2 kinase pathway aktivitet hos Parkinsons sygdom patienter huser en heterozygeous VPS35 D620N mutation. Neutrofiler blev isoleret fra ni ikke-aldersmatchede raske kontroller og tre PD-patienter med en sygdomsfremkaldende heterozygot VPS35 D620N-mutation. Cellerne blev behandlet med eller uden 200 nM MLi-2 i 30 minutter før cellelysis. (A) I alt 10 μg helcelleekstrakt underkastet kvantitativ immunoblotanalyse med de angivne antistoffer via nær-infrarød (NIR) fluorescensscanning. Immunblots blev kvantificeret for fosfo-Thr73 Rab10:total Rab10 ratio (B). Data blev analyseret af envejs ANOVA med Tukey's multiple sammenligningtest. Data, der præsenteres som midler ± SD; p < 0,0001. Dette tal er blevet ændret fra Mir et al.15. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Overbevisende klinisk, genetisk og biokemisk evidens peger i retning af en vigtig rolle for LRRK2 og især dens kinase funktion i Parkinsons sygdom7. LRRK2 kinase hæmmere er blevet udviklet og er på vej ind i kliniske forsøg2,4,12. Som sådan er der behov for at udnytte LRRK2 som en biomarkør for målengagement samt patientstratificering. Vores protokol beskriver en robust og nem analyse til analyse af LRRK2 kinase pathway aktivering som afspejles af fosforylering af dens fysiologiske substrat Rab10 i den homogene pulje af humane perifere blod neutrofiler11,14. Til analyse ved kvantitativ immunblotting anbefaler vi på det kraftigste anvendelse af et meget selektivt fosforspecifikt Rab10-antistof (MJFF-pRab10 monoklonalt antistof)14,17.
Vi bruger humane neutrofiler, fordi de udgør en homogen delmængde af perifere blodlegemer, der udgør den dominerende leukocytpopulation17,18. Endnu vigtigere er det, at neutrofiler også har et højt proteinekspressionsniveau i LRRK2 og dets understat Rab10 (figur 1)16. I modsætning hertil er de resterende delmængder af leukocytter, der udgør puljen af PBMC'er, heterogene med variabel og overvejende lav ekspression af LRRK2 og Rab10. Monocytter og dendritiske celler har høje udtryksniveauer, men er lave i samlet tæthed16.
Selvom vi anbefaler brug af EDTA vacutainer blodtapningsrør, kan der anvendes et andet antikoagulerende stof end EDTA. Tilstedeværelsen af EDTA er imidlertid vigtig for udførelsen af det neutrofile isolationssæt. Vi anbefaler derfor, at EDTA tilføres hele blodprøven, således at der opnås en endelig koncentration på 1 mM EDTA, selv om der anvendes et alternativt antikoagulerende middel. Brugen af neutrofile isolation kit giver rensende neutrofiler direkte fra humant fuldblod ved immunmagnetisk negativ udvælgelse på en relativt hurtig og nem måde. Antallet af tilgængelige magneter bestemmer, hvor mange blodprøver der kan behandles parallelt. Det er let at isolere neutrofiler fra op til seks blodprøver parallelt ved hjælp af seks magneter. En potentiel ulempe er de dermed forbundne omkostninger for kommercielle neutrofile isolation kits og den nødvendige magnet. Alternative metoder til neutrofil isolation fra fuldblod er blevet beskrevet og er afhængige af tæthedgradientseparation eller fluorescensaktiveret cellesortering (FACS), som har betydelige ulemper. Førstnævnte er betydeligt mere tid og arbejdskrævende og i det mindste i vores hænder ikke så pålidelig og effektiv. Sidstnævnte kræver en FACS-maskine, og der skal indføres yderligere håndteringstrin, herunder udtømning af røde blodlegemer og cellefarvning, hvilket tilføjer tid til celleisolationsprocessen. Samlet set er immunmagnetisk isolation hurtig, genererer en meget ren prøve og undgår overdreven håndtering af cellerne. Med hensyn til prøvebehandling har vi tidligere vist, at en forsinkelse mellem blodtapning og neutrofil isolation på mindst op til 24 timer ikke resulterer i en signifikant ændring eller variation i resultatet af vores analyse, som giver fleksibilitet for fremtidig klinisk udnyttelse11.
