Summary
Les mutations dans le gène riche de leucine de répétition de kinase 2 (LRRK2) causent la maladie héréditaire de Parkinson. Nous avons développé une méthode facile et robuste pour évaluer la phosphorylation LRRK2-contrôlée de Rab10 dans les neutrophiles périphériques humains de sang. Ceci peut aider à identifier des individus avec l’activité accrue de voie de kinase de LRRK2.
Abstract
La kinase répétée riche en leucine 2 (LRRK2) est le gène le plus souvent muté dans la maladie héréditaire de Parkinson (PD) et toutes les mutations pathogènes de LRRK2 ont comme conséquence l’hyperactivation de sa fonction de kinase. Ici, nous décrivons un essai facile et robuste pour quantifier l’activité de voie de kinase de LRRK2 dans les neutrophiles périphériques humains de sang en mesurant la phosphorylation LRRK2-contrôlée de l’un de ses substrats physiologiques, Rab10 à la thréonine 73. L’analyse de l’immunoblotting décrite nécessite un anticorps entièrement sélectif et phosphospécifique qui reconnaît le phosphore épitopique Rab10 Thr73 par LRRK2, comme l’anticorps monocnel MJFF-pRab10 lapin. Il utilise des neutrophiles sanguins périphériques humains, parce que le sang périphérique est facilement accessible et les neutrophiles sont un constituant abondant et homogène. Fait important, les neutrophiles expriment des niveaux relativement élevés de LRRK2 et Rab10. Un inconvénient potentiel des neutrophiles est leur activité intrinsèque élevée de protéase de sérine, qui nécessite l’utilisation des inhibiteurs très puissants de protéase tels que la neurotoxine d’organophosphorus diisopropylfluorophosphate (DIFP) dans le cadre du tampon de lyse. Néanmoins, les neutrophiles sont une ressource précieuse pour la recherche sur l’activité de la voie kinase LRRK2 in vivo et devraient être considérés pour l’inclusion dans les collections de biorepository.
Introduction
Les tentatives visant à ralentir ou à stopper la maladie de Parkinson (MP) ont jusqu’à présent échoué. La découverte de mutations hyperactivantes dans la kinase répétitive riche en leucine 2 (LRRK2) qui causent et/ou augmentent le risque de a conduit au développement des inhibiteurs de la kinase LRRK21,2,3. Ceux-ci sont maintenant entrés dans les essais cliniques4. La fonction exacte de LRRK2 n’est pas claire, mais un progrès majeur a été l’identification d’un sous-ensemble de protéines Rab GTPase, y compris Rab10, comme les premiers substrats physiologiques de bonne foi de la kinase LRRK25,6,7. Les principaux défis à l’ère des thérapies modificateurs de la maladie sont les marqueurs biochimiques de l’état d’activation de kinase LRRK2 et l’engagement cible des inhibiteurs de la kinase LRRK2.
Jusqu’à présent, le principal marqueur pharmacocinétique pour les inhibiteurs LRRK2 in vivo a été un groupe de résidus de sérines constitutivement phosphorylated de LRRK2, en particulier la sérine 935, qui deviennent déphosphorylated en réponse à divers inhibiteurs LRRK28,9. Cependant, la phosphorylation de la sérine 935 ne est pas corrélée avec l’activité intrinsèque de kinase cellulaire LRRK2 parce qu’elle n’est pas directement phosphorée par LRRK2 et est encore phosphorylée dans LRRK210,inactive à la kinase. LRRK2 activité kinase se corrèle bien avec l’autophosphorylation de la sérine 1292, mais il n’est en termes pratiques pas une lecture appropriée pour l’activité endogène LRRK2 kinase par l’analyse immunoblot des extraits de cellules entières en raison de l’absence actuelle d’anticorps fiables et phosphospecific pour ce site10,11.
