Summary
Le mutazioni nel gene della leucina ricca di parentesi 2 (LRRK2) causano il morbo di Parkinson ereditario. Abbiamo sviluppato un metodo semplice e robusto per valutare il fosfororylazione controllata da LRRK2 di Rab10 nei neutrofili del sangue periferici umani. Questo può aiutare a identificare gli individui con aumento dell'attività del percorso della chinasi LRRK2.
Abstract
La leucina ricca di chinasi 2 (LRRK2) è il gene più frequentemente mutato nella malattia ereditaria del Parkinson (PD) e tutte le mutazioni patogene dell'LRRK2 provocano l'iperattivazione della sua funzione di chinasi. Qui, descriviamo un saggio facile e robusto per quantificare l'attività della via della chinasi LRRK2 nei neutrofili del sangue periferici dell'uomo misurando la fosforolazione controllata da LRRK2 di uno dei suoi substrati fisiologici, Rab10 alla trenolina 73. L'analisi dell'immunoblotting descritta richiede un anticorpo completamente selettivo e fosfospecifico che riconosca l'epitopo Rab10 Thr73 fosforerilato da LRRK2, come l'anticorpo monoclonale del coniglio MJFF-pRab10. Esso utilizza neutrofili del sangue periferici umani, perché il sangue periferico è facilmente accessibile e i neutrofili sono un costituente abbondante e omogeneo. È importante sottolineare che i neutrofili esprimono livelli relativamente elevati di LRRK2 e Rab10. Un potenziale inconveniente dei neutrofili è la loro elevata attività intrinseca di proteasi serina, che richiede l'uso di inibitori della proteasi molto potenti come la diisopropylfluorofosfati (DIFP) organosa. Tuttavia, i neutrofili sono una risorsa preziosa per la ricerca sull'attività del percorso della chinasi LRRK2 in vivo e dovrebbero essere considerati per l'inclusione nelle collezioni di biorepository della PD.
Introduction
I tentativi di rallentare o fermare il morbo di Parkinson (PD) sono finora falliti. La scoperta di mutazioni iperattive nella leucina ricca ripetizione chinasi 2 (LRRK2) che causano e/o aumentano il rischio di PD ha portato allo sviluppo di inibitori della chinasi LRRK21,2,3. Questi sono ora entrati negli studi clinici4. L'esatta funzione di LRRK2 non è chiara, ma un importante progresso è stata l'identificazione di un sottoinsieme di proteine Rab GTPase, tra cui Rab10, come il primo substrati fisiologici in buona fede della chinasi LRRK25,6,7. Le sfide chiave nell'era delle terapie che modificano la malattia sono i marcatori biochimici dello stato di attivazione della chinasi LRRK2 e l'impegno mirato degli inibitori della chinasi LRRK2.
Finora, il principale marcatore farmacocinetico per gli inibitori di LRRK2 in vivo è stato un gruppo di residui di serine costituiti da fosforesti di LRRK2, in particolare serine 935, che diventano deforfatiti in risposta a diversi inibitori di LRRK28,9. Tuttavia, la fosfororylazione serina 935 non è correlata all'attività intrinseca della china lRRK2 cellulare perché non è direttamente fosforilata da LRRK2 ed è ancora fosforilata in lRRK210. L'attività della chinasi LRRK2 si correla bene con l'autofosfororylazione della serina 1292, ma in termini pratici non è una lettura adatta per l'attività endogena della chinaltra LRRK2 mediante l'analisi immunoblot di estratti di cellule intere a causa dell'attuale mancanza di anticorpi affidabili e fosforici per questo sito10,11.
Abbiamo sviluppato un saggio robusto e facile per quantificare l'attività della vaginasi l'LRRK2 nelle cellule del sangue periferiche umane che misura l'fosfororylazione controllata da LRRK2 della sua proteina bersaglio fisiologica Rab10 alla trelina 7311. Il sangue periferico è facilmente accessibile tramite venesezione, che è un basso rischio e una procedura rapida che causa un disagio minimo. Ci concentriamo sui neutrofili del sangue periferici umani perché costituiscono un'abbondante popolazione di cellule bianche (37-80% di tutti i globuli bianchi) e una popolazione omogenea di cellule che esprime livelli relativamente elevati di LRRK2 e Rab1011. Inoltre, i neutrofili del sangue periferico possono essere isolati in modo rapido ed efficiente utilizzando un approccio immunomagnetico negativo. Per garantire che la successiva fosfororylazione Rab10 osservata sia mediata da LRRK2, ogni lotto di neutrofili viene incubato con o senza un potente e selettivo inibitore della chinasi LRRK2 (usiamo e raccomandiamo MLi-2)2,12. Questo è seguito da lisi cellulare in un buffer contenente l'inibitore della proteasi (DIisophofosfato) (DIFP), che è necessario per sopprimere l'attività intrinseca della proteasi serina che è nota per essere ad alta neutrofili13. Per l'analisi finale mediante immunoblotting quantitativa, si consiglia di utilizzare l'anticorpo monoclonale del coniglio MJFF-pRab10 che rileva specificamente il Rab10 Thr73-phosphoepitope e non reagisce incrociatamente con altre proteine Rab fosforolate14. La selettività e la specificità di questo anticorpo è stata convalidata in modelli di sovraespressione di diverse proteine Rab e una linea cellulare Knock-out A549 Rab1014. Così, misuriamo la differenza nella fosforilazione Rab10 nei lismi neutrofili che sono stati trattati con e senza un potente e selettivo inibitore della chinasi LRRK22. In alternativa, i campioni potrebbero anche essere analizzati con altri metodi, come la spettrometria di massa quantitativa.
