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Biochemistry

Aislamiento de Neutrófilos de Sangre Periférica Humana para Interrogar la Vía de Kinasa LRRK2 Asociada al Parkinson mediante la evaluación de la fosforilación de Rab10

Published: March 21, 2020 doi: 10.3791/58956
Automatic Translation
*1, *1, 2, 2, 2, 3, 4, 5, 1, 1,6
1MRC Protein Phosphorylation and Ubiquitylation Unit, School of Life Sciences, University of Dundee, 2The Michael J. Fox Foundation for Parkinson's Research, 3Department of Medical and Molecular Genetics, Indiana University School of Medicine, 4Morton and Gloria Shulman Movement Disorders Centre and the Edmond J. Safra Program in Parkinson's Disease, Toronto Western Hospital, University of Toronto, 5Division of Cell Signalling and Immunology, School of Life Sciences, University of Dundee, 6Division of Molecular and Clinical Medicine, School of Medicine, Ninewells Hospital and Medical School, University of Dundee
* These authors contributed equally

Summary

Las mutaciones en el gen de la quinasa 2 de la leucina rica causan la enfermedad de Parkinson hereditaria. Hemos desarrollado un método fácil y robusto para evaluar la fosforilación controlada por LRRK2 de Rab10 en neutrófilos de sangre periférica humana. Esto puede ayudar a identificar a las personas con aumento de la actividad de la vía de la quinasa LRRK2.

Abstract

La quinasa de repetición rica en leucina 2 (LRRK2) es el gen mutado con más frecuencia en la enfermedad hereditaria de Parkinson (PD) y todas las mutaciones patógenas de LRRK2 resultan en la hiperactivación de su función quinasa. Aquí, describimos un ensayo fácil y robusto para cuantificar la actividad de la vía quinasa LRRK2 en neutrófilos de sangre periférica humana midiendo la fosforilación controlada por LRRK2 de uno de sus sustratos fisiológicos, Rab10 en la threonina 73. El análisis de inmunoblotting descrito requiere un anticuerpo totalmente selectivo y fosfoespecífico que reconozca el epítopeno Rab10 Thr73 fosforilado por LRRK2, como el anticuerpo monoclonal de conejo MJFF-pRab10. Utiliza neutrófilos de sangre periférica humana, porque la sangre periférica es fácilmente accesible y los neutrófilos son un componente abundante y homogéneo. Es importante destacar que los neutrófilos expresan niveles relativamente altos de LRRK2 y Rab10. Un inconveniente potencial de los neutrófilos es su alta actividad intrínseca de proteasa de serina, que requiere el uso de inhibidores de la proteasa muy potentes como la neurotoxina organofosfora diisopropilfluorofosfato (DIFP) como parte del tampón de lisis. Sin embargo, los neutrófilos son un recurso valioso para la investigación de la actividad in vivo de la vía quinasa LRRK2 y deben considerarse para su inclusión en las colecciones de biorrepositorios de DP.

Introduction

Los intentos de reducir o detener la enfermedad de Parkinson (PD) han fracasado hasta ahora. El descubrimiento de mutaciones hiperactivadoras en la quinasa repetitiva rica en leucina 2 (LRRK2) que causan y/o aumentan el riesgo de DP ha llevado al desarrollo de inhibidores de la quinasa LRRK21,,2,,3. Estos han entrado ahora en ensayos clínicos4. La función exacta de LRRK2 no está clara, pero un avance importante ha sido la identificación de un subconjunto de proteínas Rab GTPase, incluyendo Rab10, como los primeros sustratos fisiológicos de buena fe de la quinasa LRRK25,,6,7. Los principales desafíos en la era de las terapias modificadoras de la enfermedad son los marcadores bioquímicos del estado de activación de la quinasa LRRK2 y la participación objetivo de los inhibidores de la quinasa LRRK2.

Hasta ahora, el principal marcador farmacocinético de los inhibidores de LRRK2 in vivo ha sido un grupo de residuos de serina fosforilada constitutivamente de LRRK2, en particular la serina 935, que se desfosforilan en respuesta a diversos inhibidores de LRRK28,9. Sin embargo, la fosforilación de la serina 935 no se correlaciona con la actividad celular intrínseca de la quinasa LRRK2 porque no está fosforilada directamente por LRRK2 y sigue fosforiladaendo en LRRK210inactivo para la quinasa. La actividad de la quinasa LRRK2 se correlaciona bien con la autofosforilación de la serina 1292, pero en términos prácticos no es una lectura adecuada para la actividad endógena de la quinasa LRRK2 mediante el análisis de inmunoblot de extractos de células enteras debido a la falta actual de anticuerpos fiables y fosfoespecíficos para este sitio10,11.

