Summary
Lösin bakımından zengin tekrarlayan kiaz 2 genindeki (LRRK2) mutasyonlar kalıtsal Parkinson hastalığına neden olur. İnsan periferik kan nötrofillerinde Rab10'un LRRK2 kontrollü fosforilasyonunun değerlendirilmesi için kolay ve sağlam bir yöntem geliştirdik. Bu artmış LRRK2 kinaz yolu aktivitesi olan bireylerin belirlenmesine yardımcı olabilir.
Abstract
Lösin zengini tekrarlayan kiziaz 2 (LRRK2) kalıtsal Parkinson hastalığında (PH) en sık mutasyona uğrayan gendir ve tüm patojenik LRRK2 mutasyonları kizaz fonksiyonunun hiperaktivasyonuile sonuçlanır. Burada, fizyolojik substratlarından biri olan Rab10'un threonine 73'teki LRRK2 kontrollü fosforilasyonunu ölçerek insan periferik kan nötrofillerindeki LRRK2 kiyazı yolu aktivitesini ölçmek için kolay ve sağlam bir tahkikat tanımlıyoruz. Açıklanan immünolot analizi, MJFF-pRab10 tavşan monoklonal antikor gibi LRRK2 tarafından fosforile rab10 Thr73 epitopunu tanıyan tam seçici ve fosfospesifik antikor gerektirir. Periferik kan kolayca erişilebilir ve nötrofiller bol ve homojen bir bileşen dir, çünkü insan periferik kan nötrofilkullanır. Daha da önemlisi, nötrofiller hem LRRK2 hem de Rab10'un nispeten yüksek düzeylerini ifade eder. Nötrofillerin potansiyel bir dezavantajı yüksek içsel serin proteaz aktivitesidir, bu da lisis tamponunun bir parçası olarak organofosfor nörotoksin diisopropilorofosfat (DIFP) gibi çok güçlü proteaz inhibitörlerinin kullanılmasını gerektirir. Bununla birlikte, nötrofiller in vivo LRRK2 kiyazı yolu aktivitesi araştırma için değerli bir kaynak ve PD biyorepozitory koleksiyonlarına dahil edilmesi için düşünülmelidir.
Introduction
Parkinson hastalığını (PH) yavaşlatmaya veya durdurma girişimleri şimdiye kadar başarısız oldu. Lösin zengin tekrar kilaz 2 hiperaktivasyon mutasyonlarının keşfi (LRRK2) neden ve / veya PH riskini artırmak LRRK2 kiyaz inhibitörlerigelişimineyol açmıştır1 ,2,3. Bunlar artık klinikçalışmalaragirdik 4 . LRRK2 tam işlevi belirsizdir, ama büyük bir ilerleme Rab GTPase proteinlerin bir alt kümesinin belirlenmesi olmuştur, Rab10 dahil, LRRK2 kisenin ilk iyi niyetli fizyolojik substratları olarak5,6,7. Hastalık değiştirici terapötikler çağında kisa ların temel zorlukları LRRK2 kizaz aktivasyon durumunun biyokimyasal belirteçleri ve LRRK2 kiyaz inhibitörlerinin hedef katılımıdır.
Şimdiye kadar, vivo LRRK2 inhibitörleri için temel farmakokinetik belirteç lrrk2 kurucu fosforile serin kalıntıları bir küme olmuştur, özellikle serine 935, çeşitli LRRK2 inhibitörleri yanıt olarak fosforilted hale8,9. Ancak, serine 935 fosforilasyon doğrudan LRRK2 tarafından fosforile değildir ve hala kilaz-inaktif LRRK210fosforile çünkü içsel hücresel LRRK2 kiziz aktivitesi ile ilişkili değildir. LRRK2 kinasaktivitesi serin1292 otofosforilasyon ile iyi ilişkilidir, ama pratik açısından bu site için güvenilir ve fosfospesifik antikorların mevcut eksikliği nedeniyle tüm hücre özleri immünoblot analizi ile endojen LRRK2 kinaz aktivitesi için uygun bir okuma değil10,11.
Biz threonine 7311de fizyolojik hedef protein Rab10 LRRK2 kontrollü fosforilasyon ölçer insan periferik kan hücrelerinde LRRK2 kiyaz yolu aktivitesini ölçmek için sağlam ve kolay bir taht geliştirdik. Periferik kana, düşük riskli ve en az rahatsızlığa neden olan hızlı bir işlem olan venekesit ile kolayca ulaşılabilir. Onlar bol (tüm beyaz kan hücrelerinin% 37-80) ve hem LRRK2 ve Rab1011nispeten yüksek düzeyde ifade homojen hücre popülasyonu oluşturmak çünkü biz insan periferik kan nötrofiller odaklanmak. Ayrıca, periferik kan nötrofilleri immünomanyetik negatif yaklaşım la hızlı ve verimli bir şekilde izole edilebilir. Sonraki gözlenen Rab10 fosforilasyon LRRK2 aracılık olduğundan emin olmak için, nötrofil her toplu veya güçlü ve seçici LRRK2 kiyaz inhibitörü olmadan kuluçka (biz kullanmak ve MLi-2 tavsiye)2,12. Bu daha sonra proteaz inhibitörü diisopropil florofosfat içeren bir tampon hücre lisis i takip (DIFP), nötrofiller yüksek olduğu bilinen içsel serin prote proteaz aktivitesini bastırmak için gerekli olan13. Kantitatif immünoblotting tarafından son analiz için, özellikle Rab10 Thr73-fosfoepitop algılar ve diğer fosforile Rab proteinleri ile çapraz tepki vermez MJFF-pRab10 tavşan monoklonal antikor kullanmanızı öneririz14. Bu antikor seçiciliği ve özgüllüğü farklı Rab proteinleri ve A549 Rab10 knock-out hücre hattı14aşırı ekspresyon modellerinde doğrulanmıştır. Böylece, güçlü ve seçici LRRK2 kinaz inhibitörü2ile tedavi edilmiş nötrofil lysates Rab10 fosforilasyon farkı ölçmek . Alternatif olarak, örnekler nicel kütle spektrometresi gibi diğer yöntemlerle de analiz edilebilir.