Den neutrofile isolationprocedure i sig selv er meget let. Vi anbefaler vortexing de magnetiske perler før hver brug. Det er også vigtigt ikke at forstyrre magneten, når røret er inde i magneten for at undgå turbulens og forkobling af de magnetiske perler. Neutrofiler beriges i suspension af flere runder af immunmagnetisk fjernelse af alle uønskede celler. Der skal udvises forsigtighed for ikke at røre ved den side af røret, der er i kontakt med magneten og under den første isolationsrunde (trin 2.11), for ikke at forstyrre de røde blodlegemer i bunden af røret. Efter den sidste runde af pipettering af den berigede cellesuspension i et nyt konisk rør (trin 2.24) er neutrofiler umiddelbart tilgængelige til videreforarbejdning. Hvis neutrofiler anvendes til at vurdere LRRK2 aktivitet i celler, neutrofiler er derefter opdelt i to partier og efter pelletering ved centrifugering, resuspended i enten en LRRK2 kinase hæmmer (her, MLi-2) eller DMSO indeholder cellekultur medium. Da afphosphorylation i nærvær og rephosphorylation i mangel af LRRK2 kinasehæmning er relativt hurtige hændelser, skal der udvises forsigtighed for at sikre, at den MLi-2-behandlede neutrofile fraktion forbliver udsat for en LRRK2 kinasehæmmer (f.eks. indtil cellelyse (trin 3.8-3.10).
Der er flere centrifugation trin i denne protokol ved hjælp af 15 og 50 ml koniske rør. Mens vi rutinemæssigt bruger de angivne centrifugeringshastigheder i protokollen, er det muligt at øge centrifugeringshastigheden op til 400 x g uden at påvirke cellernes levedygtighed negativt. Dette resulterer i en lidt fastere neutrofil celle pellet, som kan bidrage til at reducere eventuelle tab af neutrofile materiale under dekantering og pipettering off supernatant trin under denne protokol. Dette vil sandsynligvis øge udbyttet i form af det samlede protein lysat opnået. En potentiel bekymring er, at en højere centrifugeringskraft kan aktivere neutrofiler og potentielt påvirke efterfølgende analyser. Vores generelle anbefaling er at håndtere neutrofiler i hvert trin af protokollen så forsigtigt som muligt.
Vores protokol bruger den meget potente serinproteasehæmmer DIFP (0,5 mM) som en del af neutrofile lysis buffer. DIFP er en potent organfohosphorus neurotoksin, og mens vi har undersøgt alternative forbindelser, dens tilføjelse til lysis buffer var afgørende for analysen af LRRK2-kontrollerede Rab10 fosforylering i humane neutrofiler ved immunblotting. For eksempel er udskiftning af DIFP med 1% (w/v) SDS blevet brugt til at lyse neutrofiler i andre undersøgelser19 og førte til betydelig proteinnedbrydning i en sådan grad, at immunblotting for LRRK2, Rab10 og selv GAPDH-belastningskontrollen ikke gav et signal, hvilket understreger vigtigheden af at inkludere en meget potent proteasehæmmer i lysisbufferen (figur 2C). Ved udskiftning af DIFP med de mindre potente, men også mindre giftige serin protease hæmmer PMSF på 2,5 mM, Rab10 phosporylering var velbevaret, men de større LRRK2 protein undergik betydelig nedbrydning (Figur 2C). For at minimere håndteringen af DIFP-stamopløsningen kan lysisbuffer indeholdende DIFP fremstilles i partier, aliquoted og opbevares ved -20 °C eller -80 °C11. Med hensyn til analysen ved kvantitativ immunblotting er det altafgørende at anvende et fosforspecifikt antistof, der har vist sig kun at være selektivt for et enkelt LRRK2 fosforyleret Rab-protein, såsom MJFF-pRab10-antistoffet, der anvendes til vores undersøgelser14.