In conclusione, la fosfororylazione Rab10 controllata da LRRK2 è un marcatore superiore dell'attività della chinasi LRRK2 alla fosforolazione LRRK2 a serine 935 e i neutrofili ematici periferici umani sono una risorsa preziosa per la ricerca della PD in LRRK2. Il nostro protocollo fornisce un saggio robusto e facile per interrogare l'attività del percorso LRRK2 nei neutrofili del sangue periferici e consente la stratificazione biochimica di individui con aumento dell'attività della chinasi LRRK215. È importante sottolineare che tali individui possono beneficiare del futuro trattamento dell'inibitore della chinasi LRRK2.
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Protocol
Secondo la normativa locale del Regno Unito, tutte le manipolazioni e il pipettaggio del sangue umano sono intrapresi in un armadietto di sicurezza biologica di categoria 2. Tutte le procedure sono state eseguite in conformità con il comitato di revisione etica locale e tutti i partecipanti hanno fornito il consenso informato.
1. Preparazione
- Preparare 0,1 mL di EDTA Stock Solution 1 contenente 100 mM EDTA in salina con buffer fosfato (PBS).
- Preparare 60 mL di EDTA Stock Solution 2 contenente 1 mM EDTA in PBS.
- Preparare il buffer di lisi contenente 50 mM Tris-HCl (pH - 7,5), 1% (v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF, 10 mM, 5 mM di pirofafato di sodio, 0,27 M di saccarosio, 0,1% (v/v)-mercaptoetanolo, 1x cocktail inibitore della proteasi, 1g/mL microcystin-LR e 0,5 mM di fluorofosofato di diisopillo (DIFP).
NOTA: Gli autori utilizzano abitualmente un prodotto privo di EDTA, ma dovrebbe funzionare anche un cocktail con inibitore della proteasi contenente EDTA. Il buffer di lisi può essere effettuato in anticipo senza il mercaptoetanolo, gli inibitori della proteasi, la microcistina-LR e la DIFP, e conservato a 4 gradi centigradi fino all'uso. Assicurarsi che gli inibitori di proteasi, la microcistina-LR e la DIFP vengano aggiunti solo immediatamente prima dell'uso.
NPITA': DIFP è tossico e deve essere maneggiato con cura in una cappa di fumi a seguito della valutazione locale dei rischi per la salute e la sicurezza. DIFP può essere aggiunto al buffer di lisi e utilizzato immediatamente. In alternativa, il buffer di lisi completo contenente tutti gli altri componenti, incluso DIFP, può essere rivestito a -80 gradi centigradi per un uso successivo per almeno 4 settimane.
2. Isolamento dei neutrofili dal sangue intero
- Raccogliere 10 mL di sangue in un tubo di raccolta del sangue. Mescolare delicatamente invertendo i tubi 7-8x.
- Trasferire 10 mL di sangue in un tubo conico da 50 mL.
- Aggiungere al sangue 100 l di soluzione EDTA Stock Solution 1. Mescolare delicatamente.
- Aggiungete 500 l del cocktail di isolamento (50 l/mL) dal kit di isolamento dei neutrofili (Tabella dei materiali) all'intero campione di sangue.
- Vorticare le perle magnetiche dal kit di isolamento neutrofilo per 30 s prima dell'uso al fine di risospendere le perline magnetiche molto fini.
- Aggiungere 500 l di perline magnetiche al campione di sangue e mescolare delicatamente invertendo il tubo più volte.
- Incubare a temperatura ambiente (RT) per 5 min.
- Riempire il tubo a 50 mL con EDTA Stock Solution 2. Mescolare con molto delicatamente pipetting su e giù 2-3x.
- Posizionare il tubo nel magnete e rimuovere il coperchio per evitare la successiva agitazione del tubo.
