Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

En plade-baseret cytotoksicitet analyse til vurdering af rotte Placental naturlig Killer Cell cytolytisk funktion

Published: June 2, 2019 doi: 10.3791/58961
Automatic Translation
1, 1, 2, 1,2
1Department of Emergency Medicine, University of Mississippi Medical Center, 2Department of Experimental Therapeutics and Pharmacology, University of Mississippi Medical Center

Summary

Her giver vi en detaljeret metodologi til at isolere og vurdere cytotoksiske funktion af naturlige dræber celler fra indsamlingerne ved en kolorimetrisk plade assay. Den reducerede livmoder perfusion tryk rotte model af placenta iskæmi blev valgt til at demonstrere antistof-medieret isolation og vurdering af den cytotoksiske funktion af naturlige dræber celler.

Abstract

Det er velkendt, at decidobbelte naturlige dræber (NK) celler spiller en afgørende rolle i etablering og vedligeholdelse af normal graviditet. Nylige undersøgelser har vist en ændret population af cirkulerende og decidobbelte NK-celler hos kvinder, der lider af ugunstige graviditetskomplikationer, såsom recidiverende abort og præeklampsi. Undersøgelser fra vores gruppe har vist, at hypertension under graviditet er forbundet med en øget population af aktiverede NK celler i placenta baseret på udtryk for overflade aktiverings markører. Dette manuskript indeholder en detaljeret protokol til vurdering af den cytotoksiske funktion af NK-celler isoleret fra placenta i en preeclampsia-lignende dyremodel af kirurgisk induceret placenta iskæmi. Følgende trin er beskrevet i detaljer: generering af enkelt cellesuspension, NK celle isolation, ex vivo stimulation, effektor: målcelle Co-kultur, og cytotoksicitet assay.

Introduction

Preeclampsia er en hypertensiv lidelse af graviditeten karakteriseret ved føtale vækst begrænsning, ende organskader og kronisk immun aktivering. Kronisk immun aktivering hos kvinder med præeklampsi fører til øget cirkulerende og placenta inflammatoriske cytokiner, en ubalance i CD4+ T- celler populationer, og en øget population af aktiverede Natural Killer (NK) celler1. Undersøgelser for nylig offentliggjort af vores laboratorium demonstrere en rolle for NK celler i forårsager nogle af Patofysiologi forbundet med preeklampsia i reduceret uterine perfusion Pressure (Rupp) rotte model af præeklampsi. Ved hjælp af flowcytometri til måling af overflade udtryk for aktiverings markører på NK-celler blev der observeret en øget population af aktiverede NK-celler i cirkulation og indsamlingerne af Rupp-rotter sammenlignet med normale drægtige (NP) rotter2.

For at bekræfte flow cytometri observationer blev der udført funktionelle undersøgelser til vurdering af den cytotoksiske aktivitet af NK-celler isoleret fra indsamlingerne af NP og Rupp-rotter. Der er flere metoder til rådighed til vurdering af cytotoksiske funktion af cytotoksiske CD8+ T celler og NK celler. Den gyldne standard for funktionel cytotoksisk analyse er chrom Release assay3. Andre udviklede protokoller anvendes omfatter flow cytometri4, billede cytometri5, calcein Release6, og senest bioluminescens7. Denne video vil give en detaljeret protokol om brug af den veletablerede lactat dehydrogenase (LDH) frigivelse assay til at måle cytotoksiske funktion af NK celler ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt LDH cytotoksicitet assay kit.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle protokoller blev godkendt af det institutionelle udvalg for dyrepasning og-brug ved University of Mississippi Medical Center. Pasning og håndtering af dyrene var i overensstemmelse med de nationale Institut for sundhed retningslinjer for etisk dyre behandling.