Hemos desarrollado un ensayo robusto y fácil para cuantificar la actividad de la vía de la quinasa LRRK2 en células sanguíneas periféricas humanas que mide la fosforilación controlada por LRRK2 de su diana fisiológica Rab10 en la threonina 7311. La sangre periférica es fácilmente accesible por venesection, que es un procedimiento rápido y de bajo riesgo que causa un mínimo malestar. Nos centramos en los neutrófilos de sangre periférica humana porque constituyen una población abundante (37-80% de todos los glóbulos blancos) y células homogéneas que expresa niveles relativamente altos de LRRK2 y Rab1011. Además, los neutrófilos de sangre periférica pueden aislarse de forma rápida y eficiente mediante el empleo de un enfoque negativo inmunomagnético. Para garantizar que la posterior fosforilación Rab10 observada sea mediada por LRRK2, cada lote de neutrófilos se incuba con o sin un inhibidor potente y selectivo de la quinasa LRRK2 (utilizamos y recomendamos MLi-2)2,12. Esto es seguido por la lisis celular en un tampón que contiene el inhibidor de la proteasa diisopropilo fluorofosfato (DIFP), que es necesario para suprimir la actividad intrínseca de la proteasa de serina que se sabe que es alta en neutrófilos13. Para el análisis final mediante inmunoblotting cuantitativo, recomendamos utilizar el anticuerpo monoclonal de conejo MJFF-pRab10 que detecta específicamente el Rab10 Thr73-fosfoepitope y no reacciona cruzadamente con otras proteínas Rab fosforiladas14. La selectividad y especificidad de este anticuerpo ha sido validada en modelos de sobreexpresión de diferentes proteínas Rab y una línea celular de nocaut A549 Rab1014. Por lo tanto, medimos la diferencia en la fosforilación de Rab10 en los lisatos de neutrófilos que han sido tratados con y sin un inhibidor potente y selectivo de la quinasa LRRK22. Alternativamente, las muestras también podrían ser analizadas por otros métodos, como la espectrometría cuantitativa de masas.

En conclusión, la fosforilación Rab10 controlada por LRRK2 es un marcador superior de la actividad de quinasa LRRK2 a la fosforilación LRRK2 en la serina 935 y los neutrófilos de sangre periférica humana son un recurso valioso para la investigación de DP en LRRK2. Nuestro protocolo proporciona un ensayo robusto y fácil para interrogar la actividad de la vía LRRK2 en neutrófilos de sangre periférica y permite la estratificación bioquímica de individuos con mayor actividad quinasa LRRK215. Es importante destacar que estos individuos pueden beneficiarse del futuro tratamiento con inhibidores de la quinasa LRRK2.

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Protocol

Según la normativa local del Reino Unido, todas las manipulaciones y pipeteos de sangre humana se llevan a cabo en un gabinete de seguridad biológica de categoría 2. Todos los procedimientos se llevaron a cabo de conformidad con la junta local de revisión ética y todos los participantes han dado su consentimiento informado.

1. Preparación

  1. Preparar 0,1 ml de EDTA Stock Solution 1 que contiene 100 mM edtA en solución salina con búfer de fosfato (PBS).
  2. Preparar 60 mL de EDTA Stock Solution 2 que contiene 1 mM de EDTA en PBS.
  3. Preparar el tampón de lisis que contenga 50 mM Tris-HCl (pH a 7,5), 1% (v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF, 10 mM de glicerofosfato, 5 mM de pirofosfato sódico, 0,27 M de sacarosa, 0,1% (v/v) de é-mercaptoetanol, 1 cóctel inhibidor de la proteasa, 1 g/ml de microcistocina-LR y 0,5 mM de diisopropilFP(DI).
    NOTA: Los autores utilizan habitualmente un producto libre de EDTA, pero un cóctel inhibidor de proteasa que contiene EDTA también debe funcionar. El tampón de lisis se puede hacer de antemano sin el é-mercaptoetanol, inhibidores de la proteasa, microcistina-LR y DIFP, y se almacena a 4 oC hasta su uso. Asegúrese de que el é-mercaptoetanol, los inhibidores de la proteasa, la microcistina-LR y el DIFP solo se añaden inmediatamente antes de su uso.
    ADVERTENCIA: El DIFP es tóxico y debe manipularse con cuidado en una campana de humos después de la evaluación local del riesgo de salud y seguridad. DIFP se puede agregar al búfer de lisis y utilizarse inmediatamente. Alternativamente, el tampón de lisis completo que contiene todos los demás componentes, incluyendo DIFP, se puede alicite y se almacene a -80 oC para su uso posterior durante al menos 4 semanas.