Nous avons développé un essai robuste et facile pour quantifier l’activité de la voie de la kinase LRRK2 dans les cellules sanguines périphériques humaines qui mesure la phosphorylation LRRK2 de sa protéine cible physiologique Rab10 à la thréonine 7311. Le sang périphérique est facilement accessible par venesection, qui est un faible risque et une procédure rapide qui provoque un inconfort minimal. Nous nous concentrons sur les neutrophiles sanguins périphériques humains parce qu’ils constituent une population abondante (37-80% de tous les globules blancs) et les cellules homogènes qui exprime des niveaux relativement élevés de LRRK2 et Rab1011. En outre, les neutrophiles sanguins périphériques peuvent être isolés rapidement et efficacement en employant une approche négative immunomagnétique. Pour s’assurer que la phosphorylation Rab10 observée ultérieure est médiée par LRRK2, chaque lot de neutrophiles est incubé avec ou sans un inhibiteur puissant et sélectif de la kinase LRRK2 (nous utilisons et recommandons MLi-2)2,12. Ceci est ensuite suivi par la lyse cellulaire dans un tampon contenant l’inhibiteur de la protéase diisopropyl fluorophosphate (DIFP), qui est nécessaire pour supprimer l’activité intrinsèque de protéase de sérine qui est connue pour être élevée dans les neutrophiles13. Pour l’analyse finale par immunoblotting quantitatif, nous recommandons d’utiliser l’anticorps monoclonal de lapin MJFF-pRab10 qui détecte spécifiquement le Rab10 Thr73-phosphoepitope et ne réagit pas contre-réagit avec d’autres protéines Rab phosphorylated14. La sélectivité et la spécificité de cet anticorps ont été validées dans des modèles de surexpression de différentes protéines Rab et une ligne cellulaire A549 Rab10 knock-out14. Ainsi, nous mesurons la différence dans la phosphorylation Rab10 dans les lysates neutrophiles qui ont été traités avec et sans un inhibiteur puissant et sélectif de la kinase LRRK22. Alternativement, les échantillons pourraient également être analysés par d’autres méthodes, telles que la spectrométrie quantitative de masse.
En conclusion, la phosphorylation Rab10 contrôlée par LRRK2 est un marqueur supérieur de l’activité de kinase LRRK2 à la phosphorylation LRRK2 à la serine 935 et les neutrophiles du sang périphérique humain sont une ressource précieuse pour la recherche de dans LRRK2. Notre protocole fournit un essai robuste et facile pour interroger l’activité de voie LRRK2 dans les neutrophiles périphériques de sang et permet la stratification biochimique des individus avec l’activité accrue de kinase de LRRK215. Fait important, ces personnes peuvent bénéficier du futur traitement inhibiteur de la kinase LRRK2.
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Protocol
Selon la réglementation locale du Royaume-Uni, toutes les manipulations et les canalisations de sang humain sont entreprises dans un cabinet de sécurité biologique de catégorie 2. Toutes les procédures ont été effectuées conformément au comité local d’examen de l’éthique et tous les participants ont donné leur consentement éclairé.
1. Préparation
- Préparer 0,1 mL de solution de stock EDTA 1 contenant 100 mM EDTA en saline tamponnée par phosphate (PBS).
- Préparer 60 ml de solution EDTA Stock 2 contenant 1 mM EDTA dans PBS.
- Préparer le tampon de lyse contenant 50 mM Tris-HCl (pH - 7,5), 1% (v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 50 m NaF, 10 mM -glycerophosphate, 5 mM de sodium pyrophosphate, 0,27 M saccharose, 0,1% (v/v) ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' ' '
REMARQUE : Les auteurs utilisent régulièrement un produit sans EDTA, mais un cocktail d’inhibiteur de la protéase contenant de l’EDTA devrait également fonctionner. Le tampon de lyse peut être fait à l’avance sans le mercaptoethanol, les inhibiteurs de la protéase, la microcystine-LR et le DIFP, et stocké à 4 oC jusqu’à l’utilisation. Assurez-vous que le mercaptoethanol, les inhibiteurs de la protéase, la microcystine-LR et le DIFP ne sont ajoutés que immédiatement avant utilisation.
CAUTION : Le DIFP est toxique et doit être manipulé avec soin dans une hotte de fumée après l’évaluation locale des risques pour la santé et la sécurité. DiFP peut être ajouté au tampon de lyse et utilisé immédiatement. Alternativement, le tampon complet de lyse contenant tous les autres composants, y compris le DIFP, peut être aliquoted et stocké à -80 oC pour une utilisation ultérieure pendant au moins 4 semaines.
2. L’isolement de Neutrophil du sang entier
- Recueillir 10 ml de sang dans un tube de collecte de sang. Mélanger délicatement en inversant les tubes 7 à 8x.
- Transférer 10 ml de sang dans un tube conique de 50 ml.
- Ajouter 100 L de la solution de stock EDTA 1 au sang. Mélanger délicatement.
- Ajoutez 500 L du cocktail d’isolement (50 l/ml/mL) du kit d’isolement du neutrophile(Tableau des matériaux)à l’échantillon de sang entier.
- Vortex les perles magnétiques du kit d’isolement neutrophile pour 30 s avant utilisation afin de réanimer les perles magnétiques très fines.
- Ajouter 500 l de perles magnétiques à l’échantillon de sang et mélanger doucement en inversant le tube plusieurs fois.
- Incuber à température ambiante (RT) pendant 5 min.
- Remplir le tube à 50 ml avec EDTA Stock Solution 2. Mélanger en faisant très doucement rouler de haut en bas de 2 à 3x.