Sonuç olarak, LRRK2 kontrollü Rab10 fosforilasyon serin 935 de LRRK2 fosforilasyon LRRK2 kiziaz aktivitesinin üstün bir belirteç ve insan periferik kan nötrofiller LRRK2 içine PD araştırma için değerli bir kaynaktır. Protokolümüz periferik kan nötrofillerinde LRRK2 yol aktivitesini sorgulamak için sağlam ve kolay bir tahkikat sağlar ve artmış LRRK2 kinaz aktivitesi15olan bireylerin biyokimyasal tabakalaşmasını sağlar. Daha da önemlisi, bu tür bireyler gelecekteki LRRK2 kiyaz inhibitörü tedavisinden yararlanabilirler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Yerel İngiltere mevzuatına göre insan kanının tüm manipülasyonları ve borulama bir kategori 2 biyolojik güvenlik kabinesinde üstlenilir. Tüm prosedürler yerel etik inceleme kuruluna uygun olarak gerçekleştirildi ve tüm katılımcılar bilgilendirilmiş onay verdi.
1. Hazırlık
- Fosfat tamponlu salinde (PBS) 100 mM EDTA içeren 0,1 mL EDTA Stok Çözeltisi 1 hazırlayın.
- PBS'de 1 mM EDTA içeren 60 mL EDTA Stok Çözeltisi 2 hazırlayın.
- 50 mM Tris-HCl (pH = 7,5), %1 (v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF içeren lysis tamponunu hazırlayın, 10 mM β-gliserinosfat, 5 mM sodyum pirofosfat, 0.27 M sakaroz, %0.1 (v/v) β-mercaptoetanol, 1x proteaz inhibitör kokteyli, 1 μg/mL microcystin-LR ve 0.5 mM diisoylprop florosfat (DIFP).
NOT: Yazarlar rutin bir EDTA içermeyen ürün kullanmak, ancak edta içeren proteaz inhibitörü kokteyl de çalışması gerekir. Lysis tamponu β-mercaptoetanol, proteaz inhibitörleri, mikrosistin-LR ve DIFP olmadan önceden yapılabilir ve kullanıma kadar 4 °C'de saklanabilir. Β-mercaptoetanol, proteaz inhibitörleri, mikrosistin-LR ve DIFP'nin kullanımdan hemen önce eklenmediğinden emin olun.
DİkKAT: DIFP toksiktir ve yerel sağlık ve güvenlik risk değerlendirmesi sonrasında bir duman başlık içinde özenle ele alınmalıdır. DIFP lysis tamponekleyebilir ve hemen kullanılabilir. Alternatif olarak, DIFP dahil diğer tüm bileşenleri içeren tam lisis tampon, aliquoted ve en az 4 hafta boyunca sonraki kullanım için -80 °C'de saklanabilir.
2. Tam kandan nötrofil izolasyonu
- Bir kan toplama tüpü içine 10 mL kan toplayın. Tüpleri 7−8x ters çevirerek hafifçe karıştırın.
- 10 mL'lik kanın 50 mL konik tüpe aktarılması.
- Kana 100 μL EDTA Stok Çözeltisi 1 ekleyin. Yavaşça karıştırın.
- Nötrofil izolasyon kitinden(Malzeme Tablosu)tüm kan örneğine 500 μL izolasyon kokteyli (50 μL/mL) ekleyin.
- Çok ince manyetik boncukları yeniden askıya almak için kullanılmadan önce nötrofil izolasyon kitinden gelen manyetik boncukları 30 s'lik bir giriş için girdap.
- Kan örneğine manyetik boncukların 500 μL'sini ekleyin ve tüpü birkaç kez ters çevirerek hafifçe karıştırın.
- 5 dakika oda sıcaklığında (RT) inkübat.
- TÜPÜ EDTA Stok Çözümü 2 ile 50 mL'ye doldurun. Çok yavaşça yukarı ve aşağı 2-3x pipetting tarafından karıştırın.
- Mıknatıs içine tüp yerleştirin ve tüp sonraki ajitasyon önlemek için kapağı çıkarın.
- RT'de 10 dakika kuluçka.
- Nötrofilleri içeren zenginleştirilmiş hücre süspansiyonu, 50 mL'lik yeni bir konik tüpe dikkatlice pipet.
NOT: Mıknatısla temas halindeolan tüpün yan tarafına dokunmayın ve tüpün altındaki kırmızı kan hücrelerinin toplanmasından ve tedirgin edilmesinden kaçının. Tüpün alt kısmında kırmızı kan hücresi süspansiyonyaklaşık 10 mL bırakın. - Kullanmadan önce 30 s için manyetik boncukvor ve zenginleştirilmiş nötrofiller içeren tüp için manyetik boncuk0.5 mL ekleyin. Tüpü ters çevirerek hafifçe karıştırın.