Protokollen kan også skaleres op ved hjælp af en maksimal mængde fuldblod på op til 25 ml, hvilket er den grænse, der kan behandles i en isolationprocedure ved hjælp af en magnet, som er i stand til at holde 50 ml koniske rør. De eneste trin, der kræver justeringer, er trin 2.4 (tilsætning af 50 μL isolationscocktail pr. ml blod), trin 2.6 og 2.12 (tilsætning af 50 μL magnetiske perler pr. ml blod) og en forholdsmæssig stigning i mængden af lysisbuffer til neutrofil lysis i trin 3.12. Alle andre trin kan holdes identiske.
Sammenfattende beskriver vores protokol en nem og robust metode til at isolere humane neutrofiler fra perifert blod. Neutrofiler kan derefter behandles med og uden en potent og specifik LRRK2 kinasehæmmer for at muliggøre kvantificering af LRRK2-kontrolleret fosforylering af Rab10 in vivo. Dette kan være nyttigt for at stratifying personer i henhold til LRRK2 kinase pathway aktivitet og for at identificere dem med pathway hyperaktivering, der kan drage fordel af fremtidige LRRK2 kinase hæmmer behandling. Mens dette vil være usandsynligt, at de fleste mennesker med PD, specifikt idiopatisk PD, vores analyse er allerede blevet anvendt med succes i personer, der bærer en sjælden, heterozygot mutation i en anden PD-associeret gen, VPS35 D620N, hvor LRRK2 kinase pathway aktivitet er steget betydeligt med en endnu ukendt mekanisme15. Vi havde tidligere undersøgt LRRK2-kontrollerede Rab 10 fosforyleringniveauer hos et lille antal personer, der bærer den mere almindelige LRRK2 G2019S-mutation, som er kendt for at aktivere LRRK2 kinase aktivitet kun beskedent med en faktor på omkring to uden at detektere en signifikant forskel sammenlignet med kontroller og patienter med idiopatisk PD med vores analyse11,14. Dette og yderligere ikke-offentliggjorte data tyder på, at LRRK2 kinase aktivitet sandsynligvis kræver en stigning på >3x for at give et betydeligt resultat ved hjælp af kvantitativ immunblotting. Følsomheden for påvisning af LRRK2 kinase pathway aktivering kan dog sandsynligvis øges, hvis der implementeres state-of-the-art massespektrometri teknologi.
Vi foreslår, at neutrofiler er en værdifuld ressource for Parkinsons sygdom forskning i LRRK2 kinase pathway aktivitet og kan hjælpe med at identificere personer, der kunne drage fordel af fremtidige LRRK2 kinase hæmmer behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker de raske frivillige, der venligt donerede blod til denne undersøgelse. Vi takker Michael J. Fox Foundation for Parkinsons Research (MJFF) og Fox BioNet undersøgelse lederskab (FBN) for deres støtte og input til den skriftlige protokol og videoen. Vi takker professor Alexander Zimprich fra Universitetet i Wien i Østrig for at have testet vores protokol og samarbejde. Vi værdsætter Paul Davies' bidrag til projektet (general manager for MRC PPU). Vi anerkender også den fremragende tekniske support af MRC Protein Phosphorylation og Ubiquitylation Unit (PPU) nemlig kemisk syntese (Natalia Shpiro til syntese MLi-2), MRC PPU Reagenser og Tjenester antistof rensning teams (koordineret af Hilary McLauchlan og James Hastie). Vi takker Mhairi Towler og Fraser Murdoch fra Vivomotion for deres hjælp med at lave videoer og animationer. Vi takker Steve Soave fra 81 film for hjælp med de endelige redigeringer. Esther Sammler er støttet af en skotsk Senior Clinical Academic Fellowship og har modtaget støtte fra Parkinsons UK (K-1706).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Pipette tips | Sarstedt | 70.762 | or equivalent |
| 1.5 mL Micro tubes | Sarstedt | 72.690.001 | or equivalent |
| 10 mL Pipette tips | Sarstedt | 86.1254.025 | or equivalent |