1. lymfocyt celle isolation fra Placentas

  1. Der fjernes en placenta fra rotte uterus (gestationsdag 19), og der anbringes 10 mL iskold PBS8.
  2. Anbring en placenta på et 100 μm filter og Sid i en Petri skål indeholdende 13,5 mL RPMI og 1,5 mL FBS (samlet volumen er 15 mL). Brug den flade side af en sprøjtens stempel til at skubbe placenta gennem filteret ind i Petri skålen.
  3. Forbered 3 15 mL koniske rør til hvert væv. Der tilsættes 3 mL densitets gradient medium (Se tabel over materialer) til hvert rør, hvorefter der forsigtigt overlejres 5 ml homogeniseret placenta i hvert rør.
  4. Der centrifugeres i 25 min ved 300 x g ved stuetemperatur (RT) uden bremse. Saml det tynde hvide Buffy-lag med en overførings pipette.
    Bemærk: Efter centrifugering, 3 lag er synlige, den røde RPMI i toppen, det hvide Buffy lag i midten, og den klare tæthed gradient medium lag i bunden. Brug en overførings pipette til at trække det hvide Buffy-lag op fra røret. Kombiner Buffy lag fra alle rør af samme placenta i 1 rør.
  5. Tilsæt 10 mL RPMI til kombinerede Buffy-lag. Der centrifugeres i 10 min, 300 x gved 4 °c, og supernatanten kasseres.

2. isolering af naturlige dræber celler

  1. Resuspension af celle pellet i 50 μL iskold PBS
  2. Tilsæt biotin-mærket CD3 antistof til pelleterede celler i henhold til producentens protokol og bland godt med en pipette. Røret anbringes i en rørrotator og inkuerer 20 min ved 4 °C.
  3. Der tilsættes 1 mL RPMI, centrifugeres i 10 min ved 400 x g og 4 °c, og supernatanten kasseres.
  4. Pellet resuspenderes i 1 mL RPMI og kombineres med 150 μL magnetiske perler i et 1,5 mL mikrocentrifugerør. Mikrocentrifuge røret anbringes i en rørrotator og roteres under inkubationen i 30 minutter ved 4 °C.
    Bemærk: Træk udløser bufferen ud på dette tidspunkt, og gør det muligt at nå RT i biosikkerhedskabinettet.
  5. Anbring rørene i magneten i 1 min. Saml supernatanten og Gem CD3-cellepopulation i et 15 mL rør på is.
    Bemærk: Dette er den CD3- population af celler.
  6. Fjern røret fra magneten og tilsæt 1 mL RPMI. Bland celler og perler 5 gange med en pipette.
  7. Gentag trin 2,5.
  8. CD3- populationen af celler centrifugeres i 10 min ved 400 x g og 4 °c, og supernatanten kasseres. Celle pillen resuspenderes i 50 μL iskold PBS
  9. Tilsæt biotin-mærket CD161a antistof til CD3- celler i henhold til producentens protokol og bland godt. Røret anbringes i en rørrotator og inkueres i 20 min ved 4 °C.
  10. Der tilsættes 1 mL RPMI, centrifugeres i 10 min ved 400 x g og 4 °c, og supernatanten kasseres. Pellet resuspenderes i 1 mL RPMI og kombineres med 150 μL magnetiske perler i et 1,5 mL mikrocentrifugerør.
  11. Mikrocentrifuge røret anbringes i en rørrotator og roteres under inkubationen i 30 minutter ved 4 °C.
  12. Anbring rørene i en magnet i 1 min. Saml supernatanten og kassér CD3-/Cd161a- celler.
  13. Fjern røret fra magnet og tilsæt 1 mL RPMI. Bland celler og perler 5 gange med en pipette.
  14. Gentag trin 2,12.
  15. Fjern mikrocentrifuge rørene fra magneten, og tilsæt 1 mL RT Release buffer. Placer røret på røret rotator og rotere mens inkubering i 15 min ved RT.
  16. Anbring rørene i magnet i 1 min. Saml supernatanten i et nyt 15 mL konisk rør på is.
    Bemærk: Dette er populationen af NK-celler.
  17. Fjern røret fra magnet og tilsæt 1 mL RT RPMI. Bland celler og perler 5 gange med pipette.
  18. Gentag trin 2,16, og placere supernatanten i samme rør. Bland godt, og tag en prøve på 20 μL for at tælle cellerne
    Bemærk: Hold røret på is.
  19. Centrifuge CD3-/Cd161a+ celler i 10 min, 400 x g ved 4 °c, og fjern derefter supernatanten. Cellerne resuspenderes i RPMI (10% FBS, 1% pen/STREP, 2 ng/mL IL-2) og frø i en koncentration på 3 x 105 celler/brønd i en 6-brønd plade i 2,5 ml af NK Cell Activation Media. Der inkurueres celler for 48 h ved 37 °C, 5% CO2 i en befuret inkubator.

