Summary
Formålet med den metode, der præsenteres her, er at vise, hvordan mikromiljø mikroarrays (MEMA) kan fremstilles og bruges til at afhøre virkningen af tusindvis af enkle kombinatoriske mikromiljøer på Fænotypen af dyrkede celler.
Abstract
Forståelse af mikromiljøets indvirkning på fænotype af celler er et vanskeligt problem på grund af den komplekse blanding af både opløselige vækstfaktorer og matrix-associerede proteiner i mikromiljøet in vivo. Endvidere, let tilgængelige reagenser til modellering af mikromiljøer in vitro typisk udnytter komplekse blandinger af proteiner, der er ufuldstændigt defineret og lider af batch til batch variabilitet. Micro Environment microarray (MEMA) platformen giver mulighed for vurdering af tusindvis af enkle kombinationer af mikromiljø proteiner for deres indvirkning på cellulære fænotyper i en enkelt analyse. Memas er tilberedt i brønd plader, som tillader tilsætning af individuelle ligander til at adskille brønde, der indeholder klædt ekstracellulære matrix (ECM) proteiner. Kombinationen af det opløselige ligand med hver trykt ECM danner en unik kombination. En typisk MEMA-analyse indeholder mere end 2.500 unikke kombinatoriske mikromiljøer, som cellerne eksponeres for i en enkelt analyse. Som en test Case, brystkræft cellelinje MCF7 blev belagt på MEMA platformen. Analysen af denne analyse identificerede faktorer, der både forbedrer og hæmmer væksten og spredningen af disse celler. MEMA platformen er meget fleksibel og kan udvides til brug med andre biologiske spørgsmål ud over kræftforskning.
Introduction
Dyrkning af Cancer cellelinjer på plastik i to-dimensionelle (2D) monolag er fortsat en af de store arbejdsheste for kræftforskere. Men, mikromiljøet er i stigende grad anerkendt for sin evne til at påvirke cellulære fænotyper. I kræft, tumor mikromiljø er kendt for at påvirke flere cellulære adfærd, herunder vækst, overlevelse, invasion, og respons på terapi1,2. Traditionelle enkeltlags cellekulturer typisk mangler mikromiljø påvirkninger, som har ført til udviklingen af mere komplekse tredimensionelle (3D) assays at dyrke celler, herunder kommercielt tilgængelige renset kælder membran ekstrakter. Men disse rensede matricer er typisk komplicerede at bruge og lider af tekniske problemer såsom batch variation3 og komplekse kompositioner3. Som et resultat, det kan være vanskeligt at tildele funktion til specifikke proteiner, der kan påvirke cellulære fænotyper3.
For at imødegå disse begrænsninger har vi udviklet mikromiljømikrosystemet (mema) teknologi, som reducerer mikromiljøet ned til enkle kombinationer af ekstracellulære matrix (ECM) og opløselige vækstfaktor proteiner4,5 . MEMA-platformen gør det muligt at identificere dominerende mikromiljømæssige faktorer, der påvirker cellernes opførsel. Ved at bruge et array-format kan tusindvis af kombinationer af mikromiljø faktorer blive analyseret i et enkelt eksperiment. MEMA beskrevet her forhør ~ 2.500 forskellige unikke mikromiljø betingelser. ECM proteiner trykt i brønden plader form vækst puder på hvilke celler kan dyrkes. Opløselige ligander tilsættes til individuelle brønde, hvilket skaber unikke kombinatoriske mikromiljøer (ECM + ligand) på hvert andet sted, som cellerne er eksponeret for. Celler dyrkes i flere dage, derefter fast, plettet, og afbildet at vurdere cellulære fænotyper som følge af eksponering for disse specifikke mikromiljø kombinationer. Da mikromiljøer er enkle kombinationer, er det ligetil at identificere proteiner, der kører store fænotypiske ændringer i celler. Memas er blevet brugt med succes til at identificere faktorer, der påvirker flere cellulære fænotyper, herunder dem, der drev celle skæbne beslutninger og reaktion på terapi4,5,6,7. Disse reaktioner kan valideres i simple 2D eksperimenter og kan derefter vurderes under forhold, der mere fuldstændigt rekapitulere kompleksiteten af tumor mikromiljø. MEMA platformen er meget tilpasningsdygtig til en række forskellige celletyper og endepunkter, forudsat at gode fænotypiske biomarkører er tilgængelige.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: En oversigt over hele MEMA-processen, herunder Anslået tid, er skitseret i det flowdiagram, der vises i figur 1. Denne protokol beskriver fremstillingen af MEMAs i 8-brønd plader. Protokollen kan tilpasses til andre plader eller dias.
1. fremstilling af protein-, fortyndings-og farvnings buffere
- Ækvibrere hætteglas med ECMs, ligands og cytokiner til rumtemperatur (RT) og centrifugeres kortvarigt. Tilføj passende volumen af den relevante RT-buffer som angivet i produktdatabladet. Følg producentens anbefaling for lager koncentrationer.
Bemærk: I tabel 1 og tabel 2findes en komplet liste over ligander og ECMS med deres beholdning og endelige koncentrationer. Både ligander og ECMS bruges typisk ved den højeste koncentration af det område, som anbefales af producenten, der fremkalder en biologisk effekt i standard 2-dages kulturanalyser. Håndtér proteiner forsigtigt og i biosikkerhedskabinetter under laminar flow for at undgå kontaminering. - Incubate hætteglas med blid Rocking på RT for 1 h. Du må ikke vortex proteiner, da dette kan få dem til at denature.
- Alikvotproteiner til langtidsopbevaring, således at alle aliquoter kun anvendes til engangsbrug for at undgå nedbrydning med gentagne fryse/tø-cyklusser. Der opbevares lyofiliserede proteiner ved-80 °C (medmindre andet er angivet), indtil det er nødvendigt. Vær forsigtig med at indsamle alle metadata til fremtidig reference, såsom: (i) protein navn, (II) dato forberedt, (III) parti/batchnummer, (IV) leverandør, (v) katalognummer, (vi) koncentration, (VII) volumen, og (VIII) klargører.
- Forbered fortyndingsbuffer indeholdende 20% (v/v) glycerol, 10 mM EDTA, 200 mM Tris-HCl, pH 7,2 og filter sterilisering. Opbevar denne buffer steril og opbevar på RT.