2. Aislamiento de neutrófilos de sangre entera

  1. Recoger 10 ml de sangre en un tubo de recolección de sangre. Mezcle suavemente invirtiendo tubos de 7 x 8x.
  2. Transfiera 10 ml de sangre a un tubo cónico de 50 ml.
  3. Añadir 100 l de EDTA Stock Solution 1 a la sangre. Mezclar suavemente.
  4. Añadir 500 l del cóctel de aislamiento (50 l/ml) desde el kit de aislamiento de neutrófilos(Tabla de materiales)a toda la muestra de sangre.
  5. Vortex las perlas magnéticas del kit de aislamiento de neutrófilos durante 30 s antes de su uso con el fin de resuspender las cuentas magnéticas muy finas.
  6. Añadir 500 s de las perlas magnéticas a la muestra de sangre y mezclar suavemente invirtiendo el tubo varias veces.
  7. Incubar a temperatura ambiente (RT) durante 5 min.
  8. Llene el tubo a 50 ml con EDTA Stock Solution 2. Mezclar pipeteando muy suavemente hacia arriba y hacia abajo 2-3x.
  9. Coloque el tubo en el imán y retire la tapa para evitar la agitación posterior del tubo.
  10. Incubar durante 10 min a RT.
  11. Pipetear cuidadosamente la suspensión celular enriquecida que contiene los neutrófilos en un nuevo tubo cónico de 50 ml.
    NOTA: No toque el lado del tubo que está en contacto con el imán y evite la recolección y perturbación de los glóbulos rojos en la parte inferior del tubo. Deje aproximadamente 10 ml de la suspensión de glóbulos rojos en la parte inferior del tubo.
  12. Vortex las perlas magnéticas durante 30 s antes de su uso y añadir 0,5 ml de las cuentas magnéticas al tubo que contiene los neutrófilos enriquecidos. Mezcle suavemente invirtiendo el tubo.
  13. Incubar a RT durante 5 min.
  14. Coloque el tubo en el imán y retire la tapa para evitar agitación posterior.
  15. Incubar a RT durante 5 min.
  16. Pipetear cuidadosamente la suspensión celular enriquecida que contiene los neutrófilos en un nuevo tubo cónico de 50 ml.
    NOTA: No toque el lado del tubo que está en contacto con el imán. Dejar aproximadamente 5 ml de la suspensión en la parte inferior del tubo.
  17. Para asegurar la eliminación completa de las perlas magnéticas de la mezcla celular, coloque el tubo que contiene las células enriquecidas en el imán.
  18. Incubar durante 10 min a RT.
  19. Pipetear cuidadosamente la suspensión celular enriquecida que ahora contiene neutrófilos puros en un nuevo tubo cónico de 50 ml.
    NOTA: No toque el lado del tubo que está en contacto con el imán. Dejar aproximadamente 5 ml de la suspensión en la parte inferior del tubo.
  20. Mezcle las células aisladas con 1 mM EDTA Stock Solution 2 a un volumen final de aproximadamente 41 ml. Pipetear hacia arriba y hacia abajo para mezclar.
  21. Divida la solución por igual en dos tubos con aproximadamente 20 ml en cada tubo.
  22. Centrifugar ambos tubos a 335 x g durante 5 min.
  23. Durante esta centrifugación, salte el congelador de -80 oC y deje en RT para su uso posterior.
  24. Inmediatamente después del paso de centrifugación y sin agitación de los tubos, vierta el sobrenadante sin molestar los pellets de neutrófilos. Resuspenda cada pellet celular en 10 ml de medios de cultivo celular(Tabla de materiales)en RT pipeteando suavemente las células arriba y abajo 4veces.