3. cytotoksicitet analyse: hentning af NK celler eller YAC1 fra kultur eller passerer celler

Bemærk: Alle trin skal udføres under kølerhjelmen. Alle cellerør skal holdes på is hele tiden.

  1. Brug et serologisk pipet til at samle YAC1 celler og medier fra kolben, Anbring i et 50 mL rør på is, og bland godt. Tag 20 μL for at tælle cellerne.
  2. Drej YAC1 cellerne i 10 min ved 300 x g og 4 °c. Tæl celler, mens disse er spinning.
  3. Tilsæt trypsin/EDTA til hver brønd i en NK-celle 6-brønd plade. Tryk på pladen og anbring den i inkubator.
  4. Efter at cellerne er inkueret med trypsin/EDTA i ~ 5 min ved 37 °C, skrabes pladen/kolben med en steril plade skraber. Tilsæt 1 mL NK Cell Media til hver brønd.
  5. Saml celler og medier med serologisk pipet og saml i et 15 mL centrifugeglas. Tag 20 μL for at tælle cellerne.
  6. Drej NK-cellerne i 10 min, 400 x g ved 4 °c. Tæl stikprøven af celler fra trin 3,5 under denne centrifugering.
    Bemærk: Se kultur pladerne under et mikroskop, før du kasser dem for at sikre, at der ikke er flere celler, der er overholdt i bunden af brøndene. Da eksperimentet bruger NK-celler og YAC1-celler, skal du sørge for at tælle hver enkelt separat.
  7. Tæl cellerne og resuspender ved de koncentrationer, der er bestemt i optimerings forsøg, for at teste for det relevante antal mål: effektor ratio. Dette vil ske ved at resuspendere pellet i deres tilsvarende medier for at gøre følgende celle koncentrationer: YAC1 ved 4 x 105 celler/ml og NK celler ved 2 x 107 celler/ml.

4. cytotoksicitet assay: analyse protokol

  1. Brug en rund bund, kultur behandlet 96-brønd plade til at opsætte pladen som foreslået i tabel 1. Denne tabel viser de eksperimentelle kontroller og 3 sæt af NK eksperimentelle kolonner. Dette kan udvides til i alt 10 NK eksperimentelle søjler i en 96-brønd plade.
  2. Analyse pladen centrifugeres ved 250 x g i 4 min. for at være sikker på, at effektoren og målcellerne er i kontakt. 96-brønd pladen inkubieres i 5 timer i en befugte kammer-inkubator ved 37 °C, 5% CO2 for at opnå rigelig kontakt mellem måleog effektor celler og målcelle lysis ved effektor celler.
    Bemærk: Protokollen kan sættes på pause her.
  3. 45 min før høst supernatants tilsættes 10 μL 10x lysis opløsning til målcellens maksimale LDH Release brønde (Wells 1E, 1F, 1G og 1H) og Anbring pladen tilbage i det befurede kammer.
  4. Når Inkubationstiden er afsluttet, centrifugeres pladen ved 250 x g i 4 min. ved hjælp af en multikanals pipettor, Overfør 50 μl aliquoter fra alle brønde til en frisk 96-godt flad bund-analyse plade.
    Bemærk: Rør ikke ved bunden af brøndene, så cellerne ikke overføres til den friske analyse plade. Brug ikke en kultiveret, behandlet plade som den friske analyse plade.
  5. Foretag assay reagens.
    1. Efter assay buffer har nået stuetemperatur, tilsættes 12 mL analyse buffer til en substrat mix flaske. Vend og Ryst forsigtigt, indtil det er helt opløst. 1 flaske er nok til 2 96-brønd plader.
      Bemærk: Analyse buffer skal beskyttes mod lys, mens den optøes. Bland umiddelbart før brug.
  6. Der tilsættes 50 μL assay reagens til alle brønde i analyse pladen fra trin 4,6. Dæk pladen med folie for at beskytte den mod lys og inkube i 30 minutter ved stuetemperatur.
    Bemærk: Nylavet assay reagens skal opbevares i en fryser. Reagensen er godt i ca. 8 uger.
  7. Der tilsættes 50 μL stop opløsning til hver brønd. Læs pladen inden for 1 time efter tilsætning af stop opløsning og Optag absorbansen ved 490 nm. Repræsentative data fremgår af tabel 2.