- Placez le tube dans l’aimant et retirez le couvercle pour éviter l’agitation subséquente du tube.
- Incubate pendant 10 min à RT.
- Soigneusement pipette la suspension cellulaire enrichie qui contient les neutrophiles dans un nouveau tube conique de 50 mL.
REMARQUE : Ne touchez pas le côté du tube qui est en contact avec l’aimant et évitez la collecte et la perturbation des globules rouges au fond du tube. Laisser environ 10 ml de la suspension des globules rouges au fond du tube. - Vortex les perles magnétiques pour 30 s avant utilisation et ajouter 0,5 mL des perles magnétiques au tube contenant les neutrophiles enrichis. Mélanger délicatement en inversant le tube.
- Incubate à RT pour 5 min.
- Placez le tube dans l’aimant et retirez le couvercle pour éviter l’agitation ultérieure.
- Incubate à RT pour 5 min.
- Soigneusement pipette la suspension cellulaire enrichie qui contient les neutrophiles dans un nouveau tube conique de 50 mL.
REMARQUE : Ne touchez pas le côté du tube qui est en contact avec l’aimant. Laisser environ 5 ml de suspension au fond du tube. - Pour assurer l’élimination complète des perles magnétiques du mélange cellulaire, placez le tube contenant les cellules enrichies dans l’aimant.
- Incubate pendant 10 min à RT.
- Soigneusement pipette la suspension cellulaire enrichie qui contient maintenant des neutrophiles purs dans un nouveau tube conique de 50 mL.
REMARQUE : Ne touchez pas le côté du tube qui est en contact avec l’aimant. Laisser environ 5 ml de suspension au fond du tube. - Mélanger les cellules isolées avec 1 mM EDTA Stock Solution 2 à un volume final d’environ 41 ml. Pipette de haut en bas pour mélanger.
- Divisez la solution également en deux tubes d’environ 20 ml dans chaque tube.
- Centrifugeuse les deux tubes à 335 x g pendant 5 min.
- Au cours de cette centrifugation, retirer le stock d’inhibiteurs MLi-2 (200 M/1 000x de concentration) du congélateur de -80 oC et laisser à RT pour une utilisation ultérieure.
- Immédiatement après l’étape de centrifugation et sans agitation des tubes, versez le supernatant sans déranger les granulés de neutrophile. Réutilisez chaque granule cellulaire dans 10 ml de support de culture cellulaire(Tableau des matériaux) à RT en canalisation doucement des cellules de haut en bas 4x.
3. Traitement inhibiteur de la kinase LRRK2 des neutrophiles purs
- Étiquetez un tube "DMSO" et l’autre tube "MLi-2".
- Au tube étiqueté « DMSO », ajoutez 10 L de DMSO et mélangez doucement en faisant monter et descendre 2x avec une pipette de 10 ml. Au tube étiqueté « MLi-2 », ajoutez 10 L de la solution de stock MLi-2 (concentration finale 200 nM) et mélangez doucement en roulant de haut en bas de 2x avec une pipette de 10 ml.
- Incuber les échantillons pendant 30 min à RT. Mélanger doucement par inversion tous les 10 minutes pendant l’incubation.
- Pendant la période d’incubation, retirer le stock diFP de 0,5 M du congélateur à -80 oC et placer dans un capot de fumée sur la glace. Retirer la solution de bouillon de microcystine-LR de 1 mg/mL du congélateur à -80 oC et laisser décongeler à RT. Prenez un aliquot (0,25 ml) du tampon de lyse hors du congélateur, laissez-le décongeler à RT, puis placez-le sur la glace pour une utilisation ultérieure.
- Préparer 1 ml de milieu de culture cellulaire contenant 1 L de DMSO et appeler ce tampon de réanimation DMSO. Préparer 1 mL de support RPMI contenant 1 L de 200 M M M M-2 et appeler ce tampon de réanimation MLi-2.
- Après la période d’incubation de 30 min, centrifuger les deux tubes à 335 x g pendant 5 min.
- Jetez soigneusement le supernatant dans chaque tube sans déranger la boulette de neutrophile.
- Pour l’échantillon étiqueté DMSO résumant doucement la granule dans 1 ml de tampon de réanimation DMSO et pour le tube étiqueté MLi-2, réutilisez la granule dans 1 ml de tampon de réanimation MLi-2.
- Transférer les granulés de cellules résuspendés sur les tubes de centrifugation correspondants étiquetés "DMSO" et "MLi-2" et la centrifugeuse les deux tubes à 335 x g pendant 3 min.