- Der forberedes en farvnings buffer med 2% (w/v) BSA, 1 mM MgCl2og 0,02% Nan3 i fosfat-bufferet saltvand (PBS). Opbevares ved 4 °C.
2. klargøring af en ECM-kilde plade
- Fjern aliciterede lagre af ECM-proteiner, der skal trykkes og tø på is. Registrer alle lotnumre til sporing af metadata.
- Svip rør af optøede proteiner forsigtigt for at sikre korrekt opblanding og spin ned i en centrifuge.
-
Gør ECM print blandinger (EPMs) og en fluorescerende fiducial til at blive brugt af en væske håndteringsrobot, der vil skabe de randomiserede 384-brønd kilde plader.
Bemærk: 384-brønden kilde plader vil blive brugt af en touch PIN array printer til at oprette de trykte arrays i 8 brønd plader.- Etiketten 1,5 mL mikrocentrifuge glas til hver EPM og den fiducial.
- Hver EPM forberedes ved at kombinere 125 μL fortyndingsbuffer (Se trin 1,4) med den passende volumen af ECM-lager og bringe blandingen op på et samlet volumen på 250 μL med PBS. De endelige koncentrationer i hver EPM tube vil være 1x ECM protein, 5 mM EDTA, 10% glycerol, og 100 mM Tris.
- Forbered et fluorescerende fiducial ved at opløse det i den passende buffer, der er angivet af fabrikanten, og Overfør 250 μL til et mærket fiducial rør.
3. oprettelse af kilde pladen ved hjælp af en væske handler
- Design en 384-brønd plade layout, der randomiserer positionerne af ECMs og er optimeret til array printer PIN hoved anvendes. Design placeringen af den fiducial, så det vil blive trykt i rækken 1, kolonne 1 placering af hver brønd til at hjælpe i array orientering.
Bemærk: I alt 14 − 15 replikater af hver ECM anvendes til at sikre solide data. Medtag yderligere replikater af kollagen eller en anden ECM, der giver robust fastgørelse til vurdering af ensartethed af binding. Layoutet kan være nødvendigt at udnytte flere 384-brønd plader afhængigt af antallet af ECMs af interesse. - Overfør EPM-rørene til en væske handler, og rør ved 4 °C enten med en afkølet Rørholder eller ved hjælp af en væske håndteringsrobot i et kølerum.
- Brug Liquid-Handlerens software til at køre et program til overførsel af 15 μL af hver EPM og den fiducial til de præudpegede brønde inden for 384-brønd kilde pladen (-erne).
- Pipet PBS ind i ubrugte brønde for at øge luftfugtigheden og beskytte mod udtørring under trykningen.
Bemærk: Se figur 2 for et eksempel på et 384-Well source-plade sæt, der er optimeret til et 4 x 7-bens hoved og indeholder en kollagen I-blok og PBS. - Tætningspladen (-erne) og opbevares ved 4 °C, indtil de er klar til udskrivning.
4. udskrivning af MEMAs ved hjælp af en matrix udskrivnings robot
Bemærk: Den følgende del af protokollen beskriver specifikt forberedelsen og anvendelsen af MEMA for at undersøge virkningen af forskellige mikromiljøproteiner på vækst og udbredelse af MCF7 celler. Men, protokollen kan nemt tilpasses til at bruge forskellige ligands, ECMs, og celler til at studere andre cellelinjer og endpoints af interesse.
-
Ved hjælp af en touch PIN printer, udskrive EPM og fiducial pletter i 8 brønd plader. Udskriv flere replikater af hver ECM-tilstand for at sikre reproducerbarhed.
Bemærk: andre plade formater eller dias kan bruges til udskrivning, men det kan være nødvendigt at optimere bufferen for at opnå optimal spot dannelse.- Udskriv ECMs for MEMA ved hjælp af 350 μm diameter stifter arrangeret i en 4 x 7 printhoved konfiguration. Udskriv matricer i 8-brøndens plader som 20 kolonner med 35 rækker, for i alt ~ 700 pletter. Større arrays er mulige i disse plader, men kommer med en trade-off af øget kanteffekter i både cellebinding og farvning.
- Efter udskrivningen opbevares pladerne i en ekssikkator i mindst 3 dage før brug.
5. oprettelse af ligand-behandlings plader
- Design en 96-brønd plade layout, herunder ligander af interesse. For at lette behandlingen af mange mema plader på én gang, designe denne plade med afstand, der giver mulighed for brug af en multi-kanal pipet med 4 fordelt tips til at overføre væsker mellem brøndene af 8-Well Memas og en 96-brønd plade.
Bemærk: I denne protokol udnyttes det fulde sæt af ligander, der er angivet i tabel 2 . - Tø ligander på is. Svip og drej kortvarigt hvert rør.
- Fortynd ligander til et 200x arbejdslager ved hjælp af producentens anbefalede buffer (typisk PBS).
- Pipet 10 μL af hvert 200x ligand-materiel ind i det tilsvarende brønd inden for 96-brønd pladen.
- Forsegl og opbevar pladerne ved-20 °C.
Bemærk: Foretag ligand-behandlings plader i batches, og Indfang alle metadata til downstream-analyse.
6. dyrkning af celler på MEMAs
- Blokere MEMAs i 20 min med 2 mL pr. brønd af ikke-fouling blokerende buffer indeholdende 1% ikke-fouling blokerende middel (tabel over materialer) i dobbeltdestilleret vand (DDH2O).
- Aspirere blokerende buffer og tredobbelt skylle brønde med PBS. For at forhindre udtørring, lad den endelige volumen af PBS i brønde indtil klar til celle plating.
Bemærk: Det er yderst nyttigt at have to bænk arbejdere for cellekultur skridt på MEMAs. En bænk arbejder kan udføre Aspirations trin, mens den anden udfører yderligere trin. Det anbefales at bruge et 1 mL multikanals pipet med spidser, der passer til 8-brønd pladen til pipettering og en Y-splitter med to Pasteur-pipetter for at aspirere flere brønde på én gang. - Frø 2 x 105 MCF7 celler pr brønd i 2 ml dulbecco's modificerede ørne medium (DMEM) medium indeholdende 10% føtal kvægserum (FBS).