5. beregning af resultater

  1. Beregn den gennemsnitlige absorbans værdi fra de kultur medium baggrund brønde og trække fra alle absorbans værdier for Eksperimentel, Target celle spontan LDH frigivelse og Effector Cell spontan LDH frigivelse brønde.
  2. Beregn de gennemsnitlige absorbansværdier for borehullerne til volumen korrektion, og træk fra de absorbansværdier, der er anskaffet til målcellens maksimale LDH-udløser kontrol brønde.
  3. Brug de korrigerede værdier fra trin 5,1 og 5,2 i følgende formel til at beregne procent cytotoksicitet for hver effektor: Målret godt.
    Equation 1

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Placental NK celler opnået fra NP og RUPP rotter blev inkueret i 5 timer med målceller i deres respektive Medias i forholdet 50:1 (NK: Target). Absorbans blev registreret ved 490 nm, og de rå data er vist i tabel 2. Den gennemsnitlige absorbans af kultur medium baggrund og volumen korrektion kontrol brønde blev beregnet. Disse gennemsnit blev trukket fra de relevante brønde, der er angivet i fabrikantens protokol, og er gengivet i tabel 3. De korrigerede værdier blev derefter anvendt til at opnå% cytotoksicitet ved anvendelse af den af fabrikanten angivne protokol (tabel 4).

1 2 3 4 5
Tcs Vcc ECSR-1 ECSR-2 ECSR-3
Tcs Vcc ECSR-1 ECSR-2 ECSR-3
Tcs Vcc ECSR-1 ECSR-2 ECSR-3
Tcs Vcc ECSR-1 ECSR-2 ECSR-3
Tcm Cmb EW-1 EW-2 EW-3
Tcm Cmb EW-1 EW-2 EW-3
Tcm Cmb EW-1 EW-2 EW-3
Tcm Cmb EW-1 EW-2 EW-3

Tabel 1: analyse plade layout. TCS = målcelle spontan LDH Release (50 μL målceller + 50 μL målcelle medium); TCM = målcellens maksimale LDH-frigivelse (50 μL-målceller + 50 μL målcelle medium); VCC = volumen korrektion kontrol (50 μL målcelle medium + 50 μL NK celle medium); CMB = kulturmedium baggrundskontrol (50 μL målcelle medium + 50 μL NK celle medium); ECSR = Effector celle spontan frigivelse (50 μL NK celler + 50 μL NK celler medium); EW = eksperimentelle brønde (50 μL målceller + 50 μL NK celler).

1 2 3 4 5
Np Rupp Np
0,615 af 0,484 af 0,473 af 0,463 af 0,471 af
0,586 af 0,484 af 0,458 af 0,474 af 0,469 af
0,61 af 0,486 af 0,464 af 0,459 af 0,469 af
0,578 af 0,495 af 0,478 af 0,458 af 0,482 af
0,605 af 0,55 af 0,524 af 0,526 af 0,543 af
0,576 af 0,504 af 0,519 af 0,502 af 0,528 af
0,565 af 0,512 af 0,515 af 0,513 af 0,531 af
0,563 af 0,581 af 0,526 af 0,508 af 0,519 af

Tabel 2: rå absorbansdata for en analyse plade, der indeholder de eksperimentelle Kontroller i kolonne 1 og 2, og eksperimentelle brønde til måling af placenta NK-cellers cytotoksiske virkning fra NP og Rupp-rotter mod YAC1-målceller.

1 2 3 4 5
Np Rupp Np
0,12775 af -0,01425 af -0,02425 af -0,01625 af
0,09875 af -0,02925 af -0,01325 af -0,01825 af
0,12275 af -0,02325 af -0,02825 af -0,01825 af
0,09075 af -0,00925 af -0,02925 af -0,00525 af
0,06825 af 0,03675 af 0,03875 af 0,05575 af
0,03925 af 0,03175 af 0,01475 af 0,04075 af
0,02825 af 0,02775 af 0,02575 af 0,04375 af
0,02625 af 0,03875 af 0,02075 af 0,03175 af

Tabel 3. Korrigeret absorbans. Absorbans af brønde efter subtraktion af den gennemsnitlige absorbans af kontrol brønde i henhold til fabrikantens protokol. Kolonne 1, Wells 1-4, er TCS Absorptionerne værdier-den gennemsnitlige CMB absorbans værdi. Kolonne 1, Wells 5-8, er TCM absorbans værdier-den gennemsnitlige VCC absorbans værdi.