3. Tratamiento del inhibidor de la quinasa LRRK2 de neutrófilos puros

  1. Etiqueta un tubo "DMSO" y el otro tubo "MLi-2".
  2. En el tubo etiquetado "DMSO", agregue 10 ml de DMSO y mezcle suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo 2 veces con una pipeta de 10 ml. En el tubo etiquetado "MLi-2", añadir 10 ml de solución de material MLi-2 de 200 MM (concentración final 200 nM) y mezclar suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo 2 veces con una pipeta de 10 ml.
  3. Incubar las muestras durante 30 minutos a RT. Mezclar suavemente mediante la inversión cada 10 minutos durante la incubación.
  4. Durante el período de incubación, retire el material DE 0,5 M de DIFP del congelador de -80 oC y colóquelo en una campana de humos sobre hielo. Retire la solución de material de microcistina-LR de 1 mg/ml del congelador de -80 oC y déjela en RT para descongelar. Saque una alícuota (0,25 ml) del tampón de lisis fuera del congelador, permita que se descongele en RT y, a continuación, colóquela en hielo para su uso posterior.
  5. Prepare 1 ml de medio de cultivo celular que contenga 1 l de DMSO y llame a este búfer de resuspensión DMSO. Prepare 1 ml de medios RPMI que contengan 1 l de 200 MLi-2 y llame a este búfer de resuspensión MLi-2.
  6. Después del período de incubación de 30 minutos, centrifugar ambos tubos a 335 x g durante 5 min.
  7. Deseche cuidadosamente el sobrenadante en cada tubo sin alterar el pellet de neutrófilos.
  8. Para la muestra etiquetada DMSO resuspende suavemente el pellet en 1 ml del tampón de reparación DMSO y para el tubo etiquetado MLi-2, resuspende el pellet en 1 ml del tampón de resuspensión MLi-2.
  9. Transfiera los gránulos de células resuspendidos a los correspondientes tubos de centrifugación etiquetados como "DMSO" y "MLi-2" y centrifugar ambos tubos a 335 x g durante 3 min.
  10. Durante el paso de centrifugación, prepare el tampón de lisis. En la campana de humos agregue cuidadosamente 0,25 ml de solución de DIFP de 0,5 M, así como 0,25 ml de microcistina-LR de 1 mg/ml al búfer de lisis de 0,25 ml. Mezclar y dejar sobre hielo hasta su uso.
    NOTA: Agregue DIFP al búfer de lisis dentro de los 15 minutos de lisis celular, porque DIFP es relativamente inestable en una solución acuosa.
  11. Inmediatamente después de la centrifugación, retire cuidadosamente y completamente todo el sobrenadante con una pipeta sin molestar el pellet de neutrófilos y coloque los tubos sobre hielo.
  12. Añadir inmediatamente 100 l de tampón de lisis que contenga DIFP y microcistina-LR a cada tubo. Usando una pipeta de 100–200 l, resuspende los gránulos celulares pipeteando hacia arriba y hacia abajo alrededor de 5-10x.
  13. Lisia las células sobre hielo durante 10 min.
  14. Tubos centrífugos a 20.000 x g durante 15 min a 4oC para eliminar los restos celulares.
  15. Transfiera los sobrenadores "DMSO" y "MLi-2" que contienen los lisados de neutrófilos a nuevos tubos centrífugos. Deseche el pellet de escombros.
    NOTA: Los lisados de neutrófilos ya están listos para su uso o se pueden congelar a presión en nitrógeno líquido y almacenarse a -80 oC para su análisis futuro.

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Representative Results

Nuestro ensayo permite interrogar la activación de la quinasa LRRK2 asociada a la PD en neutrófilos de sangre periférica humana con la fosforilación Rab10 dependiente de LRRK2 como una lectura. Los neutrófilos son una población homogénea y abundante de glóbulos blancos periféricos que expresa altos niveles de proteínas LRRK2 y Rab10(Figura 1). La única otra población celular entre las células mononucleares de sangre periférica restantes (PPBCD) con un alto número de copias de ambas proteínas son los monocitos, pero estos sólo producen entre el 2 y el 12% de los glóbulos blancos. Esto indica que los neutrófilos de sangre periférica son una biomatriz más adecuada para estudiar la fosforilación Rab10 controlada por LRRK2.

Al aislar neutrófilos de sangre periférica a partir de 10 ml de sangre con nuestro procedimiento, se obtuvieron entre 0,5-0,75 mg de lisato proteico total por donante(Figura 2A),lo que es suficiente para un número significativo de análisis de inmunoblot para los que sólo se requieren 10 g por carril de gel. Mientras que la comprobación de la pureza y viabilidad de las células no se realiza rutinariamente, demostramos para tres donantes sanos que la pureza de los neutrófilos aislados está entre 94-98% y la viabilidad de las células -99% según lo determinado por el análisis de citometría de flujo utilizando el marcador de neutrófilos de isotiocianato CD66b-Fluorescein y 4',6-Diamidina-2'-fenilindole de tinción para la viabilidad (Figura 2A).

Si bien el enfoque de esta publicación es el aislamiento y procesamiento de neutrófilos de la sangre periférica y no el análisis por hincha occidental cuantitativa, La Figura 2B demuestra que el anticuerpo monoclonal MJFF-pRab10 que detecta específicamente Rab10 fosforilado en treonina 73 reveló señales robustas en las muestras de neutrófilos, que fueron marcadamente suprimidas por el tratamiento con un potente y específico inhibidor de la quinasa LRRK2, en este caso MLi-2.

Los neutrófilos contienen altos niveles de proteasas de serina que pueden afectar el análisis posterior de la mancha occidental. Mientras que la DIFP suprime eficazmente la actividad de alta proteasa en neutrófilos, es una potente neurotoxina organofosfora y sería deseable reemplazarla con un inhibidor de la proteasa igualmente eficaz pero menos tóxico, como el fluoruro de fenilmetilsulfonil (PMSF). Encontramos que la fosforilación de Rab10 estaba igualmente bien conservada cuando el DIFP fue reemplazado por PMSF a una concentración de 2,5 mM(Figura 2C). Sin embargo, la integridad de la proteína LRRK2 se vio comprometida cuando se utiliza PMSF en comparación con DIFP, lo que sugiere que la proteína LRRK2 más grande es más susceptible a la degradación(Figura 2C).