- Pendant l’étape de centrifugation, préparer le tampon de lyse. Dans le capot de fumée ajouter délicatement 0,25 l 'L de 0.5 M solution DIFP ainsi que 0.25 'L de 1 mg/mL microcystin-LR au tampon de lyse de 0,25 mL. Mélanger et laisser sur la glace jusqu’à l’utilisation.
REMARQUE : Ajouter le DIFP au tampon de lyse dans un rayon de 15 min de lyse cellulaire, parce que le DIFP est relativement instable dans une solution aqueuse. - Immédiatement après la centrifugation, retirez soigneusement et complètement tous les supernatants avec une pipette sans déranger la boulette de neutrophile et placez les tubes sur la glace.
- Ajoutez immédiatement 100 L de tampon de lyse contenant du DIFP et de la microcystine-LR à chaque tube. À l’aide d’une pipette de 100 à 200 l,l, réutilisez les granulés de cellules en faisant monter et descendre environ 5 à 10x.
- Lyse les cellules sur la glace pendant 10 min.
- Tubes de centrifugeuse à 20 000 x g pendant 15 min à 4 oC pour enlever les débris cellulaires.
- Transférer les supernatants "DMSO" et "MLi-2" contenant les neutrophiles dans de nouveaux tubes de centrifugation. Jetez la boulette de débris.
REMARQUE : Les lysates neutrophiles sont maintenant prêts à l’emploi ou peuvent être congelés dans de l’azote liquide et stockés à -80 oC pour une analyse future.
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Representative Results
Notre essai permet d’interroger l’activation de la kinase LRRK2 associée au chez les neutrophiles du sang périphérique humain avec la phosphorylation Rab10 dépendante de LRRK2 comme lecture. Les neutrophiles sont une population de globules blancs périphériques homogènes et abondantes qui exprime des niveaux élevés des protéines LRRK2 et Rab10(figure 1). La seule autre population cellulaire parmi les cellules mononucléaires périphériques restantes (PBMC) avec un nombre élevé de copies des deux protéines sont des monocytes, mais ceux-ci ne représentent que 2 à 12 % des globules blancs. Ceci indique que les neutrophiles périphériques de sang sont un biomatrix plus approprié pour étudier la phosphorylation rab10 LRRK2-contrôlée.
En isolant les neutrophiles sanguins périphériques de 10 ml de sang avec notre procédure, entre 0,5-0,75 mg de protéine totale lysate par donneur a été obtenu(figure 2A), ce qui est suffisant pour un nombre important d’analyse de l’immunoblot pour lequel seulement 10 g par voie de gel sont nécessaires. Bien que la vérification de la pureté et de la viabilité des cellules ne soit pas systématiquement effectuée, nous avons démontré pour trois donneurs en bonne santé que la pureté des neutrophiles isolés se situe entre 94 et 98 % et la viabilité des cellules de 99 % selon l’analyse de cytométrie du débit à l’aide du marqueur de neutrophile cd66b-Fluorescein et de 4',6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrolure (DAPI) colorant pour laviability (2A).
Bien que l’objectif de cette publication soit l’isolement et le traitement des neutrophiles à partir du sang périphérique et non l’analyse par le ballonnement quantitatif occidental, La figure 2B démontre que l’anticorps monoclique MJFF-pRab10 qui détecte spécifiquement le phosphorylated de Rab10 à la thréonine 73 a indiqué des signaux robustes dans les échantillons de neutrophile, qui ont été nettement supprimés par traitement avec un inhibiteur puissant et spécifique de kinase de LRRK2, dans ce cas MLi-2.
Les neutrophiles contiennent des niveaux élevés de protéases sérine qui peuvent affecter l’analyse occidentale suivante de tache. Bien que diFP supprime effectivement l’activité de protéase élevée chez les neutrophiles, il s’agit d’une neurotoxine organophosphorée puissante et il serait souhaitable de le remplacer par un inhibiteur de protéase tout aussi efficace mais moins toxique, tel que le fluorure phénylméthylthylsulfonyl (PMSF). Nous avons constaté que la phosphorylation Rab10 était tout aussi bien préservée lorsque le DIFP a été remplacé par le PMSF à une concentration de 2,5 mM(figure 2C). Cependant, l’intégrité de la protéine LRRK2 a été compromise lors de l’utilisation de PMSF par rapport au DIFP, ce qui suggère que la protéine LRRK2 plus grande est plus sensible à la dégradation(figure 2C).