Np Rupp Np
128,9916 af 108,8235 af 93,69748 af
63,44538 af 118,9076 af 66,80672 af
75,92593 af 72,75132 af 64,28571 af
66,27907 af 63,17829 af 83,33333 af
Gennemsnitlig% cytotoksicitet 83,66049 af 90,91518 af 77,03081 af

Tabel 4. Cytotoksiske beregninger. Gennemsnitlig procent cytotoksicitet af replikate prøver af placenta NK celler isoleret fra NP og RUPP rotter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Der er en række vigtige nøgle noter at overveje for optimale resultater. Steriliteten af de anvendte celler er meget vigtigt. Efter opsamling af placenta er det vigtigt, at klargøring og isolering af NK-cellerne udføres under sterile forhold i et biosikkerhedskabinet. Da alle celler frigiver LDH ved cellulære skader, skal der desuden udvises omhu for at opnå en høj levedygtighed af NK-cellerne efter isolation og under samkulturprocessen. For meget spontan LDH-frigivelse fra NK-cellerne kan ofte resultere i negative, ubrugelige data

Der er nogle aspekter af denne protokol, der vil være specifikke for brugeren og deres behov. For eksempel er der forskellige metoder til isolering af mononukleære celler fra placenta ud over metoderne i denne artikel, såsom mekanisk og enzymatisk Disaggregering. Derudover er det op til brugeren at bestemme den optimale målcellerne nummer og Effector: Target ratio, der vil være egnet til deres eksperiment. I vores hænder, 10.000 målceller og en effektor: målet ratio af 50:1 var fast besluttet på at være optimal for vores eksperimenter. Disse tal kan variere afhængigt af de valgte målceller og det væv, som NK-cellerne er isoleret fra. Andre efterforskere har udnyttet denne metode til at vurdere NK funktion af celler isoleret fra leveren og milt9. Derfor kan denne metode anvendes på forskellige områder af forskning, ikke kun i undersøgelser af preeclampsia, som vi har valgt at bruge det.

Den gyldne standard for cytotoksicitet vurdering er chrom Release assay5. Selv om denne metode er pålidelig og reproducerbar, den mest oplagte begrænsning er brugen af radioaktiv eksponering risiko for personale og radioaktiv bortskaffelse. Andre, ikke-radioaktive cytotoksicitetsassays såsom flow cytometri baseret og calcien Release analyser er rapporteret at have sammenlignelige resultater til CRA6,10,11. Men, flow-cytometri-baserede analyser kræver yderligere specialiseret uddannelse af personale i flow cytometri at køre analysen. LDH Release assay kræver ikke nogen specialtræning, da denne test kun kræver simpel pipettering for at udføre analysen. Desuden, mens LDH Release assay kan udnyttes ved hjælp af standard spektroskopi eller fluorescerende detektion, calcien frigivelse og flow-cytometri-baserede metoder kræver udstyr i stand til at detektere fluorescens. Begrænsninger af LDH Release assay omfatter en undervurdering af celledød på grund af ufuldstændig frigivelse af LDH fra beskadigede celler.

I denne analyse sker målingen af LDH i medierne ved en enzymatisk reaktion, hvor iodonitrotetrazolium (et tetrazoliumsalt) omdannes til formazan (rød i farve). Absorbansen måles ved standard spektroskopi, og mængden af beskadigede celler i kulturen er proportional med intensiteten af den røde farve. Denne analyse giver mulighed for nøjagtig bestemmelse af beskadigede eller skadede celler i en prøve. Endelig, denne kolorimetriske assay kan også bruges med andre celletyper til assay cytotoksicitet forekommer via celle-medieret samt kemiske-medierede mekanismer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter, hverken finansielle eller andre, erklæres af forfatterne.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af national Heart Lung og Blood Institute af National Institutes of Health under Grant R00HL130456, National Institute of General Medical Sciences af National Institutes of Health under tildeling P20GM104357, og ved Mississippi INBRE, finansieret af en institutionel Udviklingspris (IDeA) fra National Institutes of General Medical Sciences af National Institutes of Health under tilskudsnummer P20GM103476. Indholdet er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter fra de nationale sundhedsinstitutter.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL Eppendorf tube Fisher 5408129
100 µL Filter Fisher 22363549 Nylon Mesh
15 mL conical tube Fisher 0553859A
3 mL syringe Fisher 14823436
50 mL conical tube Fisher 7203510
6-well cell culture plate Corning 720083
96-well Tissue Culture Plate CELLTREAT 229190 Sterile, Round Bottom
AOPI Nexcelom CS201065ML
Cell scraper Fisher 8100241
Cellometer Disposable Counting Chambers Nexcelom CHT4-SD100
Cellometer Vision Image Cytometer Nexcelom N/A
Cytotox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Kit Promega G1780
Dynabeads Flowcomp Flexi Kit Invitrogen 11061D
DynaMag-2 Magnet Invitrogen 12321D
EDTA Sigma Aldrich EDS-100G
FBS Atlanta Biologicals S11150H
Flow Cytometry Tube Corning 352008
Lymphoprep Fisher NC0460539 Density gradient medium; 4 x 250 mL
PBS Fisher SH3025801 10 x 500 mL
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140122
Petri dishes Fisher 9720500 Without Pad
Purified Mouse anti-Rat CD161a BD Biosciences 555006
Purified Mouse anti-Rat CD3 BD Biosciences 554829
Recombinant Rat IL-2 R&D Systems 502-RL
RPMI Gibco 11875135 1640 Medium
T25 flask Corning 430639
Trypsin ThermoFisher 15090046
YAC-1 cell ATCC TIB-160