Bemærk: Før et fuldt MEMA-eksperiment skal du udføre et celle titrerings eksperiment for at optimere celle numrene, så MEMA-pletter har høje cellenumre (men ikke er flydende) i slutningen af den ønskede eksperimentelle varighed. - Efter 2 − 18 h adhæsion, aspirere medium og erstatte med 2 mL reduceret vækstmedium (DMEM med 0,1% FBS).
Bemærk: Reduceret serum (f. eks. 0,1% FBS) eller vækstfaktor-depleterede betingelser kan anvendes på dette tidspunkt til at isolere de stimulerende virkninger af specifikke ligands. - Tø en ligand behandlings plade på is. Centrifuge optøet plade ved 200 x g i 1 min.
- Overfør 200 μL medium fra hver brønd i kultur pladen til det rette brønd i behandlings pladen. Pipet op og ned for at blande ligand volumen med medium og overføre denne blanding tilbage til det rette godt i MEMA pladen.
- Let klippe i hånden og returnere MEMA plader til inkubator. Kultur i hele forsøgsperioden i nærværelse af ligand/ECM-kombinationen ved 37 °C og 5% CO2.
Bemærk: Et typisk MEMA-eksperiment kører for 72 h; længere varighed eksperimenter kan kræve udskiftning af medium og re-behandling med ligand. - Puls MEMA brønde ved 71 h med 100x 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) for en endelig koncentration på 10 μM. Inkuber i forsøgsforhold med EdU i 1 time ved 37 °C og 5% CO2.
Bemærk: Andre levende celle behandlinger kan også anvendes på dette tidspunkt.
7. fastgørelse og farvning af MEMAs
- Efter 72 h og eventuelle levende celle behandlinger, aspirere brønde. Fix MEMAs i 2 mL pr. brønd af 2% PARAFORMALDEHYD (PFA) i 15 min ved RT.
- Aspirate PFA. Permeabilize med 2 mL pr. brønd på 0,1% nonionisk overfladeaktivt stof i 15 min.
- Aspirer det nonioniske overfladeaktive stof og vask med 2 mL pr. brønd af PBS. Aspirere PBS. Vask med 2 mL PBS med 0,05% Polysorbat 20 (PBS-T).
Bemærk: MEMA overfladen er hydrofobe, og manglende vask med PBS-T før bejdsning og antistof inkubation vil resultere i dannelsen af hulrum i brønde under inkubations trin og give anledning til farvning artefakter. - Aspirere PBS-T. Tilføj EdU-detekterings reaktions reagenser. Inkuber i 1 time ved RT, Rocking og beskyttet mod lys. Efter 1 h inkubation, dæmpnings reaktion med den medfølgende kommercielle slukke buffer.
Bemærk: EdU-detekterings-og farvnings/antistof trin kan udføres i 1,5 mL pr. brønd for at reducere omkostningerne. - Sug dæmpnings bufferen ud, og vask den med PBS-T, før du inkuerer med pletter eller antistoffer.
- Incubate MEMA brønde med antistoffer mod Histon H3K9me3 (1:1000) og fibrillarin (1:400) i farvnings buffer indeholdende 2% (w/v) bovin serumalbumin (BSA), 1 mM MgCl2 og 0,02% Nan3 natten over ved 4 °c.
Bemærk: Udfør Antistoftitreringer for at bestemme optimale koncentrationer, før de anvendes på et fuldt MEMA-sæt. - Efter primær antistof-eller pletinkubation vaskes brønde 2x med PBS og én gang med PBS-T.
- Tilsæt sekundære antistoffer (æsel anti-mus IgG og æsel anti-kanin IgG, begge 1:300) og 0,5 μg/mL 4 ′ 6-diamidino ‐ 2-phenylindol (DAPI). Inkuber i 1 time ved RT i mørket.
- Vask brønde 2x med 2 mL per brønd PBS, efterlader dem i den endelige 2 mL PBS.
- Fortsæt til Imaging eller Opbevar farvede MEMAs til senere billeddannelse i PBS ved 4 °C beskyttet mod lys.
8. billeddannelse af MEMAs
- Billede MEMA på et automatiseret billedbehandlingssystem med passende fluorescerende detektionskanaler.
- Output resulterende billeddata til et billede management system. Segmentere celler og beregne intensitetsniveauer ved hjælp af CellProfiler8.
9. data analyse
Bemærk: Dataanalyse består af normalisering, variation korrektion, og opsummering af RAW CellProfiler afledte data. I dette tilfælde bruges R-miljø med brugerdefineret kode til at udføre alle trinene. Dog kan ethvert statistisk miljø eller softwareprogram udnyttes til at udføre de tilsvarende handlinger. Et eksempel på den brugerdefinerede open source-kode for R-miljøet til analyse findes på: https://www.synapse.org/#!Synapse:syn2862345/wiki/72486.
- Forbehandl og normaliserer de segmenterede billeddata.
- Bestem spot celletal ved hjælp af DAPI farvede kerner.
- Auto-Gate EdU-intensitet til at mærke celler som EdU+. Mål spredning ved hjælp af andelen af EdU+ celler i hvert sted.
- Median opsummerer cytoplasmiske pletter og nukleare morfologiske målinger på spot niveau.
- Udfør fjernelse af uønsket variation (RUV) normalisering på data for at forbedre datakvalitet9.
Bemærk: Denne fremgangsmåde anvendes på hver intensitet og morfologi signal uafhængigt som en matrix med arrays ved hjælp af rækker og pletter som kolonnerne som beskrevet tidligere9. - Anvend bivariate loess-normalisering på de RUV-normaliserede residualer ved hjælp af matrix rækken og matrix kolonnen som de uafhængige variabler, der skal rettes mod rumlige eller intensitets relaterede effekter.
- Når normaliseringen er fuldført, opsummerer median replikater for hver enkelt mikromiljø betingelse for rapportering og yderligere analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at forenkle mikromiljømæssige påvirkninger af cellevækst og-spredning og for at identificere forhold, der fremmede eller hæmmede cellevækst og-spredning, blev brystkræft celle linjen MCF7 seedet på et sæt af otte 8-godt MEMAs som beskrevet i protokollen. Denne analyse eksponerede cellerne til 48 forskellige ECMs og 57 forskellige ligands, for i alt 2736 kombinatoriske mikromiljømæssige forhold. Efter 71 h i kulturen blev cellerne pulseret med EdU, fikseret, gennemsyret og plettet med DAPI, reaktionen for EdU Detection, et anti-Fibrillin antistof, og et anti-H3K9me3 antistof. Celler blev indlagret på et højt indhold mikroskop. Billederne blev uploadet til en Omero server10, segmenteret ved hjælp cellprofiler8, og normaliseret og analyseret i R9. De nedenfor beskrevne resultater fokuserer på DAPI-og EdU-signalerne.