Nous avons déjà montré qu’une autre mutation de gène DE VPS35 D620N a comme conséquence l’hyperactivation de la kinase LRRK2 par un mécanisme encore inconnu15. Les neutrophiles de trois personnes atteintes de hébergeant une mutation hétérozygote VPS35 D620N pathogènes ont été isolés à l’aide de la méthode décrite dans cet article(figure 3). Des échantillons de neutrophiles provenant de neuf donneurs en bonne santé ont été isolés en tant que témoins15. L’analyse d’immunoblot utilisant l’anticorps monocnel MJFF-pRab10 démontre une augmentation significative de 3x de la phosphorylation de Rab10 chez Thr 73 chez les neutrophiles des patients de Parkinson présentant une mutation VPS35 D620N comparée aux témoins. L’expression totale de protéine De Rab10 est similaire dans chacun des 12 échantillons de neutrophiles.
Figure 1 : Abondance de protéines LRRK2 et Rab10 dans les cellules immunitaires isolées du sang humain à l’aide de données accessibles au public dans la base de données immprot (http://www.immprot.org)16. Le graphique montre le nombre de copies protéiques par cellule pour LRRK2 et Rab10 dans une gamme de cellules immunitaires sanguines périphériques, y compris des sous-ensembles de lymphocytes T, des cellules B, des monocytes, des cellules NK, des cellules dendritiques et des neutrophiles granulocytes, des basophiles et des éosinophiles. Ce chiffre a été modifié à partir de Fan et al.11. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Caractérisation et analyse des neutrophiles sanguins périphériques humains et importance du DIFP pour la prévention de la dégradation protéolytique chez les neutrophiles. (A) Les neutrophiles ont été isolés du sang entier de trois donneurs sains (A, B et C) montrant la pureté, la viabilité et le rendement total des protéines après la lyse cellulaire. (B) Les neutrophiles ont été traités avec ou sans inhibiteur de la kinase LRRK2 (MLi-2), puis lysed et soumis à l’analyse quantitative d’immunoblot avec les anticorps indiqués par l’imagerie de fluorescence proche infrarouge (NIR). (C) Les neutrophiles ont été isolés de deux donneurs en bonne santé et traités avec 100 nM M M M-2 pendant 30 min. Les cellules ont été lysed en présence de 0,5 mM DIFP ou 2,5 mM PMSF pour bloquer l’activité de protéase sérine chez les neutrophiles. A et B ont été modifiés à partir de Mir et al.15, tandis que C a été modifié à partir de Fan et al.11. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Augmentation de l’activité de voie de kinase de LRRK2 dans les patients de la maladie de Parkinson hébergeant une mutation hétérozygeeuse de VPS35 D620N. Les neutrophiles ont été isolés de neuf contrôles sains non-âge-assortis et trois patients de présentant une mutation hétérozygote de VPS35 D620N maladie-causante. Les cellules ont été traitées avec ou sans 200 nM MLi-2 pendant 30 min avant la lyse cellulaire. (A) Un total de 10 g d’extrait de cellules entières soumis à l’analyse quantitative de l’immunoblot avec les anticorps indiqués par l’imagerie par fluorescence proche infrarouge (NIR). Immunoblots ont été quantifiés pour phospho-Thr73 Rab10:total Rab10 ratio (B). Les données ont été analysées par ANOVA à sens unique avec le test de comparaison multiple de Tukey. Données présentées comme moyens et DD; p et lt; 0,0001. Ce chiffre a été modifié à partir de Mir et al.15. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Des preuves cliniques, génétiques et biochimiques convaincantes indiquent un rôle important pour LRRK2 et en particulier sa fonction de kinase dans la maladie de Parkinson7. LRRK2 inhibiteurs de kinase ont été développés et entrent essais cliniques2,4,12. En tant que tel, il est nécessaire d’exploiter LRRK2 comme biomarqueur pour l’engagement cible ainsi que la stratification des patients. Notre protocole décrit un essai robuste et facile pour analyser l’activation de la voie de kinase LRRK2 comme en témoigne la phosphorylation de son substrat physiologique Rab10 dans le bassin homogène de neutrophiles sanguins périphériques humains11,14. Pour l’analyse par immunoblotting quantitatif, nous recommandons fortement l’utilisation d’un anticorps Rab10 hautement sélectif phosphospécial (anticorps monoclonal MJFF-pRab10)14,17.
Nous utilisons des neutrophiles humains parce qu’ils constituent un sous-ensemble homogène de cellules sanguines périphériques qui composent la population dominante de leucocytes17,18. Plus important encore, les neutrophiles ont également des niveaux élevés d’expression protéique de LRRK2 et de son sous-état Rab10(figure 1)16. En revanche, les sous-ensembles restants de leucocytes qui composent le bassin de PBMCs sont hétérogènes avec l’expression variable et principalement faible de LRRK2 et Rab10. Les monocytes et les cellules dendritiques ont des niveaux d’expression élevés, mais sont faibles en abondance globale16.