| 10 μL Pipette tips | Sarstedt | 70.113 | or equivalent |
| 15 mL falcon tube | Cellstar | 188 271 | or equivalent |
| 200 μL Pipette tips | Sarstedt | 70.760.002 | or equivalent |
| 25 mL Pipette tips | Sarstedt | 86.1685.001 | or equivalent |
| 50 mL falcon tube | Cellstar | 227 261 | or equivalent |
| BD Vacutainer Hemogard Closure Plastic K2-EDTA Tube | BD | BD 367525 | or equivalent |
| Beckman Coulter Allegra X-15R centrifuge | Beckman | or equivalent centrifuge with swimging bucket rotator for 15 mL and 50 mL falcon tubes at speed 1000-1200 x g | |
| Category 2 biological safety cabinet. | |||
| cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
| DIFP (Diisopropylfluorophosphate) | Sigma | D0879 | Prepare 0.5M stock solution in isopropanol using special precautions |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | 6250 | |
| Dry ice or liquid nitrogene | |||
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | ThermoFisher | 14190094 | or equivalent |
| Easy 50 EasySep Magnet | Stemcell | 18002 | for holding 1 x 50ml conical tube |
| EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit | Stemcell | 19666 | This contains Solutions called “Isolation Cocktail” and “RapidSpheres magnetic beads |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Eppendorf centrifuge 5417R centrifuge | Eppendorf | ||
| Ethanol, in spray bottle | |||
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | E6758 | |
| Ice | |||
| Isopropanol (anhydrous grade) | Sigma | 278475 | |
| Lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1%(v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF, 10 mM β-glycerophosphate, 5 mM sodium pyrophosphate, 0.27 M sucrose, 0.1% (v/v) β-mercaptoethanol, 1x cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail (Roche), 1 μg/ml Microcystin-LR, 0.5 mM diisopropylfluorophosphate (DIFP). | alternatively frozen lysis buffer in aliquots without Microcystin-LR, DIFP available from MRC-PPU Reagents (http://mrcppureagents.dundee.ac.uk/) | ||
| Merck LRRK2 inhibitor II (MLi-2) | Merck | 438194-10MG | or equivalent (potent and selective LRRK2 inhinitor) |
| Microcystin-LR | Enzo Life Sciences | ALX-350-012-M001 | 1 mg/ml stock in DMSO and store at -80 oC. |
| Na3VO4 | Aldrich | 450243 | |
| NaF | Sigma | S7920 | |
| Odyssey CLx scan Western Blot imaging system | Odyssey | ||
| Permanent marker pen | |||
| Personal protection equipment | |||
| RPMI 1640 Medium | ThermoFisher | 21875034 | or equivalent |
| sodium pyrophosphate | Sigma | S22 | |
| sucrose | Sigma | S0389 | |
| β-glycerophosphate | Sigma | 50020 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| Suggested antibodies for Western blotting | |||
| Anti-RAB10 (phospho T73) antibody [MJF-R21] | abcam | ab230261 | |
| Anti-α-tubulin | Cell Signaling Technologies | 5174 | used at 1:2000 dilution |
| Goat anti-mouse IRDye 680LT | LI-COR | 926-68020 | used at 1:10,000 dilution |
| Goat anti-mouse IRDye 800CW | LI-COR | 926-32210 | used at 1:10,000 dilution |
| Goat anti-rabbit IRDye 800CW | LI-COR | 926-32211 | used at 1:10,000 dilution |
| MJFF-total Rab10 mouse antibody | generated by nanoTools (nanotools.de) | not applicable* | used at 2 μg/ml final concentration; * The MJFF-total Rab10 antibody generated by nanoTools (www.nanotools.de) [11] will be commercialised by the Michael J Fox Foundation in 2018 |
| Mouse anti-LRRK2 C-terminus antibody | Antibodies Incorporated | 75-253 | used at 1 μg/ml final concentration |
| pS935-LRRK2 | MRC PPU Reagents and Services | UDD2 | used at 1 μg/ml final concentration |
References
- Paisan-Ruiz, C., et al. Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson's disease. Neuron. 44 (4), 595-600 (2004).