- Incubare per 10 min a RT.
- Attentamente pipetta la sospensione cellulare arricchita che contiene i neutrofili in un nuovo tubo conico 50 mL.
NOTA: Non toccare il lato del tubo che è in contatto con il magnete ed evitare la raccolta e la perturbazione dei globuli rossi nella parte inferiore del tubo. Lasciare circa 10 mL della sospensione del globulo rosso dietro nella parte inferiore del tubo. - Vorticare le perline magnetiche per 30 s prima dell'uso e aggiungere 0,5 mL delle perline magnetiche al tubo contenente i neutrofili arricchiti. Mescolare delicatamente invertendo il tubo.
- Incubare a RT per 5 min.
- Posizionare il tubo nel magnete e rimuovere il coperchio per evitare agitazioni successive.
- Incubare a RT per 5 min.
- Attentamente pipetta la sospensione cellulare arricchita che contiene i neutrofili in un nuovo tubo conico 50 mL.
NOTA: Non toccare il lato del tubo che è a contatto con il magnete. Lasciare circa 5 mL della sospensione nella parte inferiore del tubo. - Per garantire la completa rimozione delle perline magnetiche dalla miscela cellulare, posizionare il tubo contenente le cellule arricchite nel magnete.
- Incubare per 10 min a RT.
- Attentamente pipetta la sospensione cellulare arricchita che ora contiene neutrofili puri in un nuovo tubo conico 50 mL.
NOTA: Non toccare il lato del tubo che è a contatto con il magnete. Lasciare circa 5 mL della sospensione nella parte inferiore del tubo. - Mescolare le celle isolate con 1 mM EDTA Stock Solution 2 ad un volume finale di circa 41 mL. Pipette su e giù per mescolare.
- Dividere la soluzione equamente in due tubi con circa 20 mL in ogni tubo.
- Centrifuga entrambi i tubi a 335 x g per 5 min.
- Durante questa centrifuga estraendo il congelatore MLi-2 dell'inibitore (concentrazione di 200 m/1.000x) dal congelatore a -80 gradi centigradi e lasciare a RT per un uso successivo.
- Immediatamente dopo la fase di centrifugazione e senza agitazione dei tubi, versare il supernatante senza disturbare i pellet neutrofili. Risospendere ogni pellet cellulare in 10 mL di colture cellulari (Tabella dei materiali) a RT con il pipettaggio dolce delle cellule su e giù 4x.
3. Trattamento dell'inibitore della chinasi LRRK2 dei neutrofili puri
- Etichettare un tubo "DMSO" e l'altro tubo "MLi-2".
- Al tubo etichettato "DMSO", aggiungere 10 L di DMSO e mescolare delicatamente convogliando su e giù 2x con una pipetta da 10 mL. Al tubo con etichetta "MLi-2", aggiungere 10 o L di 200 MLi-2 soluzione stock (concentrazione finale 200 nM) e mescolare delicatamente pipettando su e giù 2x con una pipetta da 10 mL.
- Incubare i campioni per 30 min a RT. Mescolare delicatamente per inversione ogni 10 min durante l'incubazione.
- Durante il periodo di incubazione, rimuovere lo stock DIFP da 0,5 M dal congelatore -80 gradi e posizionarlo in una cappa di fumi sul ghiaccio. Rimuovere 1 soluzione di riserva di microcistina-LR mg/mL dal congelatore -80 gradi centigradi e lasciare scongelare rt. Togliere dal congelatore un'aliquota (0,25 mL) del buffer di lisi, lasciarlo scongelare a RT, quindi posizionarlo sul ghiaccio per un uso successivo.
- Preparare 1 mL di supporto di coltura cellulare contenente 1 OL di DMSO e chiamare questo buffer di sospensione DMSO. Preparare 1 mL di supporti RPMI contenenti 1 L L di 200 MLi-2 e chiamare questo buffer di sospensione MLi-2.
- Dopo il periodo di incubazione di 30 min, centrifugare entrambi i tubi a 335 x g per 5 min.
- Scartare con cura il supernatante in ogni tubo senza disturbare il pellet di neutrofilino.
- Per il campione etichettato DMSO resospendere delicatamente il pellet in 1 mL del buffer di sospensione DMSO e per il tubo etichettato MLi-2, risospendere il pellet in 1 mL del buffer di sospensione MLi-2.
- Trasferire i pellet cellulari risospesi nei corrispondenti tubi di centrifugazione etichettati "DMSO" e "MLi-2" e centrifugare entrambi i tubi a 335 x g per 3 min.