Bien que nous recommandons l’utilisation de tubes de collecte de sang vacutainer EDTA, un anticoagulant autre que l’EDTA peut être utilisé. Cependant, la présence d’EDTA est importante pour la performance de la trousse d’isolement neutrophile. Nous recommandons donc d’ajouter EDTA à l’échantillon de sang entier afin qu’une concentration finale de 1 mM EDTA soit atteinte même si un anticoagulant alternatif est utilisé. L’utilisation du kit d’isolement neutrophil permet de purifier les neutrophiles directement à partir du sang humain entier par sélection négative immunomagnétique d’une manière relativement rapide et facile. Le nombre d’aimants disponibles détermine le nombre d’échantillons de sang pouvant être traités en parallèle. Il est facilement possible d’isoler les neutrophiles de jusqu’à six échantillons de sang en parallèle à l’aide de six aimants. Un inconvénient potentiel est le coût associé pour les kits commerciaux d’isolement neutrophil et l’aimant requis. D’autres méthodes d’isolement des neutrophiles du sang entier ont été décrites et s’appuient sur la séparation de gradient de densité ou le tri de cellules activées par fluorescence (FACS), qui ont des inconvénients significatifs. Le premier est beaucoup plus de temps et de main-d’œuvre intensive et au moins dans nos mains pas aussi fiable et efficace. Ce dernier nécessite une machine FACS et des étapes de manipulation supplémentaires devraient être introduites, y compris l’épuisement des globules rouges et la coloration cellulaire, ajoutant du temps au processus d’isolement cellulaire. Dans l’ensemble, l’isolement immunomagnétique est rapide, génère un échantillon très pur, et évite la manipulation excessive des cellules. En ce qui concerne le traitement des échantillons, nous avons déjà montré qu’un délai entre la collecte de sang et l’isolement neutrophile d’au moins jusqu’à 24 h n’entraîne pas un changement significatif ou une variation dans les résultats de notre essai, qui offre une flexibilité pour l’exploitation clinique future11.
La procédure d’isolement neutrophile elle-même est très facile. Nous vous recommandons de vortexing les perles magnétiques avant chaque utilisation. Il est également important de ne pas déranger l’aimant une fois que le tube est à l’intérieur de l’aimant pour éviter la turbulence et le délogement des perles magnétiques. Les neutrophiles sont enrichis en suspension par plusieurs séries d’ablation immunomagnétique de toutes les cellules indésirables. Il faut prendre soin de ne pas toucher le côté du tube qui est en contact avec l’aimant et pendant le premier tour d’isolement (étape 2.11) afin de ne pas perturber les globules rouges au fond du tube. Après la dernière ronde de tuyauterie de la suspension cellulaire enrichie dans un nouveau tube conique (étape 2.24), les neutrophiles sont immédiatement disponibles pour le traitement ultérieur. Si les neutrophiles sont utilisés pour évaluer l’activité LRRK2 dans les cellules, les neutrophiles sont ensuite divisés en deux lots et après granulés par centrifugation, résobordés dans un inhibiteur de la kinase LRRK2 (ici, MLi-2) ou DMSO contenant le milieu de la culture cellulaire. Comme la déphosphorylation en présence et la rephosphorylation en l’absence de l’inhibition de la kinase LRRK2 sont des événements relativement rapides, il faut veiller à ce que la fraction de neutrophile traitée MLi-2 reste exposée à un inhibiteur de la kinase LRRK2 (p. ex., MLi-2) jusqu’à la lyse cellulaire (étapes 3.8-3.10).
Il y a plusieurs étapes de centrifugation dans ce protocole utilisant des tubes coniques de 15 et 50 ml. Bien que nous utilisions régulièrement les vitesses de centrifugation indiquées dans le protocole, il est possible d’augmenter la vitesse de centrifugation jusqu’à 400 x g sans nuire à la viabilité des cellules. Il en résulte une granule de cellules neutrophiles légèrement plus ferme qui pourrait aider à réduire toute perte potentielle de matière de neutrophil pendant la décantation et le tuyautage outre des étapes supernatantes pendant ce protocole. Cela augmentera probablement le rendement en termes de lysate de protéines totales obtenus. Une préoccupation potentielle est qu’une force de centrifugation plus élevée pourrait activer les neutrophiles et potentiellement affecter l’analyse ultérieure. Notre recommandation générale est de traiter les neutrophiles à chaque étape du protocole aussi doucement que possible.