- 5 dakika RT'de kuluçka.
- Mıknatıs içine tüp yerleştirin ve sonraki ajitasyon önlemek için kapağı çıkarın.
- 5 dakika RT'de kuluçka.
- Nötrofilleri içeren zenginleştirilmiş hücre süspansiyonu, 50 mL'lik yeni bir konik tüpe dikkatlice pipet.
NOT: Mıknatısla temas eden tüpün yan tarafına dokunmayın. Süspansiyonun yaklaşık 5 mL'sini tüpün altında bırakın. - Hücre karışımından manyetik boncukların tamamen çıkarılmasını sağlamak için, zenginleştirilmiş hücreleri içeren tüpü mıknatısın içine yerleştirin.
- RT'de 10 dakika kuluçka.
- Şimdi yeni bir 50 mL konik tüp içine saf nötrofiller içeren zenginleştirilmiş hücre süspansiyon dikkatle pipet.
NOT: Mıknatısla temas eden tüpün yan tarafına dokunmayın. Süspansiyonun yaklaşık 5 mL'sini tüpün altında bırakın. - İzole hücreleri 1 mM EDTA Stok Çözeltisi 2 ile yaklaşık 41 mL'lik son hacmi karıştırın. Pipet yukarı ve aşağı karıştırmak için.
- Çözeltiyi her tüpte yaklaşık 20 mL olan iki tüpe eşit olarak bölün.
- Santrifüj her iki tüpü de 335 x g'de 5 dk.
- Bu santrifüj sırasında MLi-2 inhibitör stokunu (200 μM/1000x konsantrasyon) -80 °C'lik dondurucudan çıkarın ve daha sonra kullanılmak üzere RT'de bırakın.
- Santrifüj adımından hemen sonra ve tüplerin ajitasyonu olmadan, nötrofil peletrahatsız olmadan supernatant dökün. Rt'de hücre kültürü ortamının 10 mL'lik(Malzeme Tablosu)her hücre peletini, hücreleri yavaşça yukarı ve aşağı 4 kat borulayarak yeniden askıya alın.
3. Saf nötrofillerin LRRK2 kiyaz inhibitörü tedavisi
- Etiket bir tüp "DMSO" ve diğer tüp "MLi-2".
- "DMSO" etiketli tüpe 10 μL DMSO ekleyin ve 10 mL'lik pipetle 2x yukarı ve aşağı boru lar atarak hafifçe karıştırın. "MLi-2" etiketli boruya 10 μL 200 μM MLi-2 stok çözeltisi (son konsantrasyon 200 nM) ekleyin ve 10 mL'lik pipetle 2x yukarı ve aşağı boru lar atarak hafifçe karıştırın.
- Rt. Kuluçka sırasında her 10 dakikada bir inversiyon ile hafifçe karıştırın.
- Kuluçka döneminde 0,5 M DIFP stoğunu -80 °C'lik dondurucudan çıkarın ve buz üzerinde bir duman kaputuna yerleştirin. -80 °C'lik dondurucudan 1 mg/mL mikrosistin-LR stok çözeltisini çıkarın ve erimeye RT'de bırakın. Dondurucudan bir aliquot (0.25 mL) alın, RT'de çözülmesine izin verin ve daha sonra kullanmak üzere buzüzerine yerleştirin.
- 1 μL DMSO içeren hücre kültürü ortamının 1 mL'sini hazırlayın ve bu DMSO resuspension arabelleği çağırın. 1 μL 200 m MM MLi-2 içeren 1 mL RPMI ortam hazırlayın ve bu MLi-2 resuspension tamponu deyin.
- 30 dk kuluçka süresinden sonra her iki tüpü de 335 x g'de 5 dk santrifüj edin.
- Dikkatle nötrofil pelet rahatsız etmeden her tüp içinde supernatant atın.
- DMSO etiketli numune için pelet, DMSO resuspension tamponunun 1 mL'inde ve MLi-2 etiketli tüp için, MLi-2 resuspension tamponunun 1 mL'inde peleti hafifçe askıya alın.
- Resuspended hücre peletlerini "DMSO" ve "MLi-2" etiketli ilgili santrifüj tüplerine aktarın ve her iki tüpü de 3 3 dk boyunca 335 x g'da santrifüj edin.
- Santrifüj adımında, lysis tamponunu hazırlayın. Duman kaputuna 0,25 μL 0,5 M DIFP çözeltisi ve 0,25 μL 1 mg/mL mikrosisin-LR 0,25 mL likörü tamponuna dikkatlice ekleyin. Karıştırın ve kullanıma kadar buz üzerinde bırakın.
NOT: DIFP sulu bir çözeltide nispeten kararsız olduğundan, hücre lisisinin 15 dakika içindeki lysis arabelleğine DIFP ekleyin. - Santrifüjden hemen sonra, nötrofil peletini rahatsız etmeden tüm supernatant'ı bir pipetle dikkatlice ve tamamen çıkarın ve tüpleri buza yerleştirin.
- Her tüpe hemen DIFP ve mikrosistin-LR içeren 100 μL likis tamponekleyin. 100-200 μL pipet kullanarak hücre peletlerini yaklaşık 5-10 x yukarı ve aşağı boruile tutarak yeniden askıya alın.
- Hücreleri 10 dakika boyunca buzüzerinde lyse.
- Hücre enkazLarını temizlemek için 4 °C'de 15 dakika boyunca 20.000 x g'lık santrifüj tüpleri.