Hemos demostrado previamente que otra mutación genética causante de LA PD VPS35 D620N da lugar a la hiperactivación de la quinasa LRRK2 por un mecanismo aún desconocido15. Los neutrófilos de tres personas con DP que albergan una mutación heterocigotoVPS35 D620N causante de enfermedades se aislaron utilizando el método descrito en este artículo(Figura 3). Las muestras de neutrófilos de nueve donantes sanos se aislaron como controles15. El análisis de inmunoblot utilizando el anticuerpo monoclonal MJFF-pRab10 demuestra un aumento significativo de 3 veces en la fosforilación de Rab10 a 73 de thr en neutrófilos de pacientes con Parkinson con una mutación VPS35 D620N en comparación con los controles. La expresión total de la proteína Rab10 es similar en las 12 muestras de neutrófilos.

Figure 1
Figura 1: Abundancia de proteínas LRRK2 y Rab10 en células inmunitarias aisladas de la sangre humana utilizando datos que están disponibles públicamente en la base de datos de immprot (http://www.immprot.org)16. El gráfico muestra el número de copias de proteínas por célula para LRRK2 y Rab10 en una gama de células inmunitarias de sangre periférica, incluyendo subconjuntos de células T, células B, monocitos, células NK, células dendríticas, y los neutrófilos granulocitos, basófilos y eosinófilos. Esta cifra ha sido modificada de Fan et al.11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Caracterización y análisis de neutrófilos de sangre periférica humana e importancia de DIFP para la prevención de la degradación proteolítica en neutrófilos. (A) Los neutrófilos fueron aislados de toda la sangre de tres donantes sanos (A, B y C) mostrando pureza, viabilidad y rendimiento total de proteínas después de la lisis celular. (B) Los neutrófilos fueron tratados con o sin inhibidor de la quinasa LRRK2 (MLi-2), luego lysed y sometidos a análisis cuantitativo de inmunoblot con los anticuerpos indicados a través de imágenes de fluorescencia de infrarrojo cercano (NIR). (C) Los neutrófilos fueron aislados de dos donantes sanos y tratados con 100 nM MLi-2 durante 30 minutos. A y B han sido modificados de Mir et al.15, mientras que C ha sido modificado de Fan et al.11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Aumento de la actividad de la vía quinasa LRRK2 en pacientes con enfermedad de Parkinson que albergan una mutación heterocigeosa VPS35 D620N. Los neutrófilos se aislaron de nueve controles saludables no coincidentes con la edad y tres pacientes con DP con una mutación heterocigota VPS35 D620N causante de la enfermedad. Las células fueron tratadas con o sin 200 nM MLi-2 durante 30 minutos antes de la lisis celular. (A) Un total de 10 g de extracto de células enteras sometidos a análisis cuantitativode inmunoblot con los anticuerpos indicados a través de imágenes de fluorescencia de infrarrojo cercano (NIR). Los inmunoblots se cuantificaron para la relación fosfo-Thr73 Rab10:total Rab10 (B). Los datos fueron analizados por ANOVA unidireccional con la prueba de comparación múltiple de Tukey. Datos presentados como medios : SD; p < 0.0001. Esta cifra ha sido modificada de Mir et al.15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

La evidencia clínica, genética y bioquímica convincente apunta hacia un papel importante para LRRK2 y, en particular, su función quinasa en la enfermedad de Parkinson7. Se han desarrollado inhibidores de la quinasa LRRK2 que están entrando en ensayos clínicos2,4,12. Como tal, es necesario explotar LRRK2 como biomarcador para la participación objetivo, así como la estratificación del paciente. Nuestro protocolo describe un ensayo robusto y fácil para analizar la activación de la vía quinasa LRRK2 como lo refleja la fosforilación de su sustrato fisiológico Rab10 en el grupo homogéneo de neutrófilos de sangre periférica humana11,14. Para el análisis mediante inmunoblotting cuantitativo, recomendamos encarecidamente el uso de un anticuerpo Rab10 fosfoespecífico altamente selectivo (anticuerpo monoclonal MJFF-pRab10)14,17.

Utilizamos neutrófilos humanos porque constituyen un subconjunto homogéneo de células sanguíneas periféricas que conforman la población dominante de leucocitos17,,18. Más importante aún, los neutrófilos también tienen altos niveles de expresión proteica de LRRK2 y su subestado Rab10 (Figura 1)16. Por el contrario, los subconjuntos restantes de leucocitos que componen el grupo de PBMC son heterogéneos con una expresión variable y predominantemente baja de LRRK2 y Rab10. Los monocitos y las células dendríticas tienen altos niveles de expresión, pero son bajos en abundancia general16.