- Durante la fase di centrifugazione, preparare il buffer di lisi. Nel cofano del fume aggiungere con attenzione 0,25 l di 0,5 M di soluzione DIFP e 0,25 L di 1 mg/mL microcistina-LR al buffer di lisi da 0,25 mL. Mescolare e lasciare sul ghiaccio fino all'uso.
NOTA: Aggiungere DIFP al buffer di lisi entro 15 min di lisi cellulare, perché DIFP è relativamente instabile in una soluzione acquosa. - Subito dopo la centrifugazione, rimuovere con attenzione e completamente tutti i supernatali con una pipetta senza disturbare il pellet di neutrofilino e posizionare i tubi sul ghiaccio.
- Aggiungere immediatamente 100 l di tampone di lisi contenente DIFP e microcistina-LR ad ogni tubo. Utilizzando una pipetta da 100-200 gradi, sospendere i pellet cellulari conilando su e giù circa 5-10x.
- Liscile le cellule sul ghiaccio per 10 min.
- Centrifuga tubi a 20.000 x g per 15 min a 4 gradi centigradi per rimuovere i detriti cellulari.
- Trasferire i supernatanti "DMSO" e "MLi-2" contenenti i lismi neutrofili in nuovi tubi di centrifugazione. Scartare il pellet di detriti.
NOTA: I lisati neutrofili sono ora pronti per l'uso o possono essere congelati in azoto liquido e conservati a -80 gradi centigradi per analisi future.
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Representative Results
Il nostro saggio permette di interrogare l'attivazione della chinasi LRRK2 associata alla PD nei neutrofili del sangue periferici umani con la fosforo laphorylazione Rab10 dipendente da LRRK2 come lettura. I neutrofili sono una popolazione omogenea e abbondante di globuli bianchi periferici che esprime alti livelli di proteine LRRK2 e Rab10 (Figura 1). L'unica altra popolazione cellulare tra le restanti cellule mononucleari del sangue periferiche (PBMC) con un alto numero di copie di entrambe le proteine sono monociti, ma questi costituiscono solo il 2-12% dei globuli bianchi. Ciò indica che i neutrofili del sangue periferico sono una biomatrice più adatta per studiare il fosforo latorylazione Rab10 controllata da LRRK2.
Quando si isolano i neutrofili del sangue periferici da 10 mL di sangue con la nostra procedura, è stato ottenuto tra 0,5-0,75 mg di lisa tolle proteica totale per donatore (Figura 2A), che è sufficiente per un numero significativo di analisi immunoblot per le quali sono necessari solo 10 g per corsia gel. Mentre il controllo della purezza e della vitalità delle cellule non viene eseguito regolarmente, abbiamo dimostrato per tre donatori sani che la purezza dei neutrofili isolati è tra il 94 e il 98% e la fattibilità delle cellule -99%, come determinato dall'analisi della citometria del flusso utilizzando il CD66b-Fluor marcatore di neutrofilo isotiocista dell'isotoniamina e 4',6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride (DAPI) che colora la vitalità (Figura 2A).
Mentre l'obiettivo di questa pubblicazione è l'isolamento e l'elaborazione dei neutrofili dal sangue periferico e non l'analisi mediante gonfiore occidentale quantitativo, La figura 2B dimostra che l'anticorpo monoclonale MJFF-pRab10 che rileva specificamente il fosforo Rab10 alla treonina 73 ha rivelato segnali robusti nei campioni di neutrofilina, che sono stati marcatamente soppressi dal trattamento con un potente e specifico inibitore della chinasi LRRK2, in questo caso MLi-2.
I neutrofili contengono alti livelli di proteasi serine che possono influenzare la successiva analisi delle macchie occidentali. Mentre DIFP sopprime efficacemente l'elevata attività proteasi nei neutrofili, è una potente neurotossina organofossa e sarebbe auspicabile sostituirla con un inibitore della proteasi altrettanto efficace ma meno tossico, come il fluoride fenilmethylsulfonyl (PMSF). La Serba era ugualmente ben conservata quando DIFP è stato sostituito da PMSF ad una concentrazione di 2,5 mM (Figura 2C). Tuttavia, l'integrità della proteina LRRK2 è stata compromessa quando si utilizza il PMSF rispetto a DIFP, suggerendo che la proteina LRRK2 più grande è più suscettibile alla degradazione (Figura 2C).