- Nötrofil lisatlarını içeren "DMSO" ve "MLi-2" süpernatantlarını yeni santrifüj tüplerine aktarın. Enkaz peletini atın.
NOT: Nötrofil lysates kullanıma hazır dır veya sıvı nitrojende dondurulmuş ve ileride analiz için -80 °C'de saklanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bizim taht bir okuma olarak LRRK2 bağımlı Rab10 fosforilasyon ile insan periferik kan nötrofillerinde PD ilişkili LRRK2 kizaz aktivasyonu sorgulama sağlar. Nötrofiller, hem LRRK2 hem de Rab10 proteinlerinin yüksek düzeylerini ifade eden homojen ve bol periferik beyaz kan hücresi popülasyonudur(Şekil 1). Kalan periferik kan mononükleer hücreleri arasında kalan tek hücre popülasyonu (PBMCs) her iki proteinin yüksek kopya numaraları monositler, ancak bu beyaz kan hücrelerinin sadece% 2-12 makyaj. Bu periferik kan nötrofiller LRRK2 kontrollü Rab10 fosforilasyon çalışması için daha uygun bir biyomofinolduğunu gösterir.
İşlemimizle 10 mL'den periferik kan nötrofillerini izole ederken, donör başına 0.5-0.75 mg arasında toplam protein lisat elde edildi(Şekil 2A),jel şerit başına sadece 10 μg olmak üzere önemli sayıda immünoblot analizi için yeterli olan. Hücrelerin saflığı ve canlılığı rutin olarak yapılmazken, üç sağlıklı donör için izole nötrofillerin saflığının %94-98 arasında olduğunu ve cd66b−Fluorescein izothiocyanat nötrofil belirteci ve 4',6-Diamidin-2'-fenilindole dihidroklorür (DAPI) canlılık açısından boyanabilirlik içinFigure 2Akanaat analizi ile akış sitometri analizi ile belirlenen hücre ~%99'u arasında olduğunu gösterdik.
Bu yayının odak noktası nötrofillerin periferik kandan izole edilmesi ve işlenmesi iken, kantitatif Batı lekeleme ile analiz değil, Şekil 2B, özellikle treonin 73'te Rab10 fosforilasyonunu tespit eden MJFF-pRab10 monoklonal antikorun nötrofil örneklerinde güçlü sinyaller ortaya koyduğunu göstermektedir, bu durumda MLi-2, güçlü ve spesifik LR2RK kinayör inhibitörü ile tedavi ile belirgin bir şekilde bastırılmış nötrofil örneklerinde sağlam sinyaller ortaya çıkar.
Nötrofiller sonraki Batı leke analizini etkileyebilecek yüksek düzeyde serin eteteses içerirler. DIFP nötrofillerde yüksek proteaz aktivitesini etkili bir şekilde bastırırken, güçlü bir organofosfor nörotoksindir ve fenilmetilsülfonil florür (PMSF) gibi eşit derecede etkili ama daha az toksik proteaz inhibitörü ile değiştirmek istenebilir. DiFP 2,5 mM 'lik bir konsantrasyonda PMSF tarafından değiştirildiğinde Rab10 fosforilasyonunun eşit derecede iyi korunduğunu bulduk(Şekil 2C). Ancak, DiFP ile karşılaştırıldığında PMSF kullanılırken LRRK2 proteininin bütünlüğü bozuldu, bu da büyük LRRK2 proteininin bozulmaya daha yatkın olduğunu düşündürmektedir(Şekil 2C).
Daha önce başka bir PD'ye neden olan gen mutasyonu VPS35 D620N'nin henüz bilinmeyen birmekanizmaile LRRK2 kizazının hiperaktivasyonuile sonuç verdiğini gösterdik. Hastalığa neden olan heterozigot VPS35 D620N mutasyonuna neden olan PH'li üç kişiden nötrofiller bu makalede açıklanan yöntem le izole edilmiştir(Şekil 3). Dokuz sağlıklı donörden alınan nötrofil örnekleri kontrol ler15olarak izole edildi. MJFF-pRab10 monoklonal antikor kullanılarak yapılan immünoblot analizi, kontrollere göre VPS35 D620N mutasyonu olan Parkinson hastalarında Nöfofiller'de Thr 73'te Rab10 fosforilasyonda önemli, ~3x artış göstermektedir. Toplam Rab10 protein ekspresyonu 12 nötrofil örneğinin tümünde benzerdir.