Den billedanalyse platform af MEMAs giver nogle resultater svarende til dem, der er tilgængelige fra flow cytometri tilgange, såsom DNA-indhold plots viser 2N og 4N fraktioner for celler behandlet med en given ligand (figur 3a), baseret på dapi intensitet og areal. Disse parceller giver dokumentation for forhold, der fremmer aktiv celle cykling versus som indikeret af klare bimodale toppe svarende til celler i G1 eller G2 faser vs. vækst anholdt celler, som ville vise ændringer i toppe sammenlignet med kontrolbetingelser. Vi bruger celle nummer og farvning intensitet data til at opsummere de data, hvor virkningen af mikromiljøet (ligands på én akse, ECM på den anden akse) på begge celle nummer (figur 3B) og EdU inkorporering (figur 3C) kan lettere ses som ændringer i heatmap farve og intensitet. Som det fremgår af disse parceller, mange af virkningerne er ligand-drevet, da ECM tilstand ikke stærkt påvirke celle nummer eller EdU positivitet. Nidogen-1 er en klar undtagelse, da tilstedeværelsen af denne ECM molekyle hæmmer cellebinding og vækst af MCF7. Ligander såsom FGF6 og NRG1α (NRG 1.1 på parceller) forbedre celle nummer og har høje satser for EdU inkorporering, mens ligander såsom Areg og NRG1-smdf (NRG 1.10 på parceller) hæmme cellebinding og/eller vækst af celler. Disse fund understøttes af billederne af de celler, der vokser på pletterne, hvor en tydelig forskel i celleantal og EdU positivitet er tydelig (se eksempel i figur 3D).
Da MEMA-platformen er en nyere teknologi, blev resultaterne valideret i separate assays. MCF7 celler blev seedet i 24-brønd plader belagt med kollagen i i DMEM medium med 10% FBS. Efter 18 timer blev medierne udvekslet med reduceret vækstmedium (DMEM med 0,1% FBS), og cellerne blev behandlet med NRG1α, FGF6 eller AREG og dyrket for 72 h. EdU blev tilføjet 1 time før fiksering. Celler blev plettet med DAPI og for EdU inkorporering, imaged, segmenteret, og analyseret. På samme grundlag som resultaterne fra MEMA-platformen gav både FGF6 og NRG1α anledning til højere celle tal (figur 4A) og EdU-Iblandings rater (figur 4B) sammenlignet med Areg-behandlede celler, idet vi validerer vores observationer i de oprindelige MEMA eksperimenter.
Figur 1 : Rutediagram, der viser arbejdsprocessen og tidslinjen for de forskellige faser i et typisk MEMA-eksperiment. Når MEMAs er trykt, kan de opbevares ved stuetemperatur, der er udtørret i flere måneder før brug. Typisk, den eksperimentelle fase varer 3 − 4 dage, men nogle langsomt voksende primære celler er blevet dyrket på MEMAs i op til 2 uger. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : ECM-kilde plade layout til array-udskrivning. Kollagenblokken udskrives på MEMA som et gitter, som giver et meget gentagende sæt betingelser, der giver mulighed for mere robust normalisering mellem brønde. De PBS-fyldte brønde giver fugt til hjælp til forebyggelse af fordampning under trykningen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Eksempler på data genereret fra et typisk MEMA-eksperiment. (A) celle cyklus profiler af lodret dapi-intensitetsværdier versus celletal fra en 8-brønd plade behandlet med forskellige ligands, viser bifasisk dapi intensitet farvning indikerer celler i G1 versus G2 celle cyklus fase. (B) heatmap viser normaliseret spot celle tæller grupperet efter lighed ved hjælp af hierarkisk klyngedannelse. Rød indikerer højere celle nummer, og blå er lavere celle nummer. Ligands er på x-aksen, ECMs er på y-aksen. (C) heatmap viser normaliseret EdU inkorporering, med rød indikerer højere og blå indikerer lavere EdU inkorporering. Ligands er på x-aksen, ECMs er på y-aksen. D) eksempel på MCF7 celler, der vokser på et mema spot behandlet med NRG1-α, som viser høje uddannelses rater (Pink kerner). Grøn plet er celle maske og blå er DAPI. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Validering af MEMA-resultater i cellekultur. (A) kvantificering af celle nummer som følge af behandling af MCF7 med forskellige ligands. Tilsvarende antal MCF7 celler blev belagt i multi Vægplader derefter behandlet med enten AREG, FGF6 eller NRG1α. Brønde behandlet med AREG havde signifikant færre celler end dem, der blev behandlet med FGF6 (* * indikerer student's t-test p-værdier mindre end 0,01) eller NRG1α (* indikerer en p-værdi på 0,05) ved 72 h post ligand behandling. B) kvantificering af niveauet for EdU-inkorporering i MCF7 på grund af behandling med forskellige ligander, som i panel A. Behandling med AREG resulterer i en signifikant lavere andel af celler, der inkorporerer EdU end celler behandlet med FGF6 (* *, p < 0,01) eller NRG1α (* * *, p = 0,01). Fejllinjer repræsenterer standardafvigelsen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Protein navn | Uniprot-ID | Lager Koncentration (μg/mL) |
Endelige Koncentration (μg/mL) |
| ANGPT1 | 1 | Q15389 | 1 | 100 | 0,04 |
| ANGPT2 | 1 | O15123 | 1 | 100 | 0,2 |
| AREG | P15514 | 100 | 0,02 |
| BMP2 | P12643 | 100 | 0,1 |
| BMP3 | P12645 | 1000 | 0,1 |
| BMP4 | P12644 | 100 | 0,1 |