- Fell, M. J., et al. MLi-2, a Potent, Selective, and Centrally Active Compound for Exploring the Therapeutic Potential and Safety of LRRK2 Kinase Inhibition. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 355 (3), 397-409 (2015).
- Zimprich, A., et al. Mutations in LRRK2 cause autosomal-dominant parkinsonism with pleomorphic pathology. Neuron. 44 (4), 601-607 (2004).
- Sardi, S. P., Cedarbaum, J. M., Brundin, P. Targeted Therapies for Parkinson's Disease: From Genetics to the Clinic. Journal of Movement Disorders. 33 (5), 684-696 (2018).
- Steger, M., et al. Phosphoproteomics reveals that Parkinson's disease kinase LRRK2 regulates a subset of Rab GTPases. Elife. 5, (2016).
- Ito, G., et al. Phos-tag analysis of Rab10 phosphorylation by LRRK2: a powerful assay for assessing kinase function and inhibitors. Biochemical Journal. 473 (17), 2671-2685 (2016).
- Alessi, D. R., SammLer, E. LRRK2 kinase in Parkinson's disease. Science. 360 (6384), 36-37 (2018).
- Yue, M., et al. Progressive dopaminergic alterations and mitochondrial abnormalities in LRRK2 G2019S knock-in mice. Neurobiology of Disease. 78, 172-195 (2015).
- Doggett, E. A., Zhao, J., Mork, C. N., Hu, D., Nichols, R. J. Phosphorylation of LRRK2 serines 955 and 973 is disrupted by Parkinson's disease mutations and LRRK2 pharmacological inhibition. Journal of Neurochemistry. 120 (1), 37-45 (2012).
- Sheng, Z., et al. Ser1292 autophosphorylation is an indicator of LRRK2 kinase activity and contributes to the cellular effects of PD mutations. Science Translational Medicine. 4 (164), (2012).
- Fan, Y., et al. Interrogating Parkinson's disease LRRK2 kinase pathway activity by assessing Rab10 phosphorylation in human neutrophils. Biochemical Journal. 475 (1), 23-44 (2018).
- Scott, J. D., et al. Discovery of a 3-(4-Pyrimidinyl) Indazole (MLi-2), an Orally Available and Selective Leucine-Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) Inhibitor that Reduces Brain Kinase Activity. Journal of Medicinal Chemistry. 60 (7), 2983-2992 (2017).
- Pham, C. T. Neutrophil serine proteases: specific regulators of inflammation. Nature Reviews Immunology. 6 (7), 541-550 (2006).
- Lis, P., et al. Development of phospho-specific Rab protein antibodies to monitor in vivo activity of the LRRK2 Parkinson's disease kinase. Biochemical Journal. 475 (1), 1-22 (2018).
- Mir, R., et al. The Parkinson's disease VPS35[D620N] mutation enhances LRRK2-mediated Rab protein phosphorylation in mouse and human. Biochemical Journal. 475 (11), 1861-1883 (2018).
- Rieckmann, J. C., et al. Social network architecture of human immune cells unveiled by quantitative proteomics. Nature Immunology. 18 (5), 583-593 (2017).
- Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
- Bain, B., Dean, A., Broom, G. The estimation of the lymphocyte percentage by the Coulter Counter Model S Plus III. Clinical & Laboratory Haematology. 6 (3), 273-285 (1984).
- Tomazella, G. G., et al. Proteomic analysis of total cellular proteins of human neutrophils. Proteome Science. 7, 32 (2009).