Abbiamo dimostrato in precedenza che un'altra mutazione genica che causa la PD VPS35 D620N provoca l'iperattivazione della chinasi LRRK2 da un meccanismo ancora sconosciuto15. Neutrophils da tre persone con PD che ospita una mutazione eterozigous VPS35 D620N che causa la malattia sono stati isolati utilizzando il metodo descritto in questo articolo (Figura 3). I campioni di neutrofili provenienti da nove donatori sani sono stati isolati come controlli15. L'analisi dell'immunoblot usando l'anticorpo monoclonale MJFF-pRab10 dimostra un aumento significativo di 3 volte nella fosforolalazione Rab10 a Thr 73 nei neutrofili dei pazienti affetti da Parkinson con mutazione VPS35 D620N rispetto ai controlli. L'espressione totale della proteina Rab10 è simile in tutti i 12 campioni di neutrofilina.
Figura 1: Abbondanza di proteine LRRK2 e Rab10 nelle cellule immunitarie isolate dal sangue umano utilizzando dati disponibili pubblicamente sul database immprot (http://www.immprot.org)16. Il grafico mostra il numero di copie proteiche per cellula per LRRK2 e Rab10 in una gamma di cellule immunitarie del sangue periferiche, tra cui sottoinsiemi di cellule T, cellule B, monociti, cellule NK, cellule dendritiche, e i granulociti neutrofili, bacini e eosofili. Questa cifra è stata modificata da Fan etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: La caratterizzazione e l'analisi dei neutrofili del sangue periferici umani e l'importanza del DIFP per la prevenzione della degradazione proteolitica nei neutrofili. (A) I neutrofili sono stati isolati dall'intero sangue di tre donatori sani (A, B e C) che mostravano purezza, vitalità e resa proteica totale dopo lisi. (B) I neutrofili sono stati trattati con o senza inibitore della chinasi LRRK2 (MLi-2), poi sottoposti all'analisi quantitativa dell'immunoblot con gli anticorpi indicati tramite l'imaging a fluorescenza nel vicino infrarosso (NIR). (C) I neutrofili sono stati isolati da due donatori sani e trattati con 100 nM MLi-2 per 30 min. A e B sono stati modificati da Mir et al.15, mentre C è stato modificato da Fan et al.11. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Aumento dell'attività della via della chinasi lRRK2 nei pazienti affetti dal morbo di Parkinson con una mutazione eterozigeo VPS35 D620N. Neutrophils sono stati isolati da nove controlli sani non corrispondenti all'età e tre pazienti con PD con una mutazione eteroziggous VPS35 D620N che causa la malattia. Le cellule sono state trattate con o senza 200 nM MLi-2 per 30 min prima della lisi cellulare. (A) Un totale di 10 g di estratto di cellule intere sottoposto all'analisi quantitativa dell'immunoblot con gli anticorpi indicati tramite l'imaging a fluorescenza nel vicino infrarosso (NIR). Immunoblot sono stati quantificati per fosfo-Thr73 Rab10:total Rab10 ratio (B). I dati sono stati analizzati da ANOVA unidirezionale con il test di confronto multiplo di Tukey. Dati presentati come mezzi : SD; p < 0.0001. Questa cifra è stata modificata da Mir etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Compelling evidenze cliniche, genetiche e biochimiche indicano un ruolo importante per LRRK2 e in particolare la sua funzione di chinasi nella malattia di Parkinson7. Gli inibitori della chinasi LRRK2 sono stati sviluppati e stanno entrando negli studi clinici2,4,12. Come tale, è necessario sfruttare LRRK2 come biomarcatore per l'impegno con il bersaglio e per la stratificazione del paziente. Il nostro protocollo descrive un saggio robusto e facile per analizzare l'attivazione del percorso della chinasi LRRK2 come riflesso dalla fosforolalazione del suo substrato fisiologico Rab10 nel pool omogeneo di neutrofili del sangue periferici umani11,14. Per l'analisi mediante immunoblotting quantitativa, consigliamo vivamente l'uso di un anticorpo Rab10 fosforospecifico altamente selettivo (anticorpo monoclonale MJFF-pRab10)14,17.
Usiamo neutrofili umani perché costituiscono un sottoinsieme omogeneo di cellule del sangue periferiche che costituiscono la popolazione di leucociti dominante17,18. Ancora più importante, i neutrofili hanno anche alti livelli di espressione proteica di LRRK2 e del suo sottostato Rab10 (Figura 1)16. Al contrario, i restanti sottoinsiemi di leucociti che costituiscono il pool di PBMC sono eterogenei con espressione variabile e prevalentemente bassa di LRRK2 e Rab10. I monociti e le cellule dendritiche hanno alti livelli di espressione, ma sono bassi nell'abbondanza complessiva16.