Notre protocole utilise l’inhibiteur très puissant de protéase de sérine DIFP (0.5 mM) dans le cadre du tampon de lyse de neutrophile. DIFP est une neurotoxine organophosphorée puissante, et tandis que nous avons étudié des composés alternatifs, son ajout à la mémoire tampon de lyse était essentiel pour l’analyse de la phosphorylation rab10 contrôlée par LRRK2 chez les neutrophiles humains par immunoblotting. Par exemple, le remplacement du DIFP par 1% (w/v) SDS a été utilisé pour lyser les neutrophiles dans d’autres études19 et a conduit à une dégradation significative des protéines dans la mesure où l’immunoblotting pour LRRK2, Rab10, et même le contrôle de chargement GAPDH n’a pas donné un signal, soulignant ainsi l’importance d’inclure un inhibiteur de protéase très puissant dans le tampon de lyse (Figure 2C). Lors du remplacement du DIFP par l’inhibiteur de la protéase sérine PMSF, moins puissant, mais aussi moins toxique, à 2,5 mM, la phosporylation Rab10 était bien conservée, mais la protéine LRRK2 plus grande a subi une dégradation significative(figure 2C). Afin de minimiser la manipulation de la solution de stock DIFP, le tampon de lyse contenant le DIFP peut être préparé par lots, aliquoted et stocké à -20 oC ou -80 oC11. En ce qui concerne l’analyse par immunoblotting quantitatif, il est primordial d’utiliser un anticorps phosphospécifique qui a été démontré pour être sélectif pour seulement une seule protéine LRRK2 phosphorylated Rab, comme l’anticorps MJFF-pRab10 utilisé pour nos études14.
Le protocole peut également être mis à l’échelle à l’aide d’un volume maximal de sang entier allant jusqu’à 25 ml, qui est la limite qui peut être traitée en une seule procédure d’isolement à l’aide d’un aimant, qui est capable de contenir 50 mL tubes coniques. Les seules étapes qui auraient besoin d’ajustements sont l’étape 2.4 (ajout de 50 'L de cocktail d’isolement par ml de sang), les étapes 2.6 et 2.12 (ajout de 50 'L de perles magnétiques par ml de sang), et une augmentation proportionnelle du volume de tampon de lyse pour la lyse neutrophile à l’étape 3.12. Toutes les autres étapes peuvent être maintenues identiques.
En résumé, notre protocole décrit une méthode facile et robuste pour isoler les neutrophiles humains du sang périphérique. Les neutrophiles peuvent alors être traités avec et sans inhibiteur puissant et spécifique de la kinase LRRK2 pour permettre la quantification de la phosphorylation LRRK2-contrôlée de Rab10 in vivo. Ceci peut être utile pour stratifier des individus selon l’activité de voie de kinase de LRRK2 et pour identifier ceux avec l’hyperactivation de voie qui pourraient bénéficier du traitement futur d’inhibiteur de kinase de LRRK2. Bien que ce sera peu probable pour la majorité des personnes atteintes de MP, en particulier la MP idiopathique, notre essai a déjà été déployé avec succès chez les individus porteurs d’une mutation rare et hétérozygote dans un autre gène associé à la, VPS35 D620N, où LRRK2 activité de la voie kinase est considérablement augmentée par un mécanisme encore inconnu15. Nous avions précédemment examiné les niveaux de phosphorylation rab 10 contrôlés par LRRK2 chez un petit nombre d’individus porteurs de la mutation LRRK2 G2019S plus courante qui est connue pour activer l’activité de kinase LRRK2 seulement modestement par un facteur d’environ deux sans détecter une différence significative par rapport aux contrôles et aux patients atteints de MP idiopathique avec notre essai11,14. Ces données et d’autres données non publiées suggèrent que l’activité de kinase LRRK2 nécessite probablement une augmentation de 'gt;3x afin de donner un résultat significatif en utilisant l’immunoblotting quantitatif. Cependant, la sensibilité pour détecter l’activation de la voie de kinase LRRK2 peut probablement être augmentée si le déploiement de la technologie de spectrométrie de masse de pointe.