Si bien recomendamos el uso de tubos de recolección de sangre EDTA vacutainer, se puede utilizar un anticoagulante distinto de EDTA. Sin embargo, la presencia de EDTA es importante para el rendimiento del kit de aislamiento de neutrófilos. Por lo tanto, recomendamos añadir EDTA a toda la muestra de sangre para que se alcance una concentración final de 1 mM EDTA incluso si se utiliza un anticoagulante alternativo. El uso del kit de aislamiento de neutrófilos permite purificar a los neutrófilos directamente de la sangre entera humana mediante la selección negativa inmunomagnética de una manera relativamente rápida y fácil. El número de imanes disponibles determina cuántas muestras de sangre se pueden procesar en paralelo. Es fácilmente factible aislar a los neutrófilos de hasta seis muestras de sangre en paralelo utilizando seis imanes. Un inconveniente potencial es el costo asociado para los kits de aislamiento de neutrófilos comerciales y el imán requerido. Se han descrito métodos alternativos para el aislamiento de neutrófilos de sangre entera y se basan en la separación de gradientes de densidad o la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), que tienen inconvenientes significativos. El primero es significativamente más tiempo y mano de obra intensiva y al menos en nuestras manos no tan confiable y eficiente. Este último requiere una máquina FACS y sería necesario introducir pasos de manipulación adicionales, incluyendo el agotamiento de los glóbulos rojos y la tinción celular, agregando tiempo al proceso de aislamiento celular. En general, el aislamiento inmunomagnético es rápido, genera una muestra muy pura y evita el manejo excesivo de las células. Con respecto al procesamiento de muestras, hemos demostrado previamente que un retraso entre la recolección de sangre y el aislamiento de neutrófilos de al menos 24 h no da lugar a un cambio o variación significativo en el resultado de nuestro ensayo, lo que proporciona flexibilidad para la futura explotación clínica11.

El procedimiento de aislamiento de neutrófilos en sí es muy fácil. Recomendamos vórtice las perlas magnéticas antes de cada uso. También es importante no molestar al imán una vez que el tubo está dentro del imán para evitar turbulencias y desalojamiento de las cuentas magnéticas. Los neutrófilos están siendo enriquecidos en suspensión por varias rondas de eliminación inmunomagnética de todas las células no deseadas. Se debe tener cuidado de no tocar el lado del tubo que está en contacto con el imán y durante la primera ronda de aislamiento (paso 2.11) para no perturbar los glóbulos rojos en la parte inferior del tubo. Después de la ronda final de pipeteo de la suspensión celular enriquecida en un nuevo tubo cónico (paso 2.24), los neutrófilos están inmediatamente disponibles para su posterior procesamiento. Si los neutrófilos se utilizan para evaluar la actividad de LRRK2 en las células, los neutrófilos se dividen en dos lotes y después de la peletización por centrifugación, resuspende en un inhibidor de la quinasa LRRK2 (aquí, MLi-2) o DMSO que contiene el medio de cultivo celular. Dado que la defosforilación en presencia y refosforilación en ausencia de inhibición de la quinasa LRRK2 son eventos relativamente rápidos, es necesario tener cuidado para garantizar que la fracción de neutrófilos tratada con MLi-2 permanezca expuesta a un inhibidor de la quinasa LRRK2 (por ejemplo, MLi-2) hasta la lisis celular (pasos 3.8–3.10).

Hay varios pasos de centrifugación en este protocolo utilizando tubos cónicos de 15 y 50 ml. Si bien utilizamos habitualmente las velocidades de centrifugación indicadas en el protocolo, es posible aumentar la velocidad de centrifugación hasta 400 x g sin afectar negativamente la viabilidad de las células. Esto resulta en un pellet de células neutrófilas ligeramente más firme que podría ayudar a reducir cualquier pérdida potencial de material de neutrófilos durante la decantación y pipeteo de los pasos de sobrenadant durante este protocolo. Esto probablemente aumentará el rendimiento en términos de lisato proteico total obtenido. Una preocupación potencial es que una fuerza de centrifugación más alta podría activar a los neutrófilos y afectar potencialmente el análisis posterior. Nuestra recomendación general es manejar a los neutrófilos durante cada paso del protocolo tan suavemente como sea posible.

Nuestro protocolo utiliza el inhibidor de la proteasa de serina altamente potente DIFP (0,5 mM) como parte del tampón de lisis de neutrófilos. DIFP es una potente neurotoxina organofosfora, y aunque hemos investigado compuestos alternativos, su adición al tampón de lisis fue esencial para el análisis de la fosforilación Rab10 controlada por LRRK2 en neutrófilos humanos mediante inmunoblotting. Por ejemplo, la sustitución de DIFP por SDS al 1% (p/v) se ha utilizado para alicadir a los neutrófilos en otros estudios19 y ha dado lugar a una degradación significativa de las proteínas en la medida en que la inmunoblotación para LRRK2, Rab10 e incluso el control de carga GAPDH no produjo una señal, destacando así la importancia de incluir un inhibidor de la proteasa altamente potente en el búfer de lisis (Figura 2C). Al reemplazar el DIFP por el inhibidor de la proteasa de serina menos potente, pero también menos tóxico PMSF a 2,5 mM, la fosporilación de Rab10 fue bien preservada, pero la proteína LRRK2 más grande sufrió una degradación significativa(Figura 2C). Con el fin de minimizar la manipulación de la solución de material DIFP, el tampón de lisis que contiene DIFP se puede preparar en lotes, alícuota y almacenarse a -20 oC o -80 oC11. Con respecto al análisis mediante inmunoblotting cuantitativo, es primordial utilizar un anticuerpo fosfoespecífico que se ha demostrado que es selectivo para una sola proteína Rab fosforilada LRRK2, como el anticuerpo MJFF-pRab10 utilizado para nuestros estudios14.

El protocolo también se puede escalar verticalmente utilizando un volumen máximo de sangre entera de hasta 25 ml, que es el límite que se puede procesar en un procedimiento de aislamiento utilizando un imán, que es capaz de sostener tubos cónicos de 50 ml. Los únicos pasos que necesitarían ajustes son el paso 2.4 (añadiendo 50 l de cóctel de aislamiento por ml de sangre), los pasos 2.6 y 2.12 (añadiendo 50 l de perlas magnéticas por ml de sangre), y un aumento proporcional en el volumen de tampón de lisis para la lisis neutrófilo en el paso 3.12. Todos los demás pasos se pueden mantener idénticos.

En resumen, nuestro protocolo describe un método fácil y robusto para aislar a los neutrófilos humanos de la sangre periférica. Los neutrófilos pueden entonces ser tratados con y sin un inhibidor potente y específico de la quinasa LRRK2 para permitir la cuantificación de la fosforilación controlada por LRRK2 de Rab10 in vivo. Esto puede ser útil para la estratificación de individuos de acuerdo con la actividad de la vía de quinasa LRRK2 y para identificar a aquellos con hiperactivación de la vía que podrían beneficiarse del tratamiento del inhibidor de la quinasa LRRK2. Si bien esto será poco probable que sea el caso de la mayoría de las personas con DP, específicamente la DP idiopática, nuestro ensayo ya se ha desplegado con éxito en individuos que llevan una mutación rara y heterocigota en otro gen asociado a la DP, VPS35 D620N, donde la actividad de la vía quinasa LRRK2 se incrementa significativamente por un mecanismo aún desconocido15. Anteriormente habíamos examinado los niveles de fosforilación Rab 10 controlados por LRRK2 en un pequeño número de individuos que llevaban la mutación más común LRRK2 G2019S que se sabe que activa la actividad de la quinasa LRRK2 sólo modestamente por un factor de alrededor de dos sin detectar una diferencia significativa en comparación con los controles y pacientes con PD idiopático con nuestro ensayo11,14. Este y otros datos no publicados sugieren que la actividad de la quinasa LRRK2 probablemente requiere un aumento de >3x para producir un resultado significativo utilizando inmunoblotting cuantitativo. Sin embargo, es probable que la sensibilidad para detectar la activación de la vía de quinasa LRRK2 puede aumentar si se implementa tecnología de espectrometría de masas de última generación.