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cornelius, D. C., Cottrell, J., Amaral, L. M., LaMarca, B. Inflammatory Mediators: A causal link to hypertension during pregnancy- Studies in Preeclampsia. British Journal of Pharmacology. , (2018).
  2. Elfarra, J., et al. Natural killer cells mediate pathophysiology in response to reduced uterine perfusion pressure. Clinical Science. 131 (23), 2753-2762 (2017).
  3. Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C., Chapuis, B. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 14 (2), 181-196 (1968).
  4. Kim, G. G., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Gooding, W., Whiteside, T. L. A novel multiparametric flow cytometry-based cytotoxicity assay simultaneously immunophenotypes effector cells: comparisons to a 4 h 51Cr-release assay. Journal of Immunological Methods. 325 (1-2), 51-66 (2007).
  5. Somanchi, S. S., McCulley, K. J., Somanchi, A., Chan, L. L., Lee, D. A. A Novel Method for Assessment of Natural Killer Cell Cytotoxicity Using Image Cytometry. PLoS One. 10 (10), 0141074 (2015).
  6. Neri, S., Mariani, E., Meneghetti, A., Cattini, L., Facchini, A. Calcein-acetyoxymethyl cytotoxicity assay: standardization of a method allowing additional analyses on recovered effector cells and supernatants. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 8 (6), 1131-1135 (2001).
  7. Karimi, M. A., et al. Measuring cytotoxicity by bioluminescence imaging outperforms the standard chromium-51 release assay. PLoS One. 9 (2), 89357 (2014).
  8. Caporossi, C., Nogueira, P. L., Marques, J. C., Assis, R. M., Aguilar-Nascimento, J. E. Validation of the gastroschisis experimental model and the influence of the mother's diet enriched with glutamine in the fetal morphology. Acta Cirúrgica Brasileira. 29 (3), 158-165 (2014).
  9. Lv, L. H., et al. Functional distinction of rat liver natural killer cells from spleen natural killer cells under normal and acidic conditions in vitro. Hepatobiliary and Pancreatic Diseases International. 11 (3), 285-293 (2012).
  10. Flieger, D., et al. A novel non-radioactive cellular cytotoxicity test based on the differential assessment of living and killed target and effector cells. Journal of Immunological Methods. 180 (1), 1-13 (1995).
  11. Jang, Y. Y., et al. An improved flow cytometry-based natural killer cytotoxicity assay involving calcein AM staining of effector cells. Annals of Clinical Laboratory Science. 42 (1), 42-49 (2012).

Tags

Immunologi og infektion cytotoksicitet naturlig dræber celle Lymfopre lactat dehydrogenase immunologi inflammation hypertension
En plade-baseret cytotoksicitet analyse til vurdering af rotte Placental naturlig Killer Cell cytolytisk funktion
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Baik, C. H., Geer, M., Travis, O.… More

Baik, C. H., Geer, M., Travis, O. K., Cornelius, D. C. A Plate-based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Rat Placental Natural Killer Cell Cytolytic Function. J. Vis. Exp. (148), e58961, doi:10.3791/58961 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter