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Cancer Research

Usando Microarrays para interrogar o impacto microambiental em phenotypes celulares no cancro

Published: May 21, 2019 doi: 10.3791/58957

Summary

O objetivo do método apresentado aqui é mostrar como Microarrays microambiente (MEMA) pode ser fabricado e usado para interrogar o impacto de milhares de microambientes combinatórios simples sobre o fenótipo de células cultivadas.

Abstract

Compreender o impacto do microambiente no fenótipo das células é um problema difícil devido à complexa mistura de fatores de crescimento solúvel e proteínas associadas à matriz no microambiente in vivo. Além disso, os reagentes prontamente disponíveis para a modelagem de microambientes in vitro utilizam tipicamente misturas complexas das proteínas que são definidas incompletamente e sofrem da variabilidade do grupo à lote. A plataforma do microarray do microambiente (Mema) permite a avaliação de milhares de combinações simples de proteínas do microambiente para seu impacto em fenótipos celulares em um único ensaio. Os MEMAs são preparados em placas de poço, o que permite a adição de ligantes individuais para separar os poços contendo proteínas de matriz extracelular (ECM) dispostas. A combinação do ligante solúvel com cada ECM impresso dá forma a uma combinação original. Um ensaio típico MEMA contém mais de 2.500 microambientes combinatórios únicos que as células são expostas em um único ensaio. Como um caso de teste, a linha celular MCF7 do cancro da mama foi chapeada na plataforma de MEMA. A análise deste ensaio identificou fatores que aumentam e inibem o crescimento e a proliferação dessas células. A plataforma MEMA é altamente flexível e pode ser estendida para uso com outras questões biológicas além da pesquisa de câncer.

Introduction

A cultura de linhagens de células cancerosas em plástico em monocamadas bidimensional (2D) continua sendo um dos principais cavalos de trabalho para pesquisadores de câncer. No entanto, o microambiente está sendo cada vez mais reconhecido por sua capacidade de impactar os fenótipos celulares. No câncer, o microambiente tumoral é conhecido por influenciar múltiplos comportamentos celulares, incluindo crescimento, sobrevida, invasão e resposta à terapia1,2. As culturas tradicionais da pilha do monocamada faltam tipicamente influências do microambiente, que conduziu ao desenvolvimento de uns ensaios tridimensionais (3D) mais complexos para crescer pilhas, incluindo extratos purificados comercialmente disponíveis da membrana do porão. No entanto, essas matrizes purificadas são tipicamente complicadas de usar e sofrem de problemas técnicos, como a variabilidade do lote3 e composições complexas3. Como resultado, pode ser difícil atribuir a função a proteínas específicas que podem estar afetando os fenótipos celulares3.

Para abordar essas limitações, desenvolvemos a tecnologia microarray (Mema), que reduz o microambiente até combinações simples de matriz extracelular (ECM) e proteínas de fator de crescimento solúvel4,5 . A plataforma MEMA possibilita a identificação de fatores microambientais dominantes que impactam o comportamento das células. Usando um formato de matriz, milhares de combinações de fatores de microambiente podem ser testadas em um único experimento. O MEMA descrito aqui interroates ~ 2.500 diferentes condições únicas de microambiente. As proteínas ECM impressas em placas de poço formam almofadas de crescimento sobre as quais as células podem ser cultivadas. Os ligantes solúveis são adicionados aos poços individuais, criando os microambientes combinatória originais (ECM + ligand) em cada ponto diferente a que as pilhas são expostas. As células são cultivadas por vários dias, em seguida, fixo, manchado, e imaged para avaliar fenótipos celulares como resultado da exposição a estas combinações específicas de microambiente. Desde que os microambientes são combinações simples, é direto identificar as proteínas que conduzem mudanças fenotípicas principais nas pilhas. As memas têm sido utilizadas com sucesso para identificar fatores que influenciam vários fenótipos celulares, incluindo aqueles que impulsionam as decisões de destino da célula e a resposta à terapia4,5,6,7. Essas respostas podem ser validadas em experimentos 2D simples e, em seguida, podem ser avaliadas em condições que recapitulam mais plenamente a complexidade do microambiente tumoral. A plataforma MEMA é altamente adaptável a uma variedade de tipos de células e endpoints, desde que estejam disponíveis bons biomarcadores fenotípicos.

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Protocol

Nota: Uma visão geral de todo o processo MEMA, incluindo o tempo estimado, é descrita no diagrama de fluxo mostrado na Figura 1. Este protocolo detalha a fabricação de MEMAs em placas de 8 poços. O protocolo pode ser adaptado para outras placas ou lâminas.

1. preparação de buffers de proteína, diluente e coloração

  1. Equilibrar frascos de ECMs, ligantes e citocinas à temperatura ambiente (RT) e centrifugar brevemente. Adicione o volume apropriado do buffer RT apropriado, conforme indicado na folha de dados do produto. Siga a recomendação do fabricante para concentrações de ações.
    Nota: Uma lista completa dos ligantes e ECMs com suas ações e concentrações finais são fornecidas na tabela 1 e na tabela 2. Os ligantes e os ECMs são usados tipicamente na concentração a mais elevada da escala recomendada pelo fabricante que provoca um efeito biológico em ensaios padrão da cultura de 2 dias. Manuseie as proteínas suavemente e em armários de biossegurança fluxo laminar para evitar a contaminação.
  2. Incubar frascos com balanço suave em RT para 1 h. Não vórtice proteínas como isso pode causar-lhes a desnaturar.
  3. Proteínas alíquotas para armazenamento de longo prazo para que todas as alíquotas sejam de uso único apenas para evitar a degradação com ciclos repetidos de congelamento/descongelação. Armazene as proteínas liofilizadas a-80 ° c (salvo indicação em contrário) até que seja necessário. Tome cuidado para coletar todos os metadados para referência futura, tais como: (i) nome da proteína, (II) data preparada, (III) número lote/lote, (IV) fornecedor, (v) número do catálogo, (vi) concentração, (VII) volume, e (VIII) preparador.
  4. Prepare o tampão diluente contendo 20% (v/v) glicerol, 10 mM EDTA, 200 mM Tris-HCl, pH 7,2 e esterilizar filtro. Mantenha este tampão estéril e armazene em RT.
  5. Prepare o tampão de coloração contendo 2% (p/v) BSA, 1 mM MgCl2e 0, 2% Nan3 em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Filtrar e armazenar a 4 ° c.

2. preparação de uma placa de origem ECM

  1. Remova estoques aliquotados de proteínas ECM a serem impressos e descongelar no gelo. Registre todos os números de lote para rastreamento de metadados.
  2. Flick tubos de proteínas descongelados suavemente para garantir a ressuspensão adequada e girar para baixo em uma centrífuga.
  3. Faça misturas de impressão ECM (EPMs) e uma fonte fluorescente para ser usada por um robô de manuseio de líquidos que criará as placas de origem 384-well aleatórias.
    Nota:
    as placas de fonte 384-well serão usadas por uma impressora da disposição do pino do toque para criar as matrizes impressas em 8 placas do poço.
    1. Rotule tubos de microcentrífuga de 1,5 mL para cada EPM e o
    2. Prepare cada EPM combinando 125 μL de tampão diluente (ver passo 1,4) com o volume adequado de estoque de ECM e leve a mistura até um volume total de 250 μL com PBS. As concentrações finais em cada tubo EPM serão 1x proteína ECM, 5 mM EDTA, 10% glicerol, e 100 mM Tris.
    3. Prepare uma solução fluorescente, dissolvendo-a no tampão apropriado especificado pelo fabricante e transfira 250 μL para um tubo de transmissão rotulado.

3. criação da placa de origem usando um manipulador de líquidos

  1. Projete um layout de placa 384-well que randomize as posições dos ECMs e seja otimizado para a cabeça do pino da impressora matriz que está sendo usada. Projete a colocação do material de forma que ele será impresso na linha 1, coluna 1 posição de cada poço para auxiliar na orientação da matriz.
    Nota: Um total de 14 − 15 repetições de cada ECM é usado para assegurar dados robustos. Inclua réplicas adicionais de colágeno ou outro ECM que produz um acessório robusto para avaliação da uniformidade de ligação. O layout pode precisar utilizar várias placas 384-well, dependendo do número de ECMs de interesse.
  2. Transfira tubos EPM para um manipulador líquido, mantendo os tubos a 4 ° c com um rack de tubo resfriado ou usando um robô de manuseio de líquidos localizado em uma sala fria.
  3. Usando o software do manipulador de líquidos, execute um programa para transferir 15 μL de cada EPM e a base para os poços pré-designados dentro da placa de origem 384-well (s).
  4. Pipet PBS em qualquer poços não utilizados para aumentar a umidade e proteção contra a dessecação durante o processo de impressão.
    Nota: Consulte a Figura 2 para obter um exemplo de um conjunto de placas de origem 384 bem otimizado para uma cabeça de pino de 4 x 7 e inclui um bloco de colágeno I e PBS.
  5. Placa (s) de vedação e mantenha a 4 ° c até estar pronto para imprimir.

4. imprimindo MEMAs usando um robô de impressão de matriz

Nota: A parte seguinte do protocolo descreve especificamente a preparação e o uso de MEMA para investigar o impacto de diferentes proteínas do microambiente no crescimento e proliferação de células MCF7. No entanto, o protocolo pode ser facilmente adaptado para usar diferentes ligantes, ECMs e células para estudar outras linhas celulares e pontos de extremidade de interesse.

  1. Usando uma impressora de pinos de toque, imprima EPMs e pontos de identificação em 8 placas de poços. Imprima várias repetições de cada condição de ECM para garantir a reprodutibilidade.
    Nota:
    outros formatos de chapa ou lâminas podem ser usados para impressão, mas a otimização de buffer pode ser necessária para alcançar a formação ideal do ponto.
    1. Imprima os ECMs para o MEMA usando pinos do diâmetro de 350 μm arranjados em uma configuração da cabeça de cópia 4 x 7. Imprima as matrizes nas placas de 8 poços como 20 colunas por 35 linhas, para um total de ~ 700 pontos. As matrizes maiores são possíveis nestas placas mas vêm com um trade-off de efeitos aumentados da borda na ligação e na mancha da pilha.
  2. Após a impressão, guarde as chapas num dessecador durante um período mínimo de 3 dias antes da utilização.

5. criação de placas de tratamento de ligantes

  1. Projete uma disposição da placa do 96-well que inclui ligantes do interesse. Para facilitar o tratamento de muitas placas MEMA ao mesmo tempo, projetar esta placa com espaçamento que permite o uso de um Pipet multi-canal com 4 pontas espaçadas para transferir líquidos entre os poços de 8-bem MEMAs e uma placa 96-well.
    Nota: Neste protocolo, são utilizados o conjunto completo de ligandos listados na tabela 2 .
  2. Thaw ligantes no gelo. Momentaneamente Flick e gire para baixo cada tubo.
  3. Diluir os ligantes para um estoque de trabalho de 200x usando o buffer recomendado pelo fabricante (tipicamente PBS).
  4. Pipet 10 μL de cada estoque do ligante 200x no poço correspondente dentro da placa 96-well.
  5. Selar e armazenar chapas a-20 ° c.
    Nota: Faça placas de tratamento de ligantes em lotes, capturando todos os metadados para análise a jusante.

6. cultivando células em MEMAs

  1. Bloco MEMAs por 20 min com 2 mL por poço de tampão de bloqueio não incrustante contendo 1% de agente de bloqueio não incrustante (tabela de materiais) em água destilada dupla (DDH2O).
  2. Aspirar o tampão de obstrução e os poços triplos da enxaguadura com PBS. Para evitar a dessecação, deixe o volume final de PBS em poços até estar pronto para a plaqueamento celular.
    Nota: É extremamente útil ter dois trabalhadores do banco para etapas da cultura da pilha em MEMAs. Um trabalhador do banco pode executar etapas da aspiração, quando o segundo executar etapas da adição. Recomenda-se usar um Pipet multicanal de 1 mL com pontas espaçadas para coincidir com a placa de 8 poços para pipetagem e um divisor de Y com duas pipetas Pasteur para aspirar vários poços de uma só vez.
  3. Sementes 2 x 105 MCF7 células por poço em 2 ml de Dulbecco ' s modificado médio de Eagle ' s médio (DMEM) contendo 10% soro fetal bovino (FBS).
    Nota: Antes de um experimento MEMA completo, realize uma experiência de titulação de célula para otimizar números de células, de forma que os pontos MEMA tenham números de células altas (mas não são confluentes) no final da duração experimental desejada.
  4. Após 2 − 18 h de adesão, aspirado a meio e substituir com 2 mL de meio de crescimento reduzido (DMEM com 0,1% FBS).
    Nota: Soro reduzido (por exemplo, 0,1% FBS) ou condições de fator de crescimento empobrecido podem ser usados neste momento para isolar o impacto estimulatório de ligantes específicos.
  5. Descongelar uma placa de tratamento de ligantes no gelo. Placa de centrifugação descongelada a 200 x g durante 1 min.
  6. Transferir 200 μL de meio de cada poço na placa de cultura para o poço adequado na placa de tratamento. Pipet para cima e para baixo para misturar o volume do ligante com o meio e para transferir esta mistura de volta ao poço apropriado na placa de Mema.
  7. Levemente rocha à mão e devolva as placas MEMA à incubadora. Cultura para a duração do experimento na presença da combinação ligand/ECM a 37 ° c e 5% CO2.
    Nota: Um experimento MEMA típico é executado por 72 h; os experimentos de longa duração podem requerer a reposição de meio e retratamento com ligantes.
  8. Os poços MEMA do pulso em 71 h com 100x 5-ethynyl-2 '-deoxyuridine (EdU) para uma concentração final de 10 μM. Incubar em condições experimentais com EdU para 1 h em 37 ° c e 5% CO2.
    Nota: Outros tratamentos de células ao vivo também podem ser usados neste momento.

7. fixação e coloração MEMAs

  1. Após 72 h e quaisquer tratamentos de células ao vivo, aspiram poços. Fix MEMAs em 2 mL por poço de 2% paraformaldeído (PFA) por 15 min em RT.
  2. Aspirar a PFA. Permeabilize com 2 mL por o poço do surfactante nonionic de 0,1% por 15 minutos.
  3. Aspirar o surfactante não iônico e lavar com 2 mL por poço de PBS. Aspirar PBS. Lave com 2 mL de PBS com 0, 5% de polissorbato 20 (PBS-T).
    Nota: A superfície de MEMA é hidrofóbica, e a falha lavar com PBS-T antes que a incubação da mancha e do anticorpo conduzirá à formação de vazios nos poços durante etapas da incubação e dê origem aos artefatos de coloração.
  4. Aspirar PBS-T. Adicionar reagentes de reação de detecção EdU. Incubar por 1 h em RT, balançando e protegido da luz. Após 1 h incubação, saciar a reação com o tampão de têmmata comercial fornecido.
    Nota: A deteção de EdU e as etapas da mancha/anticorpo podem ser executadas em 1,5 mL por o poço para reduzir o custo.
  5. Aspirar o tampão de têmmata e lavar com PBS-T antes de incubação com manchas ou anticorpos.
  6. Incubar os poços de MEMA com anticorpos contra a histona H3K9me3 (1:1000) e fibrillarina (1:400) em tampão de coloração contendo 2% (p/v) de albumina sérica bovina (BSA), 1 mM MgCl2 e 0, 2% Nan3 durante a noite a 4 ° c.
    Nota: Realize titulações de anticorpos para determinar as concentrações ideais antes de usá-las em um conjunto MEMA completo.
  7. Após a incubação preliminar do anticorpo ou da mancha, lave os poços 2x com PBS e uma vez com PBS-T.
  8. Adicionar anticorpos secundários (asno anti-rato IgG e asno anti-coelho IgG, ambos 1:300) e 0,5 μg/mL 4 ′ 6 ‐ diamidino ‐ 2 ‐ phenylindole (DAPI). Incubar por 1 h na RT no escuro.
  9. Lave os poços 2x com 2 mL por poço de PBS, deixando-os no final 2 mL PBS.
  10. Proceda à imagem ou armazene MEMAs manchadas para a imagem latente mais atrasada no PBS em 4 ° c protegido da luz.

8. imagem latente de MEMAs

  1. Imagem MEMA em um sistema automatizado da imagem latente com os canais de deteção fluorescentes apropriados.
  2. Saída de dados de imagem resultante para um sistema de gerenciamento de imagem. Segmentar células e calcular níveis de intensidade usando o CellProfiler8.

9. análise de dados

Nota: A análise de dados consiste em normalização, correção de variação e compactação dos dados brutos do CellProfiler. Nesta instância, o R-Environment com código personalizado é usado para executar todas as etapas. No entanto, qualquer ambiente estatístico ou programa de software pode ser utilizado para executar as ações equivalentes. Um exemplo do código personalizado de fonte aberta para o ambiente de R para análise está disponível em: https://www.Synapse.org/#!Synapse:syn2862345/wiki/72486.

  1. Pré-processar e normalizar os dados de imagem segmentada.
  2. Determine a contagem de células Spot usando os núcleos corados DAPI.
  3. Intensidade de EdU de porta automática para rotular células como EdU+. Medir a proliferação usando a proporção de células EdU+ em cada local.
  4. A mediana resume as manchas citoplasmáticas e as medições da morfologia nuclear no nível Spot.
  5. Realize a remoção da normalização indesejada de variação (RUV) nos dados para melhorar a qualidade dos dados9.
    Nota: Essa abordagem é aplicada a cada sinal de intensidade e morfologia independentemente como uma matriz com matrizes usando as linhas e pontos como as colunas como descrito anteriormente9.
  6. Aplique a normalização de loess bivariada aos resíduos normalizados RUV usando a linha de matriz e a coluna de matriz como as variáveis independentes para corrigir efeitos espaciais ou de intensidade relacionados.
  7. Uma vez que a normalização é terminada, a mediana resume as repetições para cada condição do microambiente para relatar e uma análise mais aprofundada.

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Representative Results

Para simplificar os impactos microambientais no crescimento e proliferação celular e identificar condições que promoveram ou inibiram o crescimento e proliferação celular, a linha celular de câncer de mama MCF7 foi semeada em um conjunto de oito MEMAs de 8 poços, conforme descrito no protocolo. Este ensaio expôs as células a 48 diferentes ECMs e 57 ligantes diferentes, para um total de 2736 condições microambientais combinatórias. Após 71 h na cultura, as pilhas foram pulsada com EdU, fixo, permeablized, e manchado com DAPI, a reação para a deteção de EdU, um anticorpo do anti-fibrillin, e um anticorpo H3K9me3. As pilhas foram imaged em um microscópio elevado do índice. As imagens foram carregadas para um servidor Omero10, segmentada usando cellprofiler8, e normalizada e analisada em R9. Os resultados descritos abaixo se concentram nos sinais DAPI e EdU.

A plataforma de análise de imagem de memas produz alguns resultados semelhantes aos disponíveis a partir de abordagens de citometria de fluxo, tais como parcelas de conteúdo de DNA mostrando frações 2n e 4n para células tratadas com um determinado ligante (Figura 3a), com base no DAPI intensidade e área. Essas parcelas fornecem evidências para condições que promovem a ciclagem ativa da célula versus como indicado por picos bimodais claros correspondentes às células nas fases G1 ou G2 versus células presas ao crescimento, o que mostraria mudanças nos picos em relação às condições de controle. Utilizamos o número de células e os dados de intensidade de coloração para resumir os dados, onde o impacto do microambiente (ligantes em um eixo, ECM no segundo eixo) no número de células (Figura 3B) e incorporação de EdU (Figura 3C) pode ser mais facilmente visto como mudanças na cor e intensidade do heatmap. Como visto nestas parcelas, muitos dos efeitos são ligand-driven, porque a condição do ECM não impacta fortemente o número de pilha ou o positivity de EdU. Nidogen-1 é uma exceção desobstruída, porque a presença desta molécula do ECM inibe a ligação e o crescimento da pilha de MCF7. Os ligantes tais como FGF6 e NRG1α (NRG 1.1 em parcelas) melhoram o número da pilha e têm taxas elevadas da incorporação de EdU, quando os ligantes tais como o AREG e o NRG1-SMDF (NRG 1.10 em parcelas) inibem a ligação da pilha e/ou o crescimento das pilhas. Esses achados são apoiados pelas imagens das células que crescem nos pontos, onde uma clara diferença no número de células e na positividade do EdU é evidente (ver exemplo na Figura 3D).

Desde que a plataforma de MEMA é uma tecnologia mais nova, os resultados foram validados em ensaios separados. MCF7 células foram semeadas em placas de 24 poços revestidas com colágeno I em meio DMEM com 10% FBS. Após 18 h, os meios foram trocados para o meio de crescimento reduzido (DMEM com 0,1% FBS) e as pilhas foram tratadas com NRG1α, FGF6, ou AREG e cultivadas para 72 h. EdU foi adicionado 1 h antes da fixação. As células foram coradas com DAPI e para incorporação de EdU, imaged, segmentada e analisada. De forma semelhante aos resultados obtidos na plataforma MEMA, FGF6 e NRG1α deram origem a maiores números de células (Figura 4a) e taxas de incorporação de EdU (Figura 4B) comparadas às células tratadas com AREG, Validando nossas observações em os experimentos originais da MEMA.

Figure 1
Figura 1 : Fluxograma mostrando o fluxo de trabalho e a linha do tempo para as diferentes fases de um experimento MEMA típico. Uma vez que os MEMAs são impressos, eles podem ser armazenados em temperatura ambiente dessecado por vários meses antes do uso. Tipicamente, a fase experimental dura 3 − 4 dias, mas algumas células primárias de crescimento lento foram cultivadas em MEMAs por até 2 semanas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 : Layout da placa de origem ECM para impressão de matriz. O bloco de colágeno é impresso na MEMA como uma grade, que fornece um conjunto altamente repetitivo de condições que permitem uma normalização mais robusta entre os poços. Os poços cheios de PBS fornecem a umidade para ajudar na prevenção da evaporação durante o processo de impressão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 : Exemplos de dados gerados a partir de um experimento MEMA típico. (A) perfis de ciclo celular de valores de intensidade de DAPI Binned versus contagens de células de uma placa de 8 poços tratada com diferentes ligantes, mostrando a intensidade de DAPI bifásica indicando células na fase de ciclo celular G1 versus G2. (B) heatmap mostrando contagens de células Spot normalizadas agrupadas por similaridade usando clusters hierárquicos. Vermelho indica maior número de células, e azul é menor número de células. Os ligands estão no eixo x, os ECMs estão no eixo y. (C) heatmap mostrando incorporação normalizada de edu, com indicação de vermelho maior e azul indicando menor incorporação de edu. Os ligands estão no eixo x, os ECMs estão no eixo y. (D) exemplo de células MCF7 crescendo em um local Mema tratado com NRG1-α mostrando altas taxas de incorporação de EdU (núcleos rosa). Mancha verde é a máscara celular e azul é DAPI. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4 : Validação de MEMA resulta em cultura celular. (A) quantificação do número de células resultante do tratamento de MCF7 com diferentes ligantes. Os números equivalentes de MCF7 pilhas foram chapeados em placas multifolha tratadas então com o AREG, o FGF6, ou o NRG1α. Os poços tratados com o AREG tiveram significativamente menos pilhas do que aquelas tratadas com FGF6 (* * que indica valores de p do t-teste do estudante menos do que 0, 1) ou NRG1α (* indica um valor de p de 0, 5) no tratamento do borne do ligante de 72 h. (B) quantificação do nível de incorporação de edu em MCF7 devido ao tratamento com diferentes ligantes, como no painel A. O tratamento de AREG resulta em uma proporção significativamente menor de células que incorporam EdU do que as células tratadas com FGF6 (* *, p < 0, 1) ou NRG1α (* **, p = 0, 1). As barras de erro representam o desvio padrão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Nome da proteína ID de uniprot Estoque
Concentração
(μg/mL)
Final
Concentração
(μg/mL)
ANGPT1 | 1 Q15389 | 1 100 0, 4
ANGPT2 | 1 O15123 | 1 100 0,2
Areg P15514 100 0, 2
BMP2 P12643 100 0,1
BMP3 P12645 1000 0,1
BMP4 P12644 100 0,1
BMP5 | 1 P22003 | 1 100 0,1
BMP6 P22004 100 0,1
BMP7 P18075 100 0,1
CSF2 P04141 100 0, 2
CTGF | 1 P29279 | 1 100 0, 5
CXCL12 | Alfa P48061 | 2 100 0, 1
CXCL12 | Beta P48061 | 1 100 0, 3
CXCL1 P09341 100 0, 4
CXCL8 | 1 P10145 | 1 100 0,3
DLL1 | 1 O00548 | 1 500 0,5
DLL4 Q9NR61 200 0,6
EGF | 1 P01133 | 1 500 0, 1
FASLG | 1 P48023 | 1 10 0, 2
FGF2 | 3 P09038 | 2 100 0, 1
FGF6 P10767 100 0, 1
FLT3LG | 1 P49771 | 1 50 0, 1
GPNMB | 1 Q14956 | 1 100 0,5
HGF | 1 P14210 | 1 50 0, 4
IGF1 | 1 P05019 | 1 200 0, 1
IGFBP2 P18065 100 0, 5
IGFBP3 | 1 P17936 | 1 100 0,1
IL13 P35225 100 0, 1
IL15 | IL15S48AA P40933 | 1 50 0, 1
IL1B P01584 25 0, 1
IL6 P05231 100 0, 1
IL7 | 1 P13232 | 1 100 0, 1
JAG1 | 1 P78504 | 1 200 0,5
JAG2 | Longas Q9Y219 | 1 100 0,5
KITLG | 1 P21583 | 1 100 0, 5
KNG1 | HMW P01042 | 1 100 0,2
Lep P41159 1000 0, 2
LYVE1 Q9Y5Y7 100 0, 5
NRG1 | 10 Q02297 | 10 100 0, 1
NRG1 | 1 Q02297 | 1 100 0, 5
NRG1 | 6 Q02297 | 6 100 0, 1
O PDGFAB go1990265 100 0, 5
PDGFB | 1 P01127 | 1 100 0, 5
Ptn P21246 100 0,5
SHH Q15465 100 0,5
TGFB1 | | Cterminus P01137 | Cterminus 20 0, 1
TGFB1 | | Colo P01137 | Colo 100 0,15
TGFB2 | Um P61812 | 1 20 0, 1
THPO | 1 P40225 | 1 50 0, 2
TNFRSF11B O00300 100 0, 2
TNFSF11 | 1 O14788 | 1 100 0, 1
Tnf P01375 100 0, 1
VEGFA | VEGF206 P15692 | 1 100 0, 1
WNT10A Q9GZT5 100 0,1
WNT3A | 1 P56704 | 1 200 0,1
Wnt5a | 1 P22725 | 1 100 0,1

Tabela 1: a lista completa de ligantes utilizados para os experimentos Mema. A identificação do uniprot, as concentrações de estoque, e as concentrações de trabalho finais são fornecidas.

Proteína ECM O UniprotID Concentração de estoque
(μg/mL)
Final
Concentração
(μg/mL)
Notas
ALCAM | 1 Q13740 | 1 100 30
CDH20 Q9HBT6 300 80
CDH6 | 1 P55285 | 1 100 40
CDH8 P55286 100 20
CD44 | 1 P16070 | 1 100 30
CEACAM6 P40199 100 30
COL1A1 P02453 5000 200 várias subunidades com vários IDs uniprot
COL2A1 | 2 P02458 | 2 1000 200
COL3A1 | 1 P02461 | 1 1000 200
COL4A1 | 1 P02462 | 1 1000 200 várias subunidades com vários IDs uniprot
COL5A1 P20908 1000 200
COL23A1 | 1 Q86Y22 | 1 200 80
DSG2 Q14126 100 30
CDH1 | 1 P12830 | 1 100 40
ECM1 | 1 Q16610 | 1 100 40
FN1 | 1 P02751 | 1 1000 200
GAP43 | 1 P17677 | 1 158 40
HyA-500K 1000 200 LOR-0005
HyA-50K 1000 200 LOR-0007
ICAM1 P05362 400 80
ALCAM | 1 Q13740 | 1 100 30
CDH20 Q9HBT6 300 80
CDH8 P55286 100 20
CD44 | 1 P16070 | 1 100 30
CEACAM6 P40199 100 30
DSG2 Q14126 100 30
CDH15 P55291 100 20
VCAM1 | 1 P19320 | 1 1000 200
LAMA1 P25391 500 200 várias subunidades com vários IDs uniprot
LAMA3 | 2 Q16787 | 2 130 40
Lum P51884 200 80
CDH15 P55291 100 20
NID1 | 1 P14543 | 1 100 9,3 μg/mL NID, 130 μg/mL Lam, 46,5 μg/mL COL4 + COL4 e laminina
Omd Q99983 100 40
SPP1 | Um P10451 | 1 100 40
CDH3 | 1 P22223 | 1 100 40
PECAM1 | Longas P16284 | 1 150 40
TNC | 1 P24821 | 1 500 200
VCAM1 | 1 P19320 | 1 1000 200
Vtn P04004 100 40
Bgn P21810 100 40
DCN | Um P07585 | 1 300 80
POSTN | 1 Q15063 | 1 100 40
Sparc P09486 100 40
THBS1 | 1 P07996 | 1 100 40
BCAN | 1 Q96GW7 | 1 100 40
ELN | 3 P15502 | 3 1000 200
FBN1 P35555 254 80

Tabela 2: a lista completa de proteínas e condições de ECM que são utilizadas nos experimentos Mema. A identificação do uniprot, as concentrações de estoque, e as concentrações de trabalho finais são fornecidas. Em alguns casos, a condição impressa representa um complexo proteico ou uma combinação de múltiplas proteínas, que é indicada na coluna notas.

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Discussion

A importância da "dimensionalidade" e do contexto tem sido um fator motivador no desenvolvimento de sistemas de cultura in vitro como ferramentas na caracterização de células cancerosas através de sua interação com o microambiente11, e a capacidade de in vitro sistemas de cultura para imitar o ambiente in vivo é uma força motriz por trás da busca para melhorar esses sistemas de cultura. No entanto, os sistemas in vitro continuam a ser instrumentos significativos de investigação do cancro precisamente devido à sua capacidade de destilar a situação complexa in vivo até um modelo simplificado12.

Embora os sistemas 2D possam incluir ECMs e ligands, têm faltou tradicional as capacidades da taxa de transferência para interrogar um painel largo de pertubagens combinatória. Os extratos comerciais populares da membrana do porão permitem cultivando em 3D, mas faltam a proveniência de um painel com cuidado definido das proteínas. Os extratos comerciais geralmente sofrem de composição incompleta definida, o que pode confundir a análise e resultar em significativa variação de lote para lote3,13. A plataforma MEMA supera essas barreiras, permitindo o estudo de alterações nos fenótipos celulares, atividade metabólica, status de diferenciação e variações no crescimento e proliferação celular, à medida que são moduladas por endógenos específicos e definidos Fatores.

A plataforma MEMA é uma abordagem poderosa e de médio a alto rendimento para avaliar o impacto do microambiente (ECM e fatores solúveis) no fenótipo das células. A plataforma mostra grande flexibilidade para os tipos de ensaios e células para as quais ele pode ser utilizado. Nós podemos observar os efeitos dos ligantes solúveis e das proteínas do ECM a que as pilhas são expostas. De fato, descobrimos recentemente que os ligantes eram um importante fator de resistência aos inibidores do HER2, mas que esses efeitos poderiam ser modulados pelo ECM5. Uma variedade de células, incluindo células primárias e linhas celulares derivadas de diferentes tipos de células, incluindo pulmão, bexiga, próstata, mama e pâncreas, bem como células de tronco pluripotentes induzidas (iPS), foram cultivadas com sucesso na plataforma MEMA (ver exemplos nas referências5,7,14). O uso de diferentes manchas permite a leitura de múltiplos terminais celulares, incluindo o crescimento celular, diferenciação e metabolismo. Outros pesquisadores ampliaram a plataforma para interrogar o impacto da rigidez ou do módulo elástico, acrescentando uma dimensão adicional à plataforma MEMA15. Finalmente, a plataforma é favorável à realização de telas de drogas para identificação de condições de microambiente que melhoram ou inibem a eficácia dos fármacos, como nós e outros relataram recentemente5,14,15 .

Talvez o passo mais crítico para o sucesso de um experimento MEMA é otimizar a densidade do chapeamento de células. Otimizar a densidade das células garante que células suficientes estão presentes para fornecer dados robustos, mas não tantos que o local torna-se excessivamente confluente. Os pontos confluentes podem confundir significativamente os resultados, especialmente se a proliferação é usada como um EndPoint, o que torna impossível determinar se baixas taxas de proliferação são resultado de interações com fatores microambientais ou devido à inibição de contato de alta densidade celular. Os experimentos de titulação celular podem revelar esses problemas, pois os números médios de células por local demonstrarão um aumento linear com números crescentes de células chapeadas, mas eventualmente serão platinadas. O número de célula ideal deve ser escolhido no intervalo linear da curva.

Como mencionado acima, a plataforma MEMA é flexível e pode ser preparada em uma variedade de substratos com diferentes superfícies. Estes incluem corrediças de vidro e formatos da placa do multifolha. Em nossa experiência, nem todas as químicas de superfície são passíveis à impressão de Mema, porque nós observamos o destacamento do ponto em algumas superfícies devido às propriedades pobres da adesão e à incapacidade obstruir a adesão da pilha em outras superfícies elevadas da adesão. Além disso, a mudança entre diferentes substratos requer otimização de condições de buffer, pois o desempenho da impressão com o mesmo buffer de impressão pode variar dependendo da química de superfície.

O diâmetro dos pontos de ECM impressos desempenha um papel importante na qualidade dos dados. Em geral, recomendamos usar os pinos de impressão de maior diâmetro disponíveis para o arrayer em uso (atualmente usamos pinos de diâmetro de 350 μm). Os pontos de maior diâmetro permitem que um número maior de células ocupe um ponto, o que tende a resultar em dados mais robustos do que são gerados com pinos de diâmetro menor. Uma vez que a ligação das células é um processo estocástico, não tende a ser um alto grau de variabilidade nos dados que está relacionado com o número de células originalmente anexado a cada ponto. Assim, recomendamos a impressão de um grande número de repetições para cada condição de ECM. Nós imprimimos 10 − 15 ECM Replica em cada poço com nossas condições de impressão atuais para assegurar estatísticas robustas.

Nós observamos em nossos experimentos passados que, na maior parte, os efeitos de ligantes tendem a dominar sobre os efeitos de ECM. Isso pode ser em parte devido à nossa decisão de adicionar colágeno I a todos os pontos ECM, o que garante uma ligação robusta de células. No entanto, acreditamos que isso também pode homogeneizar os efeitos de ECM, como a maioria dos pontos tendem a se comportar de uma forma altamente semelhante ao colágeno I. alterando a composição do ponto para excluir o colágeno eu posso resultar em comportamento celular diferencial como resultado da interação com o O ECM, mas igualmente impacta significativamente a ligação da pilha, tendo por resultado muitos mais pontos desocupados. Os usuários devem adaptar sua composição ECM mantendo essas diferenças em mente, especialmente aqueles interessados em células tronco e progenitoras e diferenciação, onde a matriz pode ter um impacto significativo16.

Normalmente, realizamos os ensaios MEMA por períodos de tempo relativamente curtos (por exemplo, 72 h no máximo). Isso é porque as células são restritas para os pontos (o buffer de bloqueio não permite o crescimento fora dos pontos em nossa experiência). Com a rápida divisão de células, o crescimento maior do que 72 h levará ao crescimento excessivo do local, o que, por sua vez, complica a segmentação da imagem à medida que as células se aglomeram e se acumulam, e também podem impactar os dados à medida que a parada de crescimento pode ocorrer com inibição de contato. Nós executamos uns tratamentos mais longos com as pilhas preliminares de crescimento muito lentas (10 − 14 dias), mas o cuidado deve ser tomado nestes ensaios para mudar os meios e para reabastecer ligantes cada 3 − 4 dias.

Os esforços contínuos para desenvolver a plataforma MEMA estão focados em duas áreas de interesse, maximização da qualidade óptica para imagem e otimização dentro de embarcações de menor cultura. A qualidade óptica torna-se um fator crucial quando os pesquisadores necessitam de microscopia de alta resolução para identificar a localização subcelular de seus marcadores de interesse. As telas iniciais podem ser executadas em uma resolução mais baixa em microscópios de alta taxa de transferência, seguidos por imagens de pontos específicos de interesse em instrumentos de maior resolução, mas a qualidade da imagem pode ser comprometida se as propriedades ópticas do substrato forem ruins. A melhoria das propriedades ópticas do substrato permitiria que os pesquisadores realizem as telas iniciais em sistemas de imagens de alta resolução sem a necessidade de readquirir imagens selecionadas em maior resolução. Finalmente, a capacidade de realizar MEMAs em vasos de cultura menores, como placas de 96 poços, permitiria uma redução no volume de tratamento e uma expansão de ligantes e repetições interrogadas. Essa transição requer a otimização de interações substrato-tampão-proteína e impressão de matriz dentro de novas embarcações de cultura. Tais esforços contínuos melhorarão a plataforma de Mema e expandirão em cima de suas capacidades poderosas para identificar as proteínas microambientais relevantes que alteram fenótipos celulares para uma variedade de tipos da pilha, que podem então subseqüentemente ser investigados em ensaios confirmatórios.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pela biblioteca de fundos comuns da NIH de assinaturas de rede celular (LINCS) Grant HG008100 (J.W.G., L.M.H., e J. E. K).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aushon 2470 Aushon BioSystems Arrayer robot system used in the protocol
Nikon HCA Nikon High Content Imaging system designed around Nikon Eclipse Ti Inverted Microscope
BioTek Precision XS liquid Handler BioTek liquid handling robot used in the protocol
Trizma hydrochloride buffer solution Sigma T2069
EDTA Invitrogen 15575-038
Glycerol Sigma G5516
Triton X100 Sigma T9284
Tween 20 Sigma P7949
Kolliphor P338 BASF 50424591
384-well microarray plate, cylindrical well Thermo Fisher ab1055
Nunc 8 well dish Thermo Fisher 267062
Paraformaldehyde 16% solution Electron Microscopy Science 15710
BSA Fisher BP-1600
Sodium Azide Sigma S2002
Cell Mask Molecular Probes H32713
Click-iTEdU Alexa Fluor Molecular Probes C10357
DAPI Promo Kine PK-CA70740043
ALCAM R & D Systems 656-AL ECM
Cadherin-20 (CDH20) R & D Systems 5604-CA ECM
Cadherin-6 (CDH6) R & D Systems 2715-CA ECM
Cadherin-8 (CDH8) R & D Systems 188-C8 ECM
CD44 R & D Systems 3660-CD ECM
CEACAM6 R & D Systems 3934-CM ECM
Collagen I Cultrex 3442-050-01 ECM
Collagen Type II Millipore CC052 ECM
Collagen Type III Millipore CC054 ECM
Collagen Type IV Sigma C5533 ECM
Collagen Type V Millipore CC077 ECM
COL23A1 R & D Systems 4165-CL ECM
Desmoglein 2 R & D Systems 947-DM ECM
E-cadherin (CDH1) R & D Systems 648-EC ECM
ECM1 R & D Systems 3937-EC ECM
Fibronectin R & D Systems 1918-FN ECM
GAP43 Abcam ab114188 ECM
HyA-500K R & D Systems GLR002 ECM
HyA-50K R & D Systems GLR001 ECM
ICAM-1 R & D Systems 720-IC ECM
Laminin Sigma L6274 ECM
Laminin-5 Abcam ab42326 ECM
Lumican R & D Systems 2846-LU ECM
M-Cad (CDH15) R & D Systems 4096-MC ECM
Nidogen-1 R & D Systems 2570-ND ECM
Osteoadherin/OSAD R & D Systems 2884-AD ECM
Osteopontin (SPP) R & D Systems 1433-OP ECM
P-Cadherin (CDH3) R & D Systems 861-PC ECM
PECAM1 R & D Systems ADP6 ECM
Tenascin C R & D Systems 3358-TC ECM
VCAM1 R & D Systems ADP5 ECM
Vitronectin R & D Systems 2308-VN ECM
Biglycan R & D Systems 2667-CM ECM
Decorin R & D Systems 143-DE ECM
Periostin R & D Systems 3548-F2 ECM
SPARC/osteonectin R & D Systems 941-SP ECM
Thrombospondin-1/2 R & D Systems 3074-TH ECM
Brevican R & D Systems 4009-BC ECM
Elastin BioMatrix 5052 ECM
Fibrillin Lynn Sakai Lab OHSU N/A ECM
ANGPT2 RnD_Systems_Own 623-AN-025 Ligand
IL1B RnD_Systems_Own 201-LB-005 Ligand
CXCL8 RnD_Systems_Own 208-IL-010 Ligand
IGF1 RnD_Systems_Own 291-G1-200 Ligand
TNFRSF11B RnD_Systems_Own 185-OS Ligand
BMP6 RnD_Systems_Own 507-BP-020 Ligand
FLT3LG RnD_Systems_Own 308-FK-005 Ligand
CXCL1 RnD_Systems_Own 275-GR-010 Ligand
DLL4 RnD_Systems_Own 1506-D4-050 Ligand
HGF RnD_Systems_Own 294-HGN-005 Ligand
Wnt5a RnD_Systems_Own 645-WN-010 Ligand
CTGF Life_Technologies_Own PHG0286 Ligand
LEP RnD_Systems_Own 398-LP-01M Ligand
FGF2 Sigma_Aldrich_Own SRP4037-50UG Ligand
FGF6 RnD_Systems_Own 238-F6 Ligand
IL7 RnD_Systems_Own 207-IL-005 Ligand
TGFB1 RnD_Systems_Own 246-LP-025 Ligand
PDGFB RnD_Systems_Own 220-BB-010 Ligand
WNT10A Genemed_Own 90009 Ligand
PTN RnD_Systems_Own 252-PL-050 Ligand
BMP3 RnD_Systems_Own 113-BP-100 Ligand
BMP4 RnD_Systems_Own 314-BP-010 Ligand
TNFSF11 RnD_Systems_Own 390-TN-010 Ligand
CSF2 RnD_Systems_Own 215-GM-010 Ligand
BMP5 RnD_Systems_Own 615-BMC-020 Ligand
DLL1 RnD_Systems_Own 1818-DL-050 Ligand
NRG1 RnD_Systems_Own 296-HR-050 Ligand
KNG1 RnD_Systems_Own 1569-PI-010 Ligand
GPNMB RnD_Systems_Own 2550-AC-050 Ligand
CXCL12 RnD_Systems_Own 350-NS-010 Ligand
IL15 RnD_Systems_Own 247-ILB-005 Ligand
TNF RnD_Systems_Own 210-TA-020 Ligand
IGFBP3 RnD_Systems_Own 675-B3-025 Ligand
WNT3A RnD_Systems_Own 5036-WNP-010 Ligand
PDGFAB RnD_Systems_Own 222-AB Ligand
AREG RnD_Systems_Own 262-AR-100 Ligand
JAG1 RnD_Systems_Own 1277-JG-050 Ligand
BMP7 RnD_Systems_Own 354-BP-010 Ligand
TGFB2 RnD_Systems_Own 302-B2-010 Ligand
VEGFA RnD_Systems_Own 293-VE-010 Ligand
IL6 RnD_Systems_Own 206-IL-010 Ligand
CXCL12 RnD_Systems_Own 351-FS-010 Ligand
NRG1 RnD_Systems_Own 378-SM Ligand
IGFBP2 RnD_Systems_Own 674-B2-025 Ligand
SHH RnD_Systems_Own 1314-SH-025 Ligand
FASLG RnD_Systems_Own 126-FL-010 Ligand

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References

  1. Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
  2. Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).
  3. Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
  4. LaBarge, M. A., et al. Human mammary progenitor cell fate decisions are products of interactions with combinatorial microenvironments. Integrative Biology (Cambridge). 1 (1), 70-79 (2009).
  5. Watson, S. S., et al. Microenvironment-Mediated Mechanisms of Resistance to HER2 Inhibitors Differ between HER2+ Breast Cancer Subtypes. Cell Systems. 6 (3), 329-342 (2018).
  6. Ranga, A., et al. 3D niche microarrays for systems-level analyses of cell fate. Nature Communications. 5, 4324 (2014).
  7. Malta, D. F. B., et al. Extracellular matrix microarrays to study inductive signaling for endoderm specification. Acta Biomater. 34, 30-40 (2016).
  8. Kamentsky, L., et al. Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software. Bioinformatics. 27 (8), 1179-1180 (2011).
  9. Gagnon-Bartsch, J. A., Jacob, L., Speed, T. P. Removing Unwanted Variation from High Dimensional Data with Negative Controls. University of California, Berkeley, Department of Statistics, University of California, Berkeley. , Report No. 820 (2013).
  10. Allan, C., et al. OMERO: flexible, model-driven data management for experimental biology. Nature Methods. 9 (3), 245-253 (2012).
  11. Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
  12. Bissell, M. J. The differentiated state of normal and malignant cells or how to define a "normal" cell in culture. International Review of Cytology. 70, 27-100 (1981).
  13. Serban, M. A., Prestwich, G. D. Modular extracellular matrices: solutions for the puzzle. Methods. 45 (1), 93-98 (2008).
  14. Kaylan, K. B., et al. Mapping lung tumor cell drug responses as a function of matrix context and genotype using cell microarrays. Integrative Biology (Cambridge). 8 (12), 1221-1231 (2016).
  15. Lin, C. H., Jokela, T., Gray, J., LaBarge, M. A. Combinatorial Microenvironments Impose a Continuum of Cellular Responses to a Single Pathway-Targeted Anti-cancer Compound. Cell Reports. 21 (2), 533-545 (2017).
  16. Gjorevski, N., et al. Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture. Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).

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Retração microambiente microarray MEMA câncer de mama fenótipo celular proliferação
Usando Microarrays para interrogar o impacto microambiental em phenotypes celulares no cancro
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Smith, R., Devlin, K., Kilburn, D.,More

Smith, R., Devlin, K., Kilburn, D., Gross, S., Sudar, D., Bucher, E., Nederlof, M., Dane, M., Gray, J. W., Heiser, L., Korkola, J. E. Using Microarrays to Interrogate Microenvironmental Impact on Cellular Phenotypes in Cancer. J. Vis. Exp. (147), e58957, doi:10.3791/58957 (2019).

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