Sugerimos que los neutrófilos son un recurso valioso para la investigación de la enfermedad de Parkinson en la actividad de la vía de la quinasa LRRK2 y podrían ayudar a identificar a las personas que podrían beneficiarse del tratamiento futuro con inhibidores de la quinasa LRRK2.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Agradecemos a los voluntarios sanos que amablemente donaron sangre para el presente estudio. Agradecemos a The Michael J. Fox Foundation for Parkinson's Research (MJFF) y al liderazgo del estudio Fox BioNet (FBN) por su apoyo y aportación hacia el protocolo escrito y el video. Agradecemos al profesor Alexander Zimprich, de la Universidad de Viena en Austria, por probar nuestro protocolo y colaboración. Valoramos las contribuciones de Paul Davies al proyecto (director general de la PPU de MRC). También reconocemos el excelente apoyo técnico de la Unidad de Fosforilación y Ubiquitilación de Proteínas MRC (PPU) a saber, Síntesis Química (Natalia Shpiro para la síntesis de MLi-2), Reactivos MRC PPU y equipos de purificación de anticuerpos (coordinados por Hilary McLauchlan y James Hastie). Agradecemos a Mhairi Towler y Fraser Murdoch de Vivomotion por su ayuda para hacer los videos y animaciones. Agradecemos a Steve Soave de 81 películas por su ayuda con las ediciones finales. Esther Sammler cuenta con el apoyo de una beca académica clínica sécoceses escocesa y ha recibido financiación de Parkinson's UK (K-1706).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL Pipette tips Sarstedt 70.762 or equivalent
1.5 mL Micro tubes Sarstedt 72.690.001 or equivalent
10 mL Pipette tips  Sarstedt 86.1254.025  or equivalent
10 μL Pipette tips Sarstedt 70.113 or equivalent
15 mL falcon tube  Cellstar 188 271 or equivalent
200 μL Pipette tips Sarstedt 70.760.002 or equivalent
25 mL Pipette tips  Sarstedt 86.1685.001 or equivalent
50 mL falcon tube  Cellstar 227 261 or equivalent
BD Vacutainer Hemogard Closure Plastic K2-EDTA Tube BD  BD 367525 or equivalent
Beckman Coulter Allegra X-15R centrifuge Beckman or equivalent centrifuge with swimging bucket rotator for 15 mL and 50 mL falcon tubes at speed 1000-1200 x g
Category 2 biological safety cabinet.
cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail Roche 11836170001
DIFP (Diisopropylfluorophosphate)  Sigma D0879 Prepare 0.5M stock solution in isopropanol using special precautions 
Dimethyl sulfoxide  Sigma 6250
Dry ice or liquid nitrogene
Dulbecco's phosphate-buffered saline  ThermoFisher 14190094 or equivalent
Easy 50 EasySep Magnet  Stemcell 18002 for holding 1 x 50ml conical tube
EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit  Stemcell 19666 This contains Solutions called “Isolation Cocktail” and “RapidSpheres magnetic beads
EGTA Sigma E3889
Eppendorf centrifuge 5417R centrifuge Eppendorf
Ethanol, in spray bottle
Ethylenediaminetetraacetic acid  Sigma E6758
Ice
Isopropanol (anhydrous grade)  Sigma 278475
Lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1%(v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF, 10 mM β-glycerophosphate, 5 mM sodium pyrophosphate, 0.27 M sucrose, 0.1% (v/v) β-mercaptoethanol, 1x cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail (Roche), 1 μg/ml Microcystin-LR, 0.5 mM diisopropylfluorophosphate (DIFP).  alternatively frozen lysis buffer in aliquots without Microcystin-LR, DIFP available from MRC-PPU Reagents (http://mrcppureagents.dundee.ac.uk/)
Merck LRRK2 inhibitor II (MLi-2) Merck 438194-10MG or equivalent (potent and selective LRRK2 inhinitor)
Microcystin-LR Enzo Life Sciences ALX-350-012-M001 1 mg/ml stock in DMSO and store at -80 oC. 
Na3VO4 Aldrich 450243
NaF Sigma S7920
Odyssey CLx scan Western Blot imaging system Odyssey
Permanent marker pen
Personal protection equipment
RPMI 1640 Medium  ThermoFisher 21875034 or equivalent
sodium pyrophosphate Sigma S22
sucrose Sigma S0389
β-glycerophosphate Sigma 50020
β-mercaptoethanol Sigma M3148
Suggested antibodies for Western blotting
Anti-RAB10 (phospho T73) antibody [MJF-R21] abcam ab230261
Anti-α-tubulin Cell Signaling Technologies 5174 used at 1:2000 dilution
Goat anti-mouse IRDye 680LT LI-COR 926-68020 used at 1:10,000 dilution
Goat anti-mouse IRDye 800CW LI-COR 926-32210 used at 1:10,000 dilution
Goat anti-rabbit IRDye 800CW LI-COR 926-32211 used at 1:10,000 dilution
MJFF-total Rab10 mouse antibody generated by nanoTools (nanotools.de) not applicable* used at 2 μg/ml final concentration; * The MJFF-total Rab10 antibody generated by nanoTools (www.nanotools.de) [11] will be commercialised by the Michael J Fox Foundation in 2018
Mouse anti-LRRK2 C-terminus antibody Antibodies Incorporated  75-253 used at 1 μg/ml final concentration
pS935-LRRK2 MRC PPU Reagents and Services UDD2 used at 1 μg/ml final concentration

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References

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Bioquímica Número 157 Enfermedad de Parkinson biomarcadores quinasa LRRK2 neutrófilos de sangre periférica proteínas Rab tráfico de vesículas fosforilación de proteínas
Aislamiento de Neutrófilos de Sangre Periférica Humana para Interrogar la Vía de Kinasa LRRK2 Asociada al Parkinson mediante la evaluación de la fosforilación de Rab10
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Fan, Y., Tonelli, F., Padmanabhan,… More

Fan, Y., Tonelli, F., Padmanabhan, S., Baptista, M. A. S., Riley, L., Smith, D., Marras, C., Howden, A., Alessi, D. R., Sammler, E. Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation. J. Vis. Exp. (157), e58956, doi:10.3791/58956 (2020).

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