| BMP5 | 1 | P22003 | 1 | 100 | 0,1 |
| BMP6 | P22004 | 100 | 0,1 |
| BMP7 | P18075 | 100 | 0,1 |
| CSF2 | P04141 | 100 | 0,02 |
| CTGF | 1 | P29279 | 1 | 100 | 0,05 |
| CXCL12 | Alpha | P48061 | 2 | 100 | 0,01 |
| CXCL12 | Beta | P48061 | 1 | 100 | 0,03 |
| CXCL1 | P09341 | 100 | 0,004 |
| CXCL8 | 1 | P10145 | 1 | 100 | 0,3 |
| FILEN DLL1 | 1 | O00548 | 1 | 500 | 0,5 |
| DLL4 | Q9NR61 | 200 | 0,6 |
| EGF | 1 | P01133 | 1 | 500 | 0,01 |
| FASLG | 1 | P48023 | 1 | 10 | 0,02 |
| FGF2 | 3 | P09038 | 2 | 100 | 0,01 |
| FGF6 | P10767 | 100 | 0,01 |
| FLT3LG | 1 | P49771 | 1 | 50 | 0,001 |
| GPNMB | 1 | Q14956 | 1 | 100 | 0,5 |
| HGF | 1 | P14210 | 1 | 50 | 0,04 |
| IGF1 | 1 | P05019 | 1 | 200 | 0,01 |
| IGFBP2 | P18065 | 100 | 0,05 |
| IGFBP3 | 1 | P17936 | 1 | 100 | 0,1 |
| IL13 | P35225 | 100 | 0,01 |
| IL15 | IL15S48AA | P40933 | 1 | 50 | 0,01 |
| IL1B | P01584 | 25 | 0,001 |
| IL6 | P05231 | 100 | 0,01 |
| IL7 | 1 | P13232 | 1 | 100 | 0,01 |
| JAG1 | 1 | P78504 | 1 | 200 | 0,5 |
| JAG2 | Lang | Q9Y219 | 1 | 100 | 0,5 |
| KITLG | 1 | P21583 | 1 | 100 | 0,005 |
| KNG1 | HMW | P01042 | 1 | 100 | 0,2 |
| Lep | P41159 | 1000 | 0,002 |
| LYVE1 | Q9Y5Y7 | 100 | 0,05 |
| NRG1 | 10 | Q02297 | 10 | 100 | 0,01 |
| NRG1 | 1 | Q02297 | 1 | 100 | 0,05 |
| NRG1 | 6 | Q02297 | 6 | 100 | 0,01 |
| PDGFAB | go1990265 | 100 | 0,05 |
| PDGFB | 1 | P01127 | 1 | 100 | 0,05 |
| Ptn | P21246 | 100 | 0,5 |
| Shh | Q15465 | 100 | 0,5 |
| TGFB1 | | Cterminus | P01137 | Cterminus | 20 | 0,01 |
| TGFB1 | | Lap | P01137 | Lap | 100 | 0,15 |
| TGFB2 | A | P61812 | 1 | 20 | 0,01 |
| THPO | 1 | P40225 | 1 | 50 | 0,002 |
| TNFRSF11B | O00300 | 100 | 0,02 |
| TNFSF11 | 1 | O14788 | 1 | 100 | 0,01 |
| Tnf | P01375 | 100 | 0,01 |
| VEGFA | VEGF206 | P15692 | 1 | 100 | 0,01 |
| WNT10A | Q9GZT5 | 100 | 0,1 |
| WNT3A | 1 | P56704 | 1 | 200 | 0,1 |
| Wnt5a | 1 | P22725 | 1 | 100 | 0,1 |
Tabel 1: den fulde liste over ligander, der anvendes til mema-eksperimenterne. Uniprot-ID, lager koncentrationer og endelige arbejds koncentrationer er tilvejebragt.
| ECM protein | UniprotID | Bestand koncentration (μg/mL) |
Endelige Koncentration (μg/mL) |
Noter |
| ALCAM | 1 | Q13740 | 1 | 100 | 30 | |
| CDH20 | Q9HBT6 | 300 | 80 | |
| CDH6 | 1 | P55285 | 1 | 100 | 40 | |
| CDH8 | P55286 | 100 | 20 | |
| CD44 | 1 | P16070 | 1 | 100 | 30 | |
| CEACAM6 | P40199 | 100 | 30 | |
| COL1A1 | P02453 | 5000 | 200 | flere under enheder med flere uniprot-id'er |
| COL2A1 | 2 | P02458 | 2 | 1000 | 200 | |
| COL3A1 | 1 | P02461 | 1 | 1000 | 200 | |
| COL4A1 | 1 | P02462 | 1 | 1000 | 200 | flere under enheder med flere uniprot-id'er |
| COL5A1 | P20908 | 1000 | 200 | |
| COL23A1 | 1 | Q86Y22 | 1 | 200 | 80 | |
| DSG2 | Q14126 | 100 | 30 | |
| CDH1 | 1 | P12830 | 1 | 100 | 40 | |
| ECM1 | 1 | Q16610 | 1 | 100 | 40 | |
| FN1 | 1 | P02751 | 1 | 1000 | 200 | |
| GAP43 | 1 | P17677 | 1 | 158 | 40 | |
| HyA-500K | 1000 | 200 | LOR-0005 | |
| HyA-50K | 1000 | 200 | LOR-0007 | |
| ICAM1 | P05362 | 400 | 80 | |
| ALCAM | 1 | Q13740 | 1 | 100 | 30 | |
| CDH20 | Q9HBT6 | 300 | 80 | |
| CDH8 | P55286 | 100 | 20 | |
| CD44 | 1 | P16070 | 1 | 100 | 30 | |
| CEACAM6 | P40199 | 100 | 30 | |
| DSG2 | Q14126 | 100 | 30 | |
| CDH15 | P55291 | 100 | 20 | |
| VCAM1 | 1 | P19320 | 1 | 1000 | 200 | |
| LAMA1 | P25391 | 500 | 200 | flere under enheder med flere uniprot-id'er |
| LAMA3 | 2 | Q16787 | 2 | 130 | 40 | |
| Lum | P51884 | 200 | 80 | |
| CDH15 | P55291 | 100 | 20 | |
| NID1 | 1 | P14543 | 1 | 100 | 9,3 μg/mL nid, 130 μg/mL lam, 46,5 μg/mL KOL4 | + KOL4 og Laminin |
| OMD | Q99983 | 100 | 40 | |
| SPP1 | A | P10451 | 1 | 100 | 40 | |
| CDH3 | 1 | P22223 | 1 | 100 | 40 | |
| PECAM1 | Lang | P16284 | 1 | 150 | 40 | |
| TNC | 1 | P24821 | 1 | 500 | 200 | |
| VCAM1 | 1 | P19320 | 1 | 1000 | 200 | |
| VTN | P04004 | 100 | 40 | |
| Bgn | P21810 | 100 | 40 | |
| DCN | A | P07585 | 1 | 300 | 80 | |
| POSTN | 1 | Q15063 | 1 | 100 | 40 | |
| Sparc | P09486 | 100 | 40 | |
| THBS1 | 1 | P07996 | 1 | 100 | 40 | |
| BCAN | 1 | Q96GW7 | 1 | 100 | 40 | |
| ELN | 3 | P15502 | 3 | 1000 | 200 | |
| FBN1 | P35555 | 254 | 80 |
Tabel 2: den fulde liste over ECM proteiner og betingelser, der anvendes i MEMA eksperimenter. Uniprot-ID, lager koncentrationer og endelige arbejds koncentrationer er tilvejebragt. I nogle tilfælde repræsenterer den udskrevne betingelse et protein kompleks eller en kombination af flere proteiner, som er angivet i kolonnen noter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Betydningen af "dimensionalitet" og sammenhæng har været en motiverende faktor i udviklingen af in vitro-kultur systemer som redskaber til karakterisering af kræftceller gennem deres interaktion med mikromiljøet11, og evnen til in vitro- kultur systemer til at efterligne in vivo miljøet er en drivkraft bag jagten på at forbedre disse kultur systemer. In vitro-systemer, dog fortsat betydelige værktøjer til kræftforskning netop på grund af deres evne til at opløse den komplekse in vivo situation ned til en forenklet model12.