Şekil 1: Immprot veritabanında (http://www.immprot.org)16'dakamuya açık veriler kullanılarak insan kanından izole edilen bağışıklık hücrelerindeki LRRK2 ve Rab10 proteinlerinin bolluğu 16 . Grafik, T hücreleri, B hücreleri, monositler, NK hücreleri, dendritik hücreler ve granülosit ler nötrofiller, bazofiller ve eozinofillerin alt kümeleri de dahil olmak üzere bir dizi periferik kan bağışıklık hücresinde LRRK2 ve Rab10 için hücre başına protein kopyalarının sayısını gösterir. Bu rakam Fan ve ark.11'dendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: İnsan periferik kan nötrofillerinin karakterizasyonu ve analizi ve DIFP'nin nötrofillerde proteolitik bozulmanın önlenmesindeki önemi. (A) Nötrofiller hücre lisisi sonrası saflık, canlılık ve total protein verimini gösteren üç sağlıklı donörün (A, B ve C) tüm kanından izole edildi. (B) Nötrofiller LRRK2 kinaz inhibitörü (MLi-2) ile veya olmadan tedavi edildi, daha sonra lysed ve yakın kızılötesi (NIR) floresan görüntüleme ile belirtilen antikorlar ile kantitatif immünoblot analizine tabi tutuldu. (C) Nötrofiller iki sağlıklı donörden izole edildi ve 30 dk. Hücreler nötrofillerde serin proteaz aktivitesini engellemek için 0.5 mM DIFP veya 2.5 mM PMSF varlığında 100 nM MLi-2 ile tedavi edildi. A ve B, Mir ve ark.15'tenmodifiye edilmiş, C ise Fan ve ark.11'dendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Heterozigeous VPS35 D620N mutasyonu olan Parkinson hastalarında artmış LRRK2 kiziaz yolu aktivitesi. Nötrofiller, yaşla eşleşmeyen dokuz sağlıklı kontrol ve hastalığa neden olan heterozigot VPS35 D620N mutasyonu olan üç PH hastasından izole edildi. Hücreler hücre lisisinden önce 30 dk boyunca 200 nM MLi-2 ile veya olmadan tedavi edildi. (A) Yakın kızılötesi (NIR) floresan görüntüleme yoluyla belirtilen antikorlarla kantitatif immünoblot analizine tabi tutulan toplam 10 μg'lik tüm hücre ekstresi. İmmünoblots fosfo-Thr73 Rab10:total Rab10 oranı(B)için sayısallaştırılmıştır. Veriler Tukey'nin çoklu karşılaştırma testi ile tek yönlü ANOVA tarafından analiz edildi. ± SD anlamına gelir olarak sunulan veriler; p < 0.0001. Bu rakam Mir ve ark.15'tendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zorlayıcı klinik, genetik ve biyokimyasal kanıtlar LRRK2 için önemli bir rol doğru işaret ve özellikle Parkinson hastalığında kizaz fonksiyonu7. LRRK2 kiyaz inhibitörleri geliştirilmiştir ve klinik çalışmalara giriyorsunuz2,4,12. Bu nedenle, lrrk2'nin hedef katılımı ve hasta tabakalaşması için bir biyomarker olarak sömürülmesine ihtiyaç vardır. Protokolümüz, insan periferik kan nötrofillerinin homojen havuzunda fizyolojik substrat Rab10'un fosforilasyonunun yansıttığı gibi LRRK2 kiyazı yolu aktivasyonunu analiz etmek için sağlam ve kolay bir tahkikat tanımlar11,14. Kantitatif immünoblotting ile analiz için, biz kuvvetle son derece selektif fosfospesifik Rab10 antikor (MJFF-pRab10 monoklonal antikor)14,,17kullanılmasını öneririz.
İnsan nötrofillerini kullanıyoruz çünkü baskın lökosit popülasyonunu oluşturan periferik kan hücrelerinin homojen bir alt kümesini oluşturuyorlar17,18. Daha da önemlisi, nötrofiller de LRRK2 yüksek protein ekspresyonu düzeyleri ve alt devlet Rab10 var (Şekil 1)16. Buna karşılık, PBMCs havuzu oluşturan lökositkalan alt kümeleri lrrk2 ve Rab10 değişken ve ağırlıklı olarak düşük ekspresyon ile heterojendir. Monositler ve dendritik hücreler yüksek ekspresyon düzeylerine sahiptir, ancak genel bollukdüşük16.
EDTA vacutainer kan toplama tüplerinin kullanılmasını tavsiye ederken, EDTA dışında bir antikoagülan kullanılabilir. Ancak, EDTA varlığı nötrofil izolasyon kiti performansı için önemlidir. Bu nedenle, alternatif bir antikoagülan kullanılsa bile 1 mM EDTA'lık son konsantrasyona ulaşılabilmesi için tüm kan örneğine EDTA eklemenizi öneririz. Nötrofil izolasyon kiti kullanımı nispeten hızlı ve kolay bir şekilde immünomanyetik negatif seçimi ile insan tam kan doğrudan nötrofil arındırıcı sağlar. Mevcut mıknatısların sayısı kaç kan örneğinin paralel olarak işlenebileceğini belirler. Nötrofilleri altı mıknatıs kullanarak paralel olarak altı kan örneğinden ayırmak kolayca mümkündür. Potansiyel bir dezavantajı ticari nötrofil izolasyon kitleri ve gerekli mıknatıs için ilişkili maliyettir. Tam kandan nötrofil izolasyonu için alternatif yöntemler tanımlanmış ve önemli sakıncaları olan yoğunluk gradyan ayırma veya floresan aktif hücre sıralama (FACS) güveniyor. Eski önemli ölçüde daha fazla zaman ve emek yoğun ve en azından elimizde değil güvenilir ve verimli. İkincisi bir FACS makine gerektirir ve ek işleme adımları getirilmesi gerekir, kırmızı kan hücrelerinin tükenmesi ve hücre boyama dahil olmak üzere, hücre izolasyon sürecine zaman ekleyerek. Genel olarak, immünomanyetik izolasyon hızlıdır, son derece saf bir örnek oluşturur ve hücrelerin aşırı kullanımı önler. Örnek işleme ile ilgili olarak, daha önce kan toplama ve en az 24 saat nötrofil izolasyon u arasında bir gecikme gelecekteki klinik sömürü için esneklik sağlar bizim tahkikat, sonucu önemli bir değişiklik veya varyasyon neden olmadığını göstermiştir11.
Nötrofil izolasyon prosedürü kendisi çok kolaydır. Her kullanımdan önce manyetik boncukları girmenizi öneririz. Manyetik boncukların türbülans ve yerinden edilmesinden kaçınmak için tüp mıknatısın içine girdikten sonra mıknatısı rahatsız etmemek de önemlidir. Nötrofiller tüm istenmeyen hücrelerin immünmanyetik kaldırma birkaç tur süspansiyon ile zenginleştirilmiştir. Tüpün altındaki kırmızı kan hücrelerini tedirgin etmemek için mıknatısla temas halinde olan tüpün yan tarafına ve izolasyonun ilk turunda (adım 2.11) dokunmamaya özen izlenmelidir. Zenginleştirilmiş hücre süspansiyonunun yeni bir konik tüpe (adım 2.24) borulamasının son turundan sonra nötrofiller hemen ileride işleme için kullanılabilir. Nötrofiller hücrelerdeki LRRK2 aktivitesini değerlendirmek için kullanılırsa, nötrofiller daha sonra iki gruba ayrılır ve santrifüj ile peletleme sonra, ya bir LRRK2 kizaz inhibitörü resuspended (burada, MLi-2) veya DMSO hücre kültürü orta içeren. LRRK2 kinaz inhibisyonu yokluğunda varlığında defosforilasyon ve refosforilasyon nispeten hızlı olaylar olduğundan, MLi-2 tedavi edilen nötrofil fraksiyonunun LRRK2 kizaz inhibitörüne maruz kalmasını sağlamak için dikkatli olunmalıdır (örn. MLi-2) hücre lisise kadar (adım 3.8-3.10).
Bu protokolde 15 ve 50 mL konik tüpler kullanılarak birkaç santrifüj adımı vardır. Protokolde belirtilen santrifüj hızlarını rutin olarak kullanırken, hücrelerin canlılığını olumsuz etkilemeden santrifüj hızını 400 x g'ye kadar artırmak mümkündür. Bu, bu protokol sırasında süpernatant adımların decanting ve pipetleme sırasında nötrofil malzemenin herhangi bir potansiyel kaybını azaltmaya yardımcı olabilir biraz daha sıkı nötrofil hücre pelet ile sonuçlanır. Bu büyük olasılıkla elde edilen toplam protein lisat açısından verimi artıracaktır. Potansiyel bir endişe, daha yüksek bir santrifüj kuvvetin nötrofilleri aktive edip sonraki analizleri potansiyel olarak etkileyebileceğidir. Genel tavsiyemiz protokolün her aşamasında nötrofilleri mümkün olduğunca nazik bir şekilde ele almaktır.
Protokolümüz nötrofil lisis tamponunun bir parçası olarak son derece güçlü serin proteaz inhibitörü DIFP (0.5 mM) kullansın. DIFP güçlü bir organofosfor nörotoksindir ve alternatif bileşikleri araştırMış olsak da, lysis tamponuna eklenmesi, insan nötrofillerinde lrrk2 kontrollü Rab10 fosforilasyonunun immünoblotting ile analizi için gerekliydi. Örneğin, DIFP'nin%1 (w/v) SDS ile değiştirilmesi diğer çalışmalarda nötrofillerin lyse için kullanılmıştır 19 ve lrrk2, Rab10 ve hatta GAPDH yükleme kontrolü için immünoblotting bir sinyal vermedi ölçüde önemli protein bozulmasına yol açtı, böylece lysis buffer (Şekil 2C)bir derece güçlü proteaz inhibitörü dahil önemini vurgulayarak. 2.5 mM daha az güçlü, aynı zamanda daha az toksik serin proteaz inhibitörü PMSF ile DIFP yerine, Rab10 fosporylation iyi korunmuş, ancak büyük LRRK2 protein önemli bozulma yapıldı(Şekil 2C). DIFP stok çözeltisinin kullanımını en aza indirmek için, DIFP içeren lysis tamponu toplu olarak hazırlanabilir, -20 °C veya -80 °C11'desaklanabilir. Kantitatif immünoblotting ile analiz ile ilgili olarak, sadece tek bir LRRK2 fosforlu Rab proteini için seçici olduğu gösterilmiştir bir fosfospesifik antikor kullanmak önemlidir, MJFF-pRab10 antikor çalışmalarımız için kullanılan gibi14.
Protokol ayrıca 25 mL'ye kadar maksimal bir tam kan hacmi kullanılarak ölçeklendirilebilir, bu da 50 mL konik tüpleri tutabilen tek bir mıknatıs kullanılarak tek bir izolasyon işleminde işlenebilen sınırdır. Ayarlamalar gerektiren tek adım 2.4 (mL başına 50 μL izolasyon kokteyli eklenmesi), 2.6 ve 2.12 adımları (kan mL başına 50 μL manyetik boncuk ekleme) ve adım 3.12'de nötrofil lisis için lysis tampon hacminde orantılı bir artış. Diğer tüm adımlar aynı tutulabilir.
Özetle, protokolümüz insan nötrofillerini periferik kandan izole etmek için kolay ve sağlam bir yöntem tanımlar. Nötrofiller daha sonra ve güçlü ve spesifik LRRK2 kinaz inhibitörü olmadan rab10 in vivo LRRK2 kontrollü fosforilasyon kantitatifikasyon sağlamak için tedavi edilebilir. Bu LRRK2 kinaz yolu aktivitesine göre bireylerin tabakalaşma ve gelecekteki LRRK2 kiyaz inhibitörü tedavisinden yararlanabilir yol hiperaktivasyonu olanlar tanımlamak için yararlı olabilir. Bu PD olan kişilerin çoğunluğu için olası olsa da, özellikle idiyopatik PH, bizim test zaten başarıyla başka bir PD ilişkili gen, VPS35 D620N, lrrk2 kiyaz yolu aktivitesi önemli ölçüde henüz bilinmeyen bir mekanizma15tarafından artırılır nadir, heterozigot mutasyon taşıyan bireylerde konuşlandırılmıştır . Daha önce lrrk2 kontrollü Rab 10 fosforilasyon düzeyleri bireylerin daha yaygın LRRK2 G2019S mutasyonu taşıyan sadece mütevazı lrrk2 kinaz aktivitesi ni aktive etmek için bilinen incelenmiş vardı iki civarında bir faktör ile kontroller ve idiyopatik PD ile hastalara göre önemli bir fark tespit olmadanbizimasa1,14. Bu ve daha fazla yayınlanmamış veriler LRRK2 kiyaz aktivitesi muhtemelen kantitatif immünoblotting kullanarak önemli bir sonuç elde etmek için >3x bir artış gerektirdiğini göstermektedir. Ancak, lrrk2 kinaz yolu aktivasyonunu algılama duyarlılığı, son teknoloji kütle spektrometresi teknolojisi nin devreye alınması durumunda büyük olasılıkla artabilir.
Nötrofillerin Parkinson hastalığı araştırmaları için LRRK2 kinazyolu aktivitesi için değerli bir kaynak olduğunu ve gelecekteki LRRK2 kinaz inhibitörü tedavisinden yararlanabilecek bireylerin belirlenmesine yardımcı olabileceğini öneriyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma için kan bağışında bulunan sağlıklı gönüllülere teşekkür ederiz. Biz Michael J. Fox Vakfı Parkinson Araştırma için teşekkür (MJFF) ve Fox BioNet çalışma liderlik (FBN) destek ve yazılı protokol ve video doğru giriş için. Avusturya'daki Viyana Üniversitesi'nden Profesör Alexander Zimprich'e protokolümüzü ve işbirliğimizi test ettiği için teşekkür ederiz. Paul Davies'in projeye katkılarına değer vermekteyiz (MRC PPU genel müdürü). Ayrıca MRC Protein Fosforilasyon ve Ubiquitition Unit (PPU) yani Kimyasal Sentez (Natalia Shpiro MLi-2 sentezi için), MRC PPU Reaktifler ve Hizmetler antikor arıtma ekipleri (tarafından koordine mükemmel teknik destek tanımak Hilary McLauchlan ve James Hastie). Biz Video ve animasyonlar yapımında yardım için Vivomotion Gelen Mhairi Towler ve Fraser Murdoch teşekkür ederiz. Biz steve Soave 81 film den son edinimleri ile yardım için teşekkür ederiz. Esther Sammler Bir İskoç Kıdemli Klinik Akademik Bursu tarafından desteklenir ve Parkinson İngiltere (K-1706) fon aldı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Pipette tips | Sarstedt | 70.762 | or equivalent |
| 1.5 mL Micro tubes | Sarstedt | 72.690.001 | or equivalent |
| 10 mL Pipette tips | Sarstedt | 86.1254.025 | or equivalent |
| 10 μL Pipette tips | Sarstedt | 70.113 | or equivalent |
| 15 mL falcon tube | Cellstar | 188 271 | or equivalent |
| 200 μL Pipette tips | Sarstedt | 70.760.002 | or equivalent |
| 25 mL Pipette tips | Sarstedt | 86.1685.001 | or equivalent |
| 50 mL falcon tube | Cellstar | 227 261 | or equivalent |
| BD Vacutainer Hemogard Closure Plastic K2-EDTA Tube | BD | BD 367525 | or equivalent |
| Beckman Coulter Allegra X-15R centrifuge | Beckman | or equivalent centrifuge with swimging bucket rotator for 15 mL and 50 mL falcon tubes at speed 1000-1200 x g | |
| Category 2 biological safety cabinet. | |||
| cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
| DIFP (Diisopropylfluorophosphate) | Sigma | D0879 | Prepare 0.5M stock solution in isopropanol using special precautions |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | 6250 | |
| Dry ice or liquid nitrogene | |||
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | ThermoFisher | 14190094 | or equivalent |
| Easy 50 EasySep Magnet | Stemcell | 18002 | for holding 1 x 50ml conical tube |
| EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit | Stemcell | 19666 | This contains Solutions called “Isolation Cocktail” and “RapidSpheres magnetic beads |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Eppendorf centrifuge 5417R centrifuge | Eppendorf | ||
| Ethanol, in spray bottle | |||
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | E6758 | |
| Ice | |||
| Isopropanol (anhydrous grade) | Sigma | 278475 | |
| Lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1%(v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF, 10 mM β-glycerophosphate, 5 mM sodium pyrophosphate, 0.27 M sucrose, 0.1% (v/v) β-mercaptoethanol, 1x cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail (Roche), 1 μg/ml Microcystin-LR, 0.5 mM diisopropylfluorophosphate (DIFP). | alternatively frozen lysis buffer in aliquots without Microcystin-LR, DIFP available from MRC-PPU Reagents (http://mrcppureagents.dundee.ac.uk/) | ||