Nous suggérons que les neutrophiles sont une ressource précieuse pour la recherche sur la maladie de Parkinson dans l’activité de voie de kinase LRRK2 et pourrait aider à identifier les individus qui pourraient bénéficier du traitement futur inhibiteur de kinase de LRRK2.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions les bénévoles en bonne santé qui ont gentiment donné du sang pour la présente étude. Nous remercions la Michael J. Fox Foundation for Parkinson’s Research (MJFF) et le leadership de l’étude Fox BioNet (FBN) pour leur soutien et leur contribution au protocole écrit et à la vidéo. Nous remercions le professeur Alexander Zimprich de l’Université de Vienne en Autriche d’avoir testé notre protocole et notre collaboration. Nous apprécions la contribution de Paul Davies au projet (directeur général de la MRC PPU). Nous reconnaissons également l’excellent soutien technique de l’Unité de phosphore et d’ubiquitylation des protéines de la MRC (PPU), à savoir la synthèse chimique (Natalia Shpiro pour la synthèse MLi-2), les équipes de purification des anticorps du PPU Hilary McLauchlan et James Hastie). Nous remercions Mhairi Towler et Fraser Murdoch de Vivomotion pour leur aide à faire les vidéos et les animations. Nous remercions Steve Soave de 81 films pour l’aide avec les montages finaux. Esther Sammler est soutenue par une bourse universitaire clinique senior écossaise et a reçu un financement de Parkinson’s UK (K-1706).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Pipette tips | Sarstedt | 70.762 | or equivalent |
| 1.5 mL Micro tubes | Sarstedt | 72.690.001 | or equivalent |
| 10 mL Pipette tips | Sarstedt | 86.1254.025 | or equivalent |
| 10 μL Pipette tips | Sarstedt | 70.113 | or equivalent |
| 15 mL falcon tube | Cellstar | 188 271 | or equivalent |
| 200 μL Pipette tips | Sarstedt | 70.760.002 | or equivalent |
| 25 mL Pipette tips | Sarstedt | 86.1685.001 | or equivalent |
| 50 mL falcon tube | Cellstar | 227 261 | or equivalent |
| BD Vacutainer Hemogard Closure Plastic K2-EDTA Tube | BD | BD 367525 | or equivalent |
| Beckman Coulter Allegra X-15R centrifuge | Beckman | or equivalent centrifuge with swimging bucket rotator for 15 mL and 50 mL falcon tubes at speed 1000-1200 x g | |
| Category 2 biological safety cabinet. | |||
| cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
| DIFP (Diisopropylfluorophosphate) | Sigma | D0879 | Prepare 0.5M stock solution in isopropanol using special precautions |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | 6250 | |
| Dry ice or liquid nitrogene | |||
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | ThermoFisher | 14190094 | or equivalent |
| Easy 50 EasySep Magnet | Stemcell | 18002 | for holding 1 x 50ml conical tube |
| EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit | Stemcell | 19666 | This contains Solutions called “Isolation Cocktail” and “RapidSpheres magnetic beads |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Eppendorf centrifuge 5417R centrifuge | Eppendorf | ||
| Ethanol, in spray bottle | |||
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | E6758 | |
| Ice | |||
| Isopropanol (anhydrous grade) | Sigma | 278475 | |
| Lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1%(v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF, 10 mM β-glycerophosphate, 5 mM sodium pyrophosphate, 0.27 M sucrose, 0.1% (v/v) β-mercaptoethanol, 1x cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail (Roche), 1 μg/ml Microcystin-LR, 0.5 mM diisopropylfluorophosphate (DIFP). | alternatively frozen lysis buffer in aliquots without Microcystin-LR, DIFP available from MRC-PPU Reagents (http://mrcppureagents.dundee.ac.uk/) | ||
| Merck LRRK2 inhibitor II (MLi-2) | Merck | 438194-10MG | or equivalent (potent and selective LRRK2 inhinitor) |
| Microcystin-LR | Enzo Life Sciences | ALX-350-012-M001 | 1 mg/ml stock in DMSO and store at -80 oC. |
| Na3VO4 | Aldrich | 450243 | |
| NaF | Sigma | S7920 | |
| Odyssey CLx scan Western Blot imaging system | Odyssey | ||
| Permanent marker pen | |||
| Personal protection equipment | |||
| RPMI 1640 Medium | ThermoFisher | 21875034 | or equivalent |
| sodium pyrophosphate | Sigma | S22 | |
| sucrose | Sigma | S0389 | |
| β-glycerophosphate | Sigma | 50020 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| Suggested antibodies for Western blotting | |||
| Anti-RAB10 (phospho T73) antibody [MJF-R21] | abcam | ab230261 | |
| Anti-α-tubulin | Cell Signaling Technologies | 5174 | used at 1:2000 dilution |
| Goat anti-mouse IRDye 680LT | LI-COR | 926-68020 | used at 1:10,000 dilution |
| Goat anti-mouse IRDye 800CW | LI-COR | 926-32210 | used at 1:10,000 dilution |
| Goat anti-rabbit IRDye 800CW | LI-COR | 926-32211 | used at 1:10,000 dilution |
| MJFF-total Rab10 mouse antibody | generated by nanoTools (nanotools.de) | not applicable* | used at 2 μg/ml final concentration; * The MJFF-total Rab10 antibody generated by nanoTools (www.nanotools.de) [11] will be commercialised by the Michael J Fox Foundation in 2018 |
| Mouse anti-LRRK2 C-terminus antibody | Antibodies Incorporated | 75-253 | used at 1 μg/ml final concentration |
| pS935-LRRK2 | MRC PPU Reagents and Services | UDD2 | used at 1 μg/ml final concentration |
References
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