Selvom 2D-systemer kan omfatte ECMs og ligands, har de traditionelt manglet kapacitet til at afhøre et bredt panel af kombinatoriske pertubagens. Populære kommercielle kælder membran ekstrakter giver mulighed for dyrkning i 3D, men mangler oprindelsen af en omhyggeligt defineret panel af proteiner. De kommercielle ekstrakter lider typisk af ufuldstændigt defineret sammensætning, som kan analysere og resultere i betydelige batch-til-batch variation3,13. MEMA platformen overvinder disse barrierer, giver mulighed for undersøgelse af ændringer i cellulære fænotyper, metabolisk aktivitet, differentiering status, og variationer i cellevækst og spredning, da de er moduleret af specifikke og defineret endogene Faktorer.
MEMA platformen er en kraftfuld, medium-til high-gennemløb tilgang til at vurdere virkningen af mikromiljøet (både ECM og opløselige faktorer) på fænotype af celler. Platformen viser stor fleksibilitet for de typer af assays og celler, som det kan udnyttes. Vi kan observere effekter fra både opløselige ligander og ECM proteiner, som cellerne er eksponeret. Faktisk har vi for nylig konstateret, at ligander var en vigtig drivkraft for resistens over for HER2-målrettede hæmmere, men at disse virkninger kunne modueres af ECM5. En række celler, herunder primære celler og cellelinjer afledt af forskellige celletyper, herunder lunge, blære, prostata, bryst og bugspytkirtel, samt inducerede pluripotente stamceller (iPS), er med succes dyrket på MEMA platformen (Se eksempler i henvisningerne5,7,14). Brugen af forskellige pletter giver mulighed for udaflæsning af flere cellulære endepunkter, herunder cellevækst, differentiering og metabolisme. Andre forskere har udvidet platformen til at afhøre virkningen af stivhed eller elastisk modulus, hvilket tilføjer en ekstra dimension til MEMA-platformen15. Endelig, platformen er modtagelig for at udføre narkotika skærme til identifikation af mikromiljø forhold, der enten forbedre eller hæmme narkotika effekten, som vi og andre har for nylig rapporteret5,14,15 .
Måske er det mest kritiske skridt til succes for et MEMA eksperiment optimering af celle plating tæthed. Optimering af tætheden af cellerne sikrer, at der er nok celler til stede til at levere robuste data, men ikke så mange, at stedet bliver overdrevent konflydende. Confluent spots kan i høj grad konforme resultater, især hvis spredning anvendes som et endepunkt, hvilket gør det umuligt at afgøre, om lave sprednings hastigheder er et resultat af interaktioner med mikromiljømæssige faktorer eller på grund af kontakt hæmning fra høj celletæthed. Celle titrering eksperimenter kan afsløre disse problemer, som gennemsnitlige celle tal pr spot vil demonstrere en lineær stigning med stigende antal celler belagt, men vil i sidste ende plateau. Det optimale celle nummer skal vælges i kurvens lineære område.
Som nævnt ovenfor er MEMA-platformen fleksibel og kan tilberedes på en række substrater med forskellige overflader. Disse omfatter glas rutsjebaner og multi vægplade formater. Det er vores erfaring, at ikke alle overflade kemiske stoffer er modtagelige for MEMA-trykning, da vi har observeret spot løsrivelse på nogle overflader på grund af dårlige vedhæftningsegenskaber og manglende evne til at blokere celle vedhæftning på andre høje vedhæftnings flader. Desuden nødvendiggør Skift mellem forskellige substrater optimering af buffer forhold, da ydeevnen af udskrivningen med samme print buffer kan variere afhængigt af overflade kemi.
Diameteren af de trykte ECM spots spiller en vigtig rolle i kvaliteten af dataene. Generelt anbefaler vi at bruge de største diameter print stifter til rådighed for Arrayer i brug (vi bruger i øjeblikket 350 μm diameter stifter). Større diameter pletter giver et større antal celler til at besætte en plet, som har tendens til at resultere i mere robuste data end genereres med mindre diameter stifter. Da binding af cellerne er en stokastisk proces, der har tendens til at være en høj grad af variation i de data, der er relateret til antallet af celler oprindeligt knyttet til hvert sted. Derfor anbefaler vi at udskrive et stort antal replikater for hver ECM-tilstand. Vi udskriver 10 − 15 ECM replikater i hver brønd med vores aktuelle udskrivningsbetingelser for at sikre solide statistikker.