Mentre si consiglia l'uso di tubi di raccolta del sangue EDTA vacutainer, un anticoagulante diverso da EDTA può essere utilizzato. Tuttavia, la presenza di EDTA è importante per le prestazioni del kit di isolamento dei neutrofili. Si consiglia pertanto di aggiungere EDTA all'intero campione di sangue in modo da raggiungere una concentrazione finale di 1 mM EDTA anche se viene utilizzato un anticoagulante alternativo. L'uso del kit di isolamento neutrofilo consente di purificare i neutrofili direttamente dall'intero sangue umano mediante la selezione immunomagnetica negativa in modo relativamente rapido e semplice. Il numero di magneti disponibili determina quanti campioni di sangue possono essere elaborati in parallelo. È facilmente fattibile isolare i neutrofili da un massimo di sei campioni di sangue in parallelo utilizzando sei magneti. Un potenziale inconveniente è il costo associato per i kit di isolamento neutrofia commerciale e il magnete richiesto. Sono stati descritti metodi alternativi per l'isolamento dei neutrofili dal sangue intero e si basano sulla separazione del gradiente di densità o sullo smistamento delle cellule attivate dalla fluorescenza (FACS), che presentano svantaggi significativi. Il primo è significativamente più tempo e lavoro intensivo e almeno nelle nostre mani non così affidabile ed efficiente. Quest'ultimo richiede una macchina FACS e dovrebbero essere introdotte ulteriori misure di manipolazione, tra cui l'esaurimento dei globuli rossi e la colorazione delle cellule, aggiungendo tempo al processo di isolamento delle cellule. Nel complesso, l'isolamento immunomagnetico è veloce, genera un campione altamente puro ed evita un'eccessiva manipolazione delle cellule. Per quanto riguarda l'elaborazione dei campioni, abbiamo dimostrato in precedenza che un ritardo tra la raccolta del sangue e l'isolamento dei neutrofili di almeno 24 h non comporta un cambiamento significativo o una variazione nell'esito del nostro saggio, che fornisce flessibilità per il futuro sfruttamento clinico11.
La procedura di isolamento dei neutrofili è molto facile. Si consiglia di vorticare le perline magnetiche prima di ogni utilizzo. È anche importante non disturbare il magnete una volta che il tubo è all'interno del magnete per evitare turbolenze e lo sloggiamento delle perline magnetiche. Neutrophils sono stati arricchiti in sospensione da diversi cicli di rimozione immunomagnetica di tutte le cellule indesiderate. Occorre prestare attenzione a non toccare il lato del tubo che è in contatto con il magnete e durante il primo giro di isolamento (passaggio 2.11) in modo da non perturare i globuli rossi nella parte inferiore del tubo. Dopo l'ultimo round di pipettatura delle sospensioni cellulari arricchite in un nuovo tubo conico (fase 2.24), i neutrofili sono immediatamente disponibili per l'elaborazione successiva. Se i neutrofili vengono utilizzati per valutare l'attività di LRRK2 nelle cellule, i neutrofili vengono quindi suddivisi in due lotti e dopo la pelletazione mediante centrifugazione, risospesi in un inibitore della chinasi LRRK2 (qui, MLi-2) o DMSO contenente il mezzo di coltura cellulare. Poiché la depfororylazione nella presenza e la reforfore in assenza di inibizione della chinasi LRRK2 sono eventi relativamente rapidi, occorre prestare attenzione per garantire che la frazione di neutrofilio trattata da MLi-2 rimanga esposta a un inibitore della chinasi LRRK2 (ad esempio, MLi-2) fino alla lisi cellulare (passaggi da 8 a 3,10).
Ci sono diverse fasi di centrifugazione in questo protocollo utilizzando tubi conici 15 e 50 mL. Mentre usiamo abitualmente le velocità di centrifugazione indicate nel protocollo, è possibile aumentare la velocità di centrifugafino fino a 400 x g senza influire negativamente sulla vitalità delle cellule. Ciò si traduce in un pellet di cellule neutrofili leggermente più solido che potrebbe contribuire a ridurre qualsiasi potenziale perdita di materiale neutrofilo durante la decantazione e la pipettatura fuori dai passaggi supernatali durante questo protocollo. Questo probabilmente aumenterà la resa in termini di lisato proteico totale ottenuto. Una potenziale preoccupazione è che una forza di centrifugazione superiore potrebbe attivare i neutrofili e potenzialmente influenzare l'analisi successiva. La nostra raccomandazione generale è quella di gestire i neutrofili in ogni fase del protocollo nel modo più dolce possibile.