| Merck LRRK2 inhibitor II (MLi-2) | Merck | 438194-10MG | or equivalent (potent and selective LRRK2 inhinitor) |
| Microcystin-LR | Enzo Life Sciences | ALX-350-012-M001 | 1 mg/ml stock in DMSO and store at -80 oC. |
| Na3VO4 | Aldrich | 450243 | |
| NaF | Sigma | S7920 | |
| Odyssey CLx scan Western Blot imaging system | Odyssey | ||
| Permanent marker pen | |||
| Personal protection equipment | |||
| RPMI 1640 Medium | ThermoFisher | 21875034 | or equivalent |
| sodium pyrophosphate | Sigma | S22 | |
| sucrose | Sigma | S0389 | |
| β-glycerophosphate | Sigma | 50020 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| Suggested antibodies for Western blotting | |||
| Anti-RAB10 (phospho T73) antibody [MJF-R21] | abcam | ab230261 | |
| Anti-α-tubulin | Cell Signaling Technologies | 5174 | used at 1:2000 dilution |
| Goat anti-mouse IRDye 680LT | LI-COR | 926-68020 | used at 1:10,000 dilution |
| Goat anti-mouse IRDye 800CW | LI-COR | 926-32210 | used at 1:10,000 dilution |
| Goat anti-rabbit IRDye 800CW | LI-COR | 926-32211 | used at 1:10,000 dilution |
| MJFF-total Rab10 mouse antibody | generated by nanoTools (nanotools.de) | not applicable* | used at 2 μg/ml final concentration; * The MJFF-total Rab10 antibody generated by nanoTools (www.nanotools.de) [11] will be commercialised by the Michael J Fox Foundation in 2018 |
| Mouse anti-LRRK2 C-terminus antibody | Antibodies Incorporated | 75-253 | used at 1 μg/ml final concentration |
| pS935-LRRK2 | MRC PPU Reagents and Services | UDD2 | used at 1 μg/ml final concentration |
References
- Paisan-Ruiz, C., et al. Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson's disease. Neuron. 44 (4), 595-600 (2004).
- Fell, M. J., et al. MLi-2, a Potent, Selective, and Centrally Active Compound for Exploring the Therapeutic Potential and Safety of LRRK2 Kinase Inhibition. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 355 (3), 397-409 (2015).
- Zimprich, A., et al. Mutations in LRRK2 cause autosomal-dominant parkinsonism with pleomorphic pathology. Neuron. 44 (4), 601-607 (2004).
- Sardi, S. P., Cedarbaum, J. M., Brundin, P. Targeted Therapies for Parkinson's Disease: From Genetics to the Clinic. Journal of Movement Disorders. 33 (5), 684-696 (2018).
- Steger, M., et al. Phosphoproteomics reveals that Parkinson's disease kinase LRRK2 regulates a subset of Rab GTPases. Elife. 5, (2016).
- Ito, G., et al. Phos-tag analysis of Rab10 phosphorylation by LRRK2: a powerful assay for assessing kinase function and inhibitors. Biochemical Journal. 473 (17), 2671-2685 (2016).
- Alessi, D. R., SammLer, E. LRRK2 kinase in Parkinson's disease. Science. 360 (6384), 36-37 (2018).
- Yue, M., et al. Progressive dopaminergic alterations and mitochondrial abnormalities in LRRK2 G2019S knock-in mice. Neurobiology of Disease. 78, 172-195 (2015).
- Doggett, E. A., Zhao, J., Mork, C. N., Hu, D., Nichols, R. J. Phosphorylation of LRRK2 serines 955 and 973 is disrupted by Parkinson's disease mutations and LRRK2 pharmacological inhibition. Journal of Neurochemistry. 120 (1), 37-45 (2012).
- Sheng, Z., et al. Ser1292 autophosphorylation is an indicator of LRRK2 kinase activity and contributes to the cellular effects of PD mutations. Science Translational Medicine. 4 (164), (2012).
- Fan, Y., et al. Interrogating Parkinson's disease LRRK2 kinase pathway activity by assessing Rab10 phosphorylation in human neutrophils. Biochemical Journal. 475 (1), 23-44 (2018).
- Scott, J. D., et al. Discovery of a 3-(4-Pyrimidinyl) Indazole (MLi-2), an Orally Available and Selective Leucine-Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) Inhibitor that Reduces Brain Kinase Activity. Journal of Medicinal Chemistry. 60 (7), 2983-2992 (2017).
- Pham, C. T. Neutrophil serine proteases: specific regulators of inflammation. Nature Reviews Immunology. 6 (7), 541-550 (2006).
- Lis, P., et al. Development of phospho-specific Rab protein antibodies to monitor in vivo activity of the LRRK2 Parkinson's disease kinase. Biochemical Journal. 475 (1), 1-22 (2018).
- Mir, R., et al. The Parkinson's disease VPS35[D620N] mutation enhances LRRK2-mediated Rab protein phosphorylation in mouse and human. Biochemical Journal. 475 (11), 1861-1883 (2018).
- Rieckmann, J. C., et al. Social network architecture of human immune cells unveiled by quantitative proteomics. Nature Immunology. 18 (5), 583-593 (2017).
- Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
- Bain, B., Dean, A., Broom, G. The estimation of the lymphocyte percentage by the Coulter Counter Model S Plus III. Clinical & Laboratory Haematology. 6 (3), 273-285 (1984).
- Tomazella, G. G., et al. Proteomic analysis of total cellular proteins of human neutrophils. Proteome Science. 7, 32 (2009).