Vi har noteret i vores tidligere eksperimenter, at for det meste, ligand effekter tendens til at dominere over ECM effekter. Dette kan være til dels på grund af vores beslutning om at tilføje kollagen I til alle ECM pletter, som sikrer robust cellebinding. Men vi mener, at dette også kan homogenisere ECM effekter, da de fleste pletter har tendens til at opføre sig på en måde meget lig kollagen i. ændring af spot sammensætning for at udelukke kollagen I kan resultere i differentiel celle adfærd som følge af interaktionen med ECM, men også signifikant påvirker cellebinding, hvilket resulterer i mange flere ubesatte pletter. Brugere bør skræddersy deres ECM sammensætning holde disse forskelle i tankerne, især dem, der er interesseret i Stem og stamceller og differentiering, hvor matrixen kan have en betydelig indvirkning16.
Vi udfører typisk MEMA assays i relativt korte perioder (f. eks. 72 h maksimum). Dette skyldes, at cellerne er begrænset til pletter (blokerende buffer tillader ikke vækst uden for pletter i vores erfaring). Med hurtigt dividere celler, vækst længere end 72 h vil føre til overvækst af stedet, hvilket igen komplicerer billedsegmentering som celler bliver overfyldt og hober sig op på hinanden, og kan også påvirke data som vækst anholdelse kan forekomme med kontakt hæmning. Vi har udført længere behandlinger med meget langsomt voksende primære celler (10 − 14 dage), men der skal udvises forsigtighed i disse undersøgelser for at ændre medierne og genopbygge ligander hver 3 − 4 dage.
Fortsatte bestræbelser på at udvikle MEMA platformen er fokuseret på to områder af interesse, maksimere den optiske kvalitet til billeddannelse og optimering inden for mindre kultur fartøjer. Optisk kvalitet bliver en afgørende faktor, når forskerne kræver højere opløsning mikroskopi at identificere subcellulære lokalisering af deres markører af interesse. Indledende skærmbilleder kan udføres med lavere opløsning på mikroskoper med høj gennemløb efterfulgt af billeddannelse af specifikke steder af interesse på instrumenter med højere opløsning, men billedkvaliteten kan blive kompromitteret, hvis substratens optiske egenskaber er dårlige. Forbedring af de optiske egenskaber af substratet ville gøre det muligt for forskerne at udføre de indledende skærme på høj opløsning billeddannelse systemer uden behov for at generhverve udvalgte billeder ved højere opløsning. Endelig vil evnen til at udføre Memas i mindre kultur fartøjer, såsom 96-brønd plader, give mulighed for en reduktion i behandlings volumen og en udvidelse af forhør ligander og replikater. Denne overgang kræver optimering af substrat-buffer-protein interaktioner og array-udskrivning inden for nye kultur fartøjer. En sådan igangværende indsats vil forbedre MEMA platformen og udvide dens kraftfulde kapaciteter til at identificere relevante mikromiljø proteiner, der ændrer cellulære fænotyper for en række forskellige celletyper, som derefter kan efterforskes i bekræftende assays.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af NIH Common fund library for Network Cellular signaturer (LINCS) Grant HG008100 (J.W.G., L.M.H. og J. E. K).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aushon 2470 | Aushon BioSystems | Arrayer robot system used in the protocol | |
| Nikon HCA | Nikon | High Content Imaging system designed around Nikon Eclipse Ti Inverted Microscope | |
| BioTek Precision XS liquid Handler | BioTek | liquid handling robot used in the protocol | |
| Trizma hydrochloride buffer solution | Sigma | T2069 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-038 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Triton X100 | Sigma | T9284 | |
| Tween 20 | Sigma | P7949 | |
| Kolliphor P338 | BASF | 50424591 | |
| 384-well microarray plate, cylindrical well | Thermo Fisher | ab1055 | |
| Nunc 8 well dish | Thermo Fisher | 267062 | |
| Paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Science | 15710 | |
| BSA | Fisher | BP-1600 | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| Cell Mask | Molecular Probes | H32713 | |
| Click-iTEdU Alexa Fluor | Molecular Probes | C10357 | |
| DAPI | Promo Kine | PK-CA70740043 | |
| ALCAM | R & D Systems | 656-AL | ECM |
| Cadherin-20 (CDH20) | R & D Systems | 5604-CA | ECM |
| Cadherin-6 (CDH6) | R & D Systems | 2715-CA | ECM |
| Cadherin-8 (CDH8) | R & D Systems | 188-C8 | ECM |
| CD44 | R & D Systems | 3660-CD | ECM |
| CEACAM6 | R & D Systems | 3934-CM | ECM |
| Collagen I | Cultrex | 3442-050-01 | ECM |
| Collagen Type II | Millipore | CC052 | ECM |
| Collagen Type III | Millipore | CC054 | ECM |
| Collagen Type IV | Sigma | C5533 | ECM |
| Collagen Type V | Millipore | CC077 | ECM |
| COL23A1 | R & D Systems | 4165-CL | ECM |
| Desmoglein 2 | R & D Systems | 947-DM | ECM |
| E-cadherin (CDH1) | R & D Systems | 648-EC | ECM |
| ECM1 | R & D Systems | 3937-EC | ECM |
| Fibronectin | R & D Systems | 1918-FN | ECM |
| GAP43 | Abcam | ab114188 | ECM |
| HyA-500K | R & D Systems | GLR002 | ECM |
| HyA-50K | R & D Systems | GLR001 | ECM |
| ICAM-1 | R & D Systems | 720-IC | ECM |
| Laminin | Sigma | L6274 | ECM |
| Laminin-5 | Abcam | ab42326 | ECM |
| Lumican | R & D Systems | 2846-LU | ECM |
| M-Cad (CDH15) | R & D Systems | 4096-MC | ECM |
| Nidogen-1 | R & D Systems | 2570-ND | ECM |
| Osteoadherin/OSAD | R & D Systems | 2884-AD | ECM |
| Osteopontin (SPP) | R & D Systems | 1433-OP | ECM |
| P-Cadherin (CDH3) | R & D Systems | 861-PC | ECM |
| PECAM1 | R & D Systems | ADP6 | ECM |
| Tenascin C | R & D Systems | 3358-TC | ECM |
| VCAM1 | R & D Systems | ADP5 | ECM |
| Vitronectin | R & D Systems | 2308-VN | ECM |
| Biglycan | R & D Systems | 2667-CM | ECM |
| Decorin | R & D Systems | 143-DE | ECM |
| Periostin | R & D Systems | 3548-F2 | ECM |
| SPARC/osteonectin | R & D Systems | 941-SP | ECM |
| Thrombospondin-1/2 | R & D Systems | 3074-TH | ECM |
| Brevican | R & D Systems | 4009-BC | ECM |
| Elastin | BioMatrix | 5052 | ECM |
| Fibrillin | Lynn Sakai Lab OHSU | N/A | ECM |
| ANGPT2 | RnD_Systems_Own | 623-AN-025 | Ligand |
| IL1B | RnD_Systems_Own | 201-LB-005 | Ligand |
| CXCL8 | RnD_Systems_Own | 208-IL-010 | Ligand |
| IGF1 | RnD_Systems_Own | 291-G1-200 | Ligand |
| TNFRSF11B | RnD_Systems_Own | 185-OS | Ligand |
| BMP6 | RnD_Systems_Own | 507-BP-020 | Ligand |
| FLT3LG | RnD_Systems_Own | 308-FK-005 | Ligand |
| CXCL1 | RnD_Systems_Own | 275-GR-010 | Ligand |
| DLL4 | RnD_Systems_Own | 1506-D4-050 | Ligand |
| HGF | RnD_Systems_Own | 294-HGN-005 | Ligand |
| Wnt5a | RnD_Systems_Own | 645-WN-010 | Ligand |
| CTGF | Life_Technologies_Own | PHG0286 | Ligand |
| LEP | RnD_Systems_Own | 398-LP-01M | Ligand |
| FGF2 | Sigma_Aldrich_Own | SRP4037-50UG | Ligand |
| FGF6 | RnD_Systems_Own | 238-F6 | Ligand |
| IL7 | RnD_Systems_Own | 207-IL-005 | Ligand |
| TGFB1 | RnD_Systems_Own | 246-LP-025 | Ligand |
| PDGFB | RnD_Systems_Own | 220-BB-010 | Ligand |
| WNT10A | Genemed_Own | 90009 | Ligand |
| PTN | RnD_Systems_Own | 252-PL-050 | Ligand |
| BMP3 | RnD_Systems_Own | 113-BP-100 | Ligand |
| BMP4 | RnD_Systems_Own | 314-BP-010 | Ligand |
| TNFSF11 | RnD_Systems_Own | 390-TN-010 | Ligand |
| CSF2 | RnD_Systems_Own | 215-GM-010 | Ligand |
| BMP5 | RnD_Systems_Own | 615-BMC-020 | Ligand |
| DLL1 | RnD_Systems_Own | 1818-DL-050 | Ligand |
| NRG1 | RnD_Systems_Own | 296-HR-050 | Ligand |
| KNG1 | RnD_Systems_Own | 1569-PI-010 | Ligand |
| GPNMB | RnD_Systems_Own | 2550-AC-050 | Ligand |
| CXCL12 | RnD_Systems_Own | 350-NS-010 | Ligand |
| IL15 | RnD_Systems_Own | 247-ILB-005 | Ligand |
| TNF | RnD_Systems_Own | 210-TA-020 | Ligand |
| IGFBP3 | RnD_Systems_Own | 675-B3-025 | Ligand |
| WNT3A | RnD_Systems_Own | 5036-WNP-010 | Ligand |
| PDGFAB | RnD_Systems_Own | 222-AB | Ligand |
| AREG | RnD_Systems_Own | 262-AR-100 | Ligand |
| JAG1 | RnD_Systems_Own | 1277-JG-050 | Ligand |
| BMP7 | RnD_Systems_Own | 354-BP-010 | Ligand |
| TGFB2 | RnD_Systems_Own | 302-B2-010 | Ligand |
| VEGFA | RnD_Systems_Own | 293-VE-010 | Ligand |
| IL6 | RnD_Systems_Own | 206-IL-010 | Ligand |
| CXCL12 | RnD_Systems_Own | 351-FS-010 | Ligand |
| NRG1 | RnD_Systems_Own | 378-SM | Ligand |
| IGFBP2 | RnD_Systems_Own | 674-B2-025 | Ligand |
| SHH | RnD_Systems_Own | 1314-SH-025 | Ligand |
| FASLG | RnD_Systems_Own | 126-FL-010 | Ligand |
References
- Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
- Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- LaBarge, M. A., et al. Human mammary progenitor cell fate decisions are products of interactions with combinatorial microenvironments. Integrative Biology (Cambridge). 1 (1), 70-79 (2009).
- Watson, S. S., et al. Microenvironment-Mediated Mechanisms of Resistance to HER2 Inhibitors Differ between HER2+ Breast Cancer Subtypes. Cell Systems. 6 (3), 329-342 (2018).
- Ranga, A., et al. 3D niche microarrays for systems-level analyses of cell fate. Nature Communications. 5, 4324 (2014).
- Malta, D. F. B., et al. Extracellular matrix microarrays to study inductive signaling for endoderm specification. Acta Biomater. 34, 30-40 (2016).
- Kamentsky, L., et al. Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software. Bioinformatics. 27 (8), 1179-1180 (2011).
- Gagnon-Bartsch, J. A., Jacob, L., Speed, T. P. Removing Unwanted Variation from High Dimensional Data with Negative Controls. University of California, Berkeley, Department of Statistics, University of California, Berkeley. , Report No. 820 (2013).
- Allan, C., et al. OMERO: flexible, model-driven data management for experimental biology. Nature Methods. 9 (3), 245-253 (2012).
- Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
- Bissell, M. J. The differentiated state of normal and malignant cells or how to define a "normal" cell in culture. International Review of Cytology. 70, 27-100 (1981).
- Serban, M. A., Prestwich, G. D. Modular extracellular matrices: solutions for the puzzle. Methods. 45 (1), 93-98 (2008).
- Kaylan, K. B., et al. Mapping lung tumor cell drug responses as a function of matrix context and genotype using cell microarrays. Integrative Biology (Cambridge). 8 (12), 1221-1231 (2016).
- Lin, C. H., Jokela, T., Gray, J., LaBarge, M. A. Combinatorial Microenvironments Impose a Continuum of Cellular Responses to a Single Pathway-Targeted Anti-cancer Compound. Cell Reports. 21 (2), 533-545 (2017).
- Gjorevski, N., et al. Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture. Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).