Il nostro protocollo utilizza l'inibitore della proteasi serina altamente potente DIFP (0,5 mM) come parte del buffer di lisi neutrofi. La DIFP è una potente neurotossina organofosfora, e mentre abbiamo studiato composti alternativi, la sua aggiunta al buffer di lisi era essenziale per l'analisi del fosforolazione Rab10 controllata da LRRK2 nei neutrofili umani mediante immunoblotting. Ad esempio, la sostituzione di DIFP con 1% (w/v) SDS è stata utilizzata per il litilfio dei neutrofili in altri studi19 e ha portato a una significativa degradazione delle proteine nella misura in cui l'immunoblotting per LRRK2, Rab10 e anche il controllo del carico GAPDH non hanno prodotto un segnale, evidenziando così l'importanza di includere un inibitore della proteasi altamente potente nel buffer di lirusi (Figura 2C). Quando si sostituisce DIFP con l'inibitore della proteasi serina meno tossico PMSF a 2,5 mM, la fosporylazione Rab10 è stata ben conservata, ma la proteina LRRK2 più grande ha subito una degradazione significativa (Figura 2C). Al fine di ridurre al minimo la gestione della soluzione di stock DIFP, il buffer di lisi contenente DIFP può essere preparato in lotti, con aliquota e conservato a -20 gradi centigradi o -80 gradi centigradi. Per quanto riguarda l'analisi mediante immunoblotting quantitativa, è fondamentale utilizzare un anticorpo fosforospecifico che è stato dimostrato essere selettivo per una sola proteina Fosfolata Rab LRRK2, come l'anticorpo MJFF-pRab10 utilizzato per i nostri studi14.
Il protocollo può anche essere scalato utilizzando un volume massimo di sangue intero fino a 25 mL, che è il limite che può essere elaborato in una procedura di isolamento utilizzando un magnete, che è in grado di contenere tubi conici da 50 mL. Gli unici passaggi che richiedono regolazioni sono il passo 2.4 (aggiungendo 50 L di cocktail di isolamento per mL di sangue), i passi 2.6 e 2.12 (aggiungendo 50 L di perline magnetiche per mL di sangue), e un aumento proporzionato del volume del buffer di lisi per la lisi neutrofila nel passo 3.12. Tutti gli altri passaggi possono essere mantenuti identici.
In sintesi, il nostro protocollo descrive un metodo semplice e robusto per isolare i neutrofili umani dal sangue periferico. I neutrofili possono quindi essere trattati con e senza un potente e specifico inibitore della chinasi LRRK2 per consentire la quantificazione del fosforo lingo l'LRRK2 controllato da Rab10 in vivo. Questo può essere utile per stratificare gli individui secondo l'attività del percorso della chinasi LRRK2 e per identificare quelli con iperattivazione del percorso che potrebbero beneficiare del futuro trattamento dell'inibitore della chinasi LRRK2. Anche se questo sarà improbabile per la maggior parte delle persone con PD, in particolare PD idiopatica, il nostro saggio è già stato distribuito con successo in individui che portano una rara mutazione eterozigo in un altro gene associato alla PD, VPS35 D620N, dove l'attività del percorso della chinasi LRRK2 è significativamente aumentata da un meccanismo ancora sconosciuto15. In precedenza avevamo esaminato i livelli di fosforo larab 10 di LRRK2 controllati da LRRK2 in un piccolo numero di individui che trasportavano la più comune mutazione LRRK2 G2019S che è nota per attivare l'attività della chinasi LRRK2 solo modestamente di un fattore di circa due senza rilevare una differenza significativa rispetto ai controlli e ai pazienti con PD idiopatica con il nostro saggio11,14. Questi e altri dati inediti suggeriscono che l'attività della chinasi LRRK2 richiede probabilmente un aumento di >3x per produrre un risultato significativo utilizzando l'immunoblotting quantitativa. Tuttavia, la sensibilità per rilevare l'attivazione del percorso della chinasi LRRK2 potrebbe essere aumentata se si distribuisce una tecnologia di spettrometria di massa all'avanguardia.
Suggeriamo che i neutrofili siano una risorsa preziosa per la ricerca sul morbo di Parkinson nell'attività della chinasi LRRK2 e potrebbero aiutare a identificare gli individui che potrebbero beneficiare del futuro trattamento dell'inibitore della chinasi LRRK2.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo i volontari sani che hanno gentilmente donato sangue per il presente studio. Ringraziamo la Michael J. Fox Foundation for Parkinson's Research (MJFF) e la leadership dello studio Fox BioNet (FBN) per il loro sostegno e input verso il protocollo scritto e il video. Ringraziamo il professor Alexander simprich dell'Università di Vienna in Austria per aver testato il nostro protocollo e la nostra collaborazione. Apprezziamo i contributi di Paul Davies al progetto (direttore generale della PPU MRC). Riconosciamo anche l'eccellente supporto tecnico dei team MRC Protein Phosphorylation and Ubiquilation Unit (PPU), vale a dire Chemical Synthesis (Natalia Shpiro per la sintesi MLi-2), REagents and Services anticorpation (coordinato da Hilary McLauchlan e James Hastie). Ringraziamo Mhairi Towler e Fraser Murdoch di Vivomotion per il loro aiuto nella realizzazione di video e animazioni. Ringraziamo Steve Soave di 81 film per l'assistenza con le modifiche finali. Esther Sammler è sostenuta da una borsa di studio scozzese Senior Clinical Academic e ha ricevuto finanziamenti dal Parkinson nel Regno Unito (K-1706).
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1 mL Pipette tips | Sarstedt | 70.762 | or equivalent |
1.5 mL Micro tubes | Sarstedt | 72.690.001 | or equivalent |
10 mL Pipette tips | Sarstedt | 86.1254.025 | or equivalent |
10 μL Pipette tips | Sarstedt | 70.113 | or equivalent |
15 mL falcon tube | Cellstar | 188 271 | or equivalent |
200 μL Pipette tips | Sarstedt | 70.760.002 | or equivalent |
25 mL Pipette tips | Sarstedt | 86.1685.001 | or equivalent |
50 mL falcon tube | Cellstar | 227 261 | or equivalent |
BD Vacutainer Hemogard Closure Plastic K2-EDTA Tube | BD | BD 367525 | or equivalent |
Beckman Coulter Allegra X-15R centrifuge | Beckman | or equivalent centrifuge with swimging bucket rotator for 15 mL and 50 mL falcon tubes at speed 1000-1200 x g | |
Category 2 biological safety cabinet. | |||
cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
DIFP (Diisopropylfluorophosphate) | Sigma | D0879 | Prepare 0.5M stock solution in isopropanol using special precautions |
Dimethyl sulfoxide | Sigma | 6250 | |
Dry ice or liquid nitrogene | |||
Dulbecco's phosphate-buffered saline | ThermoFisher | 14190094 | or equivalent |
Easy 50 EasySep Magnet | Stemcell | 18002 | for holding 1 x 50ml conical tube |
EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit | Stemcell | 19666 | This contains Solutions called “Isolation Cocktail” and “RapidSpheres magnetic beads |
EGTA | Sigma | E3889 | |
Eppendorf centrifuge 5417R centrifuge | Eppendorf | ||
Ethanol, in spray bottle | |||
Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | E6758 | |
Ice | |||
Isopropanol (anhydrous grade) | Sigma | 278475 | |
Lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1%(v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF, 10 mM β-glycerophosphate, 5 mM sodium pyrophosphate, 0.27 M sucrose, 0.1% (v/v) β-mercaptoethanol, 1x cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail (Roche), 1 μg/ml Microcystin-LR, 0.5 mM diisopropylfluorophosphate (DIFP). | alternatively frozen lysis buffer in aliquots without Microcystin-LR, DIFP available from MRC-PPU Reagents (http://mrcppureagents.dundee.ac.uk/) | ||
Merck LRRK2 inhibitor II (MLi-2) | Merck | 438194-10MG | or equivalent (potent and selective LRRK2 inhinitor) |
Microcystin-LR | Enzo Life Sciences | ALX-350-012-M001 | 1 mg/ml stock in DMSO and store at -80 oC. |
Na3VO4 | Aldrich | 450243 | |
NaF | Sigma | S7920 | |
Odyssey CLx scan Western Blot imaging system | Odyssey | ||
Permanent marker pen | |||
Personal protection equipment | |||
RPMI 1640 Medium | ThermoFisher | 21875034 | or equivalent |
sodium pyrophosphate | Sigma | S22 | |
sucrose | Sigma | S0389 | |
β-glycerophosphate | Sigma | 50020 | |
β-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
Suggested antibodies for Western blotting | |||
Anti-RAB10 (phospho T73) antibody [MJF-R21] | abcam | ab230261 | |
Anti-α-tubulin | Cell Signaling Technologies | 5174 | used at 1:2000 dilution |
Goat anti-mouse IRDye 680LT | LI-COR | 926-68020 | used at 1:10,000 dilution |
Goat anti-mouse IRDye 800CW | LI-COR | 926-32210 | used at 1:10,000 dilution |
Goat anti-rabbit IRDye 800CW | LI-COR | 926-32211 | used at 1:10,000 dilution |
MJFF-total Rab10 mouse antibody | generated by nanoTools (nanotools.de) | not applicable* | used at 2 μg/ml final concentration; * The MJFF-total Rab10 antibody generated by nanoTools (www.nanotools.de) [11] will be commercialised by the Michael J Fox Foundation in 2018 |
Mouse anti-LRRK2 C-terminus antibody | Antibodies Incorporated | 75-253 | used at 1 μg/ml final concentration |
pS935-LRRK2 | MRC PPU Reagents and Services | UDD2 | used at 1 μg/ml final concentration |
